CN112175990B - 阻断或减弱水稻circRNA编码位点的表达以提高水稻苗期生长性状的方法 - Google Patents

阻断或减弱水稻circRNA编码位点的表达以提高水稻苗期生长性状的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及阻断或减弱水稻circRNA编码位点表达以提高苗期生长性状的方法。本发明要解决的技术问题是，改良水稻生长性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是一种改良水稻苗期生长速度的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达，提高水稻苗期生长速度等生长性状。所述的阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达通过敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列或者干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用进行。本发明方法敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797后得到了苗期叶绿素含量上升、植株快速生长的水稻苗期生长性状提升的新材料，具有很好的前景。

Description

阻断或减弱水稻circRNA编码位点的表达以提高水稻苗期生 长性状的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及阻断或减弱水稻circRNA编码位点Os06circ02797表达以提高苗期生长性状的方法。
背景技术
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，它通过3’下游序列与5’上游序列中的“末端”连接，形成没有游离末端的共价封闭的环状分子，由于其特殊的结构从而不易被核糖核酸外切酶切割，从而保持较高的稳定性。环状RNA可分别由编码基因外显子、内含子、外显子-内含子及基因间隔区组成。已有研究指出，circRNA可能具有充当miRNA海绵、参与调控转录过程和调节RNA可变剪切的生物学功能。随着高通量测序技术的发展，研究者针对代表性动植物模式材料，在基因组水平上注释了大量circRNA候选位点测序信息(其中，水稻基因组中注释了40311条circRNA候选位点信息(Chu Q,Bai P,Zhu X,Zhang X,Mao L,Zhu Q,Fan L，Ye C.2018.Characteristics of plant circularRNAs.Briefings in bioinformatics,21,135-143.))，然而由于缺乏circRNA获选位点的突变体材料，对circRNA生物功能的阐述十分有限，水稻circRNA生物功能的研究尚无明确报道。
传统突变体创制方法主要有辐射诱变、化学诱变剂处理、转座子插入及T-DNA插入等，但因其普遍存在非靶向性、效率低、费时、费力等缺陷，逐渐被近年发展起来的CRISPR-Cas定向编辑系统所取代。CRISPR-Cas系统因其设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势而广泛应用于动物、植物、微生物基因组的定向修饰及遗传改良中。在水稻中，运用CRISPR-Cas系统主要对编码基因进行编辑，对非编码miRNA的编辑也有一些报道，而对非编码circRNA的定向编辑(敲除)及有效解析对应生物功能，进而挖掘有育种价值的植物circRNA位点的工作尚未见报道未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，改良水稻生长性状。为了解决该技术问题，提供的技术方案是一种改良水稻苗期生长速度的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达，提高水稻苗期生长性状。
其中，上述方法中所述的阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达通过敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列或者干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用进行。进一步的，上述方法中所述敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797序列的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行。更进一步的，所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。
其中，上述方法中使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797时，包括以下步骤：
a、设计针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA；
b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；
c、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；
d、收集转化植株的种子，筛选出水稻的circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑突变体种子，即得提高籽粒性状的水稻突变体。
优选的，上述方法中所述的CRISPR-Cas法包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a或CRISPR-Cas12b中的至少一种。
其中，上述方法步骤c中所述的转化水稻使用的是农杆菌介导转化方法。
其中，上述方法中步骤a中所述的针对水稻的circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1或Seq ID No.2中的至少一种所示。
其中，上述方法中所述的改良水稻苗期生长速度性状为提高叶绿素含量、提高植株高度或提高下胚轴长度中的至少一种。
同时，本发明还提供了阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的试剂在提高改良水稻苗期生长速度中的用途。
其中，上述用途中所述阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的试剂包括敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列的试剂。进一步的，所述的敲除水稻基因组中circRNA编码位点Os06circ02797序列的试剂包括针对Os06circ02797基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑OsmiR394编码基因的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。
其中，上述用途中所述用于CRISPR-Cas9的sgRNA的核苷酸序列为Seq ID No.1或Seq ID No.2所示。
本发明还提供了一种针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797的sgRNA，核苷酸序列为Seq ID No.1或Seq ID No.2中的至少一种所示。
本发明要解决技术问题的技术方案是提供一种用于CRISPR-Cas9多基因编辑系统进行水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列定向敲除的sgRNA，其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示。具体序列为GAACUAUCCGAGGAGCAGUAC，其对应的基因组序列为GAACTATCCGAGGAGCAGTAC。
以及sgRNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。具体序列为GAAUGCAACCCCUGCAAACAU，其对应的基因组序列为GAATGCAACCCCTGCAAACAT。
相应的，本发明还提供了装载有上述sgRNA的载体。进一步的，本发明装载上述sgRNA的表达载体的主要表达单元包括玉米泛素启动子ZmUbi1启动的Cas9表达单元；水稻启动子U6启动的sgRNA-scaffold表达单元,以表达核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的sgRNA；水稻启动子U3启动的sgRNA-scaffold表达单元，以表达核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的sgRNA；启动子CaMV35S启动的潮霉素抗性基因Hyg表达单元。主要表达单元的结构如图1B所示，构建的该载体命名为pZJP054。
本发明也提供了上述的sgRNA或表达载体在改良水稻苗期生长性状中的用途。该用途具体是通过制备水稻Os06circ02797突变体，以获得水稻苗期速生突变体实现的。
与此同时，本发明还提供了一种对植物circRNA编码位点进行定向编辑敲除突变体的构建方法。该方法包括以下步骤：
a、针对植物circRNA编码位点设计覆盖编码区域的向导RNA；所述向导RNA为两条，分别靠近circRNA的上下游两端，且不位于其他存在生物功能的DNA编码区域或两条向导所引导编辑敲除的编码片段不能影响其他部分的生物功能；
b、构建可同时表达Cas蛋白及步骤a设计的靶向待编辑circRNA编码位点的两条向导RNA的Cas编辑表达载体；
c、用步骤b的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；
d、收集转化植株的种子，筛选出circRNA编码位点定向编辑敲除突变体种子，即得突变体。
进一步的，上述方法中所述的其他存在生物功能的DNA编码区域为外显子、启动子或剪切位点中的至少一种。
进一步的，上述方法中所述的Cas编辑表达载体的主要表达单元包括玉米泛素启动子ZmUbi1启动的Cas9表达单元；水稻启动子U6启动的sgRNA-scaffold表达单元,以表达上述设计的一条sgRNA；水稻启动子U3启动的sgRNA-scaffold表达单元，以表达上述设计的另一条sgRNA；启动子CaMV35S启动的潮霉素抗性基因Hyg表达单元。
同时，还设计sgRNA并构建载体对其它三个circRNA进行了敲除。
针对Os02circ25329设计的sgRNA1(序列SEQ ID No.18)：gcagcucugacaugugggcc；
针对Os02circ25329设计的sgRNA2序列SEQ ID No.19：gucccgcgcuucaaggaggu。
针对Os03circ00204设计的sgRNA5序列(SEQ ID No.20)：gccuauacccuugaagcuggg；
针对Os03circ00204设计的sgRNA6序列(SEQ ID No.21)：gcuugcgcacaaucuuaacga。
针对Os05circ02465设计的sgRNA7序列(SEQ ID No.22)：guggaaaagcagcauaugugc；
针对Os05circ02465设计的sgRNA8序列(SEQ ID No.23)：gacuccauuccauuuugcag。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种改良水稻苗期生长性状的方法，该方法通过阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达从而提高水稻苗期生长性状。本发明方法中，敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列，或者影响circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用，是阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797表达的两种主要方式。通过实验，针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列设计并筛选得到两条特定的sgRNA，并以之为基础构建了用于特定敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797的CRISPR-Cas9基因编辑载体。实验表明，本发明方法能够有效敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列，敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797后得到了苗期叶绿素含量上升、植株快速生长的水稻苗期生长性状提升的新材料。而本发明对植物circRNA编码位点进行定向编辑敲除突变体的构建方法本发明也证明能成功敲除多个circRNA编码位点，该方法步骤简明、易于操作，在植物的品质改良以及基因组功能研究和应用方面具有很好的前景。
附图说明
图1.运用CRISPR-Cas9多基因定向编辑系统敲除水稻circRNAs。
A、所选四个水稻circRNAs基因的基因组结构示意图，三角形指sgRNA在基因组上的位置。其中本发明Os06circ02797为第二部分circRNA设计示意图。
B、所选四个水稻circRNAs基因的定向敲除载体示意图。
C、所选四个水稻circRNAs定向敲除载体的原生质体活性验证。
图2.无载体的水稻circRNAs定向敲除突变体系T2代的基因型
图3.在转录水平验证Os06circ02797的敲除及对来源基因的影响。
A、RT-PCR验证Os06circ02797的表达水平。箭头指扩增产物方向。
B、q-PCR分析Os06circ02797突变对来源基因的影响。
图4.Os06circ02797突变体(os06circ02797Δ1)的苗期7天时生长性状提升，**：极显著差异(p<0.01)，*：显著差异(0.01<p<0.05)。
A、os06circ02797Δ1苗期表型。
B、Os02circ25329Δ1、Os03circ00204Δ1和Os05circ02465Δ1苗期表型
C、os06circ02797Δ1的叶绿素含量极显著高于野生型。
D、os06circ02797Δ1的株高极显著高于野生型。
E、os06circ02797Δ1的下胚轴极显著高于野生型。
具体实施方式
在本发明前期针对水稻转录因子相关的大量研究工作的基础上，通过基因组编辑技术，在水稻中敲除了环状RNA(circular RNA，circRNA)编码位点Os06circ02797，结果出人意料地发现，Os06circ02797敲除突变体(os06circ02797Δ1)苗期出现生长和叶绿素含量都极显著高于野生型情况。基于上述的实验，说明了水稻的circRNA编码位点Os06circ02797与苗期生长有密切的相关性，而阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达，能够有效地改良水稻的苗期生长性状。由此，本发明建立并公开了一种新的提高水稻苗期生长性状的方法。该方法是通过阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达，以改良水稻苗期生长性状。
目前已经知晓，环状RNA可分别由编码基因外显子、内含子、外显子-内含子及基因间隔区组成。显然，对于水稻circRNA编码位点Os06circ02797表达的整个过程中的任何一步施加影响，都可能降低circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用，改良水稻的苗期生长性状。而敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列，或者干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用，是本领域可用于阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的两种主要方式。
本发明的一个实施方向是从影响circRNA编码位点Os06circ02797的转录入手。目前最常用的方法就是从基因组中敲除掉circRNA编码位点Os06circ02797序列，可以采用的技术手段有基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法等。
使用同源重组法时，可以设计特定的重组DNA片段，通过同源重组替换到基因组中，从而使水稻不表达circRNA编码位点Os06circ02797。而随机插入突变法可以使用T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)插入突变法或转座子插入突变法等方法，也可以达到类似的效果。
而近年来，本领域关注较多的是基因组编辑技术。而目前常用的用于基因敲除的基因组编辑技术有基因组巨大核酸酶(Meganuclease)法、ZFN(锌指核酸酶)法、TALEN(Transcription activator-like effectors Nucleases)法以及CRISPR-Cas法。这些方法都可以用于敲除circRNA编码位点Os06circ02797序列的水稻定向编辑突变体的创制，得到苗期生长性状显著提高的突变植株。
与此同时，本发明也提供了阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797表达的试剂在提高水稻苗期生长性状中的用途。
这些试剂一方面包括干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物并使其难以正常发挥功能的各类分子，包括且不限于针对circRNA编码位点Os06circ02797表达产物设计的RNAi分子、用于CRISPR-Cas法的向导RNA分子。
另一方面则包括可以用于敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797序列的试剂。这些试剂包括且不限于针对circRNA编码位点Os06circ02797的用于巨大核酸酶(Meganuclease)法的巨大核酸酶，用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白，用于CRISPR-Cas法的向导RNA分子、用于同源重组法的重组DNA片段、或用于随机插入突变法的T-DNA(Transfer DNA，转移DNA)分子或转座子分子。
而用于敲除编码基因的CRISPR-Cas法，目前有CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b等多种具体的技术体系，本领域技术人员在实施本发明时，能够容易地根据各项具体技术的要求进行对circRNA编码位点Os06circ02797有针对性的编辑工作。
在本发明的一个实施例中，使用两个特别设计的针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA。其两个sgRNAs分别为：sgRNA3，序列如SEQ ID No.1所示，长度为20nt，PAM位点为TGG；sgRNA4序列如SEQ ID No.2所示，长度为20nt，PAM位点为TGG。该两个sgRNAs用于CRISPR-Cas9基因编辑系统对水稻circRNA编码位点Os06circ02797进行了基因编辑。当然，本领域技术人员知晓，在CRISPR-Cas9基因编辑系统中，向导RNA分子又叫sgRNA。
在此基础上本发明也开发得到了能表达上述的sgRNA的表达载体。当然，此类sgRNA定向编辑表达载体的骨架载体有很多已报道的可以选择。其中，上述表达载体的骨架载体可为pZHY988(Zhou J,Deng K,Cheng Y,Zhong Z,Tian L,Tang X,Tang A,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2017.CRISPR-Cas9 based genome editing reveals newinsights into microRNA function and regulation in rice.Frontiers in PlantScience 8,1598.)、pTX172以及CRISPR–Cas12a系统(Tang X,Ren Q,Yang L,Bao Y,ZhongZ,He Y,Liu S,Qi C,Liu B,Wang Y,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2019.Single transcript unit CRISPR 2.0systems for robust Cas9 andCas12a mediated plant genome editing.Plant Biotechnol J 17,1431-1445.)。在本发明的实施例中使用pZHY988作为骨架载体，取得了较优的效果，得到了苗期生长性状显著改良的水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体材料。
具体而言，本发明中使用上述的Cas9定向编辑向导sgRNA，以制备敲除水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列定向编辑突变体材料，以提高改良苗期生长性状的方法包括以下主要步骤：
a、制备序列如的Cas9基因编辑表达载体；构建Os06circ02797的CRISPR-Cas9多位点编辑表达载体；序列如Seq ID No.1的sgRNA和序列如Seq ID No.2的sgRNA；
b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas9基因编辑体系得到转化植株；
c、收集转化植株的种子，筛选出水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体种子，即得水稻苗期生长性状显著改善的水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体。
b、用步骤a的得到的表达载体转化水稻，获得遗传转化植株；
c、对b得到的转化植株进行筛选鉴定，筛选出水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体；
d、对水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体苗期生长情况进行观察，得到速生性状的水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体。
其中，上述方法步骤b中所述的转化水稻使用农杆菌介导转化法。
具体而言，本发明技术方案中创制苗期生长性状改良的水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体方法具体步骤如下：
(1)sgRNAs靶位点的选择
水稻circRNA编码位点Os06circ02797位于基因组的第6号染色体上，为Os06g04610的内含子区(图1)。根据CRISPR-Cas9系统对靶位点的识别和剪切规则设计靶位点。将靶位点设计于Os06circ02797近两端(为了不删除来源基因的外显子且能大部分删除Os06circ02797)(图1)。其两个sgRNAs分别为：sgRNA3序列如SEQ ID No.1所示，长度为20nt，PAM位点为TGG；sgRNA4序列如SEQ ID No.2所示，长度为20nt，PAM位点为TGG。
同理，设计Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465的编辑位点sgRNA(图1)，其sgRNA序列分别如SEQ ID No.18，SEQ ID No.19，SEQ ID No.20，SEQ ID No.21，SEQID No.22，SEQ ID No.23所示。
(2)Cas9定向编辑表达载体构建
合成引物Os06circ02797-sgRNA-P1F(引物序列如SEQ ID No.3)和Os06circ02797-sgRNA-P1R(引物序列如SEQ ID No.4)。以质粒pZJP046(Zhou J,Xin X,HeY,Chen H,Li Q,Tang X,Zhong Z,Deng K,Zheng X,Akher SA,Cai G,Qi Y,Zhang,Y.2019.Multiplex QTL editing of grain-related genes improves yield in eliterice varieties.Plant Cell Rep 38,475-485.)为模板，Os06circ02797-sgRNA-P1F和Os06circ02797-sgRNA-P1R为引物进行PCR。运用Golden gate的方式PCR产物组装至载体pZHY988上，构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR检测，获得了针对水稻Os06circ02797的定向敲除载体pZJP054，其主要表达单元如图1B所示。采用同样的方法构建分别针对Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465的基因敲除载体pZJP053、pZJP055和pZJP057(其主要表达单元如图1B所示)。
(3)遗传转化和基因型鉴定
水稻Os06circ02797基因定向敲除载体pZJP054经农杆菌介导的水稻遗传转化、筛选、获得再生转化植株。提取水稻再生苗基因组DNA，用特异引物dcas9-F(引物序列如SEQID No.5)和dcas9-R(引物序列如SEQ ID No.6)扩增目的片段检测转基因阳性。提取单株DNA进行阳性鉴定后。用设计的特异引物Os06circ02797-F1(引物序列如SEQ ID No.7)和Os06circ02797-R1(引物序列如SEQ ID No.8)进行PCR，经Sanger测序验证，获得Os06circ02797定向敲除突变体。同样对pZJP053、pZJP055和pZJP057进行遗传转化，得到定向敲除突变体。
(4)突变体的鉴定
首先，对突变体T0代单株用特异引物dcas9-F(引物序列如SEQ ID No.5)和dcas9-R(引物序列如SEQ ID No.6)扩增目的片段检测转基因阳性。将检测所得到的阳性植株用特异引物Os06circ02797-F1(SEQ ID No.7)和Os06circ02797-R1(SEQ ID No.8)进行PCR，PCR产物1％琼脂糖凝胶筛选具有大片段删除的突变体单株。收获具有大片段删除的Os06circ02797 T1代种子，PCR扩增目的片段检测转基因阳性。筛选得到不含表达载体的植株，并对这些单株进行PCR鉴定，获得纯合大片段删除突变体，并测序验证及转录水平验证。
(5)突变体苗期生长情况分析
对突变体进行的苗期生长情况进行分析，观察其与对照(WT)表型差异。
在此基础上本发明也开发得到了能表达上述的sgRNA的表达载体pZJP054，其主要表达单元如图1B所示。包括玉米泛素启动子ZmUbi1启动的Cas9表达单元；水稻启动子U6启动的sgRNA3-scaffold表达单元；水稻启动子U3启动的sgRNA4-scaffold表达单元；启动子CaMV35S启动的潮霉素抗性基因Hyg表达单元。
所述的主要表达单元的表达载体作为circRNA编码位点Os06circ02797基因组编辑表达载体。
发明人发现使用上述基因编辑体系能够高效得到水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑敲除突变体。而且Os06circ02797突变体(os06circ02797Δ1)苗期出现生长和叶绿素含量都极显著高于野生型。
与此同时，本发明还提供了一种对植物circRNA编码位点进行定向编辑敲除突变体的构建方法。该方法包括以下步骤：
a、针对植物circRNA编码位点设计覆盖编码区域的向导RNA；所述向导RNA为两条，分别靠近circRNA的上下游两端，且不位于其他存在生物功能的DNA编码区域或两条向导所引导编辑敲除的编码片段不能影响其他部分的生物功能；
b、构建可同时表达Cas蛋白及步骤a设计的靶向待编辑circRNA编码位点的两条向导RNA的Cas编辑表达载体；
c、用步骤b的得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；
d、收集转化植株的种子，筛选出circRNA编码位点定向编辑敲除突变体种子，即得突变体。
进一步的，上述方法中所述的其他存在生物功能的DNA编码区域为外显子、启动子或剪切位点中的至少一种。
进一步的，上述方法中所述的Cas编辑表达载体的主要表达单元包括玉米泛素启动子ZmUbi1启动的Cas9表达单元；水稻启动子U6启动的sgRNA-scaffold表达单元,以表达上述设计的一条sgRNA；水稻启动子U3启动的sgRNA-scaffold表达单元，以表达上述设计的另一条sgRNA；启动子CaMV35S启动的潮霉素抗性基因Hyg表达单元。
上述方法可更进一步的用来敲除水稻基因组中的circRNA编码位点。当所述的水稻circRNA编码位点为Os02circ25329时，所述的两条sgRNA分别为序列SEQ ID No.18所示的sgRNA1和序列为SEQ ID No.19所示的sgRNA2。
当所述的水稻circRNA编码位点为Os06circ02797时，所述的两条sgRNA分别为序列SEQ ID No.1所示的sgRNA3和序列为SEQ ID No.2所示的sgRNA4。
更进一步的，当所述的水稻circRNA编码位点为Os03circ0020时，所述的两条sgRNA分别为序列SEQ ID No.20所示的sgRNA5和序列为SEQ ID No.21所示的sgRNA6。
更进一步的，当所述的水稻circRNA编码位点为Os05circ02465时，所述的两条sgRNA分别为序列SEQ ID No.22所示的sgRNA7和序列为SEQ ID No.23所示的sgRNA8。
试验证明使用上述方法，能够更为高效准确地从植物基因组中敲除掉目的circRNA编码位点。
以下通过实施例的详细描述对本发明实行更为具体的说明。
实施例1水稻Os06circ02797敲除编辑载体pZJP054的构建
(1)sgRNA设计
从数据库网站NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对检索并下载水稻circRNA编码位点Os06circ02797序列，然后根据CRISPR-Cas9系统对靶位点的识别和剪切规则，进行设计sgRNA；然后利用CRISPR-P网站在线(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)对sgRNA的错配率和脱靶位点进行预测选择最优的sgRNA3(SEQ ID No.1)和sgRNA4(SEQ ID No.2)(图1A)。根据本发明所用敲除载体pZHY988的酶切位点，在引物端加上BsaI的酶切位点，设计合成两条单链核苷酸序列Os06circ02797-sgRNA-P1F(引物序列如SEQ ID No.3)和Os06circ02797-sgRNA-P1R(引物序列如SEQ ID No.4)。交由上海生工公司合成。同理，设计针对Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465的sgRNA，其sgRNA序列分别如：
针对Os02circ25329设计的sgRNA1(序列SEQ ID No.18)：
gcagcucugacaugugggcc；
针对Os02circ25329设计的sgRNA2序列SEQ ID No.19：
gucccgcgcuucaaggaggu；
针对Os03circ00204设计的sgRNA5序列(SEQ ID No.20)：
gccuauacccuugaagcuggg；
针对Os03circ00204设计的sgRNA6序列(SEQ ID No.21)：
gcuugcgcacaaucuuaacga；
针对Os05circ02465设计的sgRNA7序列(SEQ ID No.22)：
guggaaaagcagcauaugugc；
针对Os05circ02465设计的sgRNA8序列(SEQ ID No.23)：
gacuccauuccauuuugcag。
(2)连接反应
将以质粒pZJP046(Zhou J,Xin X,He Y,Chen H,Li Q,Tang X,Zhong Z,Deng K,Zheng X,Akher SA,Cai G,Qi Y,Zhang,Y.2019.Multiplex QTL editing of grain-related genes improves yield in elite rice varieties.Plant Cell Rep 38,475-485.)为模板，Os06circ02797-sgRNA-P1F和Os06circ02797-sgRNA-P1R为引物进行PCR。切胶回收约600bp大小的产物片段。回收产物通过Golden gate的方式组装至载体pZHY988上。Golden gate反应体系为：T4 DNA连接酶
1μL，T4 DNA连接酶缓冲液(10x)2μL，pZHY988骨架载体质粒1μL(100ng/ul)，限制性内切酶BsaI 1μL，PCR回收产物产物2μL，ddH2O 13μL。Golden gate反应程序为：(37℃5min，16℃10min)10个循环，37℃15min，80℃10min。
(3)质粒转化大肠杆菌杆菌感受态
将大肠杆菌DH5α感受态置于冰上融化，加入上述20ul连接产物，混匀，冰浴30min。42℃热激1min，置于冰上冰浴2min。加入500μL LB液体培养基，37℃，200rpm震荡孵育45min。后12000rpm离心2min，弃去400μL上清，用移液枪轻轻吹打重悬菌体。全部菌液涂布于LB固体培养基(含有50mg/L Kan)，37℃正置培养1h后，倒置培养12～16h。
(4)菌落PCR
用灭菌牙签挑取LB平板上的单克隆，置于含50μL ddH2O水中，取1uL此菌液作为模板进行PCR扩增。采用25uL体系，体系如下：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 0.5μL，Os06circ02797-sgRNA-P1F 0.5μL，ZY065-RB(SEQ ID No.9)0.5μL，Taq DNA enzyme 0.2μL，Template 1μL，ddH2O 19.8μL。PCR程序为：94℃，2min→(94℃，30s→55℃，30s→72℃，30s)35个循环→72℃，5min→4℃，10min(Taq DNA enzyme，dNTP等购自天根生物公司)。PCR结束后，加入5μL 6×溴酚蓝，在1％琼脂糖凝胶中，130V，30min电泳检测。
(5)质粒提取即测序验证
将菌落PCR验证正确的单克隆，将50μL菌液接种于含有50mg/LKan的LB中摇菌12-16小时，提取质粒。质粒DNA的提取按照AXYGEN AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit说明书进行。提取的质粒送擎科生物科技有限公司进行测序验证。获得了针对水稻Os06circ02797的定向编辑表达载体pZJP054，其T-DNA区域结构示意图如图1B所示。同理，分别构建Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465的载体pZJP053、pZJP055和pZJP057。
实施例2在原生质体内验证定向编辑表达载体的编辑效率
原生质体分离和转化验证编辑效率的方法参考文献(Tang X,Ren Q,Yang L,BaoY,Zhong Z,He Y,Liu S,Qi C,Liu B,Wang Y,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,Zhang Y.2019.Single transcript unit CRISPR 2.0systems for robust Cas9and Cas12a mediated plant genome editing.Plant Biotechnol J 17,1431-1445.)。将水稻(Nipponbare)在28℃，黑暗环境中培养。用刀片将水稻幼苗切成0.5-1.0毫米长的条带。然后将其迅速转移到含有8-10ml酶液(1.5％纤维素酶R10,0.75％Macerozyme R10,0.6甘露醇,pH值为5.7的10mM MES,10mM氯化钙和0.1％BSA)的90mm培养皿中。然后在真空条件下渗透30分钟。然后在黑暗中25℃，60-80rpm摇床上摇5-6小时。随后将细胞消化产物透过一个40μm过滤器过滤在90毫米培养皿,进一步转移到无菌50毫升离心管。在100g离心力下离心5分钟，收集原生质体。再用10毫升W5缓冲液进行洗涤。然后再100g离心2min收集原生质体，再用MMG缓冲液(0.4M mannitol,15mM MgCl2和4mM MES，pH＝5.7)悬浮。最后30μg质粒DNA 通过PEG介导转入水稻原生质体中瞬时表达。
72小时后离心收集原生质体，用CTAB法提取DNA。具体如下：原生质体中加入500μL预热的CTAB提取液，65℃水浴30～50min，期间充分混匀。加入500μL氯仿：异戊醇(24︰1)，充分颠倒混匀，4℃，10000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃沉淀1h。室温，12000rpm离心10min，收集沉淀。去上清，75％乙醇漂洗，12000rpm离心2min。去掉上清，风干DNA。加入20μL ddH2O溶解DNA。用提取的原生质体DNA为模板，Os06circ02797-F1(SEQID No.7)和Os06circ02797-R1(SEQ ID No.8)为引物进行PCR扩增，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测编辑载体的编辑效率。结果显示载体pZJP054对Os06circ02797的编辑有大片段删除，效率29.9％(图1C)。同样，对Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465敲除载体的编辑效率进行原生质体转化评估，所用鉴定引物序列为：SEQ ID No.24，SEQ ID No.25鉴定Os02circ25329；SEQ ID No.26，SEQ ID No.27鉴定Os03circ00204，SEQ ID No.28，SEQID No.29鉴定Os05circ02465。
实施例3农杆菌介导的水稻遗传转化
农杆菌介导转化水稻参考文献(Tang X,Ren Q,Yang L,Bao Y,Zhong Z,He Y,LiuS,Qi C,Liu B,Wang Y,Sretenovic S,Zhang Y,Zheng X,Zhang T,Qi Y,ZhangY.2019.Single transcript unit CRISPR 2.0systems for robust Cas9 and Cas12amediated plant genome editing.Plant Biotechnol J 17,1431-1445.)中公开的实验方法。
水稻的遗传转化步骤具体为：将水稻(日本晴)成熟种子去壳消毒；将消毒过的种子接种于含0.4％结冷胶的N-6-D固体培养基上面，32℃连续光照培养1～5天；培养的种子通过农杆菌介导的转化方法分别将质粒pZJP054、pZJP053、pZJP054和pZJP057转入水稻当中，转化过的水稻种子在诱导选择培养基中连续32℃光照培养2周；增殖产生的愈伤组织转入RE-III培养基中；从愈伤组织产生的幼小植株转移到HF培养基中诱导根的产生。待获得的抗性再生苗长至15cm左右时，清水洗净根部培养基，移栽至营养土中，温室培养。
实施例4水稻Os06circ02797突变体的鉴定
(1)水稻苗基因组DNA提取
水稻苗DNA提取采用CTAB法，具体操作步骤如下：
CTAB提取液于65℃水浴锅中预热。取单株叶片一片放入带钢珠的2mL的离心管中，放入液氮速冻，后震荡成粉末状。加入500μL预热的CTAB提取液，65℃水浴30～50min，期间充分混匀。加入500μL氯仿：异戊醇(24︰1)，充分颠倒混匀，4℃，10000rpm离心10min。取上清，加入等体积的异丙醇沉淀，-20℃沉淀1h。室温，12000rpm离心10min，收集沉淀。去上清，75％乙醇漂洗，12000rpm离心2min。去掉上清，风干DNA。加入30μL ddH2O溶解DNA，-20℃冰箱中保存待用。
(2)水稻苗转基因阳性检测
用特异引物dcas9-F(引物序列如SEQ ID No.5)和dcas9-R(引物序列如SEQ IDNo.6)扩增目的片段检测转基因阳性。PCR扩增体系及反应程序同前菌落PCR。
(3)突变体基因型鉴定
将检测所得到的阳性植株用特异引物Os06circ02797-F1(SEQ ID No.7)和Os06circ02797-R1(SEQ ID No.8)进行PCR，PCR产物1％琼脂糖凝胶筛选具有大片段删除的突变体单株。
(4)无载体纯合敲除突变体筛选与测序验证
收获具有大片段删除的Os06circ02797T1代种子，发芽、单株提取DNA，用特异引物dcas9-F(引物序列如SEQ ID No.5)和dcas9-R(引物序列如SEQ ID No.6)PCR扩增目的片段检测转基因阳性。以不含表达载体的植株DNA为模板，Os06circ02797-F1(SEQ ID No.7)和Os06circ02797-R1(SEQ ID No.8)为引物进行PCR，PCR产物1％琼脂糖凝胶筛选具有大片段删除的纯合突变体单株。并将PCR产物送擎科生物有限公司测序验证，最终获得了Os06circ02797△1(-328bp/-328bp)和Os06circ02797△2(-332bp/-332bp)的纯合大片段删除突变体(图2)。使用同样方法，筛选鉴定Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465的不含载体的纯合大片段删除突变体。
实施例5水稻Os06circ02797突变体转录水平验证
(1)水稻基因组RNA提取及cDNA的合成
本实验采用TRIzol Universal Reagent(Tiangen公司)试剂提取水稻基因组RNA，具体操作采用该公司的操作说明书进行。cDNA的合成采用试剂盒HiScript III RTSuperMix for qPCR(Vazyme公司)，具体操作采用该公司的操作说明书进行。
(2)RT-PCR分析Os06circ02797突变体的转录情况
环状RNA一般是通过切割反向连接成环。为验证突变体在大片段删除时，对circRNA的影响，对突变体材料进行了Os06circ02797成环检测。设计检测环状RNA的引物，针对Os06circ02797分别合成两对引物进行扩增，一对汇聚引物：Os06circ02797-Convergent-F(SEQ ID No.10)，Os06circ02797-Convergent-R(SEQ ID No.11)；一对反向引物Os06circ02797-Divergent-F(SEQ ID No.12)，Os06circ02797-Divergent-R(SEQ IDNo.13)进行PCR。PCR程序和体系同前。结果(图3A)表明与野生型和Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465突变体体相比，无论在DNA或cDNA中，突变体Os06circ02797均没有目标带的出现，表明突变体Os06circ02797因大片段删除导致无Os05circ02465环状RNA产生，更确定了Os06circ02797突变体大片段删除突变体，无Os06circ02797环状RNA产生。
(3)qPCR检测Os06circ02797突变体中原位基因表达
Os06circ02797位于基因Os06g04610的内含子区间隔区(图1A)，需要确定删除Os06circ02797是否影响Os06g04610的正常表达。采用qPCR进行分析。首先，针对Os06g04610设计qPCR引物LOC_Os06g04610-F1(SEQ ID No.14)和LOC_Os06g04610-R1(SEQID No.15)，OsActin基因作为内参，引物为OsActin-F(SEQ ID No.16)和OsActin-R(SEQ IDNo.17)。
qPCR分析运用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)试剂盒进行，操作方法按试剂盒的说明书进行。qPCR检测反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix10ul，Primer1(10μM)0.4ul，Primer2(10μM)0.4ul，Template DNA/cDNA2ul，ddH2O补足20ul。qPCR检测反应程序：95℃2min→(95℃，20s→58℃，20s→72℃，20s→78℃，5s)43个循环→95℃，1s→Melt15s。结果采用2-△△Ct计算。结果显示在Os06circ02797敲除突变体中，来源基因Os06g04610的表达水平与野生型相比无明显差异(图3B)，表明Os06circ02797的敲除并不影响侧翼基因。
(5)敲除突变体苗期生长情况观察
对Os06circ02797突变体的苗期生长情况观察发现：Os06circ02797突变叶片颜色为浓绿，而野生型叶片为淡绿色(图4A)，叶绿素含量极显著高于野生型(图4B)。同时，发现Os06circ02797突变体植株高度和下胚轴长度都极显著高于野生型(图4A，C，D)。而Os02circ25329、Os03circ00204和Os05circ02465突变体苗期性状与野生型无明显差异(图4E)。
本发明基于发明人实验室构建的高效植物CRISPR-Cas9基因组编辑系统，针对水稻基因组注释的circRNA候选位点(位于基因内含子区的Os02circ25329、Os06circ02797，位于基因间隔区的Os03circ00204、Os05circ02465)进行了定向编辑，在创制的circRNA突变体中鉴定到得到了一个水稻苗期速生circRNA突变体os06circ02797Δ1，为有效阐明水稻circRNA生物学功能提供了材料基础，同时为基于circRNA的植物分子育种提供了准确的靶点。
序列表
<110> 电子科技大学
<120> 阻断或减弱水稻circRNA编码位点的表达以提高水稻苗期生长性状的方法
<150> 202011010344.2
<151> 2020-09-23
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacuauccg aggagcagua c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaugcaacc ccugcaaaca u 21
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggtctc agtgtgaact atccgaggag cagtacgttt tagagctaga aata 54
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgatggtctc caaacatgtt tgcaggggtt gcattgccac ggatcatctg c 51
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggctgatcc taagaagaag aggaa 25
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<212> DNA
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cgcagtaatg ccaactttgt ac 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcacgcctg agatacggtt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaccttctc catcttcctc t 21
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<212> DNA
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<400> 9
ttctaataaa cgctcttttc tct 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtacgtcag gagccaaata gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgatagattt gcaccttctc ca 22
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attaaaggag gaaagggagc aa 22
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actcatcctc gatgaaccgt at 22
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agtccatgga gcggggaa 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaggtggccc aaagtgacac t 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctagggaggg aggatgatgt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagggactat ggaagccact 20

Claims (17)

1.提高水稻苗期生长性状的方法，其特征在于：通过阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达，以提高水稻苗期生长性状；所述苗期生长性状为苗期生长速度和/或苗期叶绿素含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达通过敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797或者干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的作用进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物作用的方法包括RNA干扰法、T-DNA插入或CRISPR-Cas法中的至少一种；所述的敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797的方法为基因组编辑法、同源重组法或随机插入突变法中的至少一种进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的基因组编辑法包括巨大核酸酶法、ZFN法、TALEN法或CRISPR-Cas法中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：当使用CRISPR-Cas法敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797时，包括以下步骤：
a、设计针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA；
b、构建可表达该向导RNA的Cas编辑表达载体；
c、用步骤b得到的表达载体转化水稻，利用CRISPR-Cas基因编辑体系得到转化植株；
d、收集转化植株的种子，筛选出水稻circRNA编码位点Os06circ02797定向编辑突变体种子，即得苗期生长性状改善的水稻突变体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的CRISPR-Cas法为CRISPR-Cas9法、CRISPR-Cas12a法或CRISPR-Cas12b法中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤a中所述的针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。
8.阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的试剂在提高水稻苗期生长性状中的用途；所述苗期生长性状为苗期生长速度和/或苗期叶绿素含量。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的试剂包括敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797编码序列的试剂或者干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的试剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的试剂包括使用RNA干扰法、反义RNA法、CRISPR-Cas法、靶基因类似物法或短串联靶标类似物法中的至少一种所使用的试剂。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述干扰circRNA编码位点Os06circ02797表达产物作用的试剂包括针对circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的siRNA、针对circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的反义RNA、靶基因类似物、短串联靶标类似物、用于CRISPR-Cas法以编辑circRNA编码位点Os06circ02797表达产物的向导RNA中的至少一种。
12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的敲除水稻基因组中的circRNA编码位点Os06circ02797序列的试剂包括针对Os06circ02797基因的用于巨大核酸酶法的巨大核酸酶、用于ZFN法的ZFN蛋白、用于TALEN法的TALEN蛋白、用于CRISPR-Cas法编辑circRNA编码位点Os06circ02797的向导RNA、用于同源重组法的重组DNA片段、用于随机插入突变法的T-DNA或转座子中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述用于CRISPR-Cas9法的向导RNA的核苷酸序列为Seq ID No.1和Seq ID No.2所示。
14.针对水稻circRNA编码位点Os06circ02797以阻断或者减弱水稻中circRNA编码位点Os06circ02797的表达的向导RNA，其特征在于所述的向导RNA的编码核苷酸序列为SeqID No.1和Seq ID No.2所示。
15.装载有权利要求14所述的向导RNA的载体。
16.根据权利要求15所述的载体，其特征在于：所述的载体为用于CRISPR-Cas基因编辑技术的Cas编辑表达载体。
17.根据权利要求16所述的载体，其特征在于：所述CRISPR-Cas基因编辑技术为CRISPR-Cas9技术。
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