CN109913479A - 葡萄circATS1的用途 - Google Patents

Abstract

葡萄circATS1在实现以下任一项或多项作用中的用途：（1）调控植物抗冷性；（2）制备抗冷性植物；（3）制备植物抗冷性调控物质。本发明将circATS1在野生型拟南芥中表达。本发明针对目前植物circRNA研究基础薄弱的现状，克隆葡萄circATS1，为今后利用基因工程技术改良植物抗性，获得具有高抗冷性植株提供依据，具有很大的应用价值。

Description

葡萄circATS1的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及葡萄circATS1的用途。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，与传统的线性RNA(linear RNA，含5’和3’末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，调控miRNA表达。尽管circRNA的功能仍然大部分未知，目前在动物中的一系列研究表明circRNA可以起miRNA海绵吸附的作用；促进其来源基因的转录；在细胞中作为翻译蛋白质模板；细胞间传递信息；具备“记忆存储功能”。然而，植物中的circRNA的功能研究鲜有报道。到目前为止，只有四项研究提供了circRNA在植物中发挥作用的直接证据。在拟南芥中过表达来自At5g37720基因中第一个内含子的套索circRNA可引起多效表型，包括卷曲和簇生叶、开花晚和生育力下降。番茄中过表达源自Phytoene Synthase 1(PSY1)的circRNA后显示出不同的表型，其中一些株系产生红色果实，而另一些株系产生黄色果实。来自拟南芥中SEP3基因外显子6的circRNA能够与其自身的基因座直接相互作用，形成R环并促进外显子跳跃，过表达circRNA植株的花瓣数目增多，雄蕊数量减少。

截至目前，尚没有circRNA其他用途的报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供葡萄circATS1的用途。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供葡萄circATS1在实现以下任一项或多项作用中的用途：(1)调控植物抗冷性；(2)制备抗冷性植物；(3)制备植物抗冷性调控物质。

进一步的，所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种调控植物抗冷性的方法，所述方法采用葡萄circATS1对待调控植株进行抗冷性调控。

本发明第三方面提供一种抗冷性植物的制备方法，至少包括如下步骤：获取葡萄circATS1基因，构建葡萄circATS1过表达载体，将所述葡萄circATS1过表达载体导入到目标植株中，获得葡萄circATS1转基因植株。

如上所述，本发明的葡萄circATS1的用途，具有以下有益效果：

本发明将circATS1在野生型拟南芥中表达。本发明针对目前植物circRNA研究基础薄弱的现状，克隆葡萄circATS1，为今后利用基因工程技术改良植物抗性，获得具有高抗冷性植株提供理论依据，具有很大的应用价值。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的葡萄circATS1全长克隆验证结果；

图2为本发明的葡萄circATS1基因在不同组织的表达情况；

图3为本发明的葡萄circATS1基因在冷胁迫(4℃)后0-72h的表达情况；

图4为转葡萄circATS1基因拟南芥植株的RT-PCR检测；

图5为转葡萄circATS1基因对拟南芥的抗冷表型情况。

具体实施方式

胁迫反应是植物研究中的一个重要方向。植物circRNA在非生物、生物胁迫和不同的生长发育阶段均会发生差异表达现象。温度是影响葡萄区域分布和正常生长的重要限制环境因素之一。在晚春葡萄萌芽期间，温度的骤降会损害嫩叶并导致落花进而影响产量，严重时甚至会导致葡萄树体死亡。同样，秋季的早霜也会导致葡萄产量损失。但是，关于冷胁迫如何影响植物中circRNA的表达模式知之甚少，以及circRNA是否真正参与冷胁迫反应过程都没有直接证据。

针对以上，本发明针对一种来源于葡萄甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的circRNA展开克隆及功能研究，特别是在抗冷中的功能。

本发明提供葡萄circATS1在实现以下任一项或多项作用中的用途：(1)调控植物抗冷性；(2)制备抗冷性植物；(3)制备植物抗冷性调控物质。

所述调控植物抗冷性是指，提高植物的耐寒能力。优选的，能使经抗冷性调控的植物在气温至少为4℃条件下，生长状态优于同种未经抗冷性调控的植物。

所述葡萄circATS1是指来源于葡萄的甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的circRNA。

进一步的，所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述至少70％的同源性可以为至少80％的同源性、至少90％的同源性、至少95％的同源性、至少98％的同源性或至少99％的同源性。可选的，为80％的同源性、90％的同源性、95％的同源性、少98％的同源性或99％的同源性。

SEQ ID NO：1具体为：

CAATTCATATGTTGGCAACATCTCCCTTTTCTGTGATATGGAAGAGAAGCTTCAGCAGGGTCACAATATTGTCCTGATTTCCAACCATCAAACAGAAGCAGACCCAGCTGTCATTGCCTTGTTGCTTGAATCAACAAATCCACTTATTGCTGAGAACATGATCTATGTAGCTGGAGATAGGGTTGTAACAGATCCTCTTTGCAAGCCCTTCAGCATGGGAAGGAATCTCTTGTGTGTGTACTCAAAAAAGCACATGAATGATGTCCCTGAACTTGCTGAGATGAAAAGAAGAGCAAACACACGAAGTTTAAAGGAAATGGCTTTGCTTCTAAG

在一种实施方式中，所述植物选自拟南芥(Arabidopsis thaliana Col.)。

本发明提供的调控植物抗冷性的方法，所述方法采用葡萄circATS1对待调控植株进行抗冷性调控。

在一种实施方式中，所述方法为将葡萄circATS1的基因转化到待调控的植株中，获得circATS1转基因株系。

在一种实施方式中，所述植株选自拟南芥。

在一种实施方式中，采用PCR扩增法获取葡萄circATS1的基因，用于扩增葡萄circATS1基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

进一步的，所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述至少70％的同源性可以为至少80％的同源性、至少90％的同源性、至少95％的同源性、至少98％的同源性或至少99％的同源性。可选的，为80％的同源性、90％的同源性、95％的同源性、少98％的同源性或99％的同源性。

在一种实施方式中，利用实时荧光定量PCR法检测葡萄circATS1转基因植株中葡萄circATS1的表达量，用于对葡萄circATS1的荧光定量PCR分析的特异性扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

本发明提供的抗冷性植物的制备方法，至少包括如下步骤：

获取葡萄circATS1基因，构建葡萄circATS1过表达载体，将所述葡萄circATS1过表达载体导入到目标植株中，获得葡萄circATS1转基因植株。

在一种实施方式中，所述获取葡萄circATS1基因的方法为PCR扩增法，用于扩增葡萄circATS1基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；

或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述至少70％的同源性可以为至少80％的同源性、至少90％的同源性、至少95％的同源性、至少98％的同源性或至少99％的同源性。可选的，为80％的同源性、90％的同源性、95％的同源性、少98％的同源性或99％的同源性。

在一种实施方式中，利用实时荧光定量PCR法检测葡萄circATS1转基因植株中葡萄circATS1的表达量，用于对葡萄circATS1的荧光定量PCR分析的特异性扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

在本发明中，可用实时荧光定量PCR的方法分析葡萄circATS1的表达模式，即分析葡萄circATS1的RNA转录物在细胞组织中的存在与否以及数量。

本发明的葡萄circATS1核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明核苷酸序列中。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1、葡萄circATS1的全长克隆

1.植物材料的获得

本实验所用的植物材料为生产上广泛栽培的欧亚种鲜食兼酿酒葡萄‘玫瑰香’为试材。实验材料培养于上海交通大学现代工程训练中心(31°11′N，121°29′W)。采用避雨栽培，培养基质为土壤和珍珠岩(1：1)混合物。南北行向，株行距为1.5m×2.0m，单干双臂树形，冬季短梢修剪，根据Wang等(Wang et al.,2012.Root restriction affectsanthocyanin accumulation and composition in berry skin of'Kyoho'grape(Vitisvinifera L.x Vitis labrusca L.)during ripening.Scientia Horticulturae.137:20-28.)进行施肥和灌溉管理。于2016年生长季采集葡萄的叶片用于提取RNA。

2.RNA的提取及逆转录

使用植物RNA提取试剂盒(DP441，天根生化科技(北京)有限公司)按照标准说明书操作步骤提取葡萄总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TAE电泳缓冲液；160v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。使用随机引物逆转录成cDNA，逆转录试剂盒使用PrimeScript^TMRTMaster Mix(Perfect Real Time)(宝日医生物技术(北京)有限公司)。

3.circATS1的全长克隆

使用Primer Express 3.0.1软件设计一组背靠背的引物：

F1(SEQ ID NO.2)：5′-AGAAGCAGACCCAGCTGTCATT-3′

R1(SEQ ID NO.3)：5′-TGATGGTTGGAAATCAGGACAA-3′

使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应(20ul反应体系中，10ulPrimeSTAR Master Mix，上下游引物0.3uM，模板1ul，用水补齐至20ul)，程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃10s 34个循环；72℃延伸5mins。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，生工生物)按照标准操作步骤进行纯化。并连接到-T1 Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序，通过Sanger测序确认反向剪接位点的存在(图1)。最后，得circATS1全长序列SEQ ID NO.1。本发明葡萄circATS1的全长序列为333bp(图1)，详细序列见SEQ ID NO.1。

实施例2、葡萄circATS1在不同组织及不同低温处理时间点中的表达

1.植物材料的获得

2016年生长季分别采集葡萄根、茎、叶、花、果，将样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃超低温冰箱中贮存待用。

当‘玫瑰香’葡萄幼苗新梢有四片叶片发育良好时，将幼苗移到冷库进行低温处理，处理温度为4℃，恒定光照(47umol m^-2s^-1)。在0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h和72h时取样完全展开叶片，三次重复。取样后的样品置于液氮中快速冷冻并储存在-80℃低温冰箱。

2.RNA的提取

使用植物RNA提取试剂盒(DP441，天根生化科技(北京)有限公司)按照标准说明书操作步骤提取葡萄总RNA。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5×TAE电泳缓冲液；160v，15min)检测完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示rRNA样品的降解。纯度较好的RNA，A₂₆₀/A₂₈₀以及A₂₆₀/A₂₃₀约为2.0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

3.cDNA的获得

以500ng的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent KitPerfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。

4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织和不同低温处理时间点中的表达量。根据已经获得的葡萄circATS1序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR中葡萄circATS1基因定量分析的特异性引物，

circATS1-F(SEQ ID NO.4)：5′-ATGAATGATGTCCCTGAACTTGCT-3′

circATS1-R(SEQ ID NO.5)：5′-TGATGGTTGGAAATCAGGACAA-3′

内参基因为Actin，其引物为

ACTIN-F(SEQ ID NO.6)：5′-CTTGCATCCCTCAGCACCTT-3′

ACTIN-R(SEQ ID NO.7)：5′-TCCTGTGGACAATGGATGGA-3′

5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供)将标准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。

6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板，分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在实时荧光定量PCR仪(CFX connect Real Time PCR Detection System，Bio-Rad)进行，反应体系为采用20ul体系(10ul SYBR Premix Ex Taq，上下游引物0.3uM，模板1ul，其余用水补齐)，程序如下：95℃30s；95℃5s，60℃10s，40个循环。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是否为特异产生。

7.采用2^-△△Ct法作相对定量分析。结果表明circATS1在葡萄的根、茎、叶、花、果中都有表达，叶和花组织中的表达量高于根、茎和果实三种组织，说明circATS1的表达具有明显的空间差异性(图2)。对低温处理后不同时间点circATS1的表达情况进行检测，结果显示在冷胁迫2h时circATS1的表达量略有增加，在4、8和12h下降，然后随着低温处理时间的延长逐渐增加(图3)。

实施例3、葡萄circATS1转拟南芥的功能验证

3.1构建葡萄circATS1过表达载体

用于葡萄circRNA过表达的核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。具体为：

AAGCTTCTTGTGCTCAACTTATCACTCCAGATACCTTTTACCACCATGCCTAGATGGTTAAAATTTTGGCCTAAAAGTACTATAATGGAATCCCATATTTCTTCTTAGCCTAGTGTTGCTTTCAAAATTACCAAAACCATCTAACACTAAAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAAAACAAATTGTATTCCCGGATGGAACCAAAATCTAGTTCATTATTATTCAGAACCAAACAAGTTTAATATTTAAATAATAATAATAATAATAACAACAATAATTATAATTTTTTTATGAAAAAAAAACATCTACATGTCAATAATACATAAATATATTTATATGATCATATCATTCGAAAAAAACTGAAGCAAACACCAGAATTATTATTAATTATCAATACCATCATCATCATCCTTGCTGTACAGGATCCCTGCAGTGTACAGCAAGGATGATGATGATGGTATTGATAATTAATAATAATTCTGGTGTTTGCTTCAGTTTTTTTCGAATGATATGATCATATAAATATATTTATGTATTATTGACATGTAGATGTTTTTTTTTCATAAAAAAATTATAATTATTGTTGTTATTATTATTATTATTATTTAAATATTAAACTTGTTTGGTTCTGAATAATAATGAACTAGATTTTGGTTCCATCCGGGAATACAATTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTAGTGTTAGATGGTTTTGGTAATTTTGAAAGCAACACTAGGCTAAGAAGAAATATGGGATTCCATTATAGTACTTTTAGGCCAAAATTTTAACCATCTAGGCATGGTGGTAAAAGGTATCTGGAGTGATAAGTTGAGCACAAGTCTAGA。

以植物过表达载体pHB为基础载体，进行改造获得circRNA过表达载体。

具体实施方案如下：

1.上游环化驱动序列的克隆和连接

从葡萄基因VIT_13s0074g00100内部选取内含子片段，长度为416bp，为上游环化驱动序列。在两端分别添加BamHI、HindIII酶切位点序列，设计扩增引物：

Up-F：cggggatccTGTACAGCAAGGATGATGATG(SEQ ID NO:9)

Up-R：cggaagcttCTTGTGCTCAACTTATCACTCC(SEQ ID NO:10)

使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应(20ul反应体系中，10ulPrimeSTAR Master Mix，上下游引物0.3uM，模板1ul，用水补齐至20ul)，程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃10s 34个循环；72℃延伸5mins。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131，生工生物)按照标准操作步骤进行纯化。并连接到-T1 Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。分别对提取的质粒和pHB载体质粒进行酶切处理，酶切反应体系如下：

将上述反应液置于37℃保温30分钟，之后经琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收。

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝日医生物技术(北京)有限公司)将目的片段与酶切后的表达载体片段连接，反应体系如下：

将上述反应液置于16℃保温30分钟。转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提，试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。

2.下游环化驱动序列的克隆和连接

下游环化驱动序列是上游环化驱动序列的反向互补序列。引物设计时在两端分别添加PstI、XbaI酶切位点序列，设计扩增引物：

Down-F：cggctgcagTGTACAGCAAGGATGATGATG(SEQ ID NO:11)

Down-R：cggtctagaCTTGTGCTCAACTTATCACTCC(SEQ ID NO:12)

同样以葡萄DNA为模板，使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶进行PCR反应，之后连接克隆载体-T1 Simple Cloning Vector(北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司)载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。分别对提取的质粒和已经包含上游环化驱动序列的pHB载体质粒进行酶切处理，酶切反应体系如下：

将上述反应液置于37℃保温30分钟，之后经琼脂糖凝胶电泳之后切胶回收。

使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝日医生物技术(北京)有限公司)将目的片段与酶切后的表达载体片段连接，反应体系如下：

将上述反应液置于16℃保温30分钟。转化大肠杆菌DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科新业生物技术有限公司(上海)进行测序。对测序正确的单菌落过夜摇菌，按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽，提试剂盒(生工生物)标准说明书操作步骤提取质粒。获得的载体质粒称为circRNA-OE，为过量表达circRNA的载体。

3.2过表达葡萄circRNA拟南芥的培养

待拟南芥生长约一个月，采用花絮侵染法转化野生型拟南芥，将3.1中所述的circRNA-OE导入到野生拟南芥中，获得circATS1-OE转基因株系。首先，吸取10ul农杆菌接菌于含有卡那霉素和利福平LB培养液中的试管中，28℃，180rpm摇24h进行活化。之后，吸取200ul活化菌液转至含有卡那霉素和利福平的100ml LB培养液中，28℃，200rpm培养，测OD值，当菌液OD600达到1.0-1.5之间时，6000rpm离心3min收集菌体。用100ml转化液(50g/L蔗糖，2.2g/L MS，0.04％Silwet L-77，pH为5.8)重悬菌体。转化时将花置于转化液中浸泡60s，期间轻微摇动，黑暗培养24h，后正常培养直到种子成熟，收集种子，为T1代种子。

将T1代种子播散于培养基质中，待长至两片真叶时，用工作液浓度为0.002％的Basta喷洒，一周后野生型死亡，将正常生长的转化株(T1代植株均为杂合子)转移至新的培养穴盘中，收获T2代种子。播散T2代种子至长至两片真叶时，将喷洒Basta后出现3：1分离比的成活单株移到新的培养穴盘中收获T3代种子。播散T3代种子，喷洒Basta后全部成活为纯合体株系，可用于表型分析。

对获得的株系采用Real-time PCR检测circATS1的表达量(图4)引物为SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5。所用拟南芥内参基因为actin2，引物如下：

SEQ ID NO：13：5′-CTTGCACCAAGCAGCATGAA-3′

SEQ ID NO：14：5′-CCACCGATCCAGACACTGTACTT-3′

将筛选得到的阳性转化株同野生型正常培养14天后，一同置于4℃/光下培养30天。结果显示，野生型明显出现叶片白化受损，而circATS1转基因植株生长状态明显好于野生型(图5)。这说明circATS1具有提高拟南芥抗冷性的功能。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 葡萄circATS1的用途

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caattcatat gttggcaaca tctccctttt ctgtgatatg gaagagaagc ttcagcaggg 60

tcacaatatt gtcctgattt ccaaccatca aacagaagca gacccagctg tcattgcctt 120

gttgcttgaa tcaacaaatc cacttattgc tgagaacatg atctatgtag ctggagatag 180

ggttgtaaca gatcctcttt gcaagccctt cagcatggga aggaatctct tgtgtgtgta 240

ctcaaaaaag cacatgaatg atgtccctga acttgctgag atgaaaagaa gagcaaacac 300

acgaagttta aaggaaatgg ctttgcttct aag 333

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agaagcagac ccagctgtca tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatggttgg aaatcaggac aa 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaatgatg tccctgaact tgct 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgatggttgg aaatcaggac aa 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgcatccc tcagcacctt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctgtggac aatggatgga 20

<210> 8

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagcttcttg tgctcaactt atcactccag atacctttta ccaccatgcc tagatggtta 60

aaattttggc ctaaaagtac tataatggaa tcccatattt cttcttagcc tagtgttgct 120

ttcaaaatta ccaaaaccat ctaacactaa aaaaacaaaa acaaaaacaa aaacaaaaac 180

aaattgtatt cccggatgga accaaaatct agttcattat tattcagaac caaacaagtt 240

taatatttaa ataataataa taataataac aacaataatt ataatttttt tatgaaaaaa 300

aaacatctac atgtcaataa tacataaata tatttatatg atcatatcat tcgaaaaaaa 360

ctgaagcaaa caccagaatt attattaatt atcaatacca tcatcatcat ccttgctgta 420

caggatccct gcagtgtaca gcaaggatga tgatgatggt attgataatt aataataatt 480

ctggtgtttg cttcagtttt tttcgaatga tatgatcata taaatatatt tatgtattat 540

tgacatgtag atgttttttt ttcataaaaa aattataatt attgttgtta ttattattat 600

tattatttaa atattaaact tgtttggttc tgaataataa tgaactagat tttggttcca 660

tccgggaata caatttgttt ttgtttttgt ttttgttttt gtttttttag tgttagatgg 720

ttttggtaat tttgaaagca acactaggct aagaagaaat atgggattcc attatagtac 780

ttttaggcca aaattttaac catctaggca tggtggtaaa aggtatctgg agtgataagt 840

tgagcacaag tctaga 856

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggggatcct gtacagcaag gatgatgatg 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggaagcttc ttgtgctcaa cttatcactc c 31

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggctgcagt gtacagcaag gatgatgatg 30

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggtctagac ttgtgctcaa cttatcactc c 31

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttgcaccaa gcagcatgaa 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccaccgatcc agacactgta ctt 23

Claims (10)

1.葡萄circATS1在实现以下任一项或多项作用中的用途：(1)调控植物抗冷性；(2)制备抗冷性植物；(3)制备植物抗冷性调控物质。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述植物选自拟南芥。

4.一种调控植物抗冷性的方法，其特征在于，所述方法采用葡萄circATS1对待调控植株进行抗冷性调控。

5.如权利要求4所述的调控植物抗冷性的方法，其特征在于，所述方法为将葡萄circATS1的基因转化到待调控的植株中，获得circATS1转基因株系。

6.如权利要求4-5任一所述的调控植物抗冷性的方法，其特征在于，所述植株选自拟南芥。

7.一种抗冷性植物的制备方法，至少包括如下步骤：

获取葡萄circATS1基因，构建葡萄circATS1过表达载体，将所述葡萄circATS1过表达载体导入到目标植株中，获得葡萄circATS1转基因植株。

8.如权利要求7所述的抗冷性植物的制备方法，其特征在于，所述获取葡萄circATS1基因的方法为PCR扩增法，用于扩增葡萄circATS1基因的引物对的碱基序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

9.如权利要求7所述的抗冷性植物的制备方法，其特征在于，所述葡萄circATS1的核苷酸序列为：

1)如SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列；或者

2)与SEQ ID NO：1第1～333位所示核苷酸序列具有至少70％的同源性的核苷酸序列；或者

3)能与SEQ ID NO：1第1～333位所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

10.如权利要求7所述的抗冷性植物的制备方法，其特征在于，利用实时荧光定量PCR法检测葡萄circATS1转基因植株中葡萄circATS1的表达量，用于对葡萄circATS1的荧光定量PCR分析的特异性扩增引物对的碱基序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。