CN116286869B

CN116286869B - 一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用

Info

Publication number: CN116286869B
Application number: CN202310290035.2A
Authority: CN
Inventors: 李鸿彬; 李榕; 王斐; 孙博瀚
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2023-03-23
Filing date: 2023-03-23
Publication date: 2024-04-05
Anticipated expiration: 2043-03-23
Also published as: CN116286869A

Abstract

本发明公开了一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用，属于基因工程技术领域。所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明克隆得到羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14，并且成功构建其植物表达载体并转化，在转基因植物中研究该基因的功能，经实验证实，SpSWEET14基因可以提高植物的抗寒性能，这对于揭示羽毛针禾的抗逆机理，丰富植物抗逆分子生物学理论，提高植物的耐胁迫能力，具有重要的意义。

Description

一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用。

背景技术

植物的生长和发育是依靠植物本身与周围环境进行物质和能量交换而维持的。外界环境由温度、光照、湿度、土壤成分和周围生物等各类重要因素组成。因此研究植物对外界环境胁迫的耐受性及其抗性具有非常重要的实际意义。低温是影响植物产量和分布的一个重要环境因素。在植物的生活史中，如春季的水稻育秧，旱田从播种到出苗，且出苗后的一段时间，还有正在正常生长发育的作物一生，总会遇到低温的威胁。低温的影响主要是冷害和冻害。低温胁迫不仅会导致植物产量的降低，严重时还会造成植株的死亡。

特色沙漠植物羽毛针禾(Stipagrostispennata)是多年生草本植物，每年羽毛针禾地上部分开花结果后到了秋冬季枯黄，地下组织根结部分会度过漫长而寒冷的冬天，第二年春天在原来的根部重新长出新的叶片和根。新疆冬天最低温度可以到零下40℃，充分说明新疆特色植物羽毛针禾具有抗低温的能力。

可溶性糖在植物生长发育和逆境胁迫响应调控中具有重要作用。在逆境胁迫下，植物通过调节体内可溶性糖的再分配，维持细胞渗透势的平衡，以利于植物在逆境胁迫下维持正常生长(Yamada等，2010)。在低温逆境下植物体内常常积累大量的可溶性糖，可溶性糖能够提高植物组织抗冷性是因为：1)可以提高细胞渗透势，降低细胞水势，减少水分流失，在低温下起保护剂的作用；2)可以提供能源和底物，诱导其他抗寒有关的生理生化过程，如蛋白质的合成等，提高抗寒力；3)某些糖能直接与细胞组分分子相连接，对细胞膜与酶起到稳定作用。随着温度的降低，可溶性糖含量呈增加趋势，但品种间变化的程度存在差异，抗寒性强的品种，可溶性糖含量高(Yuanyuan et al，2009)。基于生化、分子和遗传等基础实验结果表明，可溶性糖在植物代谢的控制中发挥中心作用，在生物胁迫和非生物胁迫下与植物的碳氮代谢和光合作用有密切的联系(Li Yet al，2008；Xiao BZ et al，2009)。

糖转运蛋白是调控可溶性糖再分配的关键因子，能够响应多种逆境胁迫，与植物逆境适应密切相关。SWEET(sugars will eventually be exportedtransporter)是一类新型的糖转运蛋白，具有七个跨膜结构域，存在于原核生物、人类、植物以及动物中，可以调节单糖和二糖的运输，可顺浓度梯度对糖分进行双向跨膜运输。有人鉴定出了一个SWEET糖转运蛋白，该SWEET蛋白能不依赖于环境pH值，只利用细胞内外浓度差促进糖跨越细胞膜的浓度梯度扩散，从而参与植物光合产物的运输和分配过程(Chandran，2015)。植物SWEET蛋白属于Mt N3/saliva家族，由中心保守性较低的单个跨膜α-螺旋，以及分别位于SWEET蛋白N端和C端的相对保守的2个重复的3次α-螺旋跨膜结构域构成(Chen等，2010)。糖转运蛋白SWEET在植物响应胁迫中发挥重要作用。在茶树(Camellia sinensis)自然冷驯化过程中，CsSWEET1和CsSWEET17的表达量急剧增加(Yue等，2015)。关于拟南芥AtSWEET基因响应非生物胁迫的研究较为深入。AtSWEET16和AtSWEET17均与非生物胁迫有关。在低氮和冷胁迫条件下，atsweet17突变体植株叶片中果糖含量明显增加，根生长量显著减少；冷胁迫条件下，过表达AtSWEET17植株叶片中果糖含量降低了80％，但根生长量明显增加(Guo等，2014)。低温、干旱和高盐胁迫均可诱导拟南芥AtSWEET15的表达(Seo等，2011；He等，2008)。AtSWEET11和AtSWEET12的表达量受水分胁迫的调节。在水分亏缺条件下，拟南芥植株叶片中与蔗糖韧皮部装载相关的3个基因AtSWEET11、AtSWEET12和AtSUC2表达量增加，说明这些基因在根中可能具有蔗糖韧皮部卸载的功能(Durand等，2016)。

本发明建立了羽毛针禾cDNA文库后，从羽毛针禾文库中克隆了一个新的糖转运蛋白基因SWEET14，并命名为SpSWEET14。为了研究该基因的功能，本发明构建了该基因的植物表达载体，并将此基因导入拟南芥中，以促进植物的抗寒性。

发明内容

本发明的目的是提供一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建转SpSWEET14基因型植物，发现该转基因植物相比于野生型植物，抗寒性能显著提高，为植物耐寒胁迫的改良育种提供新思路。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用，所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述植物包括拟南芥。

本发明还提供一种用于克隆羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14全长的引物，包括如SEQ ID NO：3所示的正向引物和SEQ ID NO：4所示的反向引物。

本发明还提供一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的重组载体，所述重组载体含有所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14。

本发明还提供一种重组菌，包括所述的重组载体。

本发明还提供一种所述的重组载体或所述的重组菌在提高植物抗寒性中的应用。

本发明还提供一种促进植物抵抗冷胁迫的方法，将所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14通过转基因或有性杂交转育途径导入植物中；所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明公开了以下技术效果：

本发明克隆得到羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14，并且成功构建其植物表达载体并转化，通过对野生型WT、转SpSWEET14基因、Atsweeet14基因突变体和SpSWEET14转Atsweet14这四种植株进行冷处理后发现，冻伤最厉害的是Atsweeet14突变体，其次是野生型拟南芥；转SpSWEET14基因型拟南芥抗冻效果最好，其次是SpSWEET14转Atsweet14型拟南芥。相对于Atsweeet14突变体，SpSWEET14转Atsweet14型拟南芥冻伤有明显缓和。实验结果说明SpSWEET14基因可以提高植物的抗寒性能。这对于揭示羽毛针禾的抗逆机理，丰富植物抗逆分子生物学理论，提高植物的耐胁迫能力，具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为糖转运蛋白SpSWEET14基因的PCR扩增图；其中M：Marker D2000；1-3：SpSWEET14基因扩增条带；

图2为35S::SpSWEET14的双酶切验证图；其中M：MarkerⅢ；1-2：重组质粒双酶切验证条带；

图3为35S::SpSWEET14转化农杆单克隆菌的PCR图；其中M：Marker D2000；1-6：菌液PCR条带；

图4为野生型(WT)、SpSWEET14转基因型、突变体sweet14和SpSWEET14转Atsweet14四种拟南芥0℃处理后的表型；

图5为植物表达载体pBI1300的质粒图谱。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实验所涉及的用品pMD-19T克隆载体和LAtaq酶购自TaKaRa生物公司；RNA提取试剂盒购自Omega公司；cDNA第一链反转录试剂盒、T₄连接酶、快速限制性内切酶购自Fermentas生物公司；RNA反转录试剂盒、LATaq DNAPolylnerase、T4-DNA Ligase等相关试剂购自大连宝生物公司；XbaⅠ、XmaⅠ等相关酶购自Fermentas公司；2×Taq PCRMaster Mix，DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取微量试剂盒购自TIANGEN公司；试验所用卡那霉素、庆大霉素、MES、乙酰丁香酮、MgCl₂及培养基配制等化学试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物工程公司。PCR所用引物的合成和DNA测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

实施例1：羽毛针禾的培育及种植

将野外采集回来的羽毛针禾种子烘干，选择饱满的籽粒，去除颖果果皮后放入0.05％的GA3溶液中浸泡24h。将从野外带回的沙土装满铺垫有两层报纸的花盆中，浇灌自来水后，用镊子底端按出深度约1cm的沙坑，将使用GA3浸泡后的种子用镊子夹起放入沙坑中，并适量沙子覆盖，最后放入37℃环境下培养，观察发芽情况，适时收取组织样本，成功获得用来进行后续RNA提取的羽毛针禾材料。

实施例2：羽毛针禾总RNA的提取及cDNA的合成

参照Omega公司的植物总RNA提取试剂盒的说明书进行羽毛针禾样品总RNA的提取，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，用反转录试剂盒合成cDNA，成功获得cDNA。

实施例3：羽毛针禾糖转运蛋白SpSWEET14的克隆

在实验室前期的研究基础上，参照转录组测序结果，设计引物SpSWEET14-F其序列为5’-ATGGCTGGTCTTTCTCTTCA-3’(SEQ ID NO：3)和SpSWEET14-R其序列为5’-GACGGCGTTGCTTCCC-3’(SEQ ID NO：4)，以羽毛针禾的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：cDNA(50ng/μL)1μL，2×Taq PCRMaster Mix 10μL，引物SpSWEET14-F0.5μL，引物SpSWEET14-R 0.5μL，ddH₂O 8μL，共20μL。扩增程序为：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃保存。使用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物(图1)后，并回收目的条带，送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。SpSWEET14基因的测序结果如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SpSWEET14基因的测序结果(SEQ ID NO：1)：

5’-ATGGCTGGTCTTTCTCTTCAGCATCCCTGGGCCTTTGCCTTTGGCCTCCTAGGCA ACATCATCTCCTTCATGACCTACCTAGCCCCACTTCCGACGTTCCACCGGATCTACAAGAACAAGTCAACCGAGGGTTTCCAGTCGGTGCCCTACGTGGTGGCGCTGTTCAGCGCGATGCTGTGGATCTACTACGCGCTGCTCAAGTCCGACGAGTGCCTCCTCATCACCATCAACTCCGCCGGCTGCGTCATCGAGACGCTCTACATCATGGTCTACCTCGCTTACGCGGCCAAGGAGGCCAGGCTGTTCACGGCCAAGATCCTGCTTCTACTCAACGTGGGGGTGTTTGGGCTCATCCTTCTTCTTACGCTGCTGCTCTCTGCCGGCGAGAAGCGCATCGTCCTCCTCGGCTGGGTCTGCGTTGGCTTCTCCGTCTGCGTCTTCGTCGCGCCTCTCAGCATCATTCGTCAGGTCGTGCGCACGAGGAGCGTGGAGTACATGCCCTTCTCCCTCTCCCTCTCGCTCACCATCAGCGCTGTTGTCTGGTTCCTCTATGGCCTTCTCATCAGGGACAAATACGTAGCACTGCCGAATATCCTGGGATTCACCTTCGGTGTCATCCAGATGGGGCTCTACGCGCTCTACCGCCACGCGACACCCAGGCTGCCAGCTGCCAAGGAAGTGTCCGACGATGAGGAGTCAGTGGCTGACGTTATCCAGGTGCCTGAGCACGTCATGACCATCGCAAAGCTTGGCACACCAGCCGTCGAGCTCAAGGGCACTGAGGTGTCTCCCATGGAGTCCCGGTTGACGGGCAAGAACAAGCAGGAGGAACATCCGGTGGTTAAGGAGGAGAAGGGCAACGTGGCGGACATGGGAAGCAACGCCGTCTAG-3’；

SpSWEET14蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

MAGLSLQHPWAFAFGLLGNIISFMTYLAPLPTFHRIYKNKSTEGFQSVPYVVALFSAMLWIYYALLKSDECLLITINSAGCVIETLYIMVYLAYAAKEARLFTAKILLLLNVGVFGLILLLTLLLSAGEKRIVLLGWVCVGFSVCVFVAPLSIIRQVVRTRSVEYMPFSLSLSLTISAVVWFLYGLLIRDKYVALPNILGFTFGVIQMGLYALYRHATPRLPAAKEVSDDEESVADVIQVPEHVMTIAKLGTPAVELKGTEVSPMESRLTGKNKQEEHPVVKEEKGNVADMGSNAV-。

实验结果表明上海生工生物工程股份有限公司进行测序的结果与转录组测序结果一致，SpSWEET14基因克隆成功。

实施例4：构建SpSWEET14基因植物表达载体

用Kpn I/Xba I双酶切含有35S启动子的植物表达载体pBI1300(购自淼灵质粒平台：www.miaolingbio.com)，获得载体片段。回收目的基因片段和载体片段。将目的基因片段与载体片段进行体外连接，连接反应条件：16℃恒温连接6h；植物表达载体pBI1300的质粒图谱详见图5。经鉴定正确的重组质粒分别命名为35S::SpSWEET14。利用Xba I和Xma I两个酶进行酶切，后利用琼脂糖凝胶电泳进行可视化鉴定，图2为35S::SpSWEET14的双酶切验证图。实验结果表明SpSWEET14基因植物表达载体构建成功。

实施例5：农杆菌的转化

在超净工作台内操作：将已经鉴定的植物表达载体转入农杆菌GV1301，转化步骤如下：(1)取5μl已鉴定好的质粒，加入到100μl农杆菌感受态细胞中，混匀，冰浴20min；

(2)液氮中放置3-5min；

(3)37℃热激5min，冰浴2min；

(4)加入600μl新鲜无任何抗生素的LB培养基，混匀后在28℃，200rpm，震荡培养4-5h；

(5)5000rpm，离心5min；

(6)弃上清，留有100μl菌液涂布在含Rif(100mg/L)、Gen(50mg/L)和Kan(50mg/L)的LB固体培养基上，28℃恒温培养箱培养2d。

在平板中挑取单克隆并PCR鉴定正确即为目的基因成功的转入农杆菌。图3为35S::SpSWEET14转化农杆单克隆菌的PCR图，实验结果表明获得转SpSWEET14基因的农杆菌。

实施例6：滴花法浸染拟南芥

(1)待种植的野生型拟南芥，出薹高度达到3-4cm左右时，剪掉顶生花序，刺激其腋生花序生长，应注意避免伤到腋生花序，待腋生花序长出，即可进行转化，在第一次转化前，应将已授粉花和果荚去除掉，以便减少筛选时的工作量；

(2)浸染液的准备：在含三抗(50mg/LKan、50mg/L Gen、20mg/LRif)的LB液体中活化已鉴定含目的基因的农杆菌，28℃震荡培养过夜，将过夜培养的菌按1:100接种于100mL含三抗的LB液体中进行扩大培养约6-8h，当菌液OD₆₀₀达到1.5-2.5时，取出菌液，4℃，5000rpm离心5min，倒掉上清，用液体1/2MS(5-6％蔗糖+0.02％Silwet L-77)悬浮沉淀，使OD₆₀₀达到0.8左右；

(3)用200μl的移液器吸取侵染液，小心滴在花蕾上，尽量不要滴到叶片上，将浸染后的拟南芥暗培养24小时后，正常培养，大约每周浸染两次，共浸染5-6次。浸染完成后，将拟南芥于长光照下培养，待果荚变黄后，收集种子，进行后期实验。

(4)将收集的种子播种在含有三抗(50mg/L Kan、50mg/L Gen、20mg/L Rif)的平板中，转化成功的幼苗持续生长会是绿色，转化失败的幼苗会变黄枯死。使用表型初步筛选出转化成功的阳性植株，后续收集转化成功的阳性植株种子。

在本实施方案中，选用拟南芥作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。

实施例7：转基因拟南芥的鉴定

将收集的浸染后的拟南芥种子，按照常规的种植方法，在无菌操作台上将其播种在1/2MS(含有50mg/LKan)固体的培养基上，在人工气候室生长两到三周后，未转化成功的拟南芥幼苗会逐渐白化死亡，转化成功的拟南芥幼苗则会正常生长。将正常生长的拟南芥转移至培养土中继续培养，之后提取初步筛选的拟南芥的DNA，进行PCR鉴定，获得阳性植株，保证后续实验的进行。

实施例8：

构建突变体Atsweet14和SpSWEET14转Atsweet14拟南芥：

在拟南芥Tair网站(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)查找AtSWEET14基因对应的基因ID:AT4G25010，并通过突变体购买网站(https://www.arashare.cn/index/)查得对应的突变体拟南芥:SALK_011333C，完成拟南芥突变体Atsweet14种子的购买。参照SpSWEET14转基因拟南芥实验步骤，获得SpSWEET14转Atsweet14突变体基因回补拟南芥。冷胁迫实验过程及结果分析：

将野生型(WT)、SpSWEET14转基因型、突变体sweet14和SpSWEET14转Atsweet14拟南芥在同一条件下(具体条件为：21℃恒温环境下，自然光照18h，黑暗6h)进行培养，播种后30天将四种拟南芥放在0℃环境处理12h后，观察表型。结果如图4，突变体sweet14已经基本冻死，WT拟南芥较突变体sweet14有所缓和，SpSWEET14转基因型拟南芥长势正常，只有个别叶片有冻伤斑，SpSWEET14转Atsweet14拟南芥较突变体也好转，充分说明SpSWEET14具有提高植物抗冻的能力。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用，其特征在于，所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述植物为拟南芥。

2.一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1中所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14。

3.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求2所述的重组载体。

4.一种如权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的重组菌在提高植物抗寒性中的应用，其特征在于，所述植物为拟南芥。

5.一种促进植物抵抗冷胁迫的方法，其特征在于，将羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14通过转基因或有性杂交转育途径导入植物中；所述羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述植物为拟南芥。