CN116555322B - TtANXNL基因及其编码蛋白的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番杏TtANXNL基因及其编码蛋白的应用。番杏TtANXNL基因在提高作物抗逆性中的应用，所述番杏TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述番杏TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白；所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。番杏TtANXNL基因在酵母中的表达能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性；番杏TtANXNL蛋白在大肠杆菌中的表达能够提高大肠杆菌对氧化胁迫、盐胁迫、高渗透胁迫的耐受性。因此，番杏TtANXNL基因可广泛用于不同抗逆转基因作物的分子育种，培育高非生物胁迫耐受性的作物品种。

Description

TtANXNL基因及其编码蛋白的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种TtANXNL基因及其编码蛋白TtANXNL蛋白在提高作物抗逆性中的应用。

背景技术

番杏(Tetragoniatetragonioides)又名海菠菜、洋菠菜等，是一种具有重要经济和生态价值的盐生蔬菜。番杏不仅营养丰富，富含多种矿物质及维生素，还具有抗菌利尿、清热解毒等功效，对治疗炎症性疾病有一定作用；此外，番杏适应性强，具有耐盐碱、耐低温、抗干旱等特性，其种植条件要求不高，可广泛用于盐碱地的改良与应用，是一种高价值的经济植物。然而，番杏的耐盐碱的机制还未完全解析。

膜联蛋白(Annexin)是一类钙依赖磷脂结合蛋白，广泛存在于几乎所有植物物种中，具有较短的N端区域和4个保守的膜联蛋白重复序列。植物中的膜联蛋白家族包含多个成员，如拟南芥基因组中鉴定到8个膜联蛋白基因，而在水稻和玉米中分别有10个和12个膜联蛋白基因。膜联蛋白基因在植物各个组织器宫中均有表达，如种子、叶片、根、茎、花和果实等，从而参与调控植物的不同生理过程，如信号转导、囊泡运输、细胞胞吞和胞吐、钙离子通道的形成等。研究发现植物膜联蛋白的表达受外界胁迫的影响而改变，在非生物胁迫响应过程中发挥重要作用。如拟南芥AtAnn1和AtAnn4突变体对渗透胁迫和ABA信号具有超敏性，而水稻OsAnn10敲除突变体对渗透胁迫的耐受性增强，表明AtAnn1和AtAnn4对渗透胁迫具有正调控作用，而OsAnn10对渗透胁迫具有负调控作用。

因此，通过研究发掘盐生植物番杏的Annexin基因，解析其耐盐的分子机制，并广泛应用于抗逆作物的分子育种，是一种可行的途径，且具有重大理论意义和实际应用价值。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种TtANXNL基因及其编码蛋白在提高作物抗逆性中的应用。

实现上述发明目的的技术方案包括如下。

本发明的第一方面，提供了一种TtANXNL基因在提高作物抗逆性中的应用，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白；所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

本发明的第二方面，提供了一种TtANXNL蛋白在提高作物抗逆性中的应用，所述TtANXNL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

本发明的第三方面，提供了一种过表达TtANXNL基因的重组载体在提高作物抗逆性中的应用。

本发明的第四方面，提供了一种转化有过表达TtANXNL基因的重组载体的重组酵母在提高作物抗逆性中的应用。

本发明的第五方面，提供了一种转化有过表达TtANXNL基因的重组载体的重组菌在提高作物抗逆性中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种提高作物抗逆性的生物制剂，所述生物制剂的活性成分包括过表达TtANXNL基因的重组载体。

本发明的第七方面，提供了一种提高作物抗逆性的方法，所述方法包括提高作物中TtANXNL基因或TtANXNL蛋白的表达。

在本发明中，通过克隆番杏TtANXNL基因进行功能研究发现，与转化空载体pYES2的酵母菌株相比，超表达番杏TtANXNL基因的转基因酵母skn7Δ能够更好地在添加H₂O₂的培养基平板上生长，表明番杏TtANXNL基因在酵母中的表达能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性；番杏TtANXNL蛋白在大肠杆菌中的表达能够提高大肠杆菌对氧化胁迫、盐胁迫、高渗透胁迫的耐受性。因此，番杏TtANXNL基因可广泛用于不同抗逆转基因作物的分子育种，培育高非生物胁迫耐受性的作物品种。

附图说明

图1为本发明实施例1中的酿酒酵母重组质粒pYES2-TtANXNL的结构示意图。

图2为本发明实施例2中转化pYES2-TtANXNL的转基因酵母对氧化胁迫的耐受性结果。

图3为本发明实施例3中大肠杆菌重组蛋白表达载体pET28a-TtANXNL的结构示意图。

图4为本发明实施例3中转化pET28a-TtANXNL重组蛋白表达载体的大肠杆菌BL21对氧化胁迫的耐受性结果。

图5为本发明实施例3中转化pET28a-TtANXNL重组蛋白表达载体的大肠杆菌BL21对盐胁迫和高渗透胁迫的耐受性结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明的其中一些实施例中，公开了一种番杏TtANXNL基因在提高作物抗逆性中的应用，所述番杏TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述番杏TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白；所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种番杏TtANXNL蛋白在提高作物抗逆性中的应用，所述番杏TtANXNL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

SEQ ID NO.1

ATGGCTACCCTCATTGCCCCTGAACATGCTGATTATCTTGCTGATGCTGAAGCCCTTCAGAAAGCTTGCCATGGATGGGGAACAGATGAGAAAGGTATCATAGAGGTGATTGGTCACAGAACTTCAGCCCAGAGGAGGTTGATTAAGGAGGCATATGAAAGCCAGTACAATGAGAATCTTATGAGGCGCTTTGAGAAAGAGCTTTCTGGGGATTTTGAGAGAGCTGTGTATCGATGGATGTTGGACCCCTTGGATAGGGAGGCTGTTCTAGCCAATGTTGCTATTAAGAAAGCAGATTTCCGGGTAATCATCGAACTTGTAAGCATTCCATCAGCGGAGGAACTCTTGGCAGTCAAGCGAGCTTATCAGGCTCGATACAAGCATAGCTTGGAGGAAGATGTTGCTTCTCACTTTTCCGGTGATTTGCGCAAGCTGCTCCTTCTGCTGGTTAGTGTTTACAGGTATGAGAGTGAGGAGACCGAGGCAAGACTGGCTGAGGCAGAGGCTGAAATTCTTCACAAATGTATCCAAGACAAGGATTACAACCATGACGAGATTGTAAGGATCTTGACCACAAGGAGCAAGGCTCAGCTCGTGGCAACATTTTACAGATTTAGAGATGTCTACAGCACTCCTATCACTAAGAGCTTGGCTTCTGATCAAGACAAGGACTTTGTGAAAGCTCTCCAAACTGCCATTCGATGCCTGAAGTCCCCCAAGAAGTATTTGGAGAAGGTTGTGAGTGACTCAATCCACAAGCGCGGAACTGATGAGGATGCACTGACTAGAGTCCTAGTTACAAGAGCTGAGAGGGACCTTGCTGAGATCAAGGATCTGTTCTACAAGAAGAACAGTATGACCCTGGAGCAAGCCGTGGCTAAGGAGACTTCTGGGGACTACAAGAAATTCCTCCTGACCATTCTTGGATCACCAGAGCATCACCATTAA

应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述cDNA阅读框的碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。

SEQ ID NO.2

MATLIAPEHADYLADAEALQKACHGWGTDEKGIIEVIGHRTSAQRRLIKEAYESQYNENLMRRFEKELSGDFERAVYRWMLDPLDREAVLANVAIKKADFRVIIELVSIPSAEELLAVKRAYQARYKHSLEEDVASHFSGDLRKLLLLLVSVYRYESEETEARLAEAEAEILHKCIQDKDYNHDEIVRILTTRSKAQLVATFYRFRDVYSTPITKSLASDQDKDFVKALQTAIRCLKSPKKYLEKVVSDSIHKRGTDEDALTRVLVTRAERDLAEIKDLFYKKNSMTLEQAVAKETSGDYKKFLLTILGSPEHHH*(*表示终止)

应当理解，在不影响所述番杏TtANXNL蛋白结构和活性的前提下，对上述番杏TtANXNL蛋白的氨基酸序列进行各种取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，也属于本发明的保护范围。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种过表达番杏TtANXNL基因的重组载体在提高作物抗逆性中的应用，所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

在其中一些实施例中，所述重组载体为pYES2-TtANXNL。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有上述重组载体的重组酵母在提高作物抗逆性中的应用，所述抗逆性为抗氧化胁迫。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种转化有上述重组载体的重组菌在提高作物抗逆性中的应用，所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

在本发明的另一些实施例中，公开了番杏TtANXNL基因、番杏TtANXNL蛋白、过表达番杏TtANXNL基因的重组载体、转化有上述重组载体的重组酵母或转化有上述重组载体的重组菌在改良作物抗逆性的遗传育种中的应用。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高作物抗逆性的生物制剂，所述生物制剂的活性成分包括过表达番杏TtANXNL基因的重组载体，所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

在本发明的另一些实施例中，公开了一种提高作物抗逆性的方法，所述方法包括提高番杏TtANXNL基因或番杏TtANXNL蛋白的表达，所述抗逆性为抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫。

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1利用番杏cDNA酵母表达文库获得番杏TtANXNL的cDNA全长

本实施例利用番杏cDNA酵母表达文库获得番杏TtANXNL的cDNA阅读框，具体方法如下：

1、以申请人构建的番杏cDNA酵母表达文库涂布于LB培养基平板上(含100μg·mL^-1的卡那霉素)，37℃倒置生长16小时，挑取单克隆；

2、采用碱裂解法提取单克隆质粒，并送测序，测序引物为pYES2上的T7通用引物，引物序列为5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'。

3、测序后的cDNA核苷酸序列比较、序列同源性分析在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站的BLAST程序上进行。

其中一个单克隆含有番杏Annexin膜联蛋白基因的cDNA全长(以下命名为pYES2-TtANXNL重组质粒)，其结构示意图如图1所示。去掉pYES2载体序列后，番杏Annexin膜联蛋白基因的cDNA全长序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为番杏TtANXNL基因，其cDNA全长序列编码番杏TtANXNL蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2番杏TtANXNL基因在酵母中过表达提高酵母对氧化胁迫的耐受性

将实施例1中测序结果得到验证的pYES2-TtANXNL重组质粒调整浓度至0.1μg/μL，采用LiAc法分别转化野生型酵母株系BY4742，以及转化对H₂O₂敏感的突变株skn7Δ。同时采用空载体pYES2做对照，分别转化上述酵母株系。

分别挑取转化空载体pYES2和pYES2-TtANXNL重组质粒的酵母菌株的单克隆，将上述克隆分别接种于5mL添加了半乳糖的酵母液体培养基中，28℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD₆₀₀值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取4μl逐级稀释的菌液滴至添加有H₂O₂(0.5μM、1.0μM、1.5μM)的酵母固体培养基平板上。28℃培养3-4天，观察酵母生长情况。

结果如图2所示，与转化空载体pYES2的酵母菌株相比，过表达TtANXNL基因的转基因酵母skn7Δ能够更好地在添加H₂O₂的培养基平板上生长，表明TtANXNL基因在酵母中的过表达能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性。

实施例3番杏TtANXNL基因提高大肠杆菌的抗氧化、耐盐和耐高渗透胁迫能力

一、大肠杆菌重组蛋白表达载体pET28a-TtANXNL的构建

以实施例1中的pYES2-TtANXNL重组质粒为模板，根据已有的TtANXNL基因cDNA序列设计引物克隆TtANXNL基因CDS，所述引物包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物F和SEQ IDNO.4所示的下游引物R。采用DNA高保真酶(High-FidelityDNAPolymerase)通过PCR扩增TtANXNL基因的cDNA阅读框全长。

SEQ ID NO.3：

5′-GGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGCTACCCTCATTGCC-3′

SEQ ID NO.4：

5′-GTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATGGTGATGCTCTGGTGAT-3′

PCR反应体系为：模板1μL、上游引物(F)10μM、下游引物(R)10μM、PrimeStarMix25μL、ddH₂O20μl，总反应体系50μL。

PCR反应条件为：94℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃5min，16℃∞；其中，98℃30s，55℃30s，72℃1min这三步33个循环。

扩增的DNA片段依照Magen公司HiPureGelPureDNAKits说明书进行纯化。回收后的TtANXNL的cDNA阅读框PCR片段和线性化pET28a质粒(经BamHI和HindIII双酶切处理)经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用诺唯赞公司的ClonExpressIIOneStepCloningKit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。

构建好的大肠杆菌重组蛋白表达载体pET28a-TtANXNL的结构如图3所示。

二、TtANXNL基因提高大肠杆菌的抗氧化、耐盐和耐高渗透胁迫能力

采用碱裂解法提取pET28a-TtANXNL重组蛋白表达载体，并转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中。挑取转化番杏重组蛋白表达载体pET28a-TtANXNL的大肠杆菌单克隆，以转化pET28a空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为100μg·mL^-1的卡那霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/mL的卡那霉素)中，培养2～4小时至OD₆₀₀值达0.4～0.6，之后添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养2～4小时至OD₆₀₀值达1。

1、按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取4μL逐级稀释的菌液滴至添加有H₂O₂(2mM、4mM)的LB培养基(培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG和100μg/mL的卡那霉素)上，37℃培养12～36小时，观察大肠杆菌生长情况。

结果如图4所示，在添加有2mM和4mM的H₂O₂的培养基中，表达pET28a-TtANXNL融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pET28a的大肠杆菌，表明番杏TtANXNL蛋白在大肠杆菌中的表达能够提高大肠杆菌对氧化胁迫的耐受性。

2、取上述按照1:1、1:10、1:100、1:1000比例稀释的菌液，分别吸取4μL逐级稀释的菌液滴至添加有标准LB培养基(对照，170mMNaCl)、3％NaCl(高盐胁迫，510mMNaCl)和4％NaCl(高盐胁迫，680mMNaCl)的LB培养基(培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG和100μg/mL的卡那霉素)上，37℃培养12～36小时，观察大肠杆菌生长情况。

结果如图5所示，在添加低浓度NaCl(LB培养基，1％NaCl)的正常生长条件下，转化空载体pET28a和pET28a-TtANXNL重组蛋白表达载体的大肠杆菌的生长差异不明显，但在高盐浓度(LB培养基，3％NaCl和4％NaCl)的生长条件下，转化表达pET28a-TtANXNL融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pET28a的大肠杆菌，表明番杏TtANXNL蛋白在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐盐性。

3、取上述按照1:1、1:10、1:100、1:1000比例稀释的菌液，分别吸取4μL逐级稀释的菌液滴至添加有1MSorbitol和1.5MSorbitol的LB培养基平板(培养基中添加终浓度为0.5mM的IPTG和100μg/mL的卡那霉素)，37℃培养12～24小时，观察大肠杆菌生长情况。

结果如图5所示，在含有0.5MSorbitol和1.0MSorbitol的LB培养基平板上，转化表达pET28a-TtANXNL融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pET28a的大肠杆菌，表明番杏TtANXNL蛋白在大肠杆菌中的表达能够提高大肠杆菌的耐高渗透压的能力。

综合该实施例的结果，番杏TtANXNL基因可以应用于培育高非生物胁迫耐受性的作物品种。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种TtANXNL基因在提高酵母抗氧化胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

2.一种TtANXNL基因在提高大肠杆菌抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

3.一种TtANXNL蛋白在提高酵母抗氧化胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种TtANXNL蛋白在提高大肠杆菌抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种过表达TtANXNL基因的重组载体在提高酵母抗氧化胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组载体为pYES2-TtANXNL。

7.一种转化有过表达TtANXNL基因的重组载体的重组酵母在提高酵母抗氧化胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

8.一种转化有过表达TtANXNL基因的重组载体的重组大肠杆菌在提高大肠杆菌抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫中的应用，其特征在于，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

9.一种提高酵母抗氧化胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括提高酵母中TtANXNL基因或TtANXNL蛋白的表达，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白。

10.一种提高大肠杆菌抗氧化胁迫、抗盐胁迫或抗高渗透胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括提高大肠杆菌中TtANXNL基因或TtANXNL蛋白的表达，所述TtANXNL基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或所述TtANXNL基因编码氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的蛋白。