CN111518786A

CN111518786A - 一种番茄SlCK1基因调控番茄低温抗性的方法

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Publication number: CN111518786A
Application number: CN202010190610.8A
Authority: CN
Inventors: 张文娜; 卢小红
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明公开了一种番茄耐低温SlCK1基因克隆及载体构建及其对番茄耐低温调控作用的分析方法，具体涉及一种番茄中与拟南芥耐低温AtCK1基因同源基因SlCK1片段的分离、克隆及其对番茄耐低温调控作用的分析。该基因主要参与胆碱代谢途径，能够改变植物中磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺的比例，有利于内质网的压力胁迫耐受性调节从而提高植物的耐低温性。本发明提供了一套完整的基于模式植物研究进展的番茄中同源基因克隆、载体构建以及功能初步分析体系，同时揭示了番茄中一种新的耐低温基因SlCK1。在一定程度上减少了药品消耗、节省劳动成本、提高劳动效率。

Description

一种番茄SlCK1基因调控番茄低温抗性的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种番茄SlCK1基因克隆、载体构建以及对耐低温调控分析方法。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum Mill.)原产地为南美洲，喜温暖对低温敏感。设施高效栽培中常使用嫁接苗越冬栽培中用强耐低温性的番茄品种作砧木，能显著提高嫁接苗的耐低温性。但嫁接影响植物耐低温性的机理还未研究清楚。因此番茄(尤其是番茄砧木)自身耐低温基因的探究不仅为嫁接提高番茄耐低温性的研究提供基础，更有利于砧木的选择提高经济效益。

胆碱激酶(Cholinekinase,CK)是胆碱代谢途径第一步关键性的催化酶。胆碱激酶与底物胆碱和乙醇胺的结合比为3：1(Wharfe&Harwood,1979)，因此其更倾向与胆碱促进中产物磷酸胆碱的合成。CK的过表达可以提高了拟南芥对光周期的敏感性使其提早开花(Eastmond et al.,2010；Lin et al.,2015)。研究表明，拟南芥中胆碱激酶(Choline/Ethanolamine kinase,CK)家族中有4个亚型(Lin et al.,2015)，其中CK4影响胚胎发育，而CK1,CK2 and CK3及其编码的激酶活性在盐、低温、高渗透胁迫下有明显的上调(Tassevaet al.,2004)。磷脂酰胆碱是胆碱代谢途径的终产物，其大量存在于真核细胞的内质网中，有利于内质网胁迫耐受性调节(Sanchez-Lopez et al.,2013；Vevea et al.,2015)。SlCK1是内质网中主要的胆碱激酶，不仅参与磷脂酰胆碱的合成还可抑制衣霉素诱导的内质网胁迫(Lin et al.,2019)。胆碱激酶的功能强大，其与植物的逆境调节功能密切相关，但目前研究多集中于动物与模式植物拟南芥。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种番茄SlCK1(Cholinekinase)基因克隆、载体构建以及SlCK1基因对番茄耐低温调控分析的方法。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种番茄耐低温SlCK1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

番茄耐低温SlCK1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种番茄耐低温SlCK1基因的克隆及载体构建方法，步骤为：

步骤1：分别培养番茄铁木砧、中杂9号、久绿787、仙客1号的种子，其中番茄铁木砧、番茄久绿787作为番茄砧木，番茄中杂9号、番茄仙客1号作为番茄接穗，然后进行催芽、栽培，栽培半个月左右取样，提取番茄Total RNA，进行反转录得到总得cDNA，

步骤2：以番茄砧木和番茄接穗品种中的耐低温SlCK1基因为模板，设计特异引物，在上游引物前加上限制性酶切位点Xba I，在下游引物后加上限制性酶切位点Kpn I；得到：

WZ63:GCTCTAGATGATGGCGGTGAAGAC

WZ62:GGGGTACCACATAAATCTTTTGAGCG；

步骤3：以特异引物PCR克隆并回收SlCK1基因片段，片段长度为1131bp；

所述PCR反应条件：94℃预热4min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复34个循环，72℃延伸7min，降温至4℃；

步骤4：将克隆产物SlCK1基因片段与pGEM质粒构建克隆载体，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中增殖，涂布于LB培养基，LB培养基含1‰卡那霉素，37℃培养箱中暗培养约12h；

步骤5：PCR鉴定大肠杆菌阳性，阳性结果由公司测序；

步骤6：SlCK1基因生物信息学分析：利用生物信息学软件对4种番茄品种中克隆到的SlCK1基因与番茄基因库中CK1基因进行序列比对；将4种番茄品种中克隆到的SlCK1基因与其他物种CK1基因构建进化树进行同源分析；

步骤7：将序列比对后挑选铁木砧番茄品种和中杂9号番茄品种的SlCK1基因片段与Super 1300-GFP质粒构建表达载体，并转化农杆菌感受态GV3101，涂布于LB培养基，LB培养基含2‰利福平和2‰卡那霉素，28℃培养箱中暗培养约12h；

步骤8：PCR鉴定农杆菌阳性；

步骤9：农杆菌菌液保存：700μl阳性农杆菌菌液中加入等体积的50％甘油混匀后密封，并标记；置于液氮中速冻后，于-80℃超低温冰箱中保存备用。

一种番茄耐低温SlCK1基因对番茄耐低温调控分析方法，步骤为：

步骤1：低温处理：将番茄铁木砧和番茄中杂9号栽培1个月左右，约5片真叶时进行低温处理，处理温度为4℃，光周期为光照16h、黑暗8h；分别于处理时间0、3、6、9d取样(具体取样方按后续步骤要求进行)，其中番茄铁木砧作为番茄砧木，其中番茄中杂9号作为番茄接穗；

步骤2：不同时段低温处理下番茄生理指标检测：按照步骤1中的处理和取样时段取样，测定并比较番茄铁木砧和番茄中杂9号的叶绿素和电导率差异；

步骤3：不同时段低温处理下番茄表型鉴定：按照步骤2中生理指标测定，同时拍照记录处理后植株的表型；

步骤4：不同时段低温处理下番茄耐低温SlCK1基因以及磷脂代谢途径相关基因转录水平表达分析：

(1)按照步骤1中的处理取样，按照番茄耐低温SlCK1基因的克隆及载体构建方法中的步骤1、步骤2分别提取不同处理时间的番茄Total RNA，并反转录合成cDNA第一链；

(2)根据番茄耐低温SlCK1基因以及磷脂代谢途径相关基因序列在NCBI网站在线设计实时定量PCR引物；

(3)利用特异引物，设置一个ddH₂O的空白对照以及Actin对照组，试验步骤按照Takara公司嵌合法Real Time PCR(TB

Fast qPCR Mix)试剂盒RR430A说明书进行操作，试验全程在冰上进行；

(4)处理数据并做图比较。

进一步的，所述磷脂代谢途径相关基因包括：CCT基因、AAPT基因、NPC1基因、NPC2基因、NPC6基因、PLD基因、CK1基因、SDC1基因、PECT1基因、PMT1基因、PMT2基因和PLMT基因。

进一步的，所述CCT基因的引物为：

上游引物：GGCACATGACGCTCTTCCTT

下游引物：TTCCATCAGTCCGCTTGGTC；

所述AAPT基因的引物为：

上游引物：CATGGGTGTGATGCGCTTG

下游引物：CATCCCGTCCACACATAGCA；

所述NPC1基因的引物为：

上游引物：GCATGGGCTGGGACATTTGA

下游引物：TTGCATCTTCTCTTGGTCCCC；

所述NPC2基因的引物为：

上游引物：CCCGCGACTCTGTTTTACCT

下游引物：TCCATGTATCGCTGCTCCAC；

所述NPC6基因的引物为：

上游引物：GCCAAAGGGACCTACACCAA

下游引物：TCAGGTAGAACCTCAGGGCA；

所述PLD基因的引物为：

上游引物：GCCAGAAGGAATCCCCGAAA

下游引物：CCGCTCTTCTTCACCTCTCG；

所述CK1基因的引物为：

上游引物：GCGACAGCGATTTGTACGTG

下游引物：ACTCCCCACAATCCCCAGAA；

所述SDC1基因的引物为：

上游引物：GGTGGCGGATGTTCGATTTG

下游引物：CATCCGCATCAGGTTCCGTA；

所述PECT1基因的引物为：

上游引物：GCAGATCAAGCGCACAGAAG

下游引物：GACTGGGGGAGTCAACAGTG；

所述PMT1基因的引物为：

上游引物：CGGAACTTACTGTGGAAGCA

下游引物：GCCCAGCATTCTTGGCTAAC；

所述PMT2基因的引物为：

上游引物：CGGAACTTACTGTGGAAGCA

下游引物：GCCCAGCATTCTTGGCTAAC；

所述PLMT基因的引物为：

上游引物：GGCCCCTTTTCATCTTTGGC

下游引物：ATGCTGCCGACATACTGAGG。

进一步的，所述番茄耐低温SlCK1基因可以响应低温胁迫。

本发明提供的是针对番茄与拟南芥耐低温基因AtCK1同源的SlCK1(Cholinekinase)基因耐低温性的探究。首先利用CK1基因突变体拟南芥探究AtCK1基因对植物耐低温调控的作用；其次利用基因工程技术正确克隆番茄砧木与接穗品种中与AtCK1同源的SlCK1基因片段，并构建Super 1300-GFP-SlCK1表达载体转化GV3101农杆菌感受态；再利用生物信息学软件分析番茄砧木与接穗品种SlCK1序列差异，并建立进化树分析不同物种间CK1基因的同源性；最后通过对不同时段低温处理下番茄生理指标、表型以及SlCK1和磷脂代谢途径相关基因转录水平表达分析。

基于以上四点，本发明构建了一套完整的基于模式植物研究进展的番茄中同源基因克隆、载体构建以及功能分析体系，同时揭示了番茄中一种新的耐低温基因SlCK1。本发明在一定程度上具有开发新基因的创新性，同时实验技术提高了基因克隆的准确性与可靠性，在一定程度上减少了药品消耗、节省劳动成本、提高劳动效率。因此本发明是一套兼具科学性、创新性和实用性的科学研究方法。

附图说明

本发明有如下附图：

图1为AtCK1基因对拟南芥调控耐低温性的表型分析图；

图2为拟南芥低温胁迫下叶片数目统计图；

图3为铁木砧和中杂9号品种中克隆SlCK1基因特异引物筛选结果图；

图4为久绿787和仙客来品种中克隆SlCK1基因特异引物筛选结果图；

图5为仙客来cDNA样品1、2和铁木砧cDNA样品1中SlCK1基因克隆验证图；

图6为铁木砧cDNA样品1和中杂9号cDNA样品1、2中SlCK1基因克隆验证图；

图7为久绿787cDNA样品1、2中SlCK1基因克隆验证图；

图8为四种番茄cDNA样品构建Super 1300-GFP-SlCK1表达载体转化农杆菌阳性验证图；

图9为番茄砧木与接穗中SlCK1基因序列比对图；

图10为番茄SlCK1基因进化树分析图；

图11为番茄低温胁迫下表型变化图，其中A.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的表型正视图；B.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的表型俯视图；

图12为番茄低温胁迫下叶绿素及类胡萝卜素变化统计图，其中A.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的叶绿素a含量比较图；B.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的叶绿素b含量比较图；C.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的类胡萝卜素含量比较图；D.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的叶绿素(a+b)含量比较图。

图13为番茄低温胁迫下电导率变化统计图，其中A.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的相对电导率变化柱状图；B.为中杂9号和铁木砧4℃处理不同时段的相对电导率变化折线图。

图14为磷脂代谢途径示意图，其中，灰色斜体为相关基因简称，实线表示合成步骤，虚线表示分解步骤；

图15为中杂9号和铁木砧中4℃处理的不同时段磷脂酰乙醇胺合成途径相关基因相对表达量对比图，其中(a).为SDC基因；(b).为PECT基因；(c).为AAPT基因；(d).为CK1基因。

图16为中杂9号和铁木砧中4℃处理的不同时段磷脂酰胆碱合成途径相关基因相对表达量对比图，其中(a).为CCT基因；(b).为PMT1基因；(c).为AAPT基因；(d).为PMT2基因；(e).为PLMT基因；(f).为CK1基因。

图17为为中杂9号和铁木砧中4℃处理的不同时段磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱分解途径相关基因相对表达量对比图，其中(a).为NPC1基因；(b).为NPC3基因；(c).为NPC2基因；(d).为PLD基因。

具体实施方式

以下结合附图1-17对本发明作进一步详细说明。

实施例1.一种AtCK1基因对拟南芥耐低温调控初步分析

1.植物材料

1.1.拟南芥材料：ck1.1突变体、ck1.2突变体、col-0野生型、SlCK1过表达拟南芥

1.2.拟南芥栽培：取少许拟南芥种子均匀铺撒于基质上进行培养，保鲜膜覆盖保温保湿，并标记。在光照培养箱中培养，约1周揭膜再培养约1周后进行分苗；

1.3.拟南芥分苗：取长势较为一致的苗分于32孔穴盘中，按照处理时段数要求合理分配每个处理的苗数(每个处理苗数不少于3)，同时设置对照组。

1.4.拟南芥培养要求：培养温度为白天22℃、夜晚18℃，光周期为光照16h、黑暗8h；

基质配比为蛭石：珍珠岩：草炭＝1:1:2；拟南芥较耐旱浇水不宜过多，每隔一天浇一次；注：水应浇于穴盘中勿于植株直接接触。

2.AtCK1基因对拟南芥耐低温调控的表型分析：

拟南芥材料生长至约12片叶时设置对照组与处理组进行低温处理，处理条件为4℃，光周期为光照16h、黑暗8h，处理时长为0h、24h、48h、3d、4d；每个处理时段拍照记录其表型(参考图1)并记录拟南芥抽薹时叶片数目(参考图2)。

实施例2.一种番茄耐低温SlCK1基因克隆、载体构建方法

1.植物材料

1.1.浸种

番茄(所用番茄材料如表1所示)种子分别在55℃的水浴锅中温汤浸种20min进行表面消毒，然后继续在常温下浸种10h；

表1实施例2中所用番茄材料

1.2.催芽

再用纱布将浸种后的种子反复搓揉去掉种子表面抑制发芽的物质；准备铺有一层滤纸的培养皿并用蒸馏水稍微润湿，挑选饱满的种子摆种于滤纸上，将培养皿用锡箔纸密封置于28℃培养箱暗中催芽2-5d。

1.3.栽培

及时将出芽的种子种植于培养箱中，培养条件第一阶段28℃暗培养24h；第二阶段培养温度为白天22℃、夜晚18℃，光周期为光照16h、黑暗8h光周期；

1.4.取样

栽培半个月左右，将整株植株用蒸馏水洗净，再用锡箔纸包裹，并标记；再置于液氮中快速冻结，于-80℃冰箱中保存备用。

2.番茄Total RNA的提取

将在-80℃超低温冰箱中保存的样品取出置于研钵，加入液氮充分研磨至细粉末状；再用预冷过干净的钥匙转移至2mL离心管中，后续操作按照北京华越洋生物公司RNA提取试剂盒(GK型)说明书步骤进行。

3.番茄总cDNA制备

提取的Total RNA先测定浓度，再按Takara公司提供的试剂盒剂盒RR047A，PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)说明书步骤进行反转录得到总的cDNA。

4.番茄SlCK1基因特异引物筛选

4.1.引物设计

根据在Tair网站找到的已知拟南芥相关基因，再在NCBI上得到番茄中相似度较高的基因组序列，利用NCBI与软件CLC-sequence viewer 7.1共同完成序列分析引物设计，并在Primer F前加上限制性酶切位点Xba I、Primer R后加上限制性酶切位点Kpn I。引物由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列参考表2；

表2番茄SlCK1基因特异引物

4.2.SlCK1基因特异引物筛选

(1)将200μL的PCR离心管置于冰上，按反应体系加入试剂，并用移液枪吸打混匀，离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系：

PCR程序:

(2)电泳检测

制备20μL体系的1％的电泳凝胶，在凹槽中加入10μL样品，两头的凹槽加入10μL2kbp的DNA Marker,180V电压下电泳约15min后在紫外线下检测结果,参考图3-4选择WZ62/63作为克隆SlCK1基因特异引物组合。

5.番茄SlCK1基因克隆

5.1.SlCK1基因克隆体系：

PCR程序同实施例2的4.2

5.2.胶回收

制备50μL体系的1％的电泳凝胶，在凹槽中加入50μL样品，两头的凹槽加入10μL2k bp的DNA Marker，180V电压下电泳约15min，在紫外灯下检测并用刀将分离出的cDNA切下，放入试管中备用。回收样品为用引物WZ62/WZ63克隆出的番茄SlCK1基因，将切下的胶称重，再按Takara公司MiniBESTAgaroseGel DNAExtractionKitVer.4.0试剂盒(9762)步骤回收DNA(体系为20μL)并测定浓度。

5.3.克隆载体构建与转化

5.3.1.克隆载体构建

将回收到的SlCK1基因的DNA连接克隆载体质粒(

-T Easy Vector)，体系混合后在金属浴中16℃，过夜；

载体构建体系：

5.3.2.转化

将构建的克隆载体转入大肠杆菌感受态细胞(DH5α)中增殖，筛选，步骤如下：

(1)保存在-80℃超低温冰箱的大肠杆菌感受态细胞液在冰上融化，30μL菌液中加入10μL连接产物(克隆载体)，冰上孵育10min，期间用手指拨弄离心管，混匀几次；

(2)42℃金属浴热激1min；

(3)立即放在冰上冷激1min；

(4)LB液体培养基1mL加入步骤(3)的离心管中，在37℃、170rpm的摇床上培养45min；

(5)超净工作台紫外灯灭菌20min，送风5min；

(6)从摇床中取出菌液，6000rpm离心2min，弃800μL上清液；

(7)在超净工作台中用移液枪将200μL上清液于菌块吸打混匀，并涂板于LB固体培养基(含2‰氨苄青霉素)；

(8)菌液均匀涂干后盖盖，用封口膜封口并标记；

(9)37℃培养箱中倒置暗培养12h。

5.3.3.PCR阳性鉴定

大肠杆菌经过转化培养后，构建PCR体系进行扩增，鉴定SlCK1基因是否构建和转化成功，步骤如下：

(1)在超净工作台中，每个离心管中加入20μL LB培养液，用离心管从培养基上随机挑取8个菌斑分别放入8个装有LB培养液的离心管中；

(2)PCR扩增

PCR扩增所用主要试剂为北京聚合美生物科技有限公司的2X M5 HiPer Taq PCRmix(with Red Dye)经典红色染料2x Taq PCR mix)；

PCR扩增体系：

PCR程序：

(3)电泳

a)在凹槽中加入10μL样品，两头的凹槽加入5μL 2kbp DNA Marker；

b)电泳后在紫外灯下测定，鉴定结果参考图5-7；

(4)测序

选择扩增较亮条带对应的菌液加入到700μL LB培养液(含2‰氨苄青霉素)中37℃、180r/min摇床培养12h，再取100μL由擎科公司测序；

(5)测序结果分析

a)用软件CLC-sequence viewer 7.1分析测序结果，将番茄(铁木砧、中杂9号、仙客来、久绿787)SlCK1基因与番茄库中CK1基因进行序列对比(比对差异部分参考图9)，并将其与其他物种CK1基因构建进化树进行同源分析(参考图10)；最终选择同源性适中且序列差异较小的铁木砧(砧木)和中杂9号(接穗)进行后续试验；

b)选择测序结果正确的样品于37℃、180r/min摇床中摇匀后按天根生化科技有限公司快速质粒小提试剂盒(DP105)提取质粒，并保存备用。

6.植物表达载体构建与转化

6.1.目的基因SlCK1与表达载体制备

(1)测定选择样品和质粒浓度，标准浓度为200-300ng/μL；

(2)双酶切植物载体Super 1300-GFP(C端)和带SlCK1基因的克隆质粒，37℃金属浴中酶切过夜；

酶切体系：

(3)电泳后分别回收带酶切位点的SlCK1序列和线性质粒，并测定浓度；

(4)将双酶切产物(SlCK1序列与Super 1300-GFP线性质粒)连接，体系混合好后放入16℃金属浴中连接，过夜；

连接体系：

6.2.农杆菌电击转化

6.2.1.转化

(1)在超净工作台中将0.1cm的电击杯和杯盖从储存液中拿出，倒置于滤纸上沥干，然后正置5min待乙醇充分挥发干净后立即插入冰上预冷，电击杯完全插入冰中上部留出0.5cm方便电击杯盖盖，预冷至少5min；

(2)-80℃超低温保存的农杆菌感受态(GV3101)在冰上融化后，加入0.01-1μg质粒(本次试验均加入3μL)，用手拨打离心管底部混匀后立即插入冰中冷却，用移液枪将感受态细胞和质粒的混合物快速转移至电击杯的凹槽中，盖上杯盖至于冰上，空管保留备用；

(3)设置好电转仪的参数(manual 1.80V)，电击前将电击杯杯壁快速擦干，双击pluse听到滴滴两声后迅速拿出放在冰上冷却；

(4)电击完成后在超净工作台中用LB培养液(含1‰卡那霉素和2‰利福平)将电击杯内部菌液充分洗涤并转移到备用的空管中，培养液总共加入700μL，菌液在摇床中28℃、180r/min培养2-3h。

6.2.2.PCR阳性鉴定

(1)摇好的菌液6000rpm离心1min，在超净工作台中弃掉上清液留100μL左右，用移液枪吸打使菌块重悬，涂布于YEB(含1‰卡那霉素和2‰利福平)固体培养基上，28℃培养箱中倒置暗培养2d；

(2)挑取单菌落放入预先加有700μL的LB(含1‰卡那霉素和2‰利福平)培养液中，并设置一个只有培养基的对照组，28℃、150r/min摇菌；

(3)冰上加样，用无菌水做对照，PCR反应体系和程序以及电泳步骤同5.3.3.，PCR检测结果参考图8。

6.2.3.保菌

选择PCR结果较亮条带对应的农杆菌菌液700μl，加入等体积的甘油混匀后密封，液氮中速冻后置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

实施例3.一种SlCK1基因对番茄耐低温调控分析

1.植物材料

番茄砧木：铁木砧

番茄接穗：中杂9号

栽培方式同实施例2的步骤1，栽培1个月左右，约5片真叶时进行试验处理。

2.低温处理

取生长状态一致的番茄苗进行低温处理，为保证结果的准确性后续步骤中用到的材料应同时取样检测；处理组至少3个生物重复，处理温度为4℃，光周期为光照16h、黑暗8h，分别于0、3、6、9d取样；具体取样方式后续步骤详述。

3.不同时段低温处理下番茄生理指标检测

3.1叶绿素测定：

根据种植番茄数设置每次取样株数，本次试验设置4个生物学重复。取番茄第一真叶为材料，用毛刷对叶片表面进行清理，避开叶片的主叶脉，用半径0.4cm的打孔器取新鲜叶片，记录每个植株取样数；将样品放入加有10mL的95％乙醇的10mL离心管中；密闭后于黑暗处静置24h，叶片组织变白后，将离心管中溶液颠倒混匀，取上清液于比色皿中，用分光光度计分别于649nm，665nm，470nm三个波长下比色，记录A649,A665,A470；(参考图12)

结果计算：Ca＝13.95A665-6.88A649

Cb＝24.96A649-7.32A665

C胡＝(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245

3.2电导率测定：

取番茄第二真叶为材料，与实施例3中3.1同样的方法取样，同样设置重复数为4组；每株植物取样数固定为6个圆片，放入加有10mL的蒸馏水10mL离心管中作为一个重复。密闭后在摇床上摇晃浸泡24h，测定浸泡液的电导值EC₁；然后再将测定过电导值的各浸泡液放入沸水中煮沸15min，冷却至室温后在摇床上摇晃浸泡24h后测一次电导值EC₂，用蒸馏水做对照测定值记为EC₀；(参考图13)

相对电导率值计算按如下公式:

相对电导率(100％)＝(EC₁-EC₀)/(EC₂-EC₀)×100％

3.3不同时段低温处理下番茄表型鉴定

与实施例3中3.1取样时间相同，同样设置重复数为4组；每个处理时段按同一个角度进行拍照记录，选择处理组中较为典型的植株照片组图比较；(参考图11)

3.4不同时段低温处理下SlCK1以及磷脂代谢途径相关基因转录水平表达分析：

(1)与实施例3中3.1取样时间相同，与实施例2中相同方法提取番茄在不同低温处理下Total RNA，并反转录合成cDNA第一链；

(2)根据SlCK1以及磷脂代谢途径(参考图14)相关基因序列在NCBI网站在线设计实时定量PCR引物，引物如表3；

表3番茄磷脂代谢途径相关基因实时定量PCR引物

(4)处理数据并做图比较(参考图15-17)。

中杂9号和铁木砧中磷脂合成途径相关基因可以响应低温胁迫，并且响应程度有显著差异。其中，磷脂酰乙醇胺合成途径相关基因(SDC、CK1、PECT1、AAPT)在铁木砧中表达量除了低温处理第3d时总是高于中杂9号，尤其是低温处理第6d(如图15所示)；同样在磷脂酰胆碱合成途径中，相关基因(CCT、AAPT、PLMT、CK1)除了低温处理第3d时，在铁木砧中表达量总是高于中杂9号，尤其是低温处理第6d(如图16所示)。前人研究胆碱激酶更倾向与底物胆碱结合(Wharfe&Harwood,1979)，因此可以理解磷脂酰乙醇胺合成磷脂酰胆碱途径相关基因(PMT1、PMT2)在低温处理后表达量在铁木砧和中杂9号中均锐减(如图17所示)。而在磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱分解途径中相关基因(NPC1、NPC2、NPC3、PLD)也呈现与其他两个和成途径中相同的表达趋势，可能是因为PMT1、PMT2基因表达量减少使得本应该生成磷脂酰胆碱的磷脂酰乙醇胺累积，迫使分解过程的基因表达；也可能是因为低温处理6d番茄造成巨大损伤，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱无法正常运输到作用部位导致累积，触发分解途径基因的表达。这些猜测还需要许多后续实验进行证实。

综上所述，番茄存在磷脂代谢途径，并且其中大部分基因能够响应低温表达。在低温处理第6d表达量最高，低温处理9d时导致番茄严重损伤或死亡，基因表达量锐减。其中胆碱合成关键性的催化酶CK1(同上述SlCK1)基因可以响应低温胁迫。

上述实施例只为说明本发明的技术构思，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明提出的技术构思与路线所作的任何等效修饰或改动，均应涵盖在本发明的保护范围内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

参考文献

Eastmond PJ，Quettier AL，Kroon JTM，et al.2010.PHOSPHATIDIC ACIDPHOSPHOHYDROLASE1 and 2RegulatePhospholipid Synthesis at the EndoplasmicReticulum in Arabidopsis.Plant Cell,22:2796-2811.

Lin Y,Kanehara K and Nakamura Y.2019.Arabidopsis CHOLINE/ETHANOLAMINEKINASE 1(CEK1)is a primary choline kinase localized at the endoplasmicreticulum(ER)and involved in ER stress tolerance.New Phytologist,223:1904-1917.

Lin Y,Liu Y,and Nakamura Y.2015.The Choline/Ethanolamine KinaseFamily in Arabidopsis:Essential Role of CEK4 in Phospholipid Biosynthesis andEmbryo Development[J].Plant Cell,27:1497-1511.Sanchez-Lopez E,Zimmerman T,Gomez del Pulgar T,et al.2013.Choline kinase inhibition induces exacerbatedendoplasmic reticulum stress and triggers apoptosis via CHOP in cancercells.Cell Death&Disease,4:e933.

Tasseva G,Richard L,Zachowski A,et al.2004.Regulation ofphosphatidylcholine biosynthesis under salt stress involves choline kinasesin Arabidopsis thaliana.FEBS Letters,566:115-120.

Vevea JD,Garcia EJ,Chan RB,et al.2015.Role for lipid dropletbiogenesis and microlipophagy in adaptation to lipid imbalance inyeast.Developmental Cell,35:584-599.

Wharfe J,Harwood JL.1979.Lipid metabolism in germinatingseeds.Purification of ethanolamine kinase from soya bean.Biochimica etBiophysica Acta，575:102-111.

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种番茄SlCK1基因调控番茄低温抗性的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 1

atggcggtga agactatgga agttgttgat ggtattttgc cggaggaatt gatgaaattg 60

ctcatgtcat tagctacaaa atggggggat gtgttggatc taaagaactt gaaagttcat 120

catttgagtg gtgctatgac taatgaggtt tataggataa gttggcctac taagaacgaa 180

aacgtcccga ggagagtttt ggttcgaatg tatggtgaag gagtagatcg tttttttaat 240

agggatgaag agattagaac tttcgagtgc ttgtcaaaga agggtcaagg acctaagctt 300

cttggtcaat ttgcaaatgg tagagttgag gagttcattc atgcaaggac actgtctgct 360

gaagatcttc gtgactcgga gatctcttct ttgatagctg caaaactgag ggagtttcat 420

aaccttgaca tgcctggttc aaggaatgtt cttctatggg accgtctcag aaagtggcta 480

aatgaggcga agggtctgtg ctcccctgaa catctaaagg agttctcttt aggtaatctg 540

gacgaggaga tcagcttatt ggagaaagaa ctgccaacag agtctcaaaa cattgccttt 600

tgtcacaatg acatgcagta tggtaacata atgattgacg acaaaacaaa ggctgttact 660

atcattgact atgagtatgg cggttataat ccaattgctt atgactttgc gaaccacttc 720

tgtgaaatga ctgcaaatta tcatactgat acccctcata tcatgcactt caacacttac 780

cctgattttg aggagcgaca gcgatttgta cgtgcatatc tcagttcatc aggcaatcaa 840

ccaagtgatg aggaagtaaa gaaacttgtt gacgaatcag agaaatatac gcttgcaaat 900

cacttgttct ggggattgtg gggagtcatc tcggcatatg ttaacaatat cgagtttgac 960

tacatggagt acgcgagggg aaggttcaag cagtactggt tgagaaagcc cgaactctta 1020

ggtgcctcag acgacttgtt acatgttgat gattcagctg aaccagttca cattctccgc 1080

tcaaaagatt tatgttaa 1098

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 2

Met Ala Val Lys Thr Met Glu Val Val Asp Gly Ile Leu Pro Glu Glu

1 5 10 15

Leu Met Lys Leu Leu Met Ser Leu Ala Thr Lys Trp Gly Asp Val Leu

20 25 30

Asp Leu Lys Asn Leu Lys Val His His Leu Ser Gly Ala Met Thr Asn

35 40 45

Glu Val Tyr Arg Ile Ser Trp Pro Thr Lys Asn Glu Asn Val Pro Arg

50 55 60

Arg Val Leu Val Arg Met Tyr Gly Glu Gly Val Asp Arg Phe Phe Asn

65 70 75 80

Arg Asp Glu Glu Ile Arg Thr Phe Glu Cys Leu Ser Lys Lys Gly Gln

85 90 95

Gly Pro Lys Leu Leu Gly Gln Phe Ala Asn Gly Arg Val Glu Glu Phe

100 105 110

Ile His Ala Arg Thr Leu Ser Ala Glu Asp Leu Arg Asp Ser Glu Ile

115 120 125

Ser Ser Leu Ile Ala Ala Lys Leu Arg Glu Phe His Asn Leu Asp Met

130 135 140

Pro Gly Ser Arg Asn Val Leu Leu Trp Asp Arg Leu Arg Lys Trp Leu

145 150 155 160

Asn Glu Ala Lys Gly Leu Cys Ser Pro Glu His Leu Lys Glu Phe Ser

165 170 175

Leu Gly Asn Leu Asp Glu Glu Ile Ser Leu Leu Glu Lys Glu Leu Pro

180 185 190

Thr Glu Ser Gln Asn Ile Ala Phe Cys His Asn Asp Met Gln Tyr Gly

195 200 205

Asn Ile Met Ile Asp Asp Lys Thr Lys Ala Val Thr Ile Ile Asp Tyr

210 215 220

Glu Tyr Gly Gly Tyr Asn Pro Ile Ala Tyr Asp Phe Ala Asn His Phe

225 230 235 240

Cys Glu Met Thr Ala Asn Tyr His Thr Asp Thr Pro His Ile Met His

245 250 255

Phe Asn Thr Tyr Pro Asp Phe Glu Glu Arg Gln Arg Phe Val Arg Ala

260 265 270

Tyr Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gln Pro Ser Asp Glu Glu Val Lys Lys

275 280 285

Leu Val Asp Glu Ser Glu Lys Tyr Thr Leu Ala Asn His Leu Phe Trp

290 295 300

Gly Leu Trp Gly Val Ile Ser Ala Tyr Val Asn Asn Ile Glu Phe Asp

305 310 315 320

Tyr Met Glu Tyr Ala Arg Gly Arg Phe Lys Gln Tyr Trp Leu Arg Lys

325 330 335

Pro Glu Leu Leu Gly Ala Ser Asp Asp Leu Leu His Val Asp Asp Ser

340 345 350

Ala Glu Pro Val His Ile Leu Arg Ser Lys Asp Leu Cys

355 360 365

Claims

1.一种番茄耐低温SlCK1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.由权利要求1所述的番茄耐低温SlCK1基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种番茄耐低温SlCK1基因的克隆及载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

WZ63:GCTCTAGATGATGGCGGTGAAGAC

WZ62:GGGGTACCACATAAATCTTTTGAGCG；

步骤5：PCR鉴定大肠杆菌阳性，阳性结果由公司测序；

步骤8：PCR鉴定农杆菌阳性；

4.一种番茄耐低温SlCK1基因对番茄耐低温调控分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：低温处理：将番茄铁木砧和番茄中杂9号栽培1个月左右，约5片真叶时进行低温处理，处理温度为4℃，光周期为光照16h、黑暗8h；分别于处理时间0、3、6、9d取样，其中番茄铁木砧作为番茄砧木，其中番茄中杂9号作为番茄接穗；

(1)按照步骤1中的处理取样，按照权利要求3所述的番茄耐低温SlCK1基因的克隆及载体构建方法中的步骤1、步骤2分别提取不同处理时间的番茄Total RNA，并反转录合成cDNA第一链；

(3)利用特异引物，设置一个ddH₂O的空白对照以及Actin对照组，试验步骤按照Takara公司嵌合法Real Time PCR试剂盒RR430A说明书进行操作，试验全程在冰上进行；

(4)处理数据并做图比较。

5.如权利要求4所述的番茄耐低温SlCK1基因对番茄耐低温调控分析方法，其特征在于，所述磷脂代谢途径相关基因包括：CCT基因、AAPT基因、NPC1基因、NPC2基因、NPC6基因、PLD基因、CK1基因、SDC1基因、PECT1基因、PMT1基因、PMT2基因和PLMT基因。

6.如权利要求5所述的番茄耐低温SlCK1基因对番茄耐低温调控分析方法，其特征在于，所述CCT基因的引物为：

上游引物：GGCACATGACGCTCTTCCTT

下游引物：TTCCATCAGTCCGCTTGGTC；

所述AAPT基因的引物为：

上游引物：CATGGGTGTGATGCGCTTG

下游引物：CATCCCGTCCACACATAGCA；

所述NPC1基因的引物为：

上游引物：GCATGGGCTGGGACATTTGA

下游引物：TTGCATCTTCTCTTGGTCCCC；

所述NPC2基因的引物为：

上游引物：CCCGCGACTCTGTTTTACCT

下游引物：TCCATGTATCGCTGCTCCAC；

所述NPC6基因的引物为：

上游引物：GCCAAAGGGACCTACACCAA

下游引物：TCAGGTAGAACCTCAGGGCA；

所述PLD基因的引物为：

上游引物：GCCAGAAGGAATCCCCGAAA

下游引物：CCGCTCTTCTTCACCTCTCG；

所述CK1基因的引物为：

上游引物：GCGACAGCGATTTGTACGTG

下游引物：ACTCCCCACAATCCCCAGAA；

所述SDC1基因的引物为：

上游引物：GGTGGCGGATGTTCGATTTG

下游引物：CATCCGCATCAGGTTCCGTA；

所述PECT1基因的引物为：

上游引物：GCAGATCAAGCGCACAGAAG

下游引物：GACTGGGGGAGTCAACAGTG；

所述PMT1基因的引物为：

上游引物：CGGAACTTACTGTGGAAGCA

下游引物：GCCCAGCATTCTTGGCTAAC；

所述PMT2基因的引物为：

上游引物：CGGAACTTACTGTGGAAGCA

下游引物：GCCCAGCATTCTTGGCTAAC；

所述PLMT基因的引物为：

上游引物：GGCCCCTTTTCATCTTTGGC

下游引物：ATGCTGCCGACATACTGAGG。

7.如权利要求4-6任一权利要求所述的番茄耐低温SlCK1基因对番茄耐低温调控分析方法，其特征在于，所述番茄耐低温SlCK1基因可以响应低温胁迫。