CN117925680A

CN117925680A - 一种调控植物根系与抗逆性的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用

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Publication number: CN117925680A
Application number: CN202211305612.2A
Authority: CN
Inventors: 张义荣; 张铭; 邢界文; 陈燕红; 邢鸿雁; 柯文胜
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明涉及一种调控植物根系与抗逆性的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用。其中涉及一种用于生产具有抗旱性玉米植物的方法，所述方法包括：a.通过基因编辑的方法破坏玉米中的ZmLRT基因；和b.选择表现出具有抗旱性的所述玉米植物。

Description

一种调控植物根系与抗逆性的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种调控植物根系与抗逆性的ZmLRT基因及其相关生物材料与应用。

背景技术

根系是玉米重要的营养器官，不仅能从土壤中吸收水分和矿物质元素，还能合成多种氨基酸和蛋白质，同时根系还具有固定和支持植株生长的作用。玉米的根按照生长顺序可分为胚根、次生根和支持根 (“玉米育种学”，刘纪麟，中国农业出版社，2002)。初生根、次生根和支持根上均能够形成侧根，侧根上又能形成次级侧根，如此形成的侧根系统是玉米吸收水分和矿物质的重要器官。

与拟南芥相比，玉米侧根形成的分子机制仍不清楚，但已有一些研究对玉米侧根相关性状进行了QTL分析。如Song W等("Genetic dissection of maize seedling rootsystem architecture traits using an ultra-high density bin-map and arecombinant inbred line population",J Integr Plant Biol,58:266-279,2016)利用204个郑单958衍生的重组自交系(Recombinant inbred lines，RILs)对玉米苗期性状进行QTL 检测，其中检测到2个侧根长度QTL，2个侧根数目QTL和3个侧根密度QTL。

生长素是植物最重要的激素之一，侧根发育的各个阶段都会受到生长素信号的调控(Lavenus等，"Lateral root development in Arabidopsis:fifty shades of auxin",Trends Plant Sci,18:450-458,2013)。与拟南芥类似，玉米中侧根的发育也受到生长素的调控。Janseb 等("Phloem-associated auxin response maxima determine radialpositioning of lateral roots in maize",Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,367:1525-1533,2012)发现玉米中侧根建成细胞的形成需要维管束中生长素响应机制的形成。除了生长素，其他植物激素如赤霉素和细胞分裂素也影响玉米侧根的形成。

侧根的发育是根系形态建成的重要组成部分，而生长素对侧根的发育至关重要，许多miRNA通过参与生长素信号转导途径来调控侧根的发育。一些miRNA能作用于生长素响应因子(AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF)，如拟南芥中miR160的靶基因是ARF10、 ARF16和ARF17。

植物在生长发育过程中会不可避免的经历各种生物及非生物胁迫，一些miRNA在应对多种胁迫中发挥重要作用(Sunkar等， "Functions of microRNAs in plant stressresponses",Trends Plant Sci,17:196-203,2012)。干旱是植物生长过程最常见的胁迫之一，miRNA 能通过多种途径参与对干旱的响应。一方面，为适应干旱环境植物常常会抑制主根的伸长而促进侧根的形成以最大程度的吸收水分 (Gilbert和Medina，"Droughtadaptation mechanisms should guide experimental design",Trends Plant Sci,21:639-647,2016)。

miR166是最古老的miRNA之一，在被子植物、裸子植物、蕨类植物和苔藓植物中均具有极高的保守性。miR166靶基因通常是 HD-ZIP III家族基因(Bao等，"MicroRNAbinding sites in Arabidopsis class III HD-ZIP mRNAs are required formethylation of the template chromosome",Dev Cell,7:653-66,22004)。miR166通过对靶基因的调控参与了植物生长发育的诸多过程。在拟南芥中根系中，超表达 miR166会促进主根的伸长(Singh等，"Balanced activity of microRNA166/165and its targettranscripts from the class III homeodomain-leucine zipper family regulatesroot growth in Arabidopsis thaliana",Plant Cell Rep,33:945-953,2014)，而在苜蓿中超表达 miR166会使维管束分化异常从而侧根数目减少(Boualem等， "MicroRNA166controls root and nodule development in Medicago truncatula",Plant J,54:876-887,2008)。在棉花中，miR166受黄萎病感染诱导表达，miR166特异的切割真菌中一个Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶的mRNA，来抵御真菌入侵(Zhang等，"Cotton plants exportmicroRNAs to inhibit virulence gene expression in a fungal pathogen",NatPlants,2:16153,2016a)。同样miR166在干旱胁迫、营养胁迫和冷胁迫等非生物胁迫中发挥重要作用(Valiollahi等，"Sly-miR166 and Sly-miR319 are components of the coldstress response in Solanum lycopersicum",Plant Biotechnol Rep,8:349-356,2014；Iwamoto和 Tagiri，"MicroRNA-targeted transcription factor gene RDD1 promotesnutrient ion uptake and accumulation in rice",Plant J,85:466-477,2016； Yan等，"The miR165/166mediated regulatory module plays critical roles in ABAhomeostasis and response in Arabidopsis thaliana",PLoS Genet, 12:e1006416,2016；Zhang等，"Knockdown of rice microrna166 confers drought resistance bycausing leaf rolling and altering stem xylem development",Plant Physiol,176:2082-2094,2018)。

中国农业大学2015年筛选并克隆了一个控制玉米苗期根系性状主效QTL(qLRT5-1)区间内的ZmLRT基因。通过功能预测及鉴定结果表明：ZmLRT基因为miR166的前体之一，在根系中高丰度表达，将ZmLRT基因在拟南芥和玉米中超表达后，可有效抑制侧根的生长发育，为深入探讨玉米根系生长发育的分子调控机理积累了新的数据和资料(CN105132428A)。

发明内容

根据本发明的第一方面，其提供一种用于生产具有抗旱性玉米植物的方法，所述方法包括：

a.通过基因编辑的方法破坏玉米中的ZmLRT基因；和

b.选择表现出具有抗旱性的所述玉米植物。

在一种实施方案中，所述ZmLRT基因序列如SEQ ID NO:1所示。

在一种实施方案中，所述基因编辑由选自以下的方法实现：大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶。

在一种实施方案中，所述基因编辑由CRISPR/Cas9系统的方法实现。

在一种实施方案中，所述方法包括：

a.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，提供识别玉米中ZmLRT基因中的靶位点的sgRNA，并构建CRISPR/Cas9载体；

b.通过CRISPR/Cas9载体转化玉米，破坏玉米中ZmLRT基因，获得T1代转基因玉米；和

c.将T1代转基因玉米自交一代，在T2代中筛选不含转基因筛选标记的玉米，最终获得表现出具有抗旱性的所述玉米植物。

在一种实施方案中，所述破坏是通过敲除或敲低ZmLRT基因实现的。

在一种实施方案中，所述靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205 位。

在一种实施方案中，所述sgRNA包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

在一种实施方案中，所述破坏玉米植物中ZmLRT基因是缺失 SEQ ID NO:1的第175-194位，破坏ZmLRT基因后的序列如SEQ ID NO:3所示。

在一种实施方案中，所述破坏玉米植物中ZmLRT基因是插入 26bp且缺失SEQ IDNO:1的第189-198位，破坏ZmLRT基因后的序列如SEQ ID NO:4所示。

根据本发明的第二方面，其提供一种增加玉米植物侧根数目的方法，包括：

a.通过基因编辑的方法破坏玉米植物中的ZmLRT基因，和

b.选择表现出具有增加的侧根数目的所述玉米植物。

在一种实施方案中，所述方法包括：

a.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，提供识别玉米植物中 ZmLRT基因中的靶位点的sgRNA，并构建CRISPR/Cas9载体；

b.通过CRISPR/Cas9载体转化玉米，破坏玉米植物中ZmLRT 基因，获得T1代转基因玉米；和

c.将T1代转基因玉米自交一代，在T2代中筛选不含转基因筛选标记的玉米，最终获得表现出具有增加的侧根数目的所述玉米植物。

在一种实施方案中，所述靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205 位。

在一种实施方案中，所述sgRNA包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

根据本发明的第三方面，其提供一种CRISPR/Cas9系统，包含如下：

1)sgRNA，所述sgRNA的靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205 位；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

根据本发明的第四方面，其提供一种获得ZmLRT基因敲除突变体玉米的特异性sgRNA，其中所述特异性sgRNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的第五方面，其提供所述CRISPR/Cas9系统或所述 sgRNA在玉米植物遗传育种中的应用。

本发明所述方法、系统和引物的优异技术效果主要在于以下几个方面：

1、确定了miR166的前体基因ZmLRT为主效QTL qLRT5-1的候选基因，并采用CRISPR-Cas9技术证实，敲除ZmLRT后，苗期侧根数目增加。

2、发现ZmLRT基因的CRISPR-Cas9敲除株系抗旱性较野生型有显著增加，利用本发明的技术可以对玉米侧根数目和抗旱性进行分子遗传改良。

3、对ZmLRT进行等位变异分析发现，综3类型的ZmLRT等位变异在群体中的占比较低(15.8％)，且在不同的杂种优势群中的频率有很大差异(5.0％-25.5％)，这说明在不同群体中ZmLRT的利用程度不同，还有很大的利用潜力和价值。

附图说明

图1：ZmLRT基因的表达模式分析结果，其中图1A显示ZmLRT 在87-1根系中的表达水平显著高于综3；图1B显示成熟miR166在 87-1根系中的表达水平显著高于综3；图1C显示87-1发芽后第8天的侧根数目少于综3；图1D-E显示ZmLRT和miR166在含有87-1 等位变异的近等基因系中的表达量显著高于含有综3等位变异的近等基因系；图1F显示含87-1等位变异的近等基因系发芽后第8天的侧根数目少于含综3等位变异的近等基因系。

图2：pZmLRT::GUS转基因拟南芥T3代阳性株组织器官GUS 染色，显示ZmLRT基因在苗期根尖、侧根原基、叶片及维管束中均能检测到GUS信号，其中在根尖及侧根原基信号相对较强。在成株期，茎、角果和种子中均不能检测到GUS信号。在花器官的花柱中可以检测到GUS信号，但在花瓣及花药中均未检测到GUS信号。

图3：ZmLRT在根部的RNA原位杂交分析结果，显示ZmLRT 基因在根尖及侧根原基中均检测到较强的杂交信号。

图4：ZmLRT敲除株系miR166序列变异分析，利用CRISPR/Cas9 技术，对miR166的成熟序列进行定点敲除。通过对转基因株系 miR166位点附近序列进行扩增及测序，共获得5种突变类型。第一条线下方表示gRNA序列，第二条线上方表示成熟miR166序列；WT 为野生型，lrt1-lrt5为ZmLRT敲除突变体。其中，lrt-3、lrt-4和lrt-5 分别在miR166成熟序列第4和第5个碱基间插入了G、T和A，并未完全破坏miR166序列；lrt-1缺失了miR166成熟序列1-10bp的碱基，完全破坏了miR166的序列；lrt-2则在成熟miR166序列中间插入了26bp且造成miR166 5-14bp处碱基的缺失，完全破坏了miR166 的序列。

图5：ZmLRT敲除株系与野生型发芽后8天根系形态及根系性状统计结果，显示与野生型相比，lrt-1和lrt-2的侧根数目显著增加，lrt-1 的主根长没有明显变化，而lrt-2的主根长有所增加。

图6：转录组表达谱不同生物学重复间相关性分析，对野生型、 lrt-1和lrt-2不同生物学重复间进行的相关性分析显示，同一基因型不同生物学重复间的相关系数均达到了0.99，表明不同生物学重复间具有很高的相关性。

图7：ZmLRT敲除株系与野生型之间差异表达基因的qRT-PCR 验证，显示10个基因的表达模式均与转录组测序结果一致。

图8：ZmLRT敲除株系与野生型(WT)间差异表达基因分析，其中图8A显示lrt-1与野生型之间有4975个差异表达基因，lrt-2与野生型之间有6868个差异表达基因，其中4139个为共同差异表达的基因；图8B显示在4139个差异表达基因中，与野生型相比，在转基因株系中上调和下调表达的基因数目分别为2078个和2061个。

图9：ZmLRT敲除株系与野生型抗旱性比较，在lrt-1与野生型的比对实验中，野生型复水后的成活率为68.7％，而lrt-1的成活率则为89.6％，而在lrt-2与野生型的比对实验中，复水后成活率由野生型的16.6％提高到lrt-2的83.9％，显示与野生型相比，lrt-1和lrt-2的抗旱性均有不同程度的提高。

具体实施方式

定义

除非本文另有定义，否则术语应按照相关技术领域的普通技术人员的常规用法来理解。描述与本文所用的分子生物学相关的许多术语的资源的示例可见于Alberts等人，Molecular Biology of The Cell，第5版， Garland Science Publishing,Inc.:NewYork,2007；Rieger等人，Glossary of Genetics:Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag: New York,1991；King等人，A Dictionary of Genetics，第6版，OxfordUniversity Press:New York,2002；以及Lewin,Genes IX,Oxford UniversityPress:NewYork,2007。使用如37C.F.R.§1.822所阐述的DNA 碱基命名法。

本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利、公开的专利申请和非专利出版物均全文以引用方式并入。

术语“和/或”在用于列出两个或更多个项时意指可以单独地采用所列的项中的任一个项，或可以采用所列的项中的两个或更多个项的组合。例如，表述“A和/或B”旨在意指A和B之一或两者——即单独A、单独B或A与B组合。表述“A、B和/或C”旨在意指单独A、单独B、单独C、A与B组合、A与C组合、B与C组合，或A、B与C组合。

如本文所用，单数形式的术语和单数形式“一”、“一个”和“该/所述”例如包括多个指代物，除非内容另外明确指出。因此，例如，提及“植物”、“该植物/所述植物”或“一植物”也包括多种植物；此外，根据上下文，术语“植物”的使用也可包括该植物的遗传上相似或相同的子代；

如本文所用，术语“核酸”的使用任选地包括该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。

如本文所用，“植物”是指完整植物、植物的任何部分或源自植物的细胞或组织培养物，其包含以下任一种：完整植物、植物部件或器官(例如，叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其子代。植物细胞是取自植物或通过培养取自植物的细胞来源的植物的生物细胞。如本文所用，“植物部分”可以指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、枝条器官/结构(例如，叶、茎或结节)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚胎、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体，或其他植物组织(例如，维管组织、表皮组织、基本组织(ground tissue)等)，或它们的任何部分。本发明的植物部分可以是有活力的、无活力的、可再生的和/ 或不可再生的。“繁殖体”可包括能够生长成整株植物的任何植物部分。

如本文所用，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指物种Zea mays L的植株，并且包括可与玉米相交繁殖的所有植物品种，包括野生玉蜀黍物种。

如本文所用，“转基因植物”是指这样的植物，该植物的基因组已通过整合或插入重组DNA分子、构建体或序列而改变。转基因植物包括从最初转化的植物细胞开发或再生的R0植物，以及较晚世代中的子代转基因植物或来自R0转基因植物的杂交植物。

如本文所用，术语“插入”是指将一个或多个额外核苷酸添加到DNA 中。基因编码区中的插入可以改变mRNA的剪接(剪接位点突变)，或引起阅读框移位(移码)，mRNA的剪接和阅读框移位两者都可以显著改变基因产物。

如本文所用，术语“缺失”是指从DNA中去除一个或多个核苷酸。像插入一样，这些突变可以改变基因的阅读框。

如本领域中通常所理解的，术语“启动子”通常可指这样的DNA序列，该DNA序列含有RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和/或TATA 盒，并辅助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达。启动子可以由已知的或天然存在的启动子序列或其他启动子序列合成产生、变化或衍生。启动子还可以包括嵌合启动子，该嵌合启动子包含两个或更多个异源序列的组合。因此，本公开的启动子可以包括启动子序列的变体，所述变体与本文已知或提供的其他启动子序列在组成上相似但不相同。可以根据与启动子可操作地连接的相关编码或可转录序列或基因(包括转基因)的表达模式相关的各种标准对启动子进行分类，诸如组成型、发育型、组织特异性、诱导型等。驱动在植物的所有或大多数组织中表达的启动子被称为“组成型”启动子。驱动在某些发育时期或发育阶段中表达的启动子被称为“发育型”启动子。相对于其他植物组织驱动在植物的某些组织中的增强表达的启动子被称为“组织增强型”或“组织偏好型”启动子。因此，“组织偏好型”启动子引起在植物的特定组织中的相对较高或优先的表达，而在植物的其他组织中具有较低水平的表达。在植物的特定组织内表达，而在其他植物组织中很少或没有表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于诸如冷、干旱或光之类的环境刺激或诸如创伤或化学品施加之类的其他刺激而启动转录的启动子。启动子也可以根据其来源进行分类，诸如为异源、同源、嵌合、合成的等等。“异源”启动子是这样的启动子序列，该启动子序列相对于其相关的可转录序列、编码序列或基因(或转基因) 具有不同来源，和/或不是天然存在于待转化的植物物种中的。术语“植物可表达的启动子”是指这样的启动子，该启动子能够启动、辅助、影响、导致和/或促进其相关联的可转录DNA序列、编码序列或基因在植物细胞或组织中的转录和表达。

关于多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白、构建体、载体等等的术语“重组”是指这样的多核苷酸或蛋白质分子或序列，该多核苷酸或蛋白质分子或序列是人为制造的，而非通常在自然界中存在的，和/或存在于在自然界中通常不存在的环境中，包括包含在没有人为干预的情况下不会天然地连续或紧密靠近在一起存在的多核苷酸或蛋白质序列的组合的多核苷酸(DNA或RNA)分子、蛋白质、构建体等，和/或包含至少两个相对于彼此异源的多核苷酸或蛋白质序列多核苷酸分子、蛋白质、构建体等。重组多核苷酸或蛋白质分子、构建体等可以包含这样的多核苷酸或蛋白质序列，该多核苷酸或蛋白质序列(i)与在自然中彼此邻近存在的其他多核苷酸或蛋白质序列分离，和/或或(ii)与不是天然彼此邻近的其他多核苷酸或蛋白质序列相邻(或邻接)。该重组多核苷酸分子、蛋白质、构建体等也可以指已经在细胞外进行了遗传工程化和 /或构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组DNA分子可包含任何合适的质粒、载体等，并且可包括线性或环状DNA分子。此类质粒、载体等可含有各种维持元件，包括原核复制起点和选择性标记，以及一个或多个转基因或表达盒，以及可能还有植物选择标记基因等。术语重组还可以指具有重组物质的生物体，例如包含重组核酸的植物被视为重组植物。

如本文所用，“等位基因”通常是指在特定基因座处的另选的核酸序列；等位基因的长度可以小至1个核苷酸碱基，但通常更大。例如，第一等位基因可以出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在另一个同源染色体上，例如在杂合个体的不同染色体中出现，或者在群体中不同的纯合或杂合个体之间出现。有利的等位基因是赋予或有助于农学上所需的表型的特定基因座处的等位基因，或者另选地，是允许鉴定可以从育种程序或种植中移除的易感植物的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型分离、或者另选地与易感植物表型分离从而提供鉴定易患疾病的植物的益处的标记等位基因。染色体区间的有利等位基因形式是这样的染色体区间，该染色体区间包括在物理上位于染色体区间上的一个或多个遗传基因座处的有助于优异的农学性能的核苷酸序列。

如本文所用，“杂交的(crossed)”或“杂交(cross)”意指通过受精 (例如，细胞、种子或植物)产生子代，并且包括植物之间的杂交(有性杂交)和自体受精(自交)。

如本文所用，“回交(backcross/backcrossing)”是指子代植物重复与其亲本之一回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座所渗入到的亲本植物。初始杂交产生F1代。

如本文所用，“基因型”是与可观察到的性状(表型)形成对比的一个或多个遗传基因座处的个体(或个体群)的遗传构成。基因型由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义。术语基因型可用于指在单个基因座、多个基因座处的个体遗传构成，或者更通常地，术语基因型可用于指个体关于其基因组中所有基因的遗传组成。“单倍型”是在多个遗传基因座处个体的基因型。通常，由单倍型描述的遗传基因座在物理上和遗传上是连锁的，即在相同的染色体区间上。

术语“表型”或“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状。表型可以通过肉眼或通过本领域已知的任何其他评价方式(例如显微镜、生物化学分析、基因组分析、特定耐病性的测定等)观察到。在一些情况下，表型由单个基因或遗传基因座直接控制，即“单基因性状”。在其他情况下，表型是若干个基因的结果。

如本文所用，“载体”是在细胞之间转移核酸的多核苷酸或其他分子。载体通常源于质粒、噬菌体或病毒，并且任选地包含介导载体维持并实现其预期用途的部分。“克隆载体”或“穿梭载体”或“亚克隆载体”含有促进亚克隆步骤的可操作连接的部分(例如，含有多个限制性内切核酸酶位点的多克隆位点)。如本文所用的术语“表达载体”是指这样的载体，该载体包含可操作连接的多核苷酸序列，该可操作连接的多核苷酸序列促进编码序列在特定宿主生物中的表达(例如，细菌表达载体或植物表达载体)。

如本文所用，在育种的背景下“选择(selecting/selection)”是指通常基于某种预定标准从群体挑选或选取所需个体的行为。

术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员应认识到，多核苷酸和核酸分子可包含核糖核苷酸，以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，其包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎和环结构等。

基因组编辑

鉴于抑制玉米中的ZmLRT基因产生具有侧根长度增加，侧根数增多，抗旱性增加的植物，本发明人进一步提出可通过基因组编辑来减少或消除ZmLRT基因的表达，以向玉米或其他单子叶植物或谷类植物提供这些有益性状。

如本文所用，“靶向编辑技术”是指允许精确和/或靶向编辑基因组中的特定位置的任何方法、方案或技术(例如，该编辑不是随机的)。不受限制，使用位点特异性核酸酶是靶向编辑技术的一个示例。

如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指对内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50 个、至少75个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个、至少5000个、至少10000个、或至少25000个核苷酸的靶向诱变、插入、缺失或取代。

经由使用一个或多个位点特异性核酸酶可以实现基因组编辑或靶向编辑。位点特异性核酸酶可以诱导基因组序列的靶位点处的双链断裂 (DSB)，该双链断裂(DSB)然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的自然过程来修复。诸如插入、缺失之类的序列改性可以经由NHEJ修复在DSB位置处进行。HR可用于将供体核酸序列整合到靶位点中。如果产生两个位于一个靶区域侧翼的DSB，则可以通过逆转靶向DNA的定向(也称为“倒位”)而经由NHEJ修复断裂。

在一个方面，载体或构建体包含编码至少1种、至少2种、至少3 种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、或至少10种位点特异性核酸酶的多核苷酸。在另一个方面，细胞已经包含位点特异性核酸酶。在一个方面，将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸稳定地转化到细胞中。在另一个方面，将编码位点特异性核酸酶的多核苷酸瞬时转化到细胞中。在另一个方面，编码位点特异性核酸酶的多核苷酸处于可调控启动子、组成型启动子、组织特异性启动子或任何可用于表达位点特异性核酸酶的启动子的控制之下。

在一个方面，载体包含编码位点特异性核酸酶的顺式盒和供体分子，使得当与细胞基因组接触时，该位点特异性核酸酶实现对供体分子的位点特异性整合。在一个方面，第一载体包含编码位点特异性核酸酶的盒并且第二载体包含供体分子，使得当与细胞基因组接触时，反式提供的位点特异性核酸酶实现对供体分子的位点特异性整合。

位点特异性核酸酶可用作靶向编辑技术的一部分。方法和/或组合物中使用的位点特异性核酸酶的非限制性示例包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、RNA引导的核酸酶(例如，Cas9和Cpf1)、重组酶(不限于例如DNA识别基序的丝氨酸重组酶、DNA识别基序的酪氨酸重组酶)、转座酶(不限于例如DNA结合结构域的DNA转座酶)，或它们的任何组合。在一个方面，本文所述方法包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种位点特异性核酸酶，以诱导在一个、两个、三个、四个、五个或超过五个靶位点处的一个、两个、三个、四个、五个或超过五个DSB。

在一个方面，在本文所述方法中使用一种基因组编辑系统(例如，大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶)或基因组编辑系统的组合以将一个或多个插入、缺失、取代或倒位引入细胞中的基因座，以引入突变或产生显性负等位基因或显性正等位基因。

位点特异性核酸酶，诸如大范围核酸酶、ZFN、TALEN、Argonaute 蛋白(Argonaute蛋白的非限制性示例包括Argonaute嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus Argonaute,TtAgo)、Argonaute强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus Argonaute,PfAgo)、Argonaute格氏嗜盐碱杆菌 (Natronobacterium gregoryi Argonaute,NgAgo)，它们的同源物或它们改性形式)、Cas9核酸酶(RNA引导的核酸酶的非限制性示例包括Cas1、 Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为 Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、 Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、 Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、 Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式)诱导基因组序列的靶位点处的双链DNA断裂，该双链DNA断裂然后由HR或NHEJ的自然过程来修复。然后在切割位点处进行序列改性，该序列改性可以包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的倒位、缺失或插入，或通过HR整合核酸序列。

在一个方面，位点特异性核酸酶选自由以下项组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶，或它们的任何组合。在另一个方面，位点特异性核酸酶选自由Cas9 或Cpf1组成的组。在另一个方面，位点特异性核酸酶选自由以以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、 Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、 Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、 Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、 Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在另一个方面，RNA引导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一个方面，RNA引导的核酸酶选自由以以下项组成的组： Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、 Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、 Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、 Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、 Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在另一个方面，本文所述方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一个方面，本文所述方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。

重组酶

在一个方面，DNA识别基序的酪氨酸重组酶选自由以下项组成的组：Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶，以及Tnp1重组酶。在一个方面，Cre重组酶或Gin重组酶系留至锌指DNA结合结构域。Flp-FRT 定点重组系统来自源自面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒。在该系统中，Flp重组酶(翻转酶)重组翻转酶识别靶标(FRT) 位点之间的序列。FRT位点包含34个核苷酸。Flp结合至FRT位点的“臂” (一个臂处于反向定向)并在居间的核酸序列的任一端切割FRT位点。切割后，Flp重组两个FRT位点之间的核酸序列。Cre-lox是来源于噬菌体P1的定点重组系统，该定点重组系统类似于Flp-FRT重组系统。Cre-lox可用于使核酸序列反转、使核酸序列缺失或使核酸序列易位。在该系统中，Cre重组酶使一对lox核酸序列重组。Lox位点包含34个核苷酸，其中第一个和最后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组期间， Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合，并在lox位点处进行切割。将切割的核酸拼接在一起(相互易位)并完成重组。在另一个方面，lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、 M2、M3、M7或M11位点。在另一个方面，DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下项组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶，以及TP-901 整合酶。在另一个方面，DNA结合结构域的DNA转座酶选自由以下项组成的组：TALE-piggyBac和TALE-增变基因。

ZFN

ZFN是合成蛋白质，其由与FokI限制性核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成。ZFN可以设计成切割几乎任何长段的双链DNA，以用于对锌指DNA结合结构域进行改性。ZFN由单体形成二聚体，所述二聚体由与经工程化以结合靶DNA序列的锌指阵列融合的FokI核酸酶的非特异性DNA切割结构域构成。

ZFN的DNA结合结构域通常由3-4个锌指阵列组成。在相对于锌指∞螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸有助于与靶DNA的位点特异性结合，所述氨基酸可以经改变和定制以适配特定靶序列。其他氨基酸形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于选择ZFN 的靶序列的规则在本领域中是已知的。

FokⅠ核酸酶结构域需要进行二聚化以切割DNA，因此两个ZFN需要以它们的C末端区域结合切割位点的相对DNA链(分开5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶位点。如本文所用的术语ZFN是广泛的，并且包括可以在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN还用于指一对ZFN中的一个或两个成员，该一对ZFN经工程化以共同作用以在相同位点切割DNA。

不受任何科学理论的限制，因为原则上可以使用各种方法中的一种对锌指结构域的DNA结合特异性进行重新工程化，所以理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公开可用方法包括相邻装配(Context-dependent Assembly,CoDA)、寡聚体库工程化(OPEN)和模块化装配。

在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一个方面，ZFN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸。

大范围核酸酶

通常在微生物中鉴定出的大范围核酸酶是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式通常具有扩展的DNA识别序列(例如，14 至40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN的工程化更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中缠结在一起。已经使用专门的诱变方法和高通量筛选来产生新颖的大范围核酸酶变体，该新颖的大范围核酸酶变体识别独特序列并具有改善的核酸酶活性。

在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一个方面，大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸。

TALEN

TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并引起靶位点处的双链DNA断裂。除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokⅠ结构域用作二聚体，从而需要两个构建体，所述两个构建体具有针对靶基因组中具有适当的定向和间隔的位点的独特DNA结合结构域。 TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目都是用于实现高水平活性的参数。

TALEN是通过将转录激活因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。在一些方面，核酸酶选自由以下项组成的组：PvuII、MutH、TevI和FokI、AlwI、MlyI、SbfI、 SdaI、StsI、CleDORF、Clo051、Pept071。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并引起靶位点处的双链 DNA断裂。

如本文所用的术语TALEN是广泛的，并且包括可以在没有另一个 TALEN帮助的情况下切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指一对TALEN中的一个或两个成员，该一对TALEN共同作用以在相同位点切割DNA。

转录激活因子样效应物(TALE)可经工程化以实际上结合任何DNA 序列。TALE蛋白质是来源于黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。X病原体在感染期间将TALE分泌到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在细胞核处TALE识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区域中的特定DNA序列的启动子区域中的特定DNA序列。TALE具有由13-28个33-34个氨基酸的重复单体构成的中心DNA结合结构域。除了位置12和13处的高变氨基酸残基外，每种单体的氨基酸都是高度保守的。该两种可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可以识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。

除了野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域用作二聚体，从而需要两个构建体，所述两个构建体具有针对靶基因组中具有适当的定向和间隔的位点的独特DNA结合结构域。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数目和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目都是用于实现高水平活性的参数。PvuII、 MutH、和TevI切割结构域是与TALE一起使用的FokI和FokI变体的可用替代物。PvuII在耦合到TALE时用作高特异性切割结构域(参见 Yank等人，2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人，2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。 TevI在靶向位点处的DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人， 2013.Nature Communications.4:1762)。

氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。可使用诸如DNA Works的软件程序来设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人，Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人，Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。

在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一个方面，TALEN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供载体，所述载体包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9系统或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和 TALEN的替代方案。在一个方面，基因组编辑系统包括CRISPR系统。 CRISPR系统基于RNA引导的工程化核酸酶，该RNA引导的工程化核酸酶使用互补碱基配对来识别靶位点处的DNA序列。

在一个方面，载体可包含编码RNA引导的核酸酶的核酸序列的任何组合。

虽然不受任何特定科学理论的限制，但是CRISPR/Cas核酸酶是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割靶 DNA来保护它们免受诸如病毒之类的入侵核酸。通过在CRISPR基因座 (CRISPR阵列)的近端处的约20个核苷酸长的CRISPR重复序列之间整合入侵DNA的短片段(称为间隔区)来获取免疫力。充分描述的Cas 蛋白是Cas9核酸酶(也称为Csn1)，其是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)中的2类II型CRISPR/Cas系统的一部分。参见Makarova等人，Nature Reviews Microbiology(2015)doi：10.1038/nrmicro3569。Cas9 包含在其氨基末端的RuvC样核酸酶结构域和位于该蛋白质中间的HNH 样核酸酶结构域。Cas9蛋白还含有PAM相互作用(PI)结构域、识别叶(REC)和BH结构域。另一种II型系统Cpf1核酸酶以与Cas9类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。参见Cong等人，Science(2013)339:819-823；Zetsche等人，Cell(2015)doi：10.1016/j.cell.2015.09.038；美国专利公开No.2014/0068797；美国专利公开No.2014/0273235；美国专利公开No.2015/0067922；美国专利No.8,697,359；美国专利No.8,771, 945；美国专利No.8,795,965；美国专利No.8,865,406；美国专利No.8,871,445；美国专利No.8,889,356；美国专利No.8,889,418；美国专利 No.8,895,308；以及美国专利No.8,906,616，该等文献中的每一者全文以引用方式并入本文。

当Cas9或Cpf1切割靶向DNA时，内源性双链断裂(DSB)修复机制被激活。DSB可以经由非同源末端连接修复，该非同源末端连接修复可以将插入或缺失(插入和缺失)结合到靶向基因座中。如果产生两个位于一个靶区域侧翼的DSB，则可以通过逆转靶向DNA的定向来修复断裂。或者，如果提供与靶向DNA序列具有同源性的供体多核苷酸，则可以通过同源定向修复来修复DSB。该修复机制允许将供体多核苷酸精确整合到靶向DNA序列中。

虽然不受任何特定科学理论的限制，但在2类II型CRISPR/Cas系统中，CRISPR阵列(包括间隔区)在与公认的入侵DNA相遇时被转录，并被加工成小的干扰CRISPR RNA(crRNA)，所述crRNA的长度为约 40个核苷酸。crRNA与反式激活的crRNA(tracrRNA)杂交以激活并引导Cas9核酸酶进入靶位点。核酸分子可以将crRNA和tracrRNA组合成一个核酸分子，该核酸分子在本文中被称为“单链指导RNA(sgRNA)”。切割靶位点的先决条件是在靶DNA下游存在保守的前间隔序列-相邻基序(protospacer-adjacent motif,PAM)，该PAM通常具有序列5-NGG-3，但NAG较不频繁。特异性由PAM上游约12个碱基的所谓“种子序列”提供，该“种子序列”必须在RNA与靶DNA之间匹配。Cpf1以与Cas9 类似的方式起作用，但Cpf1不需要tracrRNA。因此，在利用Cpf1的方面，sgRNA可以被crRNA替代。

在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶。在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cas9核酸酶。在另一个方面，Cas9核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶。在一个方面，本文所述方法和/或组合物包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种Cpf1核酸酶。在另一个方面，Cpf1核酸酶能够产生靶向DSB。

在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、 PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种sgRNA的载体。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种sgRNA的载体。在另一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌属介导的转化)向细胞提供包含编码Cpf1的多核苷酸和任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的载体。

在一个方面，RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、 Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为 Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、 Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、 Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、 Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式，Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性示例包括 Argonaute嗜热栖热菌(TtAgo)、Argonaute强烈炽热球菌(PfAgo)、 Argonaute格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo)，它们的同源物、它们的改性形式)、 Argonaute蛋白的DNA指导物，以及它们的任何组合。在另一个方面， RNA引导的核酸酶选自由Cas9和Cpf1组成的组。在另一个方面，RNA 引导的核酸酶包括Cas9。在一个方面，RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、 Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、 Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、 Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、 Cpf1，它们的同源物或它们的改性形式。在一个方面，位点特异性核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、 Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、 Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、 Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、 Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、 TtAgo、PfAgo，以及NgAgo。在另一个方面，RNA引导的核酸酶选自由以下项组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、 Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、 Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、 CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、TtAgo、 PfAgo，以及NgAgo。

转化

根据本公开内容的各方面，提供了用于重组DNA分子或构建体转化细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至启动子的可转录DNA序列或转基因，以产生转基因的或基因组编辑的细胞。根据本公开的其他方面，提供了用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法，所述重组DNA分子或构建体包含可操作地连接至植物可表达的启动子的可转录DNA序列或转基因，以产生转基因的或基因组编辑的植物或植物细胞。

用于利用重组DNA分子或构建体转化植物细胞中的染色体或质体的许多方法是本领域已知的，所述方法可以根据本公开的方法使用以产生转基因的植物细胞和植物。可以根据本发明方法使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，诸如农杆菌属介导的或根瘤菌属(Rhizhobium)介导的转化和微粒轰击介导的转化。本领域已知有多种方法用于经由细菌介导的转化或微粒轰击使用转化载体来转化外植体，然后培养这些外植体以使转基因植物再生或发育。用于植物转化的其他方法，诸如显微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅拌、PEG介导的转化等，也是在本领域中已知的。通过这些转化方法产生的转基因植物取决于所用的方法和外植体而对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。

转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，用于通过微粒轰击使用包被有重组DNA的颗粒转化植物细胞的具体说明见于美国专利No.5,550,318；No.5,538,880；No.6,160,208；No.6,399, 861；以及No.6,153,812中；并且农杆菌属介导的转化描述于美国专利 No.5,159,135；No.5,824,877；No.5,591,616；No.6,384,301；No.5,750,871；No.5,463,174；和No.5,188,958中，所有这些专利都以引用方式并入本文。用于转化植物的其他方法可见于例如Compendium of Transgenic Crop Plants(2009)BlackwellPublishing中。可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法来用任何核酸分子转化植物细胞。

或者，可将本公开的核苷酸序列引入生物体中并使其经历与生物体基因组的同源区域的重组。这种同源重组方法是本领域普通技术人员所熟知的，并且可用于将本发明的序列稳定地结合到生物体中。此外，此类策略可用于将“敲除突变”引入生物体的特定基因中，该基因与本公开的序列共享基本同源性。敲除突变是基因序列中消除或基本上降低由基因编码的产物的功能或水平的任何突变。涉及转化生物体然后进行同源重组以将本公开的序列稳定整合到生物体基因组中的方法包括在本公开内容中。本公开内容特别涉及利用本公开的序列来改变生物体生长的方法。此类方法包括使用本公开的序列来干扰控制生物生长的P糖蛋白的功能或合成。

已经转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化菌株或不同菌株授粉，并鉴定出具有所需表型特性的组成型表达的所得杂合体。可以生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传所需表型特性的组成型表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特性的组成型表达。

用于转化的受体细胞或外植体靶包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚胎细胞、胚乳细胞、根细胞、枝条细胞、茎细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、秆细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞或维管组织细胞。在另一个方面，本公开提供植物叶绿体。在另一个方面，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞或块茎细胞。在另一个方面，本公开提供了原生质体。在另一个方面，本公开提供了植物愈伤组织细胞。可以再生可育植物的任何细胞被认为是用于实践本公开的有用的受体细胞。愈伤组织可以从各种组织来源开始，包括但不限于未成熟胚或胚的各部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。这些能够作为愈伤组织增殖的细胞可以作为用于转化的受体细胞。用于制备本公开的转基因植物的实际转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化，以及随后可育转基因植物的再生)公开于例如美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公开2004/0216189中，所有这些专利都以引用方式并入本文。如本领域已知的，可以对转化的外植体、细胞或组织进行附加的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。根据本领域已知的方法，可以将含有重组DNA插入的转化细胞、组织或外植体在培养物、穴盘 (plug)或土壤中培养、发育或再生成转基因植物。在一个方面，本公开提供了不是繁殖材料并且不介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一个方面，本发明还提供了为繁殖材料并介导植物的天然繁殖的植物细胞。在另一个方面，本发明提供了不能经由光合作用维持自身的植物细胞。在另一个方面，本公开内容提供了植物体细胞。与种系细胞不同，体细胞不介导植物繁殖。

转基因植物可以进一步与自身或其他植物杂交以产生转基因种子和子代。还可以通过将包含重组DNA序列或转化事件的第一植物与缺乏插入的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将重组DNA构建体或序列引入易于转化的第一植物株系中，然后可以将该第一植物株系与第二植物株系杂交以将重组DNA构建体或序列渗入第二植物株系中。这些杂交的子代可以诸如通过6至8个世代或6至8次回交而进一步多次回交成更理想的品系，以产生与原始亲本品系具有基本上相同的基因型，但引入了重组DNA构建体或序列的子代植物。

植物、细胞或外植体可以是优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指通过育种和选择优异农艺性能而产生的任何品种。植物、细胞或外植体可以是杂交植物、细胞或外植体。如本文所用，通过以下方式来产生“杂种”：将来自不同品种、品系或物种的两种植物杂交，使得子代包含来自每个亲本的遗传物质。熟练的技术人员认识到也可以产生更高阶的杂种。例如，可以通过将品种C与品种D杂交以产生C×D杂种来制备第一杂种，并且可以通过将品种E与品种F杂交以产生E×F杂种来制备第二杂种。可以将第一杂种和第二杂种进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的高阶杂种(C×D)×(E×F)。

本发明的重组DNA分子或构建体可包含用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体，或包含在用于转化靶植物细胞、组织或外植体的DNA转化载体中。除了至少一种选择标记基因、编码一种或多种位点特异性核酸酶的至少一种表达盒和/或可转录DNA序列，以及任选的一种或多种sgRNA或crRNA之外，本公开的此类转化载体通常还可以包含对于有效转化必需或有益的序列或元件。对于农杆菌属介导的转化，转化载体可包含工程化的转移DNA(或T-DNA)区段或区域，该区段或区域具有在至少可转录的DNA序列或转基因侧翼的两个边界序列左边界(LB)和右边界(RB)，使得将T-DNA插入植物基因组中将产生可转录的DNA序列、转基因或表达盒的转化事件。换句话说，所述转基因(即编码位点特异性核酸酶的可转录的DNA序列、转基因或表达盒)和/或sgRNA或crRNA可能将与附加的转基因或表达盒(诸如植物选择标记转基因和/或可赋予植物感兴趣的农艺学性状或表型的其他农艺学上感兴趣的基因)一起位于T-DNA的左右边界之间。根据另选方面，编码至少一种位点特异性核酸酶的可转录的DNA序列、转基因或表达盒，任何必需的sgRNA或crRNA，以及植物选择标记转基因(或其他农艺学上感兴趣的基因)可以存在于相同或不同重组DNA 分子上的单独T-DNA区段中，诸如以用于共转化。转化载体或构建体可以进一步包含原核维持元件，所述原核维持元件对于农杆菌属介导的转化可以位于T-DNA区域外的载体骨架中。

由于存在选择剂，诸如抗生素或除草剂，所以本公开的转化载体或构建体中的植物选择标记转基因可用于帮助选择转化的细胞或组织，其中植物选择标记转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可能偏向或有利于表达植物选择标记基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加转化细胞或组织在R0植物中的比例。常用的植物选择标记基因包括例如赋予对抗生素的耐受性或抗性的植物选择标记基因，诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)；或赋予对诸如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或Cp4-EPSPS) 之类除草剂的耐受性或抗性的植物选择标记基因。还可以使用植物可筛选标记基因，所述植物可筛选标记基因提供视觉筛选转化体的能力，所述植物可筛选标记基因为诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)、或表达β葡糖醛酸酶的基因，或各种已知的生色底物的uidA基因(GUS)。在一个方面，载体或多核苷酸包含选自由以下项组成的组的至少一种标记基因：nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、 aroA、GFP，以及GUS。

根据本公开的各方面，用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法可以进一步包括使用位点特异性核酸酶的定点或靶向整合。根据这些方法，可以将一部分重组DNA供体分子(即，插入序列)插入或整合到基因组内的所需位点或基因座处。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如小的设计元件或组织特异性启动子。供体分子还可以在插入序列侧翼具有一个或两个同源臂，以通过同源重组和/或同源定向修复来促进靶向插入事件。因此，本公开的重组 DNA分子可以进一步包含用于将转基因或构建体(诸如编码小的设计元件或组织特异性启动子的转基因或可转录的DNA序列)定点或靶向整合到基因组中的供体模板。

本公开的一些方面涉及筛选用于靶向编辑的细胞或植物并选择包含靶向编辑的细胞或植物。可以使用本领域常规技术分离核酸。例如，可以使用包括但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)的任何方法来分离核酸。一般PCR技术描述于例如PCRPrimer:A Laboratory Manual,Dieffenbach和Dveksler编辑，Cold SpringHarborLaboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如限制酶消化和连接，所述重组核酸技术可用于分离核酸。分离的核酸也可以化学合成作为单一核酸分子或作为一系列寡核苷酸。可以通过诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析之类的已知方法从天然来源(例如的生物样品)纯化多肽。例如，也可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，纯化的多肽可以通过化学合成获得。多肽的纯度可以使用例如柱色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析之类的任何合适方法测量。

可以使用可检测标记来完成检测(例如，对扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)。术语“标记”旨在包括使用直接标记以及间接标记。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料，以及放射性材料。

经改性的或转基因的植物或植物细胞的筛选和选择可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的示例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、 RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger 测序、新一代测序技术(例如，Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定，以及蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀，以及用于检测多肽的酶联免疫测定。其他技术，诸如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有参考技术的方法是已知的。

本领域已知的用于抑制靶基因的任何方法可用于根据本公开的各方面抑制ZmLRT基因，包括反义RNA、双链RNA(dsRNA)或反向重复RNA序列的表达，或经由通过表达小的干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(ta-siRNA)或微RNA(miRNA) 进行共抑制或RNA干扰(RNAi)。此外，可以使用靶向基因内或基因附近的非编码基因组序列或区域的有义和/或反义RNA分子，以使该基因沉默。因此，这些方法中的任何一种都可以用于以组织特异性或组织偏好型方式对内源ZmLRT基因进行靶向抑制。

本文所用的术语“抑制”是指与由靶基因编码的mRNA和/或蛋白质在处于给定植物发育阶段的野生型或对照植物、细胞或组织中的表达水平相比较，此类靶mRNA和/或蛋白质在处于同一植物发育阶段的植物、植物细胞或植物组织中的表达水平降低、下降或消除。根据本公开的各方面，经改性或转基因的植物包含与对照植物相比降低至少5％、至少 10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少 60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或100％的ZmLRT 表达水平。根据本公开的各方面，经改性或转基因的植物包含与对照植物相比降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％ -60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100 ％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％或10 ％-75％的ZmLRT表达水平。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A提供了所包含的序列的概述。

表A

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实施例

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的玉米自交系综3是由中国农业大学国家玉米改良中心戴景瑞教授首次通过玉米双交种三系配套法育成，在文献“杨会等，玉米优良自交系综3、综31的转化研究，农业生物技术学报，2001，9 (4):334-337”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

下述实施例中的玉米自交系87-1在文献“刘宗华等，优良玉米自交系豫自87-1的血缘及其聚类分析，分子植物育种，2005，3(4):525-530”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

实施例1：ZmLRT基因的表达模式分析

为了进一步分析ZmLRT的表达模式，首先以亲本自交系综3和87-1 发芽后8天的根系为材料，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法进行了分析。

1.1基因表达分析

1.1.1 RNA提取

利用TRIzol总RNA提取试剂提取RNA。具体步骤如下：

1)取适量在液氮中充分研磨的样品于1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，低速涡旋混匀。

2)室温静置5min，使核酸-蛋白复合体完全解离。

3)加入0.2ml氯仿，涡旋震荡15sec，室温静置5min。

4)4℃，12000g离心15min。

5)取500μl上清液，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min。

6)4℃，12000g离心10min。

7)弃上清，加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。

8)4℃，7500g离心5min。

9)用移液器完全移除上清，室温晾干5-10min。

10)加入30μl经DEPC处理过的ddH₂O。

1.1.2 RNA纯化

使用Recombinant DNase I在RNase-free的0.2ml离心管中配置反应液：

37℃孵育30min；

2)加入2.5μl 0.5M EDTA(pH 8.0)，混匀，80℃加热处理2min，用DEPC水定容至100μl；

3)加入10μl 3M NaAc(pH 5.2)，250μl预冷的无水乙醇，混匀，置于-80℃20min；

4)4℃，12000g离心10min；

5)弃上清，用预冷的70％乙醇洗涤，4℃，12000g离心5min，用移液器完全移除上清，室温晾干5-10min；

6)用适量DEPC水重悬RNA。

1.1.3反转录

1)普通mRNA反转录

使用反转录酶M-MLV对纯化后RNA进行反转录，具体步骤如下：

1)在RNase-free的0.2ml离心管中配制下列反应液：

70℃孵育10min，然后立即置于冰上2min以上；

2)在上述离心管中加入以下反应液：

42℃保温1h，70℃保温15min，然后置于冰上冷却。

2)miRNA反转录

使用miRNA First-Strand Synthesis Kit进行miRNA反转录，反应体系如下：

37℃孵育1h，85℃加热5min；

加入90μl ddH₂O。

1.1.4实时定量PCR(qRT-PCR)

使用CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行基因表达分析，反应体系如下：

PCR程序为：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；95℃， 5s，65-95℃，每5s上升0.5℃，绘制融解曲线。

使用仪器给出的Ct值计算基因的相对表达量。计算公式为：

相对表达量＝2^-ΔCt，ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内参基因

1.2 RNA原位杂交

1.2.1探针制备

1)模板制备。在ZmLRT全长cDNA特异区段设计引物分别扩增正义探针(正向引物5'端加T7启动子：TAATACGACTCACTATAGGG) 和反义探针(反向引物5'端加T7启动子)。以cDNA为模板利用高保真酶进行PCR扩增，回收纯化目的产物，连接pEASY-Blunt Simple CloningVector，取阳性克隆进行测序。以测序正确的质粒为模板进行扩增，扩增产物纯化后测定浓度。

2)体外转录。

20μl转录体系如下：

37℃保温2h。

3)探针纯化

向上述转录产物中依次加入75μl DEPC水，1μl Recombinant DNase I，1μl100mg/ml tRNA，37℃孵育30min，以去除模板DNA；向上述反应体系中加入95μl预冷的4MNH₄Ac，190μl预冷的无水乙醇，颠倒混匀，置于-20℃2h；4℃，20000g离心10min；弃上清，用600μl 70％乙醇洗涤，4℃，20000g离心7min；用移液器完全移除上清，置于冰上于超净台中吹干1h；用100μl DEPC水重悬沉淀，加入100μl 2×碳酸盐缓冲液，60℃孵育适当时间，所需时间t＝(初始片段长度-终长度) /(k×初始片段长度×终长度)(k＝0.11kb/min；最适终长度为150bp)；向上述反应液中依次加入10μl 10％冰醋酸，21μl 3M NaAc(pH 5.2)， 420μl预冷的无水乙醇，颠倒混匀，置于-20℃3h以上；4℃20000g离心10min；弃上清，用600μl70％无水乙醇洗涤，4℃20000g离心7 min；用移液器完全移除上清，置于冰上，于超净工作台上吹干1h；加入40μl 50％甲酰胺溶解沉淀，于-80℃长期保存探针。

1.2.2包埋与切片

1)取样。取发芽后6天的玉米主根，剪成5-10mm小段，立即放入新鲜配制的预冷FAA固定液中，抽真空15min，换新的固定液，4℃振荡过夜。

2)脱水。4℃振荡条件下，依次经过50％，70％，85％，95％，100％乙醇溶液，每步加1ml 2％曙红溶液(醇溶)，每次1.5h。最后换新的无水乙醇，4℃振荡过夜。

3)透明。换新的无水乙醇室温振荡2h，换乙醇/二甲苯(v/v＝1：1)，室温振荡1h；换3次二甲苯，每次室温振荡1h；换新的二甲苯，加入 1/4体积蜡片。

4)浸蜡。将样品置于42℃至蜡片完全融解，融解完全后再加入20ml 蜡片，如此重复至100ml，完全融解后倒掉，倒入融化的蜡，60℃静置过夜，连续换蜡3天，每天两次。最后换新的融化的蜡并将样品整齐摆入模具。

5)切片。将包埋样品的蜡块修成单独的梯形小块，粘在小木块上。装在切片机上，设定蜡片厚度为8μm，旋转手柄切片，将切下的连续蜡带放在A4纸上，镜检，将合适的蜡片置于滴加了DEPC水的载玻片上，置于42℃烘片机上，至蜡片完全展开后吸干DEPC水。42℃烘片2-3天。

1.2.3杂交前预处理

把载玻片放入染色架上，在染色缸中依次进行如下操作

1)置于二甲苯中，静置10min，重复一次；

2)转入无水乙醇中，静置1min，重复一次；

3)置于95％，85％，70％，50％，30％梯度乙醇中，每次30s；

4)转入0.85％ NaCl溶液中，静置2min；

5)转入1×PBS中，静置2min；

6)转入37℃预热的Protein K溶液中，37℃孵育30min；

7)转入0.2％甘氨酸溶液(1g甘氨酸溶于500ml 1×PBS)中，静置2min；

8)转入1×PBS中，静置2min，重复一次；

9)转入4％甲醛溶液中，静置2min；

10)转入1×PBS中，静置2min，重复一次；

11)转入乙酸酐溶液中，轻柔搅拌10min；

12)转入1×PBS中，静置2min，重复一次；

13)转入0.85％ NaCl溶液中，静置2min；

14)置于30％，50％，70％，85％，95％梯度乙醇中，每次30s；

15)转入无水乙醇中，静置1min，重复一次。

1.2.4杂交

1)将载玻片移至玻片板上室温晾干5-10min；

2)将探针稀释(1μl探针+23μl 50％甲酰胺)，80℃变性2min，然后立即置于冰上2-3min，加入96μl杂交液，用移液器轻轻吸打混匀；

3)用2×SSC/50％甲酰胺溶润湿吸水纸，铺在免疫组化湿盒中，并喷洒RNaseZap；

4)先用120μl不加探针的杂交液润洗载玻片，沥干后滴加杂交液120 μl，待均匀覆盖载玻片后盖上盖玻片。将载玻片放入湿盒中，用胶带将湿盒密封，50℃孵育过夜。

1.2.5显色

1)在55℃预热的0.2×SSC中去掉盖玻片，将载玻片重新放入染色架上，转入新的0.2×SSC中，55℃孵育1h；

2)转入新的0.2×SSC中，55℃孵育1h；

3)转入1×NTE中，37℃孵育5min。重复一次；

4)转入含有20μg/ml RNase A的1×NTE中，37℃孵育30min；

5)转入1×NTE中，37℃孵育5min。重复一次；

6)转入0.2×SSC中，55℃孵育1h；

7)转入1×TBS中，室温静置5min；

8)转入封闭液(11745832910Roche)中，室温低速振荡1h；

9)转入1％BSA/0.3％triton X-100溶液，室温低速振荡45min；

10)将玻片用120μl 1％BSA/0.3％triton X-100溶液冲洗2次，甩干。在载玻片上滴加120μl抗体溶液(抗体按1：1250比例稀释在 1％BSA/0.3％triton X-100溶液中)，盖上盖玻片。转入湿盒中，室温孵育 2h；

11)在1％BSA/0.3％triton X-100溶液中去掉盖玻片，将载玻片重新放入染色架上，转入新的1％BSA/0.3％triton X-100溶液中，室温下低速振荡15min，重复三次；

12)转入buffer C中，室温低速振荡5min。重复一次；

13)将载玻片用底物溶液润洗后，两个对贴在一起，转入加有底物溶液的考普林杯，用胶带密封，放置于黑暗环境中，室温下显色1-3d。

1.2.6观察

1)显色完成后，在buffer C溶液中将两张载玻片分开，重新放入染色架上；

2)转入1×TE中漂洗，静置10s，重复一次；

3)转入梯度乙醇中脱水(依次为30％，50％，70％，85％，95％， 100％，100％)，每次5s；

4)转入二甲苯，静置5s，重复一次；

5)用加拿大树胶封片，晾干后与显微镜下观察拍照。

结果显示，ZmLRT在87-1根系中的表达水平显著高于综3(图1A)，这与成熟miR166的表达模式相一致(图1B)，同时与87-1和综3发芽后第8天的苗期侧根数目差异相反(图1C)。以qLRT5-1近等基因系发芽后第8天根系为材料进行的研究结果也显示，ZmLRT和miR166 在含有87-1等位变异的近等基因系中的表达量显著高于含有综3等位变异的近等基因系(图1D-E)，并且与近等基因系发芽后第8天的侧根数目相反(图1F)。ZmLRT基因在苗期根尖、侧根原基、叶片及维管束中均能检测到GUS信号，其中在根尖及侧根原基信号相对较强。在成株期，茎、角果和种子中均不能检测到GUS信号。在花器官的花柱中可以检测到GUS信号，但在花瓣及花药中均未检测到GUS信号(图 2)。ZmLRT基因在根尖及侧根原基中均检测到较强的杂交信号(图3)，这与前面的拟南芥中GUS染色结果相符(图2)。

实施例2：ZmLRT基因的表达分析

2.1烟草瞬时表达

2.1.1载体构建

1)以ZmLRT-一扩-F/R分别对综3和87-1中ZmLRT的全长cDNA 进行扩增；以Exon2-4-一扩-F/R对87-1中ZmLRT的第二至第四外显子进行扩增；以miR167b-一扩-F/R对一个miR167的前体基因进行扩增。 PCR反应体系为：

PCR程序为：94℃1min；98℃10s，58℃15s，68℃30s，30个循环；68℃5min。

二扩反应体系及PCR程序：将上述PCR产物稀释50倍后作为二轮扩增的模板，扩增所用引物序列为二扩-F/R。PCR体系及PCR程序同一轮扩增。

2)进行BP反应。

3)进行LR反应，终载体为pB2GW7。

2.1.2转染烟草及表达分析

1)将农杆菌接种于含有利福平和壮观抗生素的LB液体培养基中， 28℃振荡培养24h。

2)按1:10的比例将菌液接种于10ml含有响应抗生素的LB液体培养基中，加入0.4μl 1M乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)和200μl 0.5 M MES(pH＝5.6),28℃振荡培养12-16h。

3)常温下，3200g离心10min集菌。用含有200μM AS的10mM 的Mg₂Cl重悬菌体，含miR167b的菌液调节OD值至2-3，其余菌液调节OD值至1.0左右，且OD值应基本相同。室温静置3h以上。

4)在相同体积的含87-1类型ZmLRT全长cDNA、综3类型ZmLRT 全长cDNA和87-1ZmLRT第二至第四外显子的菌液中加入少量相同体积的含miR167b的菌液以作为内参基因。将混合好的菌液注射烟草叶片，并标记侵染范围。

5)2-3天后，对侵染范围内的烟草叶片进行取材，提取RNA。

6)对提取的RNA进行miRNA反转录并进行表达分析。

实施例3：ZmLRT转基因功能鉴定

3.1CRISPR载体构建、转基因株系鉴定与根系性状表型考察

3.1.1载体构建

1)在miR166成熟序列处设计gRNA，序列为 5'-TTCTTGTCGATCTCGGACC-3'。

2)合成在5'端分别加有BsaI Bsa酶切位点的正向gRNA序列 (5'-GGCGTTCTTGTCGATCTCGGACC-3')和反向互补gRNA序列(5'- AAACGGTCCGAGATCGACAAGAA-3')。

3)将两条引物以10μM浓度进行混合，65℃热激10min，后立即置于冰上。

4)以如下体系将DNA片段连接pBUE411载体：

37℃孵育5h，50℃5min，80℃10min。

4)将连接好的载体转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定后送测。

5)提取测序正确的阳性菌株，提取质粒，并转化农杆菌。

6)在中国农业大学玉米功能基因组平台用幼胚转化法转染玉米，受体为B73-329。

3.1.2转基因株系鉴定

在gRNA位点两侧设计引物对gRNA附近DNA片段进行扩增。引物为 LRT-CRISPR-F/R。

扩增体系为：

对PCR产物进行测序。选取突变株进行自交。

3.1.3转基因株系根系性状考察

为进一步验证ZmLRT的功能，利用CRISPR/Cas9技术，对miR166的成熟序列进行定点敲除。通过对转基因株系miR166位点附近序列进行扩增及测序，共获得5种突变类型(图4)。其中，lrt-3、lrt-4和lrt-5分别在 miR166成熟序列第4和第5个碱基间插入了G、T和A，并未完全破坏 miR166序列；lrt-1缺失了miR166成熟序列1-10bp的碱基，完全破坏了miR166的序列；lrt-2则在成熟miR166序列中间插入了26bp且造成miR166 5-14bp处碱基的缺失，完全破坏了miR166的序列。因此，以lrt-1和lrt-2 为材料进行了后续的研究。

对ZmLRT敲除株系和野生型发芽后8天的的根系性状进行考察，发现与野生型相比，lrt-1和lrt-2的侧根数目显著增加，lrt-1的主根长没有明显变化，而lrt-2的主根长有所增加(图5)。

实施例4：ZmLRT敲除株系与野生型发芽后8天根系转录组分析

提取野生型与ZmLRT敲除株系lrt-1和lrt-2发芽后8天的根系RNA。每种材料设置3个生物学重复。RNA测序文库的构建、高通量测序由贝瑞和康公司完成，测序平台为NovaSeq测序系统，采用双端测序，每个读长为150bp，每个样品测序数据量为6G。差异表达基因鉴定及GO分析由实验室宋婉君同学协助完成。以|log₂ ^FoldChange|≥1，padj<0.05为阈值筛选差异表达基因。

对野生型、lrt-1和lrt-2不同生物学重复间进行的相关性分析结果显示，同一基因型不同生物学重复间的相关系数均达到了0.99，表明不同生物学重复间具有很高的相关性(图6)。为了验证转录组测序数据的可靠性，随机选取10个基因进行qRT-PCR验证。结果显示，10个基因的表达模式均与转录组测序结果一致(图7)。

以|log₂ ^FoldChange|≥1，padj<0.05为阈值筛选野生型与ZmLRT敲除株系间的差异表达基因。结果表明，lrt-1与野生型之间有4975个差异表达基因，lrt-2与野生型之间有6868个差异表达基因，其中4139个为共同差异表达的基因(图8A)。在4139个差异表达基因中，与野生型相比，在转基因株系中上调和下调表达的基因数目分别为2078个和2061个 (图8B)。

实施例5：ZmLRT敲除株系与野生型抗旱性比较

研究表明，侧根数目的增加会提高玉米苗期的抗旱性(Wang等， "Geneticvariation in ZmVPP1 contributes to drought tolerance in maize seedlings",NatGenet,48:1233-1241,2016b)，所以对野生型和ZmLRT敲除株系的抗旱性也进行了比较。

在条形盆的两侧分别种植野生型和ZmLRT敲除株系，前期正常浇水，一叶一心期后停止浇水，使之自然失水。待植株叶片完全干枯且茎秆出现倒伏后复水，1-2天后统计植株成活率。试验设置3个生物学重复，每个重复野生型和ZmLRT敲除株系至少10颗苗。结果显示，在lrt-1与野生型的比对实验中，野生型复水后的成活率为68.7％，而lrt-1的成活率则为 89.6％，而在lrt-2与野生型的比对实验中，复水后成活率由野生型的16.6％提高到lrt-2的83.9％，说明与野生型相比，lrt-1和lrt-2的抗旱性均有不同程度的提高(图9)。

应当理解，尽管本发明已根据其优选实施例进行了示例性描述，但不应限于上述实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。破坏玉米中的ZmLRT基因所使用的基因编辑方法、载体、 gRNA等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于生产具有抗旱性玉米植物的方法，所述方法包括：

a.通过基因编辑的方法破坏玉米植物中的ZmLRT基因；和

b.选择表现出具有抗旱性的所述玉米植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑由选自以下的方法实现：大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑由CRISPR/Cas9系统的方法实现。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括：

a.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，提供识别玉米植物中ZmLRT基因中的靶位点的sgRNA，并构建CRISPR/Cas9载体；

b.通过CRISPR/Cas9载体转化玉米，破坏玉米植物中ZmLRT基因，获得T1代转基因玉米；和

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述破坏是通过敲除或敲低ZmLRT基因实现的。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205位。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述sgRNA包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述破坏玉米植物中ZmLRT基因是缺失SEQ ID NO:1的第175-194位，破坏ZmLRT基因后的序列如SEQ ID NO:3所示。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述破坏玉米植物中ZmLRT基因是插入26bp且缺失SEQ ID NO:1的第189-198位，破坏ZmLRT基因后的序列如SEQ ID NO:4所示。

10.一种增加玉米植物侧根数目的方法，包括：

a.通过基因编辑的方法破坏玉米植物中的ZmLRT基因；和

b.选择表现出具有增加的侧根数目的所述玉米植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因编辑由选自以下的方法实现：大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、重组酶、转座酶。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因编辑由CRISPR/Cas9系统的方法实现。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法包括：

14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述破坏是通过敲除或敲低ZmLRT基因实现的。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205位。

16.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述sgRNA包含如SEQ ID NO:2所示的序列。

17.一种CRISPR/Cas9系统，包含如下：

1)sgRNA，所述sgRNA的靶位点为SEQ ID NO:1的第185-205位；

2)表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。

18.一种获得ZmLRT基因敲除突变体玉米的特异性sgRNA，其中所述特异性sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

19.权利要求17所述的CRISPR/Cas9系统或权利要求18所述的sgRNA在玉米植物遗传育种中的应用。