CN110172473A

CN110172473A - 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS

Info

Publication number: CN110172473A
Application number: CN201910414489.XA
Authority: CN
Inventors: 师恭曜; 位芳; 田保明; 李晶; 张斌; 郝建峰; 邓凯文; 彭月
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: CN110172473B

Abstract

本申请属于棉花育种技术领域，具体涉及一种棉花早期发芽和幼苗阶段的基因沉默方法。该方法包括：制备转染用农杆菌液、利用烟草进行病毒扩增、侵染棉花种子等步骤。本申请中，以烟草脆裂病毒（TRV）作为病毒载体，对棉花基因沉默技术进行了优化改良。结果证明应用TRV病毒匀浆或农杆菌接种棉花子叶或种子，均可以得到基因沉默表型。对比TRV病毒匀浆与农杆菌接种的异同，发现应用种子吸涨法（Si:Seed imbibition）接种任一侵染液，均可将病毒接种时间提前至种子露白期，并于3天内高效沉默种子发芽期间的功能基因，并且病毒匀浆介导的基因沉默能持续至棉花幼苗期。本发明Si‑VIGS可以从棉花发芽早期高效沉默基因，操作简单，表型统一，表现出较好应用前景。

Description

一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS

技术领域

本申请属于棉花育种技术领域，具体涉及一种棉花发芽及幼苗早期阶段的基因沉默方法。

背景技术

现有基因组研究方法中，病毒诱导的基因沉默（VIGS）作为一种较为成熟的转基因技术，广泛应用于单子叶和双子叶植物中，如拟南芥、烟草、棉花、大豆等。

VIGS最早用来解释植物被病毒侵染后所导致的植物体的防御机制，而这种现象在植物体内普遍存在。植物被病毒侵染后，由于病毒RNA插入到植物细胞内，因此可诱导植株产生具有序列特异性的遗传免疫机制。

TRV-VIGS作为一种瞬时基因沉默技术，其原理与RNA干扰类似，主要用来下调目标基因的表达。其技术操作原理为：首先将与目的基因同源或相同的片段装载到病毒载体中，然后用组装好的病毒载体侵染植株，从而引起寄主植物同源基因沉默的现象。病毒载体刚进入植物体内时，由宿主的RNA聚合酶复制其RNA，形成双链病毒RNA，然后由DICER-like识别、切割，形成小的干扰RNA。最后被降解为单链，该单链RNA会特异互补目标基因，形成局部双链RNA结合，并激活植物体内的双链RNA降解机制，从而使宿主植物中的目标基因被降解，即在转录后水平，特异的沉默目标RNA。

VIGS技术常用的病毒载体系统有RNA病毒载体、DNA病毒载体、卫星病毒载体等。其中最早应用于VIGS中的载体是RNA病毒载体，包括烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草脆裂病毒（TRV）、番茄金色花叶病毒（TGMV）、豆荚斑驳病毒（BPMV）、豌豆早期褐变病毒（PEBV）、雀麦花叶病毒（BMV）等。具体选择应用时，需根据作物类型、目的基因序列等情况选择最为适宜的病毒载体。病毒诱导的基因沉默早期常用于烟草中，用来研究候选基因的功能，从而可以在不同的信号途径，尤其是抗病途径中发现新基因。

Tobacco rattle virus病毒载体系统因其可以侵染植物分生组织，及较轻的病毒症状，成为应用普遍的病毒载体。TRV病毒载体侵染的植物宿主较为广泛，在单子叶植物和双子叶植物中都有应用。在棉花研究中，TRV病毒介导的基因沉默对特定功能基因进行研究被广泛开展。但是，目前TRV病毒系统常用的接种方法是叶片注射法，要侵染子叶期的幼苗，操作繁琐且无法研究种子萌发阶段的基因。尚未见到关于棉花种子发芽阶段的基因沉默的研究报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种棉花发芽及幼苗早期阶段的基因沉默方法，从而为相关基因研究及棉花育种奠定一定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS，该方法包括如下步骤：

（一）制备转染用菌液

针对待沉默的目的基因，通过构建的病毒质粒介导转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液；

（二）利用烟草进行扩增

将步骤（一）中的转染用菌液侵染烟草叶片，并进行培养，收集含病毒粒子的烟草叶片的并制备成病毒侵染液；

所述烟草，具体例如为本氏烟草或普通烟草品种；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发（一般浸泡至破壳露白即可）后，用步骤（一）中的农杆菌重悬液，或步骤（二）中病毒侵染液在22~24℃条件下，黑暗浸泡培养1 d（农杆菌）或3 d（病毒侵染液，为保证基因沉默效果，每天应更换新的病毒侵染液）；然后转移到潮湿蛭石培养；具体而言：

培养过程中，保持湿度60-70%，温度22-24℃；针对种子发芽过程的基因沉默，移到潮湿蛭石后培养3 d；针对种子幼苗发育过程的基因沉默，培养棉花种子长到两片子叶完全展开后（期间每天添加新的病毒侵染液），移至正常条件下培养。

以沉默陆地棉GhHLS1基因和GhCLA1基因为例，就上述过程简介如下：

（一）制备转染用菌液

待沉默目的基因为GhHOOKLESS1（GhHLS1）基因，转染用菌液制备步骤如下：

（1）提取棉花叶片RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计引物，PCR扩增棉花GhCLA1基因的部分片段，并回收扩增产物；

扩增GhHLS1时，引物序列设计（如SEQ ID NO.1~2所示）为：

GhHLS1-F：5'-GGAATTCCGTTGGTCCCAGTAGCG-3'，

GhHLS1-R：5'-GGGTACCCGGACGGCGTACGGAAC-3；

扩增GhCLA1时，引物序列设计（如SEQ ID NO.3~4所示）为：

GhCLA1-F：5'-ACTAAAACAACGGGTCCGGTCTTGAT-3'，

GhCLA1-R：5'-AGGTTTCAAGCCTTCACAGGCCAA-3'；

（3）酶切、连接、并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得pTRV2-GhHLS1、pTRV2-GhCLA1；

（4）将步骤（3）中pTRV2-GhHLS1、pTRV2-GhCLA1进一步转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液；

（二）利用烟草进行扩增

利用注射器，通过烟草叶片伤口缓慢注入步骤（一）中的转染用菌液，并继续培养7 d；

收集含病毒粒子的烟草叶片，将叶片剪碎后加入磷酸缓冲液（PB），研磨成液体匀浆，过滤备用；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发后，用步骤（二）中病毒侵染液（病毒侵染液应适当稀释）在22~24℃条件下，黑暗浸泡培养3-4 d（为保证基因沉默效果，每天应更换新的病毒侵染液）；然后移到含病毒的潮湿蛭石共培养5~7 d（期间每天添加病毒侵染液）；具体而言：

培养过程中，保持湿度60-70%，温度22-24℃；培养棉花种子长到两片子叶完全展开（即共培养的5~7 d时间）后，移至正常条件下培养两周左右即可表现出基因沉默表型。

本申请中，以烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）作为病毒载体，以农杆菌或病毒侵染液作为接种源。病毒侵染液准备，首先利用农杆菌接种烟草叶片，然后病毒在烟草叶片中复制扩增，再收集接种的烟草叶片和第一片系统叶，研磨成含病毒粒子的液体匀浆，并将此作为病毒侵染液用于后续的叶注射法、根吸收法和种子吸涨法的实验中。

具体实验中，以GhHLS1和GhCLA1为例，对棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默进行了优化改良。结果证明应用TRV病毒匀浆或农杆菌接种棉花子叶或种子，均可以得到基因沉默表型。对比TRV病毒匀浆与农杆菌接种的异同，发现应用种子吸涨法（Si: Seedimbibition）接种任一侵染液，均可将病毒接种时间提前至种子露白期，并于3天内高效沉默种子发芽期间的功能基因，并且病毒匀浆介导的基因沉默能持续至棉花幼苗期。本发明Si-VIGS可以从棉花发芽早期高效沉默基因，操作简单，表型统一，表现出较好应用前景。

需要说明的是，利用TRV农杆菌感染种子法的实验虽然已有报道，但未被应用于种子发芽阶段的基因沉默，并且由于棉花品种的差异、以及温度湿度等环境因素的影响造成的重复率降低，沉默效果不佳。本申请创新性是将病毒匀浆渗透种子的方法应用于TRV系统中，可有效提高基因沉默的效率。TRV病毒匀浆介导的种子吸涨法比TRV农杆菌介导的种子吸涨法的沉默效率要高，且易操作，无需脱壳和在培养基上培养，只需用合适的病毒匀浆直接感染种子即可。相较于农杆菌侵种法而言，病毒匀浆介导的种子吸涨法不仅效率高，而且简单易操作，设备要求低，沉默持续时间长。具体而言，本申请的TRV病毒匀浆介导的种子吸涨的方法具有如下优点。

（1）简化了侵染前繁琐的准备工作。利用含TRV病毒的烟草叶片匀浆减少了侵染前一系列复杂的准备工作，如摇菌、富集菌落和配制重悬液等。一次可收集大量的病毒匀浆，冷冻储存，侵染时可直接稀释使用。

（2）避免了叶片接种对植物造成的机械损伤。病毒介导的种子吸涨法与叶注射法相比，避免了机械损伤对植物子叶造成的伤害，以至于子叶过早脱落造成的沉默效率下降。

（3）操作简便，对设备要求不高。病毒介导的种子吸涨法与叶注射法相比，省去了繁琐的叶注射过程。只需在病毒匀浆里浸泡3 d，移入含病毒颗粒的潮湿蛭石中培养5 d之后转入正常培养即可。不需要经过抽真空，种子脱壳，在培养基中无菌共培养等复杂的操作过程。

（4）Si-VIGS提前了侵染的时期。病毒介导的种子吸涨法可以沉默发芽及幼苗早期阶段生长发育相关的基因，将侵染时间的提前，打破了传统叶注射法接种对植物苗龄的限制。叶注射法要等到子叶完全展开以后才可以进行侵染，对苗龄要求较高，只有在合适的苗期侵染才能达到最高的沉默效果。而在病毒介导的种子吸涨法中，只需将萌发的种子直接浸泡在病毒匀浆中，降低了对苗龄的要求，可以研究种子萌发到幼苗期之间的基因功能。

（5）病毒匀浆比农杆菌重悬液的沉默效率更高。在叶注射方法中，病毒匀浆比农杆菌重悬液有更高的沉默效率，病毒匀浆接种棉花子叶，可以在子叶中出现沉默现象。病毒匀浆在叶注射法、根吸收法和种子吸涨法中的沉默效率均高于农杆菌重悬液。病毒匀浆介导的种子吸涨法比农杆菌重悬液介导的种子吸涨法更方便，无需将种子脱壳处理，就可以达到较高的沉默效率。

（6）Si-VIGS（Seed imbibition-VIGS）是一种适合用根中基因功能鉴定的方法。叶注射法对子叶以下的植株沉默效果较差，不利于研究根中基因的功能。由于种子吸涨法最先感染的是棉花的根系，因此这种方法在植株根中的基因沉默效果较好。

TRV-VIGS系统沉默的棉花植株表型可以持续3-4个月左右。TRV系统拥有有较温和的病毒表型、较高的沉默效率、以及在植株中系统性扩散的能力，这些特征使得TRV病毒载体成为一个高效的基因沉默载体。

TRV病毒系统在棉花中常用的接种方法是叶注射法，这种方法在棉花中的应用已经非常成熟，具有较高的沉默效率。但是，叶注射法也存在一定的不足，如对棉花子叶造成很大的伤害，使子叶过早的脱落，影响基因的沉默效率。此外，叶注射法虽然在真叶中沉默表型较好，但是在子叶以下的部分沉默效果不佳。而且，叶注射法要等到棉花的子叶期才进行侵染，无法研究幼苗早期发育相关的基因功能。实验结果表明，植物幼苗较容易被病毒感染，这可能是由于病毒在植物中的复制、扩散程度较强所导致的。因此，为高效研究种子萌发及幼苗早期发育的基因功能，优化和修饰了一种Si-VIGS方法。

本氏烟草在农杆菌侵染的基础上，将获得含病毒粒体的烟草叶片匀浆作为病毒接种的侵染液。因为病毒匀浆比农杆菌重悬液的感染力和扩散力都要强，所以相比较而言，病毒匀浆更适合被用于接种萌发的棉花种子。

种子吸涨法较好地解决了病毒侵染对幼苗时期的限制。不同的植物材料接种叶片的最佳时间不同，因此选择合适的苗期侵染，才能提高沉默效率。而种子吸涨法避免了这一问题，无需考虑感染植物的苗龄。除此之外，由于提前了接种的时间，使得研究幼苗早期生长阶段的基因的功能以及所涉及的信号途径得以实现，尤其适用于研究根发育相关的基因功能。另外，TRV介导的种子吸涨法能够缩短沉默机制诱发的时间，从而节省实验时间达到缩短实验周期的目的。值得注意的是，病毒匀浆比农杆菌接种的侵染力更强，更容易渗透到种子内部，达到的沉默效果也优于农杆菌。

综上所述，棉花种子吸涨接种病毒可以有效感染种子，并在幼苗中表现出与目的基因相关的沉默表型。Si-VIGS在棉花中的成功使用，也为其他植物的基因沉默提供了可信的参考。其中，最重要的是开拓了植物幼苗早期基因功能的研究的方法，扩大了植物中基因研究的范围。这种高通量接种病毒的方法，保证了客观条件的一致性，确保感染表型更加统一，避免因植株表型的差异影响实验结果，减少了实验误差。TRV系统是一个强大的基因功能鉴定工具，不仅可以用于基因沉默，还可以改造为基因编辑载体和过表达载体。Si-VIGS不仅适用于TRV系统，在BSMV系统中也已经报道了相关研究。因此，随着Si-VIGS适应更多植物物种，期望可以成为植物生物学中基因功能研究的常用工具。

附图说明

图1为利用农杆菌重悬液（OD₆₀₀=1.2）侵染四周龄的野生型本氏烟草和普通烟草后持续生长一周的植株表型（上图）以及TRV1与TRV2的半定量结果（下图）；

图2为利用农杆菌重悬液（OD₆₀₀=1.2）侵染四周龄的野生型普通烟草和野生型本氏烟草后持续生长一周的叶片表型对比；

图3为TRV系统载体图谱示意图；

图4为侵染烟草的农杆菌浓度对收集的病毒匀浆浓度的影响，实验结果证明农杆菌浓度OD₆₀₀=1.2时所收集的病毒匀浆的沉默效率最好；

图5为TRV病毒在烟草叶片中生长的天数对收集的病毒匀浆的沉默效率的影响（上图和下图为TRV1,TRV2病毒表达结果）；实验结果表明TRV病毒在烟草叶片中繁殖生长7 d之后收集的病毒匀浆的沉默效果最好；

图6为在农杆菌侵染7 d的烟草叶片和病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染之后的棉花叶片中检测TRV1和TRV2片段，对照为野生型烟草叶片；

图7为在普通烟草叶片上检测提取病毒匀浆的侵染力；将收集的病毒匀浆混合金刚砂摩擦接种在普通烟草叶片的右边，在同一叶片的左边接种水；3-4 d之后在接种病毒液的一边出现局部病毒枯斑，而接种水的一边未出现枯斑现象；WT为野生型烟草叶片，分别使用收集的侵染3 d、5 d、7 d的普通烟草叶片的病毒匀浆摩擦接种野生型烟草叶片之后的表型，以及收集的侵染7 d、9 d的本氏烟草的叶片的病毒匀浆摩擦接种野生型普通烟草叶片之后的表型（上图）以及半定量结果（下图）；

图8为利用TRV-GhCLA1病毒匀浆叶注射法侵染棉花子叶两周之后的棉花植株白化表型，对照组为TRV-GFP；

图9为利用TRV-GhCLA1病毒匀浆介导的根吸收法侵染棉花根系两周之后的棉花植株黄化表型，对照组为TRV-GFP；

图10为利用TRV-GhCLA1病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染棉花发芽种子两周之后的棉花叶片的沉默表型，对照组为TRV-GFP；上图为Si-VIGS法沉默GhCLA1基因之后的棉花植株表型；下图为Si-VIGS法沉默GhCLA1基因之后的棉花真叶沉默表型；

图11为利用TRV病毒匀浆介导的种子吸涨法和TRV病毒匀浆介导的叶注射法沉默GhCLA1基因后相关表型及检测结果，上图为GhCLA1基因表达量检测结果，对照为野生型棉花，内参基因为GhUBQ7；中图为相关表型对照结果（a为萌发的棉花种子；b为病毒匀浆侵染种子后的棉花植株表型；c为病毒匀浆侵染种子后的棉花真叶表型；d为脱壳的棉花种子；e为农杆菌侵染种子后棉花植株表型；f为农杆菌侵染种子后棉花真叶表型），下图为不同侵染方式的的基因表达量检测结果；

图12为利用TRV病毒匀浆介导的种子吸涨法和TRV病毒匀浆介导的叶注射法沉默GhCLA1基因之后检测叶片中叶绿素的含量，对照为野生型棉花；

图13为棉花种子类型，发芽棉花种子和未发芽棉花种子的沉默效率的差异；

图14为TRV病毒匀浆稀释不同的倍数对沉默效率的影响；结果发现稀释40倍的病毒匀浆用于接种棉花种子的沉默效果更好；

图15为TRV病毒稀释液接种发芽棉花种子的天数对沉默效率的影响，结果发现棉花种子在病毒匀浆中吸涨3 d之后，基因沉默的效率最好；

图16为TRV病毒稀释液与蛭石共培养感染后的棉花种子的天数对沉默效率的影响，结果发现共培养5 d之后对于基因沉默的效率有所提高；

图17为TRV病毒匀浆介导的种子吸涨法的概括流程图以及棉花种子的萌发过程示意图（下图中A~F分别表示不同萌发生长阶段）；

图18为利用TRV-GhHLS1病毒匀浆接种棉花种子沉默GhHLS1基因，对照为TRV-GFP；从上之下依次为表型图、基因半定量表达检测结果、沉默不同天数表达结果、不同组织表达结果；从沉默之后的表型可以看出，沉默了GhHLS1基因之后的棉花幼苗没有出现顶端弯钩现象，而对照组发生了顶端弯钩现象。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

（一）实验材料及培养条件

植物材料：陆地棉（Gossypium.hirsutum L.）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和普通烟草（Nicotiana tabacum L. cv.K326）均为常见生物材料品种。

烟草的种植：将种子播种在装有营养土：蛭石(W/W)=4：1的穴盆中，保持土壤湿润；两周之后，将完全展开子叶的烟草移入装有营养土：蛭石(W/W)=4：1花盆中正常培养，温度保持在22~24℃，湿度保持在60%，24℃光照14 h、黑暗10 h。

棉花的培养：将种子用浓硫酸脱绒之后清水冲洗10 min，移至烧杯中，加水至淹没种子约2 cm，放入37℃培养箱中一天培养至萌发；将泡至萌发的棉花种子埋于干净湿润的沙中，待子叶完全展开移植至1/2 Hoagland营养液中水培培养，每7 d更换一次营养液；在温室中生长，温度保持在22~24℃，相对湿度为60~75%，光照14 h、黑暗10 h的培养条件。

烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）载体pTRV1（pYL192）和pTRV2（pYL156），一种常用病毒载体系统，可由公开渠道获得。

大肠杆菌DH5α菌株、农杆菌GV3101菌株，均为实验操作中常见微生物菌株，可由公开渠道获得。

（二）部分实验试剂

LB液体培养基、LB固体培养基、YEB液体培养基、YEB固体培养基、1/2-Hogland营养液参考现有技术常规制备、灭菌即可；

抗生素的配制：

50 mg/mL庆大霉素（Gentamycin）、50 mg/mL卡那霉素（Kanamycin）：称取0.5 g庆大霉素和卡那霉素粉末，加入8 mL去离子水中，完全溶解后，定容至10 mL；在无菌超净台中，用0.22 μm无菌微孔滤膜过滤除菌，分装至2 mL EP管中，-20℃冰箱储存备用。

50 mg/mL利福平霉素（Rifampicin）：与庆大霉素和卡那霉素配制不同，利福平霉素需要溶解在适量的二甲基亚砜（DMSO）中并定容到10 mL，无菌条件下过滤除菌，分装于2mL EP管中并于-20℃冰箱储存。

侵染液的配制：

200 μmol/L乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）：用适量DMSO溶剂溶解200 mg的乙酰丁香酮粉末，在10 mL容量瓶中定容；在无菌条件下，将溶液过滤除菌、分装，储存于-20℃冰箱备用；

10 mmol/L氯化镁（MgCl₂）：用适量无菌水溶解2.033 g的MgCl₂·6H₂O粉末，在10 mL容量瓶中定容；在无菌条件下，将溶液过滤除菌，分装，储存于-20℃冰箱备用；

10 mmol/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸（MES）：将1.95 g的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸固体粉末，完全溶于适量无菌水中，在10 mL容量瓶中定容（pH=5.5~5.7），将溶液在无菌条件下过滤除菌并分装，于-20℃的冰箱储存备用；

VIGS重悬液（100 mL）：分别取400 μL As (200 μmol/L)，2 mL MgCl₂(10 mmol/L)，2mL MES (10 mmol/L)加入到适量水中无菌水中，定容到100 mL。

磷酸缓冲液（Phosphate buffer，PB）的配制：

0.2 mol/L磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）：用适量无菌水将71.6 g的Na₂HPO₄·12H₂O粉末充分溶解，定容到1 L；

0.2 mol/L磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）：用适量无菌水将31.2 g的NaH₂PO₄·2H₂O粉末完全溶解，定容到1 L；

20 mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.2）：分别取配制好的28 mL磷酸氢二钠溶液、72 mL磷酸二氢钠溶液均匀混合。121℃灭菌20 min后，冷藏备用，在实验使用时按1：100的比例稀释成工作液。

实施例1

下述实施例主要以沉默陆地棉GhHLS1为例，就相关实验过程详细介绍如下。需要说明的是，TRV-VIGS体系中涉及有pTRV1、阳性对照pTRV2-GhCLA1、阴性对照pTRV2-GFP、实验组pTRV2-GhHLS1等载体，本实施例以pTRV2-GhCLA1载体为例（所构建载体结构可部分参考图3所示），就其构建过程详细介绍如下。其他载体参考其操作即可。

（一）提取RNA，并反转录为cDNA

因棉花组织中富含多糖多酚，因此采用FOREGENE公司的多糖多酚植物RNA快速提取试剂盒（Plant Total RNA Isolation Kit Plus），提取棉花组织的RNA，然后利用DNaseI消化去除DNA，再利用反转录试剂盒反转录为cDNA备用，具体操作介绍如下。

（1）棉花不同组织RNA的提取：

将500 μL PSL1 Buffer与10 μL β-巯基乙醇（自备）于2 mL RNase-Free离心管中均匀混合，以备后续使用；

称取适量的棉花叶片或根组织，用液氮研磨成细粉；将研磨好的粉末添加到事先准备好的含β-巯基乙醇的PSL1 Buffer中，将粉末与PSL1 Buffer混合均匀后在室温中放置5min（需注意：如果植物组织量过多，会导致提取的RNA质量下降；研磨完成后，应迅速转移植物组织粉末，因为在无冷冻环境下，RNA很容易发生降解）；

将100 μL PS Buffer加入到PSL1 Buffer与粉末的混合液中，均匀混合；如果发现组织裂解后的溶液中有比较明显的组织碎片或溶液过于粘稠，将组织裂解液12000 rpm离心5min，弃沉淀取上清；

将所有上清液转移到DNA-Cleaning Column中12000 rpm室温离心2 min；然后，移除DNA-Cleaning Column，保留过滤液（需注意：将上清液转移时，切勿吸到沉淀，以免造成不必要的影响）；

小心转移经过DNA-Cleaning Column离心的过滤液到2 mL新的RNase-Free离心管（自备）中，加入过滤液体积1.5倍的PSL2 Buffer（加入无水乙醇），均匀混合，以备后续RNA纯化过程使用，如果出现沉淀，就不能进行离心；

将750 μL混合液移至RNA-Only Column中，12000 rpm室温离心1 min，弃废液；

将RNA-Only Column放回收集管中，将剩余混合液全部加入RNA-Only Column中，12000rpm离心1 min，弃废液；

向RNA-Only Column中加入500 μL PRW1 Buffer，12000 rpm室温离心1 min，弃废液；

向RNA-Only Column中加入700 μL无水乙醇，12000 rpm室温离心1 min，弃废液；

向RNA-Only Column中加入700 μL PRW2 Buffer（含无水乙醇），12000 rpm室温离心1min，弃废液；重复一次；

将RNA-Only Column放回收集管中，12000 rpm空管离心2 min，弃掉收集管；

将RNA-Only Column转移至新的离心管中，在膜中央滴加入100 μL RNase-FreeddH2O，室温放置2 min，然后12000 rpm离心1 min收集RNA洗脱液，重复操作一次。

（2）RNA浓度及纯度检测

通过核酸微量测定仪检测提取的RNA的浓度与纯度；确保RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8~2.1之间。

（3）cDNA第一链的合成

RNA反转录所用试剂盒为Trans反转录试剂盒（TransScript One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix）。需要注意的是：因为模板是RNA，所以在加反转录体系的时候，需在RNase-Free管中进行，以免RNA在加样过程中发生降解。

20 μL反转录体系如下：

Total RNA，3.0 μL；

Anchored Oligo(dT)₁₈ Primer (0.5 µg/µL)，1.0 μL；

2×TS Reaction Mix，10.0 μL

TransScript RT/RI Enzyme Mix，1.0 μL

gDNA Remover，1.0 μL

RNase-freeWater，4.0 μL

快速混合均匀，42℃孵育30 min；反应结束后85℃加热5s失活TransScript RT/RI与gDNA Remover。

（二）设计引物，PCR扩增棉花GhCLA1基因，并回收扩增产物

参考已知拟南芥AtCLA1基因、AtHLS1基因序列，以及陆地棉（Gossypium hirsutum L）基因组序列，设计扩增用引物序列如下：

GhCLA1-F：5'-ACTAAAACAACGGGTCCGGTCTTGAT-3'，

GhCLA1-R：5'-AGGTTTCAAGCCTTCACAGGCCAA-3'；

扩增GhHLS1时，引物序列设计为：

GhHLS1-F：5'-GGAATTCCGTTGGTCCCAGTAGCG-3'，

GhHLS1-R：5'-GGGTACCCGGACGGCGTACGGAAC-3';

需要解释的是，所设计引物的5'端加入有限制性内切酶EcoRI和KpnI的酶切位点；

利用上述引物，以步骤（一）种所制备cDNA为模板进行PCR扩增，以获得目的基因GhCLA1（或GhHLS1）；

PCR扩增时，50 μL扩增体系设计如下：

10xTaq PCR Buffer with Mg²⁺，5.0 μL；

dNTP Mix（2.5 mM each），4.0 μL；

Forward Primer（10 μM），2.0 μL；

Reverse Primer（10 μM），2.0 μL；

棉花基因组cDNA，1.0 μL；

Taq DNA Polymerase（5 U/μL），0.25 μL；

RNase-Free Water，加至50 μL；

PCR反应程序：94℃预变性5 min，94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、70 s，35个循环；72℃终延伸5 min。取5 μl PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳分析检测条带大小是否正确（PCR扩增得到GhCLA1基因长度为421 bp，扩增GhHLS1基因长度434 bp），-20℃保存PCR产物。

对PCR扩增产物进行回收时，具体操作可参考如下：

称取切下的、含有目的片段的胶块重量；加入适量的V1缓冲液溶解胶块（需要注意：如果目的条带过长，再加入适量的V2溶液）；

放入55℃水浴锅中加热10 min，溶胶期间要间隔颠倒离心管几次，使胶块能均匀的溶解在缓冲液中。直至胶块被均匀溶解在缓冲液中，方可取出；

分批将溶胶液移至吸附柱中，室温静置3 min。常温下12000 rpm离心1 min，弃过滤液（需要注意：加入吸附柱的混合液不能超过吸附柱的最大容量，否则液体会益处）；

用600 μL的漂洗液W2冲洗柱子，常温下，12000 rpm离心1 min，弃过滤液；此步骤需重复一次；

常温下，12000 rpm空管离心2 min，将过滤柱移至新的离心管中，室温开盖放置5 min，蒸发多余的液体；

取30 μL预热的TE洗脱液加入吸附膜中，常温下放置2 min。然后12000 rpm离心1 min洗脱DNA，收集洗脱下来的过滤液。

（三）酶切、连接、并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞

将步骤（二）中所回收PCR扩增产物GhCLA1基因与病毒载体pTRV2分别经EcoRI和KpnI双酶切（37℃酶切2 h），然后利用用T4连接酶进行连接（16℃连接4 h），之后将连接产物转入大肠杆菌菌株DH5α，进行筛选、验证，提取获得病毒质粒pTRV2-GhCLA1。

感受态大肠杆菌DH5α细胞的制备可具体参考如下：

将大肠杆菌菌液加入到不含任何抗生素的液体培养基，置于37℃摇床中200 rpm活化12 h；将活化起来的大肠杆菌菌液按1：50的比例接种到无菌三角瓶中，置于37℃摇床中，200 rpm扩大培养，直至大肠杆菌的浓度为OD₆₀₀=0.5~0.8时，终止培养；

在无菌条件下，将扩大的大肠杆菌菌液分装到无菌的50 mL离心管中，置于冰中预冷20min。在4℃条件下，5000 rpm离心7 min，收集大肠杆菌细胞；

将CaCl₂提前预冷，用来悬浮富集的细胞。之后冰上放置30 min，在4℃下5000 rpm离心6 min，收集细胞；

在离心管中加入适量的CaCl₂和甘油溶液，将溶液与细胞混合均匀，分装并储存在超低温冰箱中。

大肠杆菌DH5α转化操作可具体参考如下：

先将转化所需的固体培养板倒置于37℃培养箱预热；将2 μL的质粒加入大肠杆菌感受态细胞中，混合均匀后冰上静置20 min；42℃水浴90 s，冰中放置2 min；在无菌条件下，向含质粒的感受态细胞中再加入适量的液体培养液，置于37℃摇床中，200 rpm培养1 h；

在无菌条件下，将活化好的菌液涂在预热的培养板上，完全干燥后封口，放于37℃培养箱中倒置培养12 h。

（四）将病毒质粒pTRV2-GhCLA1进一步转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液

将步骤（三）中转化、构建正确的大肠杆菌培养，并提取质粒后，进一步转化农杆菌GV3101感受态细胞（具体操作参考步骤（三）及现有常规操作技术即可），然后培养制备转染用菌液，具体培养方式参考如下：

分别挑取转染pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GFP、pTRV2-GhHLS1、pTRV1的农杆菌单菌落，加入到含有KN、Rif、Gen抗性的5ml YEB培养液中，28℃、200 rpm培养24 h；然后取1 ml上述菌液，加入到含有KN、Rif、Gen抗性的50 ml YEB培养液中，28℃、200 rpm扩大培养12 h，菌液浓度为OD₆₀₀=1.2~1.6；

分别将含有pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GFP、pTRV2-GhHLS1、pTRV1质粒的菌液倒入50 ml离心管中，8000 rpm离心6 min，弃上清，以富集菌落；

最后用配制好的重悬液（1 M MgCl₂、1 M MES、20 mg/mL AS）重悬富集的菌落至OD₆₀₀=1.2，避光放置3 h，此即为转染用菌液。

实施例2

在实施例1所制备转染用菌液基础上，将转染菌液先侵染烟草后再侵染棉花种子，以对相关基因沉默操作进行优化，具体实验过程及实验结果介绍如下。

（一）农杆菌介导的TRV-VIGS侵染烟草

先用针头轻轻触碰四周龄的烟草叶片背面造成微伤口，然后将实施例1所制备的pTRV2-GhCLA1、pTRV2-GFP、pTRV2-GhHLS1农杆菌重悬液分别与pTRV1农杆菌重悬液按1：1体积比混合，再用注射器通过伤口缓慢注入烟草叶片中并继续培养7 d左右。

（二）侵染棉花种子

首先，称取步骤（一）中1 g注射农杆菌重悬液并培养7 d的含病毒粒子的烟草叶片（注射叶或注射叶以上第一片系统叶都可以用来收集病毒均浆），将叶片剪碎放入研钵中（研钵需灭菌处理，以免造成污染），然后加入1 ml的pH=7.2的0. 2M磷酸缓冲液（PB），在研钵中将烟草叶片研磨成液体均浆，为了去除大物质用四层纱布将均浆过滤到烧杯中，过滤后的液体分装于2 ml离心管中，-20℃储存备用；

其次，将脱过绒的棉花种子浸泡在温水中破壳露白，之后将制备好的病毒液用无菌水按1：40的比列稀释成病毒侵染液，将发芽的棉花种子浸泡在病毒侵染液里黑暗培养3~4 d，温度维持在22~24℃，每天更换新的病毒侵染液；

最后，将侵泡在病毒液里的种子冲洗干净，移到含病毒液的潮湿蛭石中（每天需添加新的病毒液稀释液）共培养5~7 d，蛭石不宜过于潮湿，会影响种子萌发，保持湿度60~70%，温度22~24℃。直至长到棉花两片子叶完全展开，移至营养液中正常水培培养，保持湿度60~70%，温度22~24℃。两周左右出现基因沉默表型。

（三）指标测定及侵染力验证

实验过程中，通过局部枯斑实验、叶绿素含量及利用半定量PCR实验以对基因沉默效果进行评价，具体评价方法简介如下。

（1）局部枯斑实验检测侵染力

枯斑是指植物病毒感染植物叶片之后，会使感染部位的细胞快速死亡而形成局部坏死斑，是植物叶片上的植物病毒群体；

将收集的病毒液原液混合适当的金刚砂摩擦接种于烟草叶片中，同时用水混合金刚砂后用同样的方法接种烟草叶片作为对照；

接种之后用水把接种过病毒的叶片清洗干净，保持湿度在60%左右，接种后约3~4 d出现枯斑现象。

（2）棉花叶片中叶绿素含量的测定

用丙酮：无水乙醇：水（体积比为4.5：4.5：1）混合均匀后配制成叶绿素提取液；

分别取野生型陆地棉植株叶片、TRV-GhCLA1农杆菌叶注射法侵染植株叶片、TRV-GhCLA1病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染植株叶片各0.5 g，将叶片剪成细丝状放入试管中；

加5 ml提取液，用塞子塞好试管口，17℃黑暗条件下放置过夜，待细丝完全变白，取上清，以提取混合液作对照，测定在645 nm和663 nm波长处的吸光值，通过Arnon公式算得叶绿素的含量（mg·g^-1 FW）；

叶绿素a=（12.7 D663-2.69 D645）V/（1000×W）；

叶绿素b=（22.9 D645-4.68 D663）V/（1000×W）；

叶绿素总含量=（20.2 D645+8.02 D663）V/（1000×W）；

其中V代表叶绿素提取液体积（mL）；W为取的叶片鲜重（g）

（3）定量PCR检测沉默效率

分别提取野生型陆地棉植株叶片RNA、TRV-GhCLA1农杆菌叶注射法侵染植株叶片RNA、TRV-GhCLA1病毒液泡种子法侵染棉花叶片的RNA，反转录成cDNA当模板，以GhUBQ7做内参基因，对GhCLA1基因表达情况进行定量。

（四）实验结果

（1）农杆菌TRV-GhCLA1侵染不同品种烟草的差异

本实验施例中选用本氏烟草和普通烟草两个品种进行实验，实际培养及操作中，由于普通烟草的叶片比本氏烟草的宽大且肥厚且易注射，一次可收集大量的TRV病毒匀浆（如图1所示）；而本氏烟草的叶片较薄，注射之后叶片易发生枯萎甚至死亡的现象，因此，普通烟草是较好操作对象。另一方面，从侵染后的叶片中可以看出普通烟草叶片上出现较多的病毒枯斑，而本氏烟草的叶片上出现较少的病毒枯斑（图1、图2均为侵染并培养7d后结果）。从这一结果可以看出，普通烟草叶片收集的病毒匀浆沉默效率更高，更适合用来收集TRV病毒匀浆，因此我们后续的实验均选用普通烟草进行操作。

需要解释的是，本氏烟草是很好的收集病毒的宿主植物，只是叶片相对小而薄，容易出现叶片死亡的现象；而普通烟草相较于模式生物本氏烟草拥有宽大肥厚的叶片，一次可收集大量的病毒均浆，而且叶片不会发生叶片坏死现象，收集的病毒匀浆侵染力较强，比较适合作为病毒繁殖的宿主植物。

（2）TRV农杆菌侵染烟草的最佳浓度和侵染时间

选用六叶期的普通烟草，用叶注射法将TRV农杆菌菌液投送到烟草叶片中进行病毒的复制、繁殖、装配。实验结果表明，农杆菌侵染普通烟草叶片的浓度为OD₆₀₀=1.2之间最佳（如图4所示）。农杆菌浓度太低，起不到病毒大量繁殖的效果；农杆菌浓度太高，易导致叶片枯萎死亡。

而TRV农杆菌分别在普通烟草叶片中生长3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d结果如图5所示。可以看出，综合而言，TRV病毒在烟草叶片中生长7 d后的侵染效果最好。若生长天数太少，病毒繁殖的浓度不够，侵染的效率下降，若生长的天数过长，病毒开始移动，发挥沉默效果，收集的病毒匀浆的沉默效率就会大大下降。因此，只有TRV载体病毒在烟草叶片中侵染合适的天数，即可以依靠宿主复制繁殖出更多的病毒，也不会在烟草中发挥沉默效果。

（3）TRV病毒的检测和局部枯斑实验验证TRV病毒侵染力

将TRV农杆菌菌液侵染烟草7 d之后，提取烟草叶片的总RNA，反转录之后进行RT-PCR检测烟草叶片中是否含有TRV1和TRV2片段。实验对照为野生型烟草叶片。

结果发现在野生型烟草叶片中不含有TRV1和TRV2片段，而在经TRV侵染后的烟草叶片中含有TRV1和TRV2片段（结果如图6所示）。

同时我们对种子吸涨法侵染过后的棉花叶片进行TRV1和TRV2片段的检测。实验对照为野生型的棉花叶片。

结果发现：在野生型棉花叶片中不含有TRV1和TRV2片段，而经种子吸涨法处理的棉花植株叶片中含有TRV1和TRV2片段（如图6所示）。

这些结果说明种子吸涨法接种具有有效性和可行性。

进一步地，对检测过TRV病毒的烟草叶片提取病毒匀浆，并对病毒匀浆的侵染力利用局部枯斑实验进行验证。具体而言：选取一株未经处理的普通烟草，在同一烟草叶片中分别用水和TRV病毒匀浆混合金刚砂摩擦接种烟草叶片；接种后，用清水冲洗干净，保持叶片湿度，黑暗培养1 d，之后转入正常光照生长3-4 d。

结果发现接种TRV病毒匀浆的烟草叶片长出病毒枯斑，而对照组接种水的烟草叶片未出现病毒枯斑，说明TRV病毒匀浆具有侵染力（如图7所示）。

（四）利用TRV病毒液分别侵染棉花叶、根、种子，以沉默GhCLA1基因

将收集的TRV病毒原液稀释成侵染液以后，分别用叶注射法侵染棉花子叶，根吸收法侵染棉花根部，种子吸涨法侵染萌发的棉花种子。

叶注射法是将病毒原液稀释100倍，用针头在棉花子叶背面造成微伤口，之后用注射器将稀释过的病毒液通过微伤口注射入棉花子叶中，直至病毒匀浆充满整个叶片。侵染后在叶片上喷洒适量的水，盖上塑料盖子，保持叶片湿度，湿度维持在60~75%。侵染约两周之后得到沉默表型，叶注射法侵染之后的植株在真叶和茎中均呈现白化表型（如图8所示）。与农杆菌叶注射法沉默效率相比，病毒匀浆介导的叶注射法沉默效率稍微有所提高，而且省去了农杆菌侵染前的准备工作，可直接使用收集好的病毒均浆进行侵染。

根吸收法是将病毒原液稀释50倍，将一周龄的幼苗的根部插入到稀释液中，黑暗培养3~4 d，每天更换稀释液一次。侵染后移入正常水培培养，两周左右出现沉默表型。如果对根部制造微伤口，易出现幼苗死亡的现象；如果不制造微伤口，病毒很难侵染进入植物体内，达不到沉默的效果，所以导致沉默效率较低（图9）。农杆菌介导的根吸收法侵染幼苗很难达到基因沉默的目的。而使用病毒匀浆介导的根吸收法相较于农杆菌介导的根吸收法而言，沉默效率要高，并且可以直接使用制备好的病毒液侵染。

种子吸涨法侵染是将病毒原液稀释40倍之后，将萌发的种子浸泡在稀释过的病毒匀浆中，黑暗培养3~4 d。之后将病毒匀浆浸泡过的种子冲洗干净，移入含有病毒的蛭石中，继续共培养5~7 d，直至棉花的两片子叶完全展开，移入正常水培培养，约两周左右出现沉默现象。农杆菌介导的种子吸涨法相对于Si-VIGS而言，沉默效率要低。而且农杆菌介导的种子吸涨法还需抽真空和种子脱壳处理，培养基生长等复杂的操作。Si-VIGS法只需将发芽的种子浸泡在病毒侵染液中3~4天，之后移到蛭石中与病毒共培养即可。

利用种子吸涨法接种之后的植株真叶为黄白状表型，与叶注射法的表型稍有差异。在种子吸涨法的叶片中叶脉呈绿色，叶肉细胞呈黄近白状（图10）。

（五）利用Si-VIGS沉默GhCLA1后基因表达量和叶绿素含量降低

分别取TRV-GFP棉花植株叶片RNA，病毒匀浆介导的注射法侵染的TRV-GhCLA1棉花植株叶片RNA，病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染的TRV-GhCLA1棉花植株叶片RNA，使用RT-PCR的方法对GhCLA1基因的表达量进行检测（如图11上图所示）。

结果发现：无论是病毒匀浆介导的叶片注射法，还是种子吸涨法均能高效沉默GhCLA1基因，说明种子吸涨法完全可以达到基因沉默的目的（如图11下图所示），而且表型统一（如图11中图所示）。

具体通过种子吸涨接种农杆菌和病毒沉默GhCLA1基因的效率统计数据如下表所示：

。

分别取病毒匀浆介导的叶注射法侵染植株的阴性对照TRV-GFP植株叶片，阳性对照TRV-GhCLA1的植株叶片以及病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染之后的TRV-GhCLA1植株叶片进行叶绿素含量测定。

实验结果表明：病毒匀浆介导的种子吸涨法侵染的TRV-GhCLA1植株叶分片叶绿素含量与对照组TRV-GFP相比明显降低，与用病毒匀浆介导的叶注射法的相比叶绿素含量稍高（图12），但是并不影响基因沉默的效率。这些结果说明种子吸涨法可以有效沉默目的基因，可以作为研究基因功能的一种方法。

（六）Si-VIGS法沉默条件优化

我们选用了发芽棉花种子与不发芽棉花种子两种类型的种子进行实验（图13），用稀释的病毒匀浆接种萌发与不萌发的棉花种子，结果发现萌发的棉花种子有更好的沉默效率。分别用稀释的病毒匀浆接种萌发的棉花种子之后，在蛭石中共培养至幼苗子叶完全展开，移至正常水培液中正常生长。结果发现萌发的棉花种子的沉默效率要比未萌发的棉花种子的沉默效率高。实验结果说明有裂口的种子更容易被侵染，种子萌发造成的自然伤口，既不会对种子自身造成伤害，也可以使病毒侵染进入种子内部。而未萌发的种子种壳坚硬、没有裂缝，病毒液难以侵染。

病毒匀浆的浓度是种子吸涨法的沉默效率的重要因素之一。我们的实验分别将病毒原液稀释20、40、60、80、100倍之后侵染萌发的棉花种子，结果发现被稀释40倍的病毒匀浆沉默效率最高。病毒匀浆稀释之后，浓度太低，沉默效率下降；浓度太高，种子的萌发率减少（图14），都会造成沉默效率的下降。所以对于种子吸涨法而言，合适的病毒匀浆浓度是必须的，决定了种子的萌发率和沉默效率。

种子在病毒匀浆中浸泡的天数也是基因沉默效果的一个因素。分别将棉花种子在病毒匀浆里泡1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，经实验证明棉花种子在病毒匀浆里接种3-4 d的沉默效率最高（图15）。浸泡种子天数太少，病毒未能进入或进入量不够，不能引起沉默效应；浸泡种子太多，种子萌发率降低，造成沉默效率下降。所以合适的接种天数对种子吸涨法而言十分重要，影响沉默的效率。

种子在蛭石中与病毒匀浆共培养对基因的沉默也很重要。在含病毒的蛭石中共培养3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，结果证明在蛭石中长5-7 d的沉默效率最高（图16）。分别统计病毒匀浆接种过的种子与含病毒匀浆的蛭石共培养和不含病毒的蛭石共培养之后的沉默效率。结果发现与含病毒的蛭石共培养的棉花植株，沉默效率要高于不经含病毒的蛭石共培养植株。所以蛭石共培养对种子吸涨法而言是必要的，可以有效提高沉默效率。

综合上述实验结果说明病毒匀浆稀释40倍，接种棉花种子天数为3 d以及病毒匀浆与蛭石共培养5 d的条件下对于沉默效率是最高的。在合适的侵染条件下，利用病毒匀浆接种棉花种子可有效沉默目的基因，省时省力且表型统一（总体过程如图17所示）。

（七）利用Si-VIGS法沉默GhHOOKLESS1基因抑制棉花幼苗顶端弯钩的形成

传统的叶注射法要等到子叶完全展开才可以进行注射侵染，而种子吸涨法提前了侵染的时间，可以研究更前期的基因。

HOOKLESS1（HLS1）是一种乙烯反应基因，对下胚轴的差异细胞伸长至关重要。HOOKLESS1编码具有与N-乙酰转移酶类似的序列的蛋白质，已经鉴定出在外源乙烯应用的情况下表现出完全丧失钩形成功能。顶端弯钩对于幼苗出土至关重要，而HLS1调控顶端弯钩的形成。

双子叶植物幼苗在出土时会形成顶端弯钩，该结构位于子叶的下部和下胚轴的顶部，可以保护幼小的子叶和顶端分生组织免受伤害，确保幼苗安全出土。幼苗顶端弯钩的形成是因为下胚轴顶端的细胞生长、分裂、延伸不均匀导致的，使得弯钩内侧细胞的生长速度小于外侧。在植物幼苗出土见光以后，弯钩内侧的细胞将会迅速生长，弯钩现象也随之消失。

其中，HOOKLESS1（HLS1）基因参与了乙烯途径，调节着下胚轴细胞的差异生长，而乙烯通过调控顶端分生组织中内侧与外侧细胞的分裂速度来促进幼苗弯钩的形成。除此之外，HOOKLESS1基因发挥着传递乙烯和生长素信号的作用，还参与编码了N-乙酰转移酶。在拟南芥hls1突变体中，幼苗不表现顶端弯钩现象，且无法恢复该表型，说明生长素无法从幼苗顶部运输到下部。因为顶端弯钩影响了幼苗的出土，所以在植物的生长过程中显得尤为重要，而GhHLS1基因调节并控制了顶端弯钩的形成，因此，通过沉默GhHLS1基因，研究该基因对顶端弯钩的影响具有实际意义。

我们构建了pTRV2-GhHLS1沉默载体，在普通烟草叶片中复制繁殖之后收集病毒匀浆。将收集的病毒匀浆按种子吸涨法最佳条件对萌发的棉花种子进行接种，对照组为TRV-GFP。结果发现利用Si-VIGS法沉默GhHLS1基因的棉花幼苗没有产生顶端弯钩，而对照组则出现顶端弯钩现象（如图18所示）。由于幼苗期植株生长较快，应尽量控制温度，以免幼苗生长过快，错过弯钩现象。具体统计结果如下表所示：

。

综上所述，比较三种方法的侵染效率可以看出：种子吸涨法能更高效统一，方便快捷的达到基因沉默的目的。虽然沉默表型与叶注射法稍有不同，但是完全可以达到基因沉默的目的。相较于叶注射法和根吸收法而言，种子吸涨法可以省去繁琐的注射过程，操作简单，而且对设备的要求很低。种子吸涨法可以沉默种子发芽阶段的基因，将侵染的时间从幼苗期提前到种子发芽期，打破了侵染在时间上的局限性。植株的苗龄影响基因的沉默效率，越幼嫩的植株越容易出现基因沉默表现，而我们的方法将侵染时间提前到种子阶段。此外，病毒匀浆比农杆菌重悬液接种的侵染力更好、沉默效果更高、表型更统一，且减少了大量繁琐的工作。

TRV病毒系统在棉花中常用的接种方法是叶注射法，这种方法在棉花中的应用已经非常成熟，具有较高的沉默效率。但是，叶注射法也存在一定的不足，如对棉花子叶造成很大的伤害，使子叶过早的脱落，影响基因的沉默效率。此外，叶注射法虽然在真叶中沉默表型较好，但是在子叶以下的部分沉默效果不佳。而且，叶注射法要等到棉花的子叶期才进行侵染，无法研究幼苗早期发育相关的基因功能。实验结果表明，植物幼苗较容易被病毒感染，这可能是由于病毒在植物中的复制、扩散程度较强所导致的。因此，为高效研究幼苗早期发育的基因功能，优化和修饰了一种Si-VIGS方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

ggaattccgt tggtcccagt agcg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

gggtacccgg acggcgtacg gaac 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

actaaaacaa cgggtccggt cttgat 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 4

aggtttcaag ccttcacagg ccaa 24

Claims

1.一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（一）制备转染用菌液

针对待沉默的目的基因，通过病毒质粒介导转化农杆菌菌株GV3101，制备转染用菌液；

（二）利用烟草进行扩增

将步骤（一）中的转染用菌液接种烟草叶片，并进行培养，收集含病毒粒子的烟草叶片并制备成病毒侵染液；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发后，用步骤（一）中转染菌液在22~24℃条件下，避光浸泡培养1 d；然后移到潮湿蛭石培养3 d；或用步骤（二）中病毒侵染液在22~24℃条件下，避光浸泡培养3 d；然后移到潮湿蛭石培养共培养5~7 d。

2.如权利要求1所述棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，步骤（二）中，所述烟草，为本氏烟草或普通烟草品种。

3.如权利要求1所述棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，步骤（一）中，所述待沉默的目的基因为陆地棉GhHLS1基因或GhCLA1基因。

4.如权利要求3所述棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法Si-VIGS，其特征在于，针对待沉默的目的基因为陆地棉GhHLS1基因或GhCLA1基因，棉花发芽及幼苗阶段的基因沉默方法的具体步骤为：

（一）制备转染用菌液

（1）提取棉花叶片RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）设计引物，PCR扩增棉花，并回收扩增产物；

扩增GhHLS1时，引物序列设计为：

GhHLS1-F：5'-GGAATTCCGTTGGTCCCAGTAGCG-3'，

GhHLS1-R：5'-GGGTACCCGGACGGCGTACGGAAC-3；

扩增GhCLA1时，引物序列设计为：

GhCLA1-F：5'-ACTAAAACAACGGGTCCGGTCTTGAT-3'，

GhCLA1-R：5'-AGGTTTCAAGCCTTCACAGGCCAA-3'；

（二）利用烟草进行扩增

利用注射器，通过烟草叶片上的伤口缓慢注入步骤（一）中的转染用菌液，并继续培养7d；

收集含病毒粒子的烟草叶片，将叶片剪碎后加入磷酸缓冲液，研磨成液体匀浆，过滤备用；

（三）侵染棉花种子

将脱绒棉花种子浸泡萌发后，用步骤（一）中转染菌液在22~24℃条件下，避光浸泡培养1 d；然后移到潮湿蛭石培养3 d；或用步骤（二）中病毒侵染液在22~24℃条件下，避光浸泡培养3 d；然后移到潮湿蛭石培养共培养5~7 d；具体而言：

培养过程中，保持湿度60-70%，温度22-24℃；针对种子发芽过程基因沉默，移到潮湿蛭石后培养3 d；针对种子幼苗发育过程基因沉默，培养棉花种子长到两片子叶完全展开后，移至正常条件下培养。