CN113444738B - 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 - Google Patents
棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113444738B CN113444738B CN202110692128.9A CN202110692128A CN113444738B CN 113444738 B CN113444738 B CN 113444738B CN 202110692128 A CN202110692128 A CN 202110692128A CN 113444738 B CN113444738 B CN 113444738B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- cotton
- ghgols2
- vigs
- silencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 title abstract description 31
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 title abstract description 9
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims abstract description 47
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims abstract description 22
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 claims description 7
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000018322 upland cotton Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 abstract description 10
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 abstract 3
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 7
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 7
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 5
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 4
- 244000070990 Gomphocarpus physocarpus Species 0.000 description 3
- 235000004342 Gossypium thurberi Nutrition 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 3
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 3
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N galactitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-GUCUJZIJSA-N 0.000 description 2
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010036618 Galactinol-raffinose galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
- C12N15/8267—Seed dormancy, germination or sprouting
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01123—Inositol 3-alpha-galactosyltransferase (2.4.1.123), i.e. galactinol-synthase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
本发明公开了一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用，棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用，棉花GhGOLS2基因作为Si‑VIGS沉默系统阳性对照的应用。本发明通过使用携带TRV‑GhGOLS2载体的两种侵染液分别浸染棉花种子，结果证明两种浸染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因，并降低棉花种子的萌动率，病毒匀浆侵染液的沉默效果好于农杆菌侵染液的沉默效果，证明棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。本发明证明GhGOLS2基因可以作为Si‑VIGS种子萌发早期基因沉默研究，方便研究人员应用Si‑VIGS方法研究基因功能。
Description
技术领域
本发明属于棉花育种技术领域，具体涉及到一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
背景技术
种子中的糖被认为是参与调节并影响种子发育过程的信号，其中，棉子糖家族低聚糖（Raffinose family oligosaccharides，RFOs）在大多数植物的种子成熟过程中积累，半乳糖醇合成酶（GALACTINOL SYNTHASE, GOLS）、棉子糖合成酶（棉子糖合成酶，RS）和水苏糖合成酶（STACHYOSE SYNTHASE, STS）是植物RFO生物合成的主要酶。研究人员通过在转基因拟南芥或烟草植物中表达多种GOLS基因，发现普遍增加了半乳糖醇和棉子糖的含量，同时增强了植物非生物胁迫的耐受性，这使得GOLS基因得到了广泛的研究。2016年，Vidigal等人在黄瓜中突变了GOLS2基因后发现，半乳糖醇含量的减少与种子寿命的降低相符，因此他们认为GOLS2是种子寿命的合适生物标记。
专利公开了一种名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489，本专利通过ESTs库构建了大量pTRV2瞬时沉默载体，使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理，通过观察棉花种子以及幼苗表型，发现其中一套瞬时沉默载体出现抑制棉花种子发芽的表型，随后对此套pTRV2瞬时沉默载体进行了基因测序，将测序结果在陆地棉全基因组序列中进行BLAST搜索，发现瞬时沉默载体中的基因片段与GhGOLS2基因CDS序列信息吻合，初步判断GhGOLS2基因被沉默后会抑制棉花种子的萌发。Si-VIGS是一种简单、快速以及高通量地病毒介导的基因沉默方法，能够在当代获得沉默植株。Si-VIGS提前了VIGS的侵染时期，可以研究种子以及幼苗早期生长发育以及地下部相关的基因。Si-VIGS方法缩短了基因沉默机制诱发的时间，进而缩短了实验周期。在常用的VIGS方法方法中，研究人员选择GhCLA基因作为阳性对照，因为GhCLA基因一旦被沉默，将在7 d后在棉花叶片上出现光漂白表型，这一白化表型非常稳定，因此GhCLA基因常被用作传统VIGS方法的阳性对照，而Si-VIGS方法将VIGS的作用时间提前，此时棉花子叶还未打开，沉默后能够使叶片白化的GhCLA基因无法在Si-VIGS方法中作为阳性对照。因此Si-VIGS方法急需寻找适合的阳性对照。GhGOLS2基因被沉默后，表现为种子萌动率下降，这个表型相对比较直观，便于研究人员辨认，并且使用Si-VIGS的方法沉默GhGOLS2基因的结果比较统一且稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：
通过沉默GhGOLS2基因可降低棉花种子的萌发率，所述GhGOLS2基因的序列是以陆地棉Z79基因组为模板通过引物GhGOLS2FL-F: 5'-ATGGAAGGTGTTGCCATCGCCAAG -3'、GhGOLS2FL-R: 5'-AGCAGCAGAGGGGGCGTTAATATA -3'扩增所得。
本发明的有益效果如下：
（1）本发明通过使用携带TRV-GhGOLS2载体的两种侵染液分别浸染棉花种子，结果证明两种浸染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因，并降低棉花种子的萌动率，病毒匀浆侵染液的沉默效果好于农杆菌侵染液的沉默效果，证明棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
（2）本发明证明GhGOLS2基因可以作为Si-VIGS种子萌发早期基因沉默研究，方便研究人员应用Si-VIGS方法研究基因功能。
附图说明
图1是对棉花GhGOLS2PCR扩增结果。
图2是pTRV2-GhGOLS2质粒酶切验证结果。
图3是在农杆菌侵染液处理下TRV-GFP载对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图4是在病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图5是在农杆菌侵染液与病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花种子萌动率。
图6是在农杆菌侵染液与病毒匀浆侵染液处理下TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花中GhGOLS2基因的表达水平。
图 7是Si-VIGS处理棉花种子后GhGOLS2基因表达分析。
图8是Si-VIGS处理Z79、ZG5、Z9807三种不同品种棉花种子后TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株表型。
图9是Si-VIGS处理Z79、ZG5、Z9807三种不同品种棉花种子后TRV-GFP对照与沉默了GhGOLS2基因后的棉花中GhGOLS2基因的表达水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例的棉花GhGOLS2基因的制备方法如下：
棉花GhGOLS2基因的CDS序列设计全长引物：
GhGOLS2FL-F: 5'-ATGGAAGGTGTTGCCATCGCCAAG -3'
GhGOLS2FL-R: 5'-AGCAGCAGAGGGGGCGTTAATATA -3'
使用TAKARA 公司的dNTP、DNA Polymerase和DNA Polymerase Buffer 进行基因扩增，扩增全长993bp；使用AXYGEN公司 DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收，回收后将全长基因连入Ti载体中进行测序。
本实施例pTRV2-GhGOLS2瞬时沉默载体构建方法如下：
根据棉花GhGOLS2基因的CDS序列信息，设计基因沉默片段的特异性引物，设计的引物序列为：
GhGOLS2-F：5＇-GGAATTCGACCCAGTTTGCC-3＇
GhGOLS2-R：5＇-GGGTACCACCAAGTTGTAAATTG-3＇，
并在引物的两端分别加入限制性核酸内切酶KpnI和EcoRI。沉默片段位于GhGOLS2开放阅读框的中间区域，扩增片段长度为441 bp。以陆地棉Z79的根部cDNA为模板进行PCR扩增，如图1所示，得到一条441 bp的目的条带，连接到pTRV2载体，酶切验证重组质粒pTRV2-GhGOLS2的正确性，如图2所示，其中载体片段为9663 bp，目的片段为441 bp。将经过酶切验证正确的重组质粒进行测序，将序列比对正确的pTRV2-GhGOLS2瞬时沉默载体转化到GV3101农杆菌细胞中。
实施例1
实验一、发明人通过以下实验验证GOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用。
本实验分别使用两种侵染液：农杆菌侵染液（Aagrobacterium）、病毒匀浆侵染液（Virus sap）；
实验对象：以TRV-GFP对照棉花植株为对照组、以沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株为实验组；
使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理的具体步骤在专利名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489中已经公开。
如图3-4所示，通过Si-VIGS法侵染露白的陆地棉种子，侵染液侵染1 d 后转入潮湿的蛭石培养5 d，待培养5 d 后，对幼苗进行了表型观察，实验结果表明，两种侵染液使用Si-VIGS方法处理棉花种子后，沉默了GhGOLS2基因的棉花种子的萌动均受到显著抑制。
如图5所示，对照组以及实验组棉花种子的萌动率进行了统计，统计结果显示：以农杆菌作为侵染液时，对照组棉花种子的萌动率为77%，实验组棉花种子的萌动率下降至18%；以病毒匀浆作为侵染液时，对照组棉花种子的萌动率为79%，实验组棉花种子的萌动率则为13%。
如图6所示，为了证明GhGOLS2基因确实被沉默，又进一步检测了对照组和实验组的棉花种子中的GhGOLS2基因的表达水平。荧光定量PCR的结果显示，两种侵染液通过Si-VIGS法均能够造成棉花种子中GhGOLS2基因的沉默，从而造成棉花种子萌动率降低的表型。其中病毒匀浆作为侵染液时，棉花幼苗（种子）中的GhGOLS2基因表达水平下降最为显著。
综上所述，两种侵染液都可以有效沉默棉花GhGOLS2基因，并降低棉花种子的萌动率，并且病毒匀浆作为侵染液的沉默效果要好于农杆菌作为侵染液的沉默效果。
为了进一步研究棉花种子中GhGOLS2基因的表达水平，确定Si-VIGS方法能够在早期实现基因沉默，本实验对不同生长时期的棉花种子进行了实时荧光定量PCR。
实验对象：选择了状态基本相同的陆地棉种子分为三组：分别为野生型组WT、
携带TRV-GFP对照的侵染液为对照组、携带TRV-GhGOLS2载体的侵染液为实验组；
使用实验一中农杆菌侵染液和病毒匀浆侵染液通过Si-VIGS的方法侵染棉花种子，分别侵染0 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h，以及放入潮湿蛭石培养2 d、3 d、4 d和5d 的棉花种子为模板，提取了RNA，将提取的RNA反转录成cDNA，以这些cDNA为模板进行qPCR。
如图7所示，未经过任何处理的野生型棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平随着时间的推移而显著升高，在培养3 d 时野生型棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平约为培养0h时的40倍，对照组棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平与野生型的变化基本一致；使用Si-VIGS方法沉默了GhGOLS2基因的棉花种子中的GhGOLS2基因表达水平在侵染6 h 后开始降低，在培养5 d 时，GhGOLS2基因表达水平已经降低了80%以上，其中病毒匀浆作为侵染液时，GhGOLS2基因表达水平降低了99%。
综上所述，Si-VIGS方法在处理6 h 后实现基因沉默，提前了Si-VIGS方法作用的时间。
实施例2
实验二、发明人通过以下实验验证棉花GhGOLS2基因作为Si-VIGS沉默系统阳性对照的应用
本实验分别使用病毒匀浆侵染液（Virus sap）；
实验对象：选择Z79、ZG5、Z9807三种不同遗传背景的棉花品种，以TRV-GFP载体棉花植株为对照组、以沉默了GhGOLS2基因后的棉花植株为实验组、；
使用Si-VIGS方法对棉花种子进行处理的具体步骤在专利名称为“一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS”，专利号为CN201910414489中已经公开。
如图8所示，通过Si-VIGS法分别侵染Z79、ZG5、Z9807三种品种的露白的陆地棉种子，侵染液侵染1 d 后转入潮湿的蛭石培养5 d，待培养5 d 后，对幼苗进行了表型观察，实验结果表明，使用Si-VIGS方法处理棉花种子后，沉默了GhGOLS2基因的不同品种的棉花种子的萌动均受到显著抑制。
如图9所示，为了证明不同品种的棉花种子中GhGOLS2基因确实被沉默，又进一步检测了对照组和实验组的棉花种子中的GhGOLS2基因的表达水平。荧光定量PCR的结果显示，通过Si-VIGS法均能够造成棉花种子中GhGOLS2基因的沉默，从而造成棉花种子萌动率降低的表型。
综上所述，沉默棉花GhGOLS2基因，能够在多种棉花品种中稳定降低棉花种子的萌动率，这种稳定且便于观察的表型使GhGOLS2基因成为Si-VIGS法的合适的阳性对照。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用，其特征在于：通过沉默GhGOLS2基因可降低棉花种子的萌发率，所述GhGOLS2基因的序列是以陆地棉Z79基因组为模板通过引物GhGOLS2FL-F: 5'-ATGGAAGGTGTTGCCATCGCCAAG -3'、
GhGOLS2FL-R: 5'-AGCAGCAGAGGGGGCGTTAATATA -3'扩增所得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110692128.9A CN113444738B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110692128.9A CN113444738B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113444738A CN113444738A (zh) | 2021-09-28 |
| CN113444738B true CN113444738B (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=77812164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110692128.9A Expired - Fee Related CN113444738B (zh) | 2021-06-22 | 2021-06-22 | 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113444738B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115873889B (zh) * | 2022-04-22 | 2023-07-14 | 南通大学 | 一种SsGolS2基因在提高植物抗旱性中的应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107841512A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-03-27 | 西北农林科技大学 | 利用植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用 |
| CN108164588A (zh) * | 2017-11-21 | 2018-06-15 | 郑州大学 | 棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用 |
| US10064373B1 (en) * | 2017-12-08 | 2018-09-04 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Cotton cultivar UA 107 |
| CN109762795A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-05-17 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种抗旱相关的芝麻基因SiGolS2及其应用 |
| KR20190083578A (ko) * | 2018-01-04 | 2019-07-12 | 한국해양과학기술원 | 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 |
| CN110172473A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-27 | 郑州大学 | 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS |
| CN110452917A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-15 | 河南科技大学 | 野葡萄VyGOLS基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 |
-
2021
- 2021-06-22 CN CN202110692128.9A patent/CN113444738B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107841512A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-03-27 | 西北农林科技大学 | 利用植物棉子糖合成通路提高种子活力及耐贮性的应用 |
| CN108164588A (zh) * | 2017-11-21 | 2018-06-15 | 郑州大学 | 棉花转运蛋白GhBASS5基因在植物耐盐中的应用 |
| US10064373B1 (en) * | 2017-12-08 | 2018-09-04 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Cotton cultivar UA 107 |
| KR20190083578A (ko) * | 2018-01-04 | 2019-07-12 | 한국해양과학기술원 | 식물의 환경 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 |
| CN109762795A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-05-17 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种抗旱相关的芝麻基因SiGolS2及其应用 |
| CN110172473A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-08-27 | 郑州大学 | 一种棉花早期基因沉默方法Si-VIGS |
| CN110452917A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-15 | 河南科技大学 | 野葡萄VyGOLS基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A newly established virus-induced gene silencing method via seed imbibition for functional genomics at early germination stages in cotton;Gongyao Shi et al.;《Industrial Crops & Products 》;20210915;第172卷;第1-12页 * |
| TRV病毒介导的基因沉默体系在新疆陆地棉和亚洲棉中的建立;刘慧等;《棉花学报》;20161231;第28卷(第05期);第485-492页 * |
| 大豆GmGolS2基因启动子的克隆及功能分析;李涵哲等;《基因组学与应用生物学》;20151231;第34卷(第12期);第2683-2689页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113444738A (zh) | 2021-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumagai et al. | Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules | |
| CN111118005B (zh) | 一种与稻瘟病抗性相关的miRNA、相应的前体与应用 | |
| CN113444738B (zh) | 棉花GhGOLS2基因在控制棉花种子萌发中的应用 | |
| CN117025626A (zh) | 烟草硝酸盐转运蛋白NtNPF7.4及其编码基因、基因编辑载体和应用 | |
| CN108795944B (zh) | 棉花长链非编码RNA-lnc973及其在植物耐盐性中的应用 | |
| CN111041043A (zh) | 基于CRISPR/Cas9编辑本氏烟基因的载体及其构建方法和应用 | |
| CN107177608B (zh) | 一种调控中山杉耐水淹特性的Thadh4基因及其应用 | |
| CN115976052A (zh) | 小麦茎基腐病抗性基因TaHSP18．6、其表达产物、重组载体及应用 | |
| CN112175990B (zh) | 阻断或减弱水稻circRNA编码位点的表达以提高水稻苗期生长性状的方法 | |
| CN108424910B (zh) | 一种用于目的基因干扰的rna片段及其应用 | |
| CN113416735B (zh) | 一种烟草生殖细胞特异高表达基因及应用 | |
| CN115806979A (zh) | 拟南芥长链非编码rna-dana1及其在植物干旱耐受性的应用 | |
| CN115851761A (zh) | 一种烟草类扩展蛋白基因NtEXLA2及其应用 | |
| CN115772212A (zh) | 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用 | |
| CN114107305A (zh) | 一种低温诱导型增强子及其在植物低温诱导时增强基因表达中的应用 | |
| CN110904109B (zh) | 控制水稻种子萌发的miR1866基因、过表达载体、gRNA表达载体、制备方法及其应用 | |
| CN108823221B (zh) | 兴安落叶松LgUGPase基因启动子序列及其在植物遗传改良中的应用 | |
| CN108753777B (zh) | 一种具有花药组织特异性的启动子及其应用 | |
| CN112795589A (zh) | 一种抑制烟叶烘烤变黑的非转基因混合侵染方法及其应用 | |
| CN111909956A (zh) | 阻断或减弱水稻OsNAC092基因表达以提高水稻抗旱性的方法 | |
| CN117327712B (zh) | 一种通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法 | |
| CN117402877B (zh) | 长链非编码rna natal57在调节水稻产量相关性状中的应用 | |
| CN118360322B (zh) | Hox32基因在提高植物高光耐受性中的应用 | |
| CN112725361B (zh) | 与烤烟挂灰相关的基因及其应用 | |
| CN113493787B (zh) | 一种阻断或减弱水稻OsMIR7695表达以改良籽粒性状的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20220705 |