CN117866065A - 基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术领域，提供了基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用，SlJUBL2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SlJUBL2编码的SlJUBL2转录因子氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。过表达载体，所述过表达载体包含所述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质。所述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质应用在调控番茄耐盐性和培育耐盐转基因植物中。本发明将过表达载体导入后得到的阳性过表达植株的耐盐性高于野生型植株的耐盐性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用。
背景技术
由于不合理的耕作灌溉、过度施肥、过度砍伐森林以及一些自然原因，导致目前土壤盐渍化加剧，严重影响了土地资源及作物产量，限制农业的发展。土壤盐渍化指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程，这会导致土壤理化性状及基本特性发生改变。植物在盐渍化土壤中会出现根系吸水困难和细胞脱水等现象，从而影响植物的正常生长发育，造成巨大的经济损失，盐胁迫已经成为全球作物生产的日益严重的威胁。
番茄(Solanum lycopersicum)是市场中最常见的园艺产品之一，但是栽培番茄大多不耐盐，在高盐情况下，正常生长发育会受到影响，病虫害加重，产量和品质下降，次生盐渍化是目前番茄栽培所遇见的重要障碍之一。目前，可利用的番茄耐盐资源还比较有限。因此，利用生物育种技术开发耐盐基因，定向快速培育耐盐番茄品种具有重要的理论意义和应用价值。
随着分子生物学理论与技术的发展，目前在分子层面对番茄耐盐性机制已经有了一定的研究。目前已发现多种转录因子家族能够参与盐胁迫响应，如NAC转录因子、MYB转录因子、bHLH转录因子等。其中NAC转录因子是植物特有的一类转录因子，广泛分布在拟南芥、水稻、番茄等植物中，能够调控植物生长发育、合成次生代谢产物，并能够调控植物非生物胁迫响应。拟南芥JUB1转录因子属于NAC转录因子的一员，目前在叶片衰老中的功能和分子机制已有报导，但NAC家族中不同的基因功能有所差异，在番茄中JUB1转录因子调控逆境胁迫响应中的功能和分子机理还并不清楚。为此我们提出基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质，所述SlJUBL2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SlJUBL2编码的SlJUBL2转录因子氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
过表达载体，所述过表达载体包含上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质。
上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用。
上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在培育耐盐转基因植物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用，将过表达载体导入后得到的阳性过表达植株的耐盐性高于野生型番茄植株的耐盐性，200mM NaCl处理14d后，野生型番茄植株与SlJUBL2过表达植株相比受损程度更加严重；处理21d后，野生型番茄植株与SlJUBL2过表达植株相比明显萎蔫、枯黄。
附图说明
图1为本发明实施例1中胶回收(a)、大肠杆菌(b)和农杆菌(c)的检测结果图。
图2为本发明实施例2中阳性苗检测结果图。其中，M代表Marker，泳道1-33是SlJUBL2过表达植株，泳道34为野生型番茄植株Micro Tom(MT)，泳道35为阳性对照。
图3为本发明实施例2中野生型番茄植株与SlJUBL2过表达植株的SlJUBL2表达情况。
图4为本发明实施例2中清水处理21d野生型番茄植株MT和SlJUBL2过表达植株的表型观察对比。
图5为本发明实施例2中盐处理21d野生型番茄植株MT和SlJUBL2过表达植株的表型观察对比。
图6为本发明实施例2中未经过盐处理和盐处理后野生型番茄植株MT和SlJUBL2过表达植株叶片的DAB染色结果图。
图7为本发明实施例2中盐处理14d后野生型番茄植株MT叶片与SlJUBL2过表达植株的生理指标测定结果图。其中，(a)为SOD含量测定结果；(b)为POD含量测定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质，所述SlJUBL2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SlJUBL2编码的SlJUBL2转录因子氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
过表达载体，所述过表达载体包含上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质。
上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用。
上述SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在培育耐盐转基因植物中的应用。
实施例1、转基因植株的获得
A、过表达载体的构建：提取野生型番茄植株MT叶片的总RNA，反转录出cDNA，以获得的cDNA为模板，引物为：
SlJUBL2-F：GGAGAGAACACGGGGGACTTTGCAACATGATGGAAGT GGAAAAAAT；
SlJUBL2-R：CCACTCCCTGAAGCGGCCGCTGTACAAAACAAAGGATC AAACGAAA；
进行PCR扩增，获得目的片段后进行胶回收。用限制性内切酶酶切pBWA(V)HS-GLosGFP载体，并运用无缝克隆技术将目标基因片段与载体进行连接，完成过表达载体的构建。
B、大肠杆菌介导遗传转化
1)取50μL DH5α感受态细胞在冰上融化，并在超净工作台上加入2-5μL重组产物；
2)轻轻拨打离心管壁混匀(不可涡旋)，静置冰上30min；
3)放入42℃水浴锅，热激30-60s，然后置于冰上冷却2min；
4)在离心管中加入400ml无抗LB液体培养基，在37℃、200r/min的条件下培养1h；
5)取100μL菌液涂于卡那霉素抗性的LB平板上，放于37℃培养箱过夜培养；
6)取阳性菌落测序并提取质粒，-20℃冰箱保存备用。
C、农杆菌介导遗传转化获得过表达植株
1)取50μL GV3101农杆菌感受态在冰上融化，在超净工作台内加入1μL质粒；
2)轻轻拨打离心管壁混匀，静置冰上5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
3)加入500μL无抗LB液体培养液，在28℃摇床中振荡培养3-5h；
4)取大约100μL菌液涂于含利福平和卡那霉素的LB平板上，放于28℃培养箱，培养2-3d；
5)选取阳性菌甘油保存，存放于-80℃冰箱。
D、遗传转化获得过表达植株。
在本发明实施例中，胶回收、大肠杆菌和农杆菌的检测结果如图1中(a)、(b)和(c)所示。
实施例2、耐盐性鉴定
A、植物材料的种植：取若干所需要的番茄种子，提前浸泡在清水中约3h。准备一些干净的培养皿，垫上干净湿润的滤纸，根据不同株系，将浸泡好的种子均匀铺在滤纸上，进行催芽。暗处理约3-4d，种子露白后将其转移到花盆中；2-3片真叶时期分苗，转到方形花盆；放置在培养室中培养，培养温度25/20℃(昼/夜)，光周期16/8h光暗循环。
B、转基因阳性苗的鉴定：提取DNA后PCR检测，引物为：
35SF：GACGCACAATCCCACTATCC；
SlJUBL2-R：AAACAAAGGATCAAACGAAA；
进行PCR扩增，PCR反应体系(10μL)如下：
反应条件为：
琼脂糖和TAE缓冲液以1g:100mL比例配制，加入EB替代染料，后进行电泳检测，以质粒作为阳性对照，以野生型番茄MT作为阴性对照。与阳性对照有相应的条带的即为阳性植株，挑选阳性植株保留。
阳性苗的检测结果如图2所示，M代表Marker，泳道1-33是SlJUBL2过表达植株，泳道34为野生型番茄植株MT，泳道35为阳性对照。
C、野生型番茄植株MT与SlJUBL2过表达植株的SlJUBL2表达情况及表型观察：在植株生长过程中发现，处于同一生长时期的野生型番茄植株MT与SlJUBL2过表达植株在株高上有一定差异，野生型番茄植株MT高于SlJUBL2过表达植株。利用实时荧光定量技术，结果如图3所示，野生型番茄植株MT的SlJUBL2表达量明显低于过表达植株的SlJUBL2表达量，并且不同株系的表达量不同。
D、过表达SlJUBL2植株与野生型番茄植株耐盐性比较
分别用200mM NaCl(实验组)和清水(对照组)处理野生型MT和SlJUBL2过表达植株；
参见图4，清水处理21d野生型番茄植株MT和SlJUBL2过表达植株发现，野生型番茄植株MT株高略高于SlJUBL2过表达植株；而经过盐处理21d后的实验组中，野生型番茄植株MT叶片严重萎蔫枯黄，但是SlJUBL2过表达植株叶片没有出现严重干枯萎蔫现象(参见图5)。
盐处理14d后取实验组和对照组的番茄叶片进行DAB染色，参见图6，发现对照组中野生型番茄植株MT叶片与SlJUBL2过表达植株的叶片受损程度相似，而实验组中野生型番茄植株MT叶片比SlJUBL2过表达植株的叶片受损程度明显更大。
参见图7，盐处理14d后，野生型番茄植株MT叶片与SlJUBL2过表达植株中SOD和POD含量均明显增加，SlJUBL2过表达植株的增幅大于野生型番茄植株MT，这说明基因SlJUBL2的过表达会引起植株体内抗氧化酶的活性增强，从而减少活性氧含量，进一步减小胁迫的伤害，从而提高植株耐盐性。
综上所述，SlJUBL2过表达植株的耐盐性优于野生型番茄植株。本发明所提供的应用，是将SlJUBL2基因以农杆菌介导的方式转入番茄植株，观察转基因植株与野生型番茄植株的表型差异，进行生理指标的测定，并进行对比，同时研究该基因对植物耐盐性的影响，探索关于影响植物耐盐性的新方法。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (4)
1.SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质，其特征在于，所述SlJUBL2的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述SlJUBL2编码的SlJUBL2转录因子氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包含如权利要求1所述的SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在调控番茄耐盐性中的应用。
4.根据权利要求1所述的SlJUBL2基因及其所编码的蛋白质在培育耐盐转基因植物中的应用。
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