KR20090053370A

KR20090053370A - 고구마 뿌리 유래의 ｓｗＤＲＥＢ1 단백질 및 이를코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20090053370A
Application number: KR1020070120194A
Authority: KR
Inventors: 곽상수; 이행순; 김윤희; 김차영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-11-23
Filing date: 2007-11-23
Publication date: 2009-05-27
Also published as: KR100930593B1

Abstract

본 발명은 고구마 뿌리 유래의 swDREB1에 관한 것으로, 보다 상세하게는 건조 처리된 고구마 뿌리 유래의 건조 스트레스 유도성 DREB 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 swDREB1 유전자는 고구마 식물체의 뿌리에서 건조, 저온, 염 등의 여러 가지 스트레스에 의해 발현이 강하게 유도되기 때문에 조건 불리지역에 적합한 환경스트레스 내성 식물체를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

SwDREB1, 스트레스, RT-PCR

Description

고구마 뿌리 유래의 ｓｗＤＲＥＢ1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자{SwDREB1 protein originated from a root of Ipomoea batatas and gene coding the same}

본 발명은 고구마 뿌리 유래의 swDREB1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 건조, 저온 및 다양한 화합물에 의해 고발현되는 고구마 뿌리 유래의 전사인자인 swDREB1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

고구마(Ipomoea batatas L. Lam)는 비교적 척박한 땅에도 재배가 가능할 뿐만 아니라 헥타르당 생산량이 약 22톤으로 높아 식량과 가축사료로 이용되는 대표적인 뿌리작물이다. 특히 고구마는 건물중의 약 70%가 전분으로 이루어져 주정의 원료작물로 오래전부터 이용되었으며, 바이오에탄올 생산을 위한 친환경 대체에너지작물로 최근 재조명되고 있다.

최근 급속한 산업화와 인구증가에 의해 지구규모의 환경문제와 식량문제가 제기되고 있어 사막화지역, 공해지역, 추운지역 등의 조건이 불리한 지역에서도 잘 자라는 환경재해 내성 농작물 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히 조건 불리지역에 적합한 산업용 고구마를 개발하기 위하여 분자육종에 의한 환경재해 내성 형질전환 고구마 연구가 시도 되고 있다 (Lim et al. Mol Breeding 19, 227-239, 2007).

건조, 추위 등의 열악한 토양에서 유식물체의 초기생장을 좋게 하는 환경재해 내성 고구마를 개발하기 위해서는 고구마 실뿌리(fibrous root)에 특이적으로 고발현하는 유전자의 개발이 절실히 요구된다. 수분 부족으로 인한 건조 스트레스 조건에서 실뿌리의 발달이 덩이뿌리의 성장에 중요할 것으로 생각된다. 또한 실뿌리가 발달하여 덩이뿌리로 성장하기 때문에 덩이뿌리에서 유용소재를 생산하고자 할 때 실뿌리에서 고발현하는 유전자의 개발 연구는 중요하다고 생각된다. 그러나 건조를 포함한 다양한 스트레스 조건에서 고구마의 어린뿌리에 특이적으로 고발현하는 유전자가 아직 보고되어 있지 않다. 다만, 고구마의 덩이뿌리(tuber)에 고발현하는 스포라민(sporamin) 단백질을 암호화하는 유전자가 오래전에 분리되어 연구된 적은 있다 (Hattori et al. Plant Mol Biol 14, 595-604, 1990).

이러한 관점에서 스트레스 조건에서 고구마 실뿌리에 특이적으로 강하게 발현하는 유전자의 분리는 환경재해 내성 식물체 및 각종 유용소재를 생산하는 형질전환 고구마를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 즉 첨단 생명공학기술을 이용한 대사공학으로 특히 건조지역, 간척지역, 공해지역 등 한계농지(조건 불리지역)에서 잘 자라면서 전분, 기능성 단백질 등 산업적으로 유용한 소재를 생산하는 고구마 품종을 개발하면 식량수급에 영향을 주지 않고 친환경 바이오에너지 등을 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 DREB(DRE-binding protein) 전사인자는 애기장대에서 건조, 저온, 염 스트레스 유도성 유전자인 rd29A, rd15 / cor47, kin1, cor6 .6/ kin2 유전자의 프로모터의 DRE (Dehydration responsive element: TACCGACAT) 시스 활성 조절인자에 결합하는 전사인자이다 (Wang et al. Plant Mol Biol 28, 605-617, 1995; Iwasaki et al. Plant Physiol 115, 1287-1294, 1997). 최근 애기장대에서 16개의 건조유도성 유전자들의 프로모터에서 DRE 시스 활성 조절인자는 확인되었으며, 이들 유전자들은 애기장대의 DREB1이나 DREB2 계열의 전사인자가 결합하는 것이 확인되었다 (Seki et al. Plant J 31, 279-292, 2002). 게놈정보가 완전히 밝혀진 애기장대에서는 55개의 DREB 전사인자가 확인되었으며, 이들은 스트레스 조건에서 식물호르몬인 ABA에 대해 의존적이거나 독립적인 신호전달기작에 의해 발현이 조절되었다. 하지만 아직 고구마에서 DREB 유전자가 보고된 바는 없다 (Stockinger et al. Proc Natl Acad Sci USA 94, 1035-1040, 1997; Liu et al. Plant Cell 10, 1391-1406, 1998; Sakuma et al. Biochem Biophys Res Commun 290, 998-1009, 2002).

이에, 본 발명자들은 건조 처리된 고구마 실뿌리로부터 분리한 swDREB1 유전자가 건조를 포함한 다양한 스트레스 조건에서 실뿌리 특이적으로 강하게 발현하는 것을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 건조 처리된 고구마 뿌리 유래의 swDREB1 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고구마 뿌리에서 유래된 swDREB1 단백질 및 그의 아미노산 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 swDREB1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 외래단백질을 뿌리에서 고발현시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고구마 뿌리에서 유래된 swDREB1 단백질 및 그의 아미노산 서열을 제공한다.

본 발명의 swDREB1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 swDREB1 단백질은 257개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 일반적인 DREB 단백질 구조에서 나타나는 NLS, AP2/EREBP 부위 및 C말단의 산성화 부위가 swDREB1 단백질 아미노산 서열에서도 잘 보존되어 있었다. 특히, 본 발명의 swDREB1 유전자는 애기장대의 DREB 계열들 중 DREB1 계열이 갖는 특이적 서열인 DSAWRL과 LWSF가 보존되어 있었다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 swDREB1의 코딩부분을 블라스트(BlastX)로 조사하였을 때 고추(Capsicum annuum)의 CaCBF1B , CaDREBLP1, 토마토(Lycopersicon esculentum)의 LeCBF1, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 AtDREB1D/CBF4과 아미노산 수준에서 61-67%의 상동성을 보였다(도 2a 및 2b 참조).

또한, 본 발명은 상기 swDREB1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하며, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 swDREB1 cDNA 유전자는 전체길이가 1,206 bp로써 132 bp의 5' 말단의 비번역부위(UTR)와 300 bp의 3' 말단의 비번역부위 그리고 774 bp의 코딩부분(257 개의 아미노산으로 구성)으로 구성되어 있다(도 1 참조).

본 발명의 swDREB1 유전자는 저장뿌리(tuberous root)와 줄기(stem)에서 강하게 발현되었다. 실뿌리(fibrous root)에서도 발현되었지만 잎(leaf)과 굵은 뿌 리(thick pigmented root)에서는 매우 약하게 발현되는 양상을 보였다(도 3 참조).

또한, 본 발명의 swDREB1 유전자는 실뿌리조직에서 건조처리 후 1시간째에 가장 강한 발현 수준을 보였으며, 16시간까지 강한 발현 수준이 유지되었다(도 4a 참조). 반면에 잎 조직에서는 건조처리에 의한 swDREB1의 발현량의 증감이 관찰되지 않았다. 또한 swDREB1은 건조 스트레스 관련 식물호르몬인 앱시스산 처리에 발현의 증감이 관찰되지 않았다(도 4b 참조). SwDREB1 유전자는 다양한 온도 스트레스 중 저온(4℃)에 의해 발현이 잎과 뿌리에서 강하게 증가되었다(도 4c 참조). 다양한 화합물 스트레스인 염화나트륨, 메틸 비올로젠, 카드뮴 처리에 의해서도 각각 잎과 뿌리에서 강한 발현 증가를 보였다(도 4d 참조).

그러므로 건조 스트레스를 포함한 다양한 스트레스에 대한 강한 반응성을 갖는 swDREB1 유전자는 다양한 스트레스 유전자들의 발현을 조절하는 전사인자로써 건조 스트레스를 포함한 다양한 스트레스에 대한 내성을 가지는 식물체 개발에 매우 유용하게 사용할 수 있을 것으로 본다.

본 발명의 발현벡터에 포함되는 유전자는 본 발명의 swDREB1를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이다. 상기 유전자를 삽입하기 위하여 사용되는 벡터로는 pKBS1-1 벡터, pBI101 벡터, pCAMBIA 벡터 중 어느 하나를 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 일반적인 식물 형질전환용 발현벡터라면 어느 것을 이 용하여도 무방하다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환 숙주세포를 제공한다.

상기 형질전환 숙주세포는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함한다.

또한, 본 발명은

1) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주 식물세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환 식물세포를 선별하는 단계;

4) 상기 형질전환 식물세포의 발아를 유도하여 캘러스를 제조하는 단계; 및

5) 상기 캘러스의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

DREB(DRE-binding protein)는 건조, 저온 및 다양한 화합물 스트레스 유도성 유전자의 프로모터의 DRE(Dehydration responsive element: TACCGACAT) 시스 활성 조절인자에 결합하는 전사인자로 이를 코딩하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환 식물체는 상기 스트레스에 대한 내성을 갖는다.

또한, 본 발명의 범위에는 상기 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 식물체 및 상기 식물체의 종자, 열매, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스 또는 원형질체도 포함된다.

아울러, 본 발명은

1) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주 식물세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;

4) 상기 형질전환 식물세포의 발아를 유도하여 캘러스를 제조하는 단계;

5) 상기 캘러스의 분화를 유도하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및

6) 상기 형질전환 식물체를 재배하는 단계를 포함하는 외래단백질을 뿌리에서 고발현시키는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 식물세포는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단자엽 식물은 택사과(Alismataceae), 자라풀과(Hydrocharitaceae), 지채과(Juncaginaceae), 장지채과(Scheuchzeriaceae), 가래과(Potamogetonaceae), 나자스말과(Najadaceae), 거머리말과(Zosteraceae), 백합과(Liliaceae), 지모과(Haemodoraceae), 용설란과(Agavaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 마과(Dioscoreaceae), 물옥잠과 (Pontederiaceae), 붓꽃과(Iridaceae), 버먼초 과(Burmanniaceae), 골풀과 (Juncaceae), 닭의장풀과(Commelinaceae), 곡정초과(Eriocaulaceae), 화본과(벼과, Gramineae, Poaceae), 천남성과(Araceae), 개구리밥과(Lemnaceae), 흑삼릉과 (Sparganiaceae), 부들과(Typhaceae), 사초과(방동사니과, Cyperaceae), 파초과 (Musaceae), 생강과(Zingiberaceae), 홍초과(Cannaceae), 난초과(Orchidaceae)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 쌍자엽 식물은 암매과(돌매화나무과, Diapensiaceae), 매화오리나무과(Clethraceae), 노루발과(Pyrolaceae), 진달래과(Ericaceae), 자금우과(Myrsinaceae), 앵초과(Primulaceae), 갯질경이과 (Plumbaginaceae), 감나무과(Ebenaceae), 때죽나무과(Styracaceae), 노린재나무과, 회목과(Symplocaceae), 물푸레나무과(목서과, Oleaceae), 마전과(Loganiaceae), 용담과(Gentianaceae), 조름나물과(Menyanthaceae), 협죽도 과(마삭나무과, Apocynaceae), 박주가리과(Asclepiadaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 꽃고비과 (Polemoniaceae), 메꽃과(Convolvulaceae), 지치과(Boraginaceae), 마편초과 (Verbenaceae), 꿀풀과(Labiatae), 가지과(Solanaceae), 현삼과(Scrophulariaceae), 능소화과(Bignoniaceae), 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 참깨과(Pedaliaceae), 열당과 (Orobanchaceae). 제스네리아과(Gesneriaceae), 통발과(Lentibulariaceae), 파리풀과(Phrymaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 인동과(Caprifoliaceae), (연복초과 Adoxaceae), 마타리과(Valerianaceae), 산토끼꽃과(Dipsacaceae), 초롱꽃과 (Campanulaceae), 국화과(Compositae), 소귀나무과 Myricaceae, 가래나무과 (Juglandaceae), 버드나무과(Salicaceae), 자작나무과(Betulaceae), 너도 밤나무과(참나무과, Fagaceae), 느릅나무과(Ulmaceae), 뽕나무과(Moraceae), 쐐기풀과 (Urticaceae), 단향과(Santalaceae), 겨우살이과(Loranthaceae), 마디풀과(여뀌과, Polygonaceae), 자리공과(상륙과, Phytolaccaceae), 분꽃과(Nyctaginaceae), 석류풀과(Aizoaceae), 쇠비름과(Portulacaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 명아주과 (Chenopodiaceae), 비름과(Amaranthaceae), 선인장과(Cactaceae), 목련과 (Magnoliaceae), 붓순나무과(Illiciaceae), 녹나무과(Lauraceae), 계수나무과 (Cercidiphyllaceae), 미나리아재비과(Ranunculaceae), 매자나무과(Berberidaceae), 으름덩굴과(Lardizabalaceae), 새모래덩굴과(방기과, Menispermaceae), 수련과 (Nymphaeaceae), 붕어마름과(Ceratophyllaceae), 어항마름과(Cabombaceae), 삼백초과(Saururaceae), 후추과(Piperaceae), 홀아비꽃대과(Chloranthaceae), 쥐방울덩굴과(Aristolochiaceae), 다래나무과(Actinidiaceae), 차나무과(동백나무과, Theaceae), 물레나물과(Guttiferae), 끈끈이주걱과(Droseraceae), 양귀비과 (Papaveraceae), 풍접초과(Capparidaceae), 십자화과(겨자과, Cruciferae), 플라타너스과(버즘나무과, Platanaceae), 조록나무과(금루매과, Hamamelidaceae), 꿩의비름과(돌나물과, Crassulaceae), 범의귀과(Saxifragaceae), 두충과(Eucommiaceae), 돈나무과(Pittosporaceae), 장미과(Rosaceae), 콩과(Leguminosae), 괭이밥과 (Oxalidaceae), 쥐손이풀과(Geraniaceae), 한련과(Tropaeolaceae), 남가새과 (Zygophyllaceae), 아마과(Linaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 별이끼과 (Callitrichaceae), 운향 과(Rutaceae), 소태나무과(Simaroubaceae), 멀구슬나무과 (Meliaceae), 원지과(Polygalaceae), 옻나무과(Anacardiaceae), 단풍나무과(단풍과, Aceraceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 칠엽수과(Hippocastanaceae), 나도 밤나무과(Sabiaceae), 봉선화과(물봉선과, Balsaminaceae), 감탕나무과(Aquifoliaceae), 노박덩굴과(화살나무과, Celastraceae), 고추나무과(Staphyleaceae), 회양목과 (Buxaceae), 시로미과(Empetraceae), 갈매나무과(Rhamnaceae), 포도 과(Vitaceae), 담팔수과(Elaeocarpaceae), 피나무과(Tiliaceae), 아욱과(Malvaceae), 벽오동과 (Sterculiaceae), 팥꽃나무과(서향나무과, Thymelaeaceae), 보리수나무과 (Elaeagnaceae), 이나무과(Flacourtiaceae), 제비꽃과(Violaceae), 시계꽃과 (Passifloraceae), 위성류과(Tamaricaceae), 물별과(Elatinaceae), 베고니아과 (Begoniaceae), 박과(Cucurbitaceae), 부처꽃과(배롱나무과, Lythraceae), 석류나무과(Punicaceae), 바늘꽃과(Onagraceae), 개미탑과(Haloragaceae), 박쥐나무과 (Alangiaceae), 층층나무과(산수유나무과, Cornaceae), 두릅나무과(오갈피나무과, Araliaceae), 산형과(미나리과)(Umbelliferae(Apiaceae))인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

가장 바람직하게는 식물세포는 십자화과, 가지과, 장미과 및 메꽃과에 속하는 식물로부터 선택된다.

상기 단계 2)의 발현벡터를 숙주 식물세포에 도입하는 단계는 공지된 식물 형질전환 방법에 의하여 식물체내로 도입될 수 있다. 즉, 아그로박테리움 매개방법, 유전자 총(gene gun), PEG를 이용한 방법 및 전기천공법(electroporation)등 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 주지의 방법을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 쌍자엽식물은 아그로박테리움 매개방법(R.B. Horsch, et al., A simple and general method for transferring genes into plants, Science 227(1985), pp. 1229-1231)을 이용하고, 단자엽식물은 유전자 총을 이용한 방법(P. Christou, Particle bombardment, Methods Cell Biol 50(1995), pp. 375-382) 또는 아그로박테리움 매개에 의한 DREB 형질전환 식물체 제작(Oh et al. Plant Physiol 138: 341-351, 2005; Ito et al. Plant Cell Physiol 47: 141-153, 2006)을 이용하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

형질전환 후, 식물세포는 전식물로 재생되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재생을 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해 잘 알려져 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.). 따라서 일단 형질전환이 실현되면, 형질전환된 식물세포로부터 성숙한 식물을 재생시키는 것은 당분야의 지식 범위 내에 있다.

본 발명의 방법에서 외래단백질은 약리효과를 발휘하는 단백질 또는 형질전환체에 스트레스에 대한 내성을 부여하는 단백질 등을 포함한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 건조 처리된 고구마 실뿌리 유래의 swDREB1 유전자는 건조를 포함한 다양한 스트레스 조건에서 특히 실뿌리에서 강하게 발현이 유도되기 때문에 이를 이용하면 조건 불리지역에 적합한 환경스트레스에 내성을 갖는 형질전환체를 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예1> 고구마 swDREB1 유전자의 클로닝, 염기서열 분석 및 유연관계 분석

고구마 (Ipomoea batatas (L.) Lam. cv. White star) 식물체를 10시간 동안 건조 처리한 후 0, 0.5, 2, 6, 10시간째의 실뿌리(fibrous root)조직을 CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)을 통해 총 RNA를 분리하였다. Poly(A) Tract mRNA 분리 시스템(Promega사)을 사용하여 mRNA를 분리하고, SMART-cDNA 합성키트(Clontech사)를 사용하여 건조 처리된 고구마 실뿌리의 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

DREB 유전자의 스크리닝을 위한 DREB 탐침 DNA를 제작하기위해 애기장대 웹 사이트(http://www.arabidopsis.org)의 데이터베이스에서 5개의 DREB 유전자를 선발하였으며, 각 유전자의 코딩 부분을 PCR 하기위한 프라이머로는 염기서열 AtDREB1A/CBF3: AT4G25480 (서열번호 3: 정방향: 5'-ATGAACTCATTTTCTGCT-3', 서열번호 4: 역방향: 5'-TTAATAACTCCATAACGATAC-3'), AtDREB1B/CBF1: AT4G25490 (서열번호 5: 정방향: 5'-TTTGGCTCCGATTAC-3', 서열번호 6: 역방향: 5'- TTAGTAACTCCAAAGCG-3'), AtDREB1C / CBF2 : AT4G25470 (서열번호 7: 정방향: 5'-ATGAACTCATTTTCTGCC-3', 서열번호 8: 역방향: 5'-TTAATAGCTCCATAAGGAC-3'), AtDREB2A: AT5G05410 (서열번호 9: 정방향: 5'-ATGGCAGTTTATGATCAG-3', 서열번호 10: 역방향: 5'-TTAGTTCTCCAGATCCAA-3'), AtDREB2B: AT3G11020 (서열번호 11: 정방향: 5'-ATGGCTGTATATGAACAAA-3', 서열번호 12: 역방향 5'-TCAAATATCCAGAGAACTC-3')를 사용하였다. 상기 제작된 탐침 DNA를 이용하여 통상의 방법으로 라이브러리를 스크리닝하였으며, 57개의 클론을 확보하였다. 상기 클론으로부터 DNA를 분리하여 T3 프라이머를 사용하여 cDNA의 5' 말단부분의 염기서열을 결정하고 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Blast 데이터베이스 분석을 통해 연관되는 유전자 정보 및 자료를 확보하였다. 이들 중에서 자료 분석을 통해 건조를 포함한 다양한 스트레스에 뿌리 특이적 발현을 보일 것으로 생각되는 후보로 애기장대의 DREB1 계열에 속하는 DREB 유전자를 클로닝하고 cDNA의 전체 염기서열을 결정하였다. 이 cDNA 유전자의 이름을 'swDREB1' cDNA라고 명명하였다.

SwDREB1 cDNA 유전자의 전체길이는 1206 bp로써 132 bp의 5' 말단 비번역부위(UTR)와 300 bp의 3' 말단 비번역부위 그리고 774 bp의 코딩부분(257 개의 아미노산으로 구성)으로 구성되어 있음을 보였다(도 1). NLS(nuclear localization signal)는 DREB 전사인자의 핵으로 신호전달을 위한 서열이며, AP2/EREBP 부위는 DNA 결합 부위이며 C말단의 산성화 부위(acidic region)는 DREB 전사인자를 활성화시키는 부분이다. 상기 유전자는 다른 DREB 단백질구조와 비교해서 NLS, AP2/EREBP 부위 및 C말단의 산성화 부위가 잘 보존되어 있었다. 특히, 본 발명의 swDREB1 유전자는 애기장대의 DREB 계열들 중 DREB1 그룹이 갖는 특이적 서열인 DSAWRL과 LWSF가 보존되어 있었다.

고구마 swDREB1의 코딩부분을 블라스트(BlastX)로 조사하였을 때 고추(Capsicum annuum)의 CaCBF1B, CaDREBLP1과 아미노산 수준에서 67%의 상동성을 보였으며, 토마토(Lycopersicon esculentum)의 LeCBF1, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 AtDREB1D/CBF4와는 61%의 상동성을 보였다(도 2a). 고구마 swDREB1의 추정되는 단백질의 아미노산 서열과 다양한 식물종의 DREB 사이의 유연관계를 ClustalW 프로그램(http://plant.pdrc.re.kr/gene/align/ClustalW.html)를 이용하여 조사한 결과 고구마 swDREB1은 애기장대의 DREB1계열의 단백질인 것으로 추정된다(도 2a 및 2b).

<실시예2> 고구마 조직별 swDREB1 유전자의 발현분석

건초 처리한 고구마 뿌리로부터 분리한 본 발명의 고구마 DREB 전사인자인 swDREB1의 조직별 발현양상을 분석하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. CTAB 방법(Kim and Hamada, Biotech Lett 27, 1841-1845, 2005)으로 고구마 조직(잎, 줄기, 저장뿌리, 실뿌리, 굵은 뿌리)으로부터 총 RNA를 추출한 후 RNA 2.5 μg을 사용하여 MMLV Reverse Transcription System cDNA 합성키트(Clontech사)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. SwDREB1 유전자 특이적 프라이머와 Accel Taq Premix 키트(Genedocs사)를 사용하여 swDREB1 유전자의 발현양상을 조사하였다. SwDREB1의 특이적인 프라이머로는 염기서열(서열번호 13: 정방향: 5'-CTATTCGCCCTATTCCTAT-3', 서열번호 14: 역방향: 5'-CAAATTCAAGCCTTGGTATC-3')를 사용하였다.

그 결과 swDREB1 유전자는 저장뿌리(tuberous root)와 줄기(stem)에서 강하게 발현되었으며, 실뿌리(fibrous root)에서도 발현되었다. 하지만 잎(leaf)과 굵은 뿌리(thick pigmented root)에서는 매우 약하게 발현되는 양상을 보였다(도 3). 따라서 건조처리된 고구마 뿌리 조직에서 분리한 본 발명의 swDREB1 유전자는 줄기, 실뿌리, 저장뿌리에서 발현되는 유전자임을 알 수 있었다.

<실시예3> 건조처리를 포함한 다양한 스트레스 처리에 의한 swDREB1 유전자의 발현분석

본 발명의 swDREB1 유전자가 건조를 포함한 다양한 스트레스 처리에 대해 반응하는 정도를 분석하기위해, 건조, 식물호르몬(ABA), 온도 및 화학물질과 같은 다양한 스트레스 처리를 한 후 swDREB1 유전자의 발현변화를 RT-PCR로 분석하였다.

먼저, swDREB1 유전자가 건조처리에 의해 반응하는 정도를 분석하기위해 고구마의 잎과 실뿌리 조직을 시간대별(0, 1, 2, 8, 16, 24 시간)로 건조처리 한 후에 상기 실시예 2에서 수행한 방법으로 RNA를 분리한 후 cDNA를 각각 합성하였다. 상기 실시예 2에서 사용한 swDREB1 유전자 특이적 프라이머로 RT-PCR를 수행하였다. 그 결과 swDREB1 유전자는 실뿌리 조직에서 건조처리 후 1시간째에 가장 강한 발현 수준을 보였으며, 16시간까지 강한 발현 수준이 유지되었다(도 4a). 반면에 잎 조직에서는 건조처리에 의한 swDREB1의 발현량의 증감이 관찰되지 않았다.

일반적으로 건조 스트레스 하에서는 식물호르몬인 앱시스산의 양이 증가되며 앱시스산이 건조에 대응하여 식물의 기공 개폐를 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 다양한 식물종의 DREB 전사인자는 앱시스산 처리에 의해 발현의 반응성을 보이는지의 여부에 따라 앱시스산 의존적 또는 독립적인 신호전달 기작을 갖는 DREB 전사인자로써 분류된다. 따라서 건조처리에 반응한 swDREB1 유전자가 앱시스산 처리에 의해서 발현이 증가하는 지를 관찰하기 위해 고구마의 잎과 실뿌리 조직을 0.1 mM의 앱시스산을 시간대별(0, 12, 24, 36, 48 시간)로 처리한 후 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였으며 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 잎과 실뿌리 조직에서는 앱시스산 처리에 의한 swDREB1의 발현량의 증감이 관찰되지 않았다(도 4b). 따라서 고구마의 swDREB1 유전자는 앱시스산에 대해 독립적인 신호전달 기작에 의해 그 발현이 조절되는 것으로 생각된다.

애기장대의 DREB 유전자들은 저온 및 염 유도성의 반응 특성을 보였다. 이에 swDREB1의 온도 스트레스에 대한 반응성을 보기위해 다양한 저온 스트레스인 15℃와 4℃를 기내 배양기 조건에서 16시간동안 처리 후 동일한 방법으로 RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하여 RT-PCR를 수행하였다. 그 결과 swDREB1 유전자는 잎과 실뿌리 조직에서 저온(4℃) 처리 후 가장 강한 발현 수준을 보였다(도 4c).

다음으로 swDREB1의 다양한 화합물 스트레스에 대한 반응성을 보기위해 100 mM 염화 나트륨과 0.05 mM 메틸 비올로젠(methyl viologen, paraquat) 처리 후 24시간째와 0.05 mM 카드뮴을 48시간 처리 후 동일한 방법으로 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였으며 RT-PCR을 수행하였다. 메틸 비올로젠은 활성산소를 과량으로 발생하여 식물을 고사시키는 비선택성 제초제이다. 각각의 대조군으로는 멸균수를 사용하였다. 그 결과 swDREB1 유전자는 잎과 실뿌리 조직에서 염화나트륨, 메틸 비올로젠, 카드뮴 처리에 강한 발현 증가를 보였다(도 4d). 따라서 swDREB1 유전자가 다양한 스트레스에 반응성을 가짐을 알 수 있으며, 특히 실뿌리에서 높은 발현수준을 보임을 알 수 있었다. 그러므로 swDREB1 유전자는 건조, 추위 등 열악한 토양에서 유식물체의 초기생장을 좋게 하는 환경재해 내성 식물체 (고구마 포함) 개발에 도움이 될 것으로 판단된다.

<실시예4> S wDREB1 유전자의 서던 블롯 분석

본 발명의 swDREB1 유전자의 고구마 게놈(genome)내의 존재 및 다른 상동성 유전자의 존재 여부를 관찰하기 위하여 서던 블롯 분석(Southern blot analysis)을 실시하였다. CTAB 방법으로 고구마 잎으로부터 게놈 DNA를 분리, 정제한 후 EcoRI, EcoRV, HindIII로 절단하였다. 제한 효소로 절단된 게놈 DNA를 전기영동한 후 swDREB1 cDNA의 3' 말단 특이적 영역의 300 bp를 ³²P방사성 동위원소로 표지한 탐침자를 사용하여 서던 블롯을 수행하였다.

그 결과 swDREB1 유전자는 제한 효소로 절단된 각 절편들에서 swDREB1의 탐 침자가 인식하는 DNA 밴드가 1개 존재하여 본 발명의 swDREB1 유전자가 고구마 게놈 내에 단일 유전자로 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 5).

도 1은 본 발명의 건조 처리된 고구마 뿌리 유래 swDREB1 유전자의 염기서열과 이로부터 추론한 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.

도 2a는 본 발명의 swDREB1 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(고추, 토마토, 애기장대, 목화, 단버찌)의 DREB 유전자 아미노산 서열을 비교한 도면이다

도 2b는 본 발명의 swDREB1 유전자의 추론된 단백질의 아미노산 서열과 여러 식물(고추, 토마토, 애기장대, 목화, 단버찌)의 DREB 유전자 사이의 유연관계를 나타낸 도면이다.

도 3은 고구마의 여러 조직에서 본 발명의 swDREB1 유전자가 발현하는 양상을 RT-PCR 전기영동한 사진이다. L, leaf(잎); S, stem(줄기); TR, tuberous root(저장뿌리); FR, fibrous root(실뿌리); TPR, thick pigmented root(굵은 뿌리).

도 4a는 고구마 잎과 실뿌리에 건조 처리 후 0, 1, 2, 8, 16, 24 시간째의 본 발명의 swDREB1 유전자의 발현양상을 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.

도 4b는 고구마 잎과 실뿌리에 식물호르몬 0.1 mM의 앱시스산을 처리한 후 0, 6, 12, 24, 48 시간째의 본 발명의 swDREB1 유전자의 발현양상을 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.

도 4c는 고구마 잎과 실뿌리에 온도 스트레스(4℃, 15℃)를 처리한 후 16시간째의 본 발명의 swDREB1 유전자의 발현양상을 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.

도 4d는 고구마 잎과 실뿌리에 100 mM의 염화나트륨(NaCl)과 0.05 mM의 메틸 비올로젠(methyl viologen)을 처리한 후 24시간째, 그리고 0.5 mM의 카드뮴을 처리한 후 48시간째의 본 발명의 swDREB1 유전자의 발현양상을 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.

도 5는 본 발명의 swDREB1 유전자가 고구마의 게놈상에 존재하는 것을 확인한 서던블롯 사진이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> SwDREB1 protein originated from a root of Ipomoea batatas and gene coding the same <130> 7p-11-07 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1206 <212> DNA <213> SwDREB1 gene from a root of Ipomoea batatas <400> 1 aatacatacc cacttccagt tttagctttt ccatatatat atatatatat actttactaa 60 gtaccgccgt cgtttacgta cctactacta gtctcaatca ctcaagattc gattctatat 120 atggatatgg atatggatat agttgggaat tattattctg ggaattttct aagtgctgct 180 gcggcggcgt cgagtttttg gtcgccggaa atgggtgcag tagtgccttc gccactgtct 240 tcttctgata ctgggagttg cagcgctact atgaaagcga atttgtcgga tgaagaggtg 300 ttgttggctt ctaataatcc gaagaaacgc gctgggagga agaagtttcg ggagactcga 360 cacccggtgt accggggagt gaggaggagg aactccggga agtgggtgtg tgaggtgagg 420 gagcccaaca agaagtccag gatatggctg ggaactttcc ccacggctga aatggcggct 480 agagctcatg acgtggccgc catcgctctc agaggctgct ccgcctgtct caacttcgcc 540 gactcggctt ggaggcttcc aatcccggcg tccgccgacc ccaaggacat ccagaaagct 600 gcggcggagg cggcggaggc tttccgtcca gtggcactgc cagcaaacca aaaccaaacc 660 caacggatta ttctagaagc tgaagaagaa gaagaagagt gcaacagtag tatgaaagag 720 gaacaagtgt ccacaaccaa cgaaaacgtg ttcttcatgg acgaggaagc gtttttcgac 780 atgcccggat tgcttgctga catggctcaa gccctgatgc tacctccacc tcaatgcgca 840 ctagtggacc gtaccaatga cgtggagctt gatgctgacg tgtcactctg gtctttctcc 900 atttaaaacc caaaattagg atgaagatgg ataatctatc tgtgaattga atgtcgtcca 960 ttgtccactc tactctactc cgtacgtact agtctctagt tatatgaata gaagggatgc 1020 ctttcaagaa aaggcgaaaa gcgtccattc ctattcgccc tattcctatt cctattctat 1080 ataggtagga ttagctaata tccgtacttc attttttgag gttgtacggc ttgtaaaata 1140 tccgatacca aggcttgaat ttgaatgaat tatgccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaa 1206 <210> 2 <211> 257 <212> PRT <213> SwDREB1 protein from a root of Ipomoea batatas <400> 2 Met Asp Ile Val Gly Asn Tyr Tyr Ser Gly Asn Phe Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Ser Phe Trp Ser Pro Glu Met Gly Ala Val Val Pro 20 25 30 Ser Pro Leu Ser Ser Ser Asp Thr Gly Ser Cys Ser Ala Thr Met Lys 35 40 45 Ala Asn Leu Ser Asp Glu Glu Val Leu Leu Ala Ser Asn Asn Pro Lys 50 55 60 Lys Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr 65 70 75 80 Arg Gly Val Arg Arg Arg Asn Ser Gly Lys Trp Val Cys Glu Val Arg 85 90 95 Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala 100 105 110 Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly 115 120 125 Cys Ser Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Leu Pro Ile 130 135 140 Pro Ala Ser Ala Asp Pro Lys Asp Ile Gln Lys Ala Ala Ala Glu Ala 145 150 155 160 Ala Glu Ala Phe Arg Pro Val Ala Leu Pro Ala Asn Gln Asn Gln Thr 165 170 175 Gln Arg Ile Ile Leu Glu Ala Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys Asn Ser 180 185 190 Ser Met Lys Glu Glu Gln Val Ser Thr Thr Asn Glu Asn Val Phe Phe 195 200 205 Met Asp Glu Glu Ala Phe Phe Asp Met Pro Gly Leu Leu Ala Asp Met 210 215 220 Ala Gln Ala Leu Met Leu Pro Pro Pro Gln Cys Ala Leu Val Asp Arg 225 230 235 240 Thr Asn Asp Val Glu Leu Asp Ala Asp Val Ser Leu Trp Ser Phe Ser 245 250 255 Ile <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1A/CBF3: AT4G25480 forward primer <400> 3 atgaactcat tttctgct 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1A/CBF3: AT4G25480 reverse primer <400> 4 ttaataactc cataacgata c 21 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1B/CBF1: AT4G25490 forward primer <400> 5 tttggctccg attac 15 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1B/CBF1: AT4G25490 reverse primer <400> 6 ttagtaactc caaagcg 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1C/CBF2: AT4G25470 forward primer <400> 7 atgaactcat tttctgcc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB1C/CBF2: AT4G25470 reverse primer <400> 8 ttaatagctc cataaggac 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB2A: AT5G05410 forward primer <400> 9 atggcagttt atgatcag 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB2A: AT5G05410 reverse primer <400> 10 ttagttctcc agatccaa 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB2B: AT3G11020 forward primer <400> 11 atggctgtat atgaacaaa 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AtDREB2B: AT3G11020 reverse primer <400> 12 tcaaatatcc agagaactc 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer specific for swDREB1 <400> 13 ctattcgccc tattcctat 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer specific for swDREB1 <400> 14 caaattcaag ccttggtatc 20

Claims

서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 고구마 유래 swDREB1 단백질.
제 1항의 swDREB1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 2에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제 4항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환 숙주세포.
1) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주 식물세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환 식물세포를 선별하는 단계;

4) 상기 형질전환 식물세포의 발아를 유도하여 캘러스를 제조하는 단계; 및

5) 상기 캘러스의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 스트레스 내성을 갖는 형질전환 식물체의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 스트레스는 건조, 앱시스산, 저온 또는 화합물에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
청구항 7에 있어서, 화합물은 염화나트륨, 메틸 비올로젠 또는 카드뮴인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 상기 식물세포는 십자화과, 가지과, 장미과 및 메꽃과에 속하는 식물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체의 제조방법.
제 6항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체의 자손 또는 클론인 식물체.
제 6항의 방법에 의해 제조된 형질전환 식물체의 종자, 열매, 이삭, 괴경, 괴근, 주, 캘러스 또는 원형질체.
1) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 및 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주 식물세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계;

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환 식물세포를 선별하는 단계;

4) 상기 형질전환 식물세포의 발아를 유도하여 캘러스를 제조하는 단계;

5) 상기 캘러스의 분화를 유도하여 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및

6) 상기 형질전환 식물체를 재배하는 단계를 포함하는 외래단백질을 뿌리에서 고발현시키는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 식물세포는 십자화과, 가지과, 장미과 및 메꽃과에 속하는 식물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 외래단백질을 뿌리에서 고발현시키는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 외래단백질은 약리효과를 발휘하는 단백질 또는 형질전환체에 스트레스에 대한 내성을 부여하는 단백질인 것을 특징으로 하는 외래단백질을 뿌리에서 고발현시키는 방법.