CN118127032A

CN118127032A - 一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的myb转录因子筛选及其应用

Info

Publication number: CN118127032A
Application number: CN202410260518.2A
Authority: CN
Inventors: 肖继坪; 陈碧聪
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2024-03-07
Filing date: 2024-03-07
Publication date: 2024-06-04

Abstract

本发明涉及花色苷调控技术领域。本发明提供了一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用，所述基因为StMYB113基因和/或StMYB308基因；所述StMYB113和StMYB308基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述的StMYB113基因只有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3‑MYB蛋白，所述的StMYB308基因有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3‑MYB蛋白；异源转化StMYB308烟草叶片出现明显紫色斑点，说明StMYB308正调控花色苷合成，而不具备完整结构域的StMYB113则不能调控花色苷合成。

Description

一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用

技术领域

本发明涉及花色苷调控技术领域，尤其涉及一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)原产于南美洲安第斯山区，为一年生草本植物，是继小麦、水稻、玉米之后的第四大粮食作物。马铃薯是世界性商品化作物，也是重要的粮菜兼用作物。彩色马铃薯属于马铃薯栽培种，富含花色苷，花色苷使块茎的表皮和薯肉呈现出红色、紫色、黑色等丰富色彩。彩色马铃薯由于富含花色苷，比普通马铃薯含有更多的多酚化合物，因而具有更高的抗氧化活性，可作为获得天然花色苷的植物原材料之一。培育高花色苷含量的彩色马铃薯品种更有利于满足人类的营养需求。云南地域辽阔，属低纬高原省份，其生态环境、气候条件适宜彩色马铃薯的生长，在云南各地也有许多地方彩色马铃薯品种，如剑川红(红皮红圈)和花心洋芋(紫皮紫圈)分别含有较高的矢车菊色素和飞燕草色素，这两种彩色马铃薯可作为研究花色苷的理想资源材料。

MYB蛋白是含有两个(R2和R3)或三个(R1,R2和R3)不完全重复的DNA结合域的转录调控因子。大多数的MYB蛋白属于R2R3家族，而C1家族的MYB蛋白是最早发现的MYB转录因子家族的成员。在植物中，部分R2R3-MYB基因家族成员调控花色苷合成途径结构基因的表达，如：VvMYBP1调控葡萄浆果CHI基因的表达；在拟南芥中AtMYB113和AtMYB114等R2R3-MYB转录因子作为正调节因子参与花色苷的生物合成；在苹果中，MdMYB1、MdMYB10已被证明负责控制花色苷的生物合成；红肉猕猴桃中AcMYBF110通过特异性激活花色苷结构基因的启动子，在花色苷积累的调控中发挥重要作用。在彩色马铃薯中具有两个完整结构域的StMYB113和StAN1基因过量表达促进了花色苷的合成和积累。

温度是影响花色苷生物合成的一个重要环境因素，并且环境响应基因可以通过激活MYB转录因子来影响植物的颜色。拟南芥的MYB转录因子GL1、bHLH转录因子GL3和WD40蛋白TTG1的表达量在高温下减少，从而抑制花色苷的合成；苹果的MdMYB308L和MdMYBPA1均响应低温处理，两种基因均在低温胁迫和花色苷积累过程中扮演正调控者的角色，MdMYB308还可以与MdbHLH33直接互作进一步提高苹果的低温胁迫抗性和花色苷积累。目前，温度影响马铃薯的研究集中在低温(寒害)下马铃薯叶片的生理生化变化及其相关机理研究或在低温贮藏过程中马铃薯块茎内含物的变化，而适当低温处理促进彩色马铃薯花色苷合成的机理研究鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用，通过转录组测序发现彩色马铃薯StMYB113和/或StMYB308在低温条件下表达量显著增加，且与花色苷含量相关，推测这两个基因可能响应低温参与调控彩色马铃薯花色苷的生物合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种调控花色苷的基因，其所述基因为StMYB113基因和/或StMYB308基因；

所述StMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述StMYB308基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为优选，所述StMYB113基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述StMYB308基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了所述的基因在调控花色苷含量中的应用。

作为优选，所述调控时为10～15℃的低温环境，所述调控的对象为彩色马铃薯。

本发明还提供了一种用于扩增所述StMYB113基因的引物组，包括StMYB113-F和StMYB113-R；

所述StMYB113-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述StMYB113-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种用于扩增所述StMYB308基因的引物组，包括StMYB308-F和StMYB308-R；

所述StMYB308-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述StMYB308-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明提供了一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用，所述基因为StMYB113基因和/或StMYB308基因；所述StMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述StMYB308基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的StMYB113基因只具有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3-MYB蛋白，所述的StMYB308基因具有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白；异源转化StMYB308烟草叶片出现明显紫色斑点，说明StMYB308作为正调节因子参与花色苷的合成，而不具备完整结构域的StMYB113不能调控花色苷的合成。

附图说明

图1为两个彩色马铃薯品种不同时期块茎中StMYB113和StMYB308基因的相对表达量及花色苷含量；

图2为不同温度处理72天后剑川红不同组织部位的StMYB113和StMYB308基因的相对表达量与花色苷含量；

图3为StMYB113和StMYB308蛋白质结构分析及序列比对；其中A为三级结构预测，B为蛋白结构域分析，C为与花色苷合成相关蛋白的序列比对；

图4为StMYB113和StMYB308的亚细胞定位；

图5为转基因烟草的表型、基因表达量和花色苷含量；其中A为转StMYB113基因烟草，B为转StMYB308基因烟草，C为转StMYB113/StMYB308基因烟草中NtAN1a和NtAN1b基因的表达量，D为转StMYB113/StMYB308基因烟草和空载中的花色苷含量，采用Duncan多重比较法进行分析(P<0.05，n＝3)。

具体实施方式

所述StMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1：

ATGTGTAGGATTAAATCGATGTCGAAAGAGTTGCAGACTAAGGTGGCTAAATTATCTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCAGGAAGGACAGCAAATGATGTGAAGAACTATTGGAACACTCACTTTCAAAAGAAGTTAAATATTATTGCTCCTCCTCCTCCTCCTCGCCCTCGTCCTAATCATCATCTACAGATTAAGCATAAGAGCATCACGGTTAATAAGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAACTTCTCAAACGTTAAGAAGAATAATTCTCATTGGTGCAACAACAAAAGTATGATCACAAACACATTAGACAAAGACGACAAACGTTGCAAGGAAATCGTAGTAAATATTTCTGAGAAGCCAACAGGAGAAAATACATCGTCGATAGACGATGGAGTTCAATGGTGGACAAATTTACTGGAAAATTGCAATGAAATTGAAGAAGAAGTAGCTGTTACAAATTTTGAAAAAACACCAACAATGTTGTTACATGAGGAAATATCACCACCGTTAATTAATGGTGAAGGCAATTCCATGCAACAAGGACAAAGTCATGATTGGGATGACTTTTCAACTGATATTGACTTATGGAATCTACTTAATTAA；

所述StMYB308基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

SEQ ID NO.2；

ATGACTTCACATGTAATGATCATGAGTACTCCTATGATGTGTACATTTTTGGGAGTAATAAGGAAAGGTTCATGGACTGAAGAAGAAGATATTCTTTTGAGGAAATGTATTGATAAATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCAGGAAGGACAGCTAACGATGTGAAAAACTATTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGCTAAATACTAGTACTAAATTTGCTCCTCAACCACAAGAAGGAATTAATACTAGTACTATTGCTCCTCAACCACAAGAAGGAATTAAGTATGGGCAAGCCAATGCCATAATAAGACCTCAACCTCAGAAATTCACAAGCTCCATGAAGATTAATGTCTCTTGGTGCAACAACAATAGTATGGTAAATAATGAAGAAGCATCGAAAGACAACAACGATATGCAATGGTGGGCAAATATACTGGAAAATTGCAATGACATTGGAGAAGGAGAAGCTGAAAGAACACTACCTTCATGTAAGGAAATTAATTGCAATGAAATTGATAAAGCACCAAGTTTGTTACATGAGGGAGGCAACTCCATGCAACAAGGACAAGGTGATGG TGGTTGGGATGAATTTGCTCTAGATGATATATGGAATCTACTTAATTAA。

在本发明中，所述StMYB113基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

SEQ ID NO.3；

MCRIKSMSKELQTKVAKLSKATYQERWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTHFQKKLNIIAPPPPPRPRPNHHLQIKHKSITVNKNEIIRPQPRNFSNVKKNNSHWCNNKSMITNTLDKDDKRCKEIVVNISEKPTGENTSSIDDGVQWWTNLLENCNEIEEEVAVTNFEKTPTMLLHEEISPPLINGEGNSMQQGQSHDWDDFSTDIDLWNLLN；

所述StMYB308基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

SEQ ID NO.4；

MTSHVMIMSTPMMCTFLGVIRKGSWTEEEDILLRKCIDKWSLIAGRLPGRTANDVKNYWNTNLLRKLNTSTKFAPQPQEGINTSTIAPQPQEGIKYGQANAIIRPQPQKFTSSMKINVSWCNNNSMVNNEEASKDNNDMQWWANILENCNDIGEGEAERTLPSCKEINCNEIDKAPSLLHEGGNSMQQGQGDGGWDEFALDDIWNLLN。

所述的StMYB113基因只具有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3-MYB蛋白，所述的StMYB308基因具有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白。

本发明还提供了所述的基因在调控花色苷含量中的应用，即异源转化StMYB308烟草叶片出现明显紫色斑点，说明StMYB308作为正调节因子参与花色苷的合成，而不具备完整结构域的StMYB113不能调控花色苷的合成。

在本发明中，所述调控时为10～15℃的低温环境，进一步优选为12～13℃，所述调控的对象为彩色马铃薯。

所述StMYB113-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述StMYB113-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述StMYB308-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述StMYB308-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明通过转录组测序发现彩色马铃薯StMYB113和/或StMYB308在低温条件下表达量显著增加，且与花色苷含量相关，推测这两个基因可能响应低温参与调控彩色马铃薯花色苷的生物合成。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1材料准备

彩色马铃薯品种为剑川红(红皮红圈)和花心洋芋(紫皮紫圈)。经过25天的组织培养苗培养后，分株移植至移植盆中，在光照强度为11000lx、光周期为光/暗(12/12h)的光培养箱中，分别置于20℃(CK)、15℃和10℃三种不同温度处理下直至全生育期结束，共96天。过低的温度(10℃)处理抑制了花心洋芋的结薯，推迟了剑川红的结薯，剑川红在72天时才有块茎形成。不同温度处理马铃薯植株24天、48天和72天后，采集倒四叶和地上茎；处理48天、72天和96天后收集块茎。将每个组织的三个样品混合成一个重复，每个处理设计三个生物重复，在液氮中快速冷冻，并储存于-80℃冰箱中。提取样品的Total RNA并反转录成cDNA用于后续实验。采用pH示差法测定花色苷含量，选择不同处理下块茎花色苷含量最高时期的块茎送转录组测序。

实施例2实时荧光定量分析StMYBs的时空表达模式

根据StMYB113/StMYB308的cDNA序列设计qPCR特异性引物。采用qRT-PCR检测StMYB113/StMYB308在叶、茎和块茎的表达模式。

马铃薯看家基因(StGAPDH)：

正向引物(Forward Primer)5'-ATGAAGGACTGGAGAGGTGG-3'(SEQ ID NO.9)

反向引物(Reverse Primer)5'-GAAAATGCTTGACCTGCTGT-3'(SEQ ID NO.10)

StMYB113-qRT-PCR：

正向引物(Forward Primer)5'-AGCTTAATCCTCAAGTGGAGCATCG-3'(SEQ ID NO.5)

反向引物(Reverse Primer)5'-CGACCTGGTAACAAACGGGCTATC-3'(SEQ ID NO.6)

StMYB308-qRT-PCR：

正向引物(Forward Primer)5'-GTGGCATCTTGTTCCAACTAGAGC-3'(SEQ ID NO.7)

反向引物(Reverse Primer)5'-AAGTGACCATCGGTTGCCTAAGAG-3'(SEQ ID NO.8)

烟草看家基因(NtGAPDH)：

正向引物(Forward Primer)5'-GGTGTCCACAGACTTCGTGG-3'(SEQ ID NO.11)

反向引物(Reverse Primer)5'-GACTCCTCACAGCAGCACCA-3'(SEQ ID NO.12)

NtAN1a-qRT-PCR：

正向引物(Forward Primer)5'-ACCATTCTCGAACACCGAAG-3'(SEQ ID NO.13)

反向引物(Reverse Primer)5'-TGCTAGGGCACAATGTGAAG-3'(SEQ ID NO.14)

NtAN1b-qRT-PCR：

正向引物(Forward Primer)5'-CTTGAACACTTCTCAAACCGA-3'(SEQ ID NO.15)

反向引物(Reverse Primer)5'-TGCTAGGGCACAATGTGAAG-3'(SEQ ID NO.16)

qRT-PCR采用2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix(High ROX)试剂盒，在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行。

反应体系如表1所示：

表1

扩增程序：95℃预变性2min；95℃，变性15sec；60℃，退火30sec；扩增循环数：40。扩增的熔解曲线结果证实了PCR反应的特异性。Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase(GAPDH)基因作为马铃薯的内参基因，每个样品设置4个技术重复，基因的相对表达量采用2^-ΔΔCt方法计算。

结果表明：两个彩色马铃薯品种三个时期块茎中StMYB113和StMYB308基因的相对表达量在15℃处理72天时最高，且与花色苷含量变化趋势相同(图1)。不同温度处理72天后剑川红不同组织部位的StMYB113和StMYB308基因的相对表达量表现为茎＞块茎＞叶，与花色苷含量正相关(图2)。

实施例3生物信息学分析

使用NCBIORF finder软件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测StMYB113/StMYB308的ORF。利用ExPASy ProtParam对理论等电点(pI)、分子量、氨基酸组成进行预测和计算。

利用DNAMAN将马铃薯StMYB113/StMYB308编码蛋白序列与其他物种中具有调控花色苷合成功能的蛋白序列进行多序列比对；利用InterPro、SMART对StMYB113/StMYB308基因编码蛋白质的结构域进行预测分析。

StMYB113的核苷酸长度为639bp，共编码212个氨基酸，分子量为24.5kDa，只具有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3-MYB蛋白。

StMYB308的核苷酸长度为627bp，共编码208个氨基酸，分子量为23.4kDa，具有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白(图3)。

实施例4分子克隆

在剑川红转录组数据挑选MYB序列片段，以花心洋芋和剑川红的块茎中提取并反转得到的cDNA为底物，进行PCR扩增。

StMYB113-CDS扩增：

正向引物(Forward Primer)5'-ATGTGTAGGATTAAATCGATGTCG-3'(SEQ ID NO.17)

反向引物(Reverse Primer)

5'-TTAATTAAGTAGATTCCATAAGTCAATATCAGT-3'(SEQ ID NO.18)

StMYB308-CDS扩增：

正向引物(Forward Primer)

5'-ATGACTTCACATGTAATGATCATGAG-3'(SEQ ID NO.19)

反向引物(Reverse Primer)

5'-TTAATTAAGTAGATTCCATATATCACTAGAGCA-3'(SEQ ID NO.20)

使用SnapGene软件(4.3.6版)设计嵌套引物，使用2×Flash MasterMix克隆得到全长序列。

扩增反应体系如表2所示：

表2

StMYB113扩增程序：98℃，预变性30s：98℃，变性10sec；58℃，退火5sec；68℃，延伸3sec；扩增循环数：35；最后72℃延伸1min；4℃储存。

StMYB308扩增程序：98℃，预变性30s：98℃，变性10sec；55℃，退火5sec；68℃，延伸3sec；扩增循环数：35；最后72℃延伸1min；4℃储存。

通过PCR扩增，切胶回收纯化，参照试剂盒操作说明(Lethal Based Fast CloningKit)将克隆的目的片段连接到PLB Vector载体上。

克隆反应体系如表3所示：

表3

轻弹短暂离心混匀，放置于PCR仪中22℃控温7分钟。

(1)将连接好的体系加入100μL大肠杆菌菌株DH5α细胞(DH5αResistantChemically Competent Cell)；

(2)冰浴30min；

(3)42℃热激90sec后立即冰浴3分钟；

(4)向离心管中加入500μL 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基，150rpm、37℃振荡培养45min。

(5)将离心管中的菌液1500g离心2min，吸掉上清液510μL后混匀；

(6)吸取100μL加到含Amp⁺的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。待平板表面干燥30min后，倒置平板，37℃培养16h。

经Amp⁺抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，检测阳性克隆菌液，得到与预计产物大小相同的片段送去测序。通过测序与目的基因序列比对得到了StMYB113/StMYB308的全长cDNA序列。所采用引物序列如表1所示。

实施例5过表达载体构建

将基因片段利用IIOne Step Cloning Kit试剂盒与植物过表达载体PCAMBIA2305.1(KpnⅠ和XbaI双酶切)和亚细胞定位载体pHELLSGATE(KpnⅠ和XbaI双酶切)重组。

StMYB113-PCAMBIA2305.1：

正向引物(Forward Primer)

5'-CGGGGGACTCTTGACACTAGTATGTGTAGGATTAAAT-3'(SEQ ID NO.21)

反向引物(Reverse Primer)

5'-GTCACCAATTCACACTTAATTAAGTAGATTCCATAAG-3'(SEQ ID NO.22)

StMYB308-PCAMBIA2305.1：

正向引物(Forward Primer)

5'-CGGGGGACTCTTGACACTAGTATGACTTCACATGTAA-3'(SEQ ID NO.23)

反向引物(Reverse Primer)

5'-GTCACCAATTCACACTTAATTAAGTAGATTCCATATA-3'(SEQ ID NO.24)

StMYB113-pHELLSGATE：

正向引物(Forward Primer)

5'-TTGGAGAGGACACGCATGTGTAGGATTAAAT-3'(SEQ ID NO.25)反向引物(ReversePrimer)

5'-CCCTTGCTCACCATTTACAGACACTTCCCTCCATAT-3'(SEQ ID NO.26)

StMYB308-pHELLSGATE：

正向引物(Forward Primer)

5'-TTGGAGAGGACACGCATGACTTCACATGTAATGATCA-3'(SEQ ID NO.27)

反向引物(Reverse Primer)

5'-CCCTTGCTCACCATCGCTGCCGCCGCCGCCATTAAGT-3'(SEQ ID NO.28)。

重组反应体系如表4所示：

表4

目的基因回收产物	3.5μL
		PCAMBIA2305.1/pHELLSGATE	2.5μL
5×CEIIBuffer	2μL
		ExnaseII	1μL
ddH₂O	补齐至20μL

轻轻吸打混匀后，放置在PCR仪中37℃控温30min进行重组。

(1)取10μl重组产物加入到100μL DH5α感受态细胞中(DH5αResistantChemically Competent Cell)，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)；

(2)冰上静置30min；

(3)42℃水浴热激90sec后，立即置于冰上冷却3min；

(4)加入900μL LB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速150rpm)

(5)5,000rpm离心5min，弃掉900μL上清；

(6)用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Kan+抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养16h。

经Kan⁺抗生素筛选，挑取单克隆摇菌，阳性克隆测序，形成植物表达载体StMYB113-PCAMBIA2305.1/StMYB308-PCAMBIA2305.1及StMYB113-pHELLSGATE/StMYB308-pHELLSGATE。

提取StMYB113-PCAMBIA2305.1/StMYB308-PCAMBIA2305.1及StM YB113-pHELLSGATE/StMYB308-pHELLSGATE载体质粒，转化农杆菌GV3101(pSoup-p19)，经Kan⁺和Rif⁺抗生素筛选，得到阳性克隆，为植物表达载体StMYB113-PCAMBIA2305.1/StMYB308-PCAMBIA2305.1及StM YB113-pHELLSGATE/StMYB308-pHELLSGATE农杆菌。

实施例6亚细胞定位

为了在细胞水平上验证StMYB113，StMYB308蛋白编码产物的核定位信息，本发明构建了带YFP标签的亚细胞定位表达载体StMYB113-pHELLSGATE/StMYB308-pHELLSGATE。在添加Spec⁺抗性的LB培养基上37℃培养14h，挑取阳性单菌落,显微镜下观察。所有荧光实验均独立重复三次。亚细胞定位结果表明：StMYB113和StMYB308均定位于细胞核(图4)，具有核转录激活活性。

实施例7烟草中超量表达StMYB113/StMYB308基因

分别取5ml含有重组植物表达载体StMYB113-PCAMBIA2305.1，StMYB308-PCAMBIA2305.1和PCAMBIA2305.1(空载体)的农杆菌菌液转移至50ml新鲜的YEB液体培养基(含50mg/L的Kan⁺和Rif⁺)中，28℃，250r/min条件下继续培养，至菌液OD600达到0.6。转移菌液至离心管中，室温条件下，5000r/min离心10min，收集沉淀，重悬于MMA缓冲液(10mM MES，10mM MgCl₂)。调OD600至1左右，室温静置3h。采用一次性注射器将溶液注射至4周龄的烟草叶片中，以PCAMBIA2305.1空载体为阴性对照，暗室培养12h，再移入25℃、光周期(光/暗：12h/12h)的人工气候箱中培养。转基因烟草的表型、基因表达量和花色苷含量如图5所示，与对照烟草相比，注射StMYB113-PCAMBIA2305.1烟草叶片无明显变化，注射StMYB308-PCAMBIA2305.1烟草叶片出现紫色斑点，花色苷含量显著升高，且bHLH内源性转录因子NtAN1a和NtAN1b的表达量均显著上升。

本发明表明：两个彩色马铃薯品种块茎中StMYB113/StMYB308基因的相对表达量与花色苷含量变化趋势一致(图1)。不同温度处理72天后剑川红不同组织部位的StMYB113和StMYB308基因的表达模式为茎＞块茎＞叶，与花色苷含量正相关(图2)。克隆到的StMYB113的核苷酸长度为639bp，共编码212个氨基酸，分子量为24.5kDa，只具有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3-MYB蛋白；克隆到的StMYB308的核苷酸长度为627bp，共编码208个氨基酸，分子量为23.4kDa，具有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白(图3)。StMYB113/StMYB308亚细胞定位均在细胞核(图4)，属于核转录因子。注射StMYB113的烟草叶片无紫色斑点出现，注射StMYB308的烟草叶片出现了明显紫色斑点。q-RT-PCR证明转StMYB308基因烟草叶片中花色苷合成相关内源性转录因子NtAN1a和NtAN1b的表达量均显著上升(图5)。本发明初步确定了StMYB308对于烟草叶片花色苷的合成具有正向调控作用，不具备完整结构域的StMYB113不能调控花色苷的合成。

由以上实施例可知，本发明通过转录组测序发现了彩色马铃薯StMYB113和StMYB308在低温条件下表达量显著增加，且与花色苷含量相关，推测这两个基因可能响应低温参与调控彩色马铃薯花色苷的生物合成。本发明提供了一种响应低温调控彩色马铃薯花色苷合成的MYB转录因子筛选及其应用，所述基因为StMYB113基因和/或StMYB308基因；所述StMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述StMYB308基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的StMYB113基因只具有一个SANT/MYB结构域，不是典型的R2R3-MYB蛋白，所述的StMYB308基因具有两个SANT/MYB结构域，是典型的R2R3-MYB蛋白；异源转化StMYB308烟草叶片出现明显紫色斑点，说明StMYB308作为正调节因子参与花色苷的合成，而不具备完整结构域的StMYB113不能调控花色苷的合成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种调控花色苷的基因，其特征在于，所述基因为StMYB113基因和/或StMYB308基因；

所述StMYB113基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述StMYB308基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述StMYB113基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；

所述StMYB308基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1或2所述的基因在调控花色苷合成中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控时为10～15℃的低温环境，所述调控的对象为彩色马铃薯。

5.一种用于扩增权利要求1中所述StMYB113基因的引物组，其特征在于，包括StMYB113-F和StMYB113-R；

所述StMYB113-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述StMYB113-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种用于扩增权利要求1中所述StMYB308基因的引物组，其特征在于，包括StMYB308-F和StMYB308-R；

所述StMYB308-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述StMYB308-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。