CN109576280B

CN109576280B - 番杏TtASR基因及其编码蛋白和应用

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Publication number: CN109576280B
Application number: CN201811384255.7A
Authority: CN
Inventors: 杨礼香; 叶玉妍; 陈红锋; 罗鸣; 张美�
Original assignee: Guangzhou University; South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: Guangzhou University; South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2018-11-20
Filing date: 2018-11-20
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2038-11-20
Also published as: CN109576280A

Abstract

本发明涉及分子生物学领域。本发明提供了番杏盐胁迫应答相关基因TtASR，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA全长序列如SEQ ID NO.2所示。本发明TtASR基因编码的脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR与提高酿酒酵母、大肠杆菌和植物的耐盐耐旱性相关。通过构建TtASR基因的酵母、大肠杆菌和植物转基因超表达载体，将TtASR基因在酵母、大肠杆菌和拟南芥中超表达，可以提高酵母、大肠杆菌和拟南芥对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。该基因可应用于工程菌及植物针对高盐干旱胁迫的遗传工程育种，具有很大的应用价值。

Description

番杏TtASR基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及番杏(Tetragonia tetragonioides L.)中的TtASR(Abscisic acid-,stress-,and ripening-induced gene)基因及其编码蛋白和在调控生物体耐盐耐旱方面的应用。

背景技术

番杏(Tetragonia tetragonioides L.)又名新西兰菠菜、野菠菜、洋菠菜、白番苋，为番杏科番杏属一年生或二年生半蔓性草本植物，广泛分布于亚热带及温带地区的滨海富盐区域，是一种具有经济价值和生态价值的盐生蔬菜。此外，番杏营养价值高，富含矿物质及多种维生素，营养丰富，肉质茎叶鲜嫩，口味清爽。番杏可全株入药,有清热、解毒的功效，对消化道癌症有一定的缓解和治疗作用。番杏全株还含有抗菌的番杏素，是近几年我国新兴的一种很受人们欢迎的新型保健型蔬菜。此外，番杏作为一种高耐盐性的盐生植物(halophyte)，可耐受海水盐度，在海水倒灌引起的盐滞地区可正常生长，可用于对滨海滩涂地、盐荒地、海水倒灌农田改良和利用，是一种具有重要生态价值的经济作物。

ASR(ABA,stress and ripening)基因是植物中特有的一类主要参与调控细胞耐受水分缺失的抗逆基因，通常只含有较少的基因家族成员，且编码高度亲水的小分子蛋白。该类基因在包括模式植物拟南芥在内的十字花科植物中明显缺失。番茄Asr1基因是植物中首次克隆的ASR基因成员，参与调控番茄果实发育成熟及叶片应答干旱及ABA处理等胁迫，之后又在番茄基因组中依次发现了4个ASR基因成员。番茄中该基因家族的不同成员因其表达的差异性可能参与调控不同组织和器官的抗逆应答反应。目前已在多种植物中克隆获得了ASR基因成员，其编码蛋白的典型特征为C端包含一个高度保守的ABA/WDS结构域(ABA/water deficit stress domain；PF02496in PFAM)。研究表明，ASR蛋白不仅可以作为分子伴侣对细胞成分在缺水情况下行使保护作用，而且还可以作为转录因子调控抗逆基因的表达，提高细胞抗逆能力。

ASR蛋白除了介导植物参与应答干旱/水分缺失等胁迫外，其参与调控植物耐盐应答也受到了人们的重视。百合ASR基因LLA23能够提高转基因超表达拟南芥的耐盐性；同样，香蕉ASR基因MpAsr也能够提高转基因超表达拟南芥的耐盐性和渗透压胁迫耐受性；海蓬子(Salicornia brachiata)和辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis K.)均为生长于温带地区的滨海盐生植物，具有高度的耐盐性和耐旱性。海蓬子ASR基因成员SbASR和辽宁碱蓬ASR基因SlASR在烟草，花生和拟南芥中超量表达能够转基因植物的耐盐性；农作物小米(Setariaitalica)ASR基因SiASR4的超量表达也能够提高转基因植物对盐旱胁迫的耐受性。

作物转基因功能育种为抗逆育种提供了一种行之有效的便捷手段，但该技术需要提供具有抗逆生物学功能的候选操作基因，而分离和鉴定该类功能基因已成为植物基因工程的研究焦点之一。野生植物是重要的自然资源和环境要素，而在自然选择的压力下，极端逆境下的适生植物必然具有较强的抗逆遗传资源，其抗逆功能基因的挖掘和鉴定也是野生植物资源保护和开发利用的一个重要方面。目前关于番杏ASR基因资源的开发利用方面还未见报道。本发明首次公布了番杏TtASR基因在基因工程育种方面针对耐盐耐旱抗氧化胁迫方面的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐盐、耐旱植物功能性蛋白——番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR及其应用。实现上述目的的技术方案如下。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR和/或TtASR基因在提高植物对高盐/干旱的耐受中的应用，所述TtASR基因的cDNA阅读框为如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的核苷酸序列。

本发明的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因TtASR的阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核苷酸序列进行修改，也属于本发明的保护范围内。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR和/或TtASR基因在农作物转基因育种中改良农作物对高盐/干旱耐受性、和/或调控农作物对氧化胁迫耐受性的应用，所述番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的核苷酸序列。

本发明的另一目的是公开一组番杏TtASR蛋白重组表达载体及其应用，该重组载体插入了上述TtASR基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在高盐和过氧化氢胁迫处理下，提高酵母对盐胁迫和氧化胁迫的耐受性。

同时，公开构建番杏TtASR蛋白重组原核表达载体及其运用，该重组载体插入了上述TtASR基因，将该载体转化进入大肠杆菌BL21菌株中，通过IPTG诱导该基因在大肠杆菌中的超表达，证明TtASR基因能够提高工程菌大肠杆菌的耐盐和耐旱性。

此外，本发明的另一目的是公开了番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR在模式植物拟南芥中的超表达载体及其应用，该重组载体通过农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥进行转基因，能够提高拟南芥的耐盐和抗旱性。

实现上述目的的技术方案如下：

本发明以番杏幼苗为材料，提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，并将cDNA分别以pDONR222和pYES-DEST52为目标载体，采用

技术(Invitrogen)构建cDNA表达文库，并将文库单克隆进行分离，并提取质粒，对质粒进行测序，通过序列分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA全长，其序列如SEQ ID NO.7所示。

将含有TtASR的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，以转化酵母表达载体pYES2空载体的W303为对照，分别在含盐量为1mol L^-1的NaCl培养基上测试转基因酵母的耐盐性。

以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增TtASR基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1的cDNA阅读框片段。引物如SEQ ID NO.3(TtASREEF:5′-GGGGCCCCTGGGATCCATGGCCGAAAGCCGTGACAG-3′)和SEQ ID NO.4(TtASREER:5′-GGAATTCCGGGGATCCTTAAAAGAAGTGGTGCTTCT-3′)所示。

以上PCR采用高保真的Taq酶进行扩增，并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1上(BamHI切点)，形成重组载体TtASR-pGEX 6p-1，并测序。

采用CaCl₂的方法将上述番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白大肠杆菌蛋白表达重组载体转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，通过添加0.2mM的IPTG诱导TtASR基因在大肠杆菌中的超表达。之后检测表达有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的大肠杆菌的耐盐性和抗旱性。

以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，设计以下引物分别扩增TtASR基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pEGAD的cDNA阅读框片段，用于构建番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因转基因超表达重组载体TtASR-pEGAD。引物如SEQ ID NO.5(TtASROXF:5′-GGCAGCGGCCGAATTCATGGCCGAAAGCCGTGACAG-3′)和SEQ ID NO.6(TtASROXR:5′-CAGTTATCTAGGATCCTTAAAAGAAGTGGTGCTTCT-3′)所示。

采用CaCl₂的方法将上述番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白转基因超表达重组载体TtASR-pEGAD转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Kan抗性筛选获得转基因后代，对转基因超表达番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因的拟南芥后代进行耐盐性和抗旱性检测。

在本发明中，我们公开了番杏体内的一个编码脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的基因TtASR，该基因的表达能够提高酵母菌对盐和氧化胁迫的耐受性，提供了将该基因应用于工程菌酿酒酵母的耐盐和抗氧化遗传改良的应用；TtASR在大肠杆菌中的表达能够提高工程菌大肠杆菌对高盐和干旱的耐受性，提供了将该基因用于包括大肠杆菌在内的工程菌耐盐和耐脱水的遗传改良方面的应用。本发明也简单阐述了可将该基因应用于植物的遗传改造，培育用于提高耐盐/耐旱性的转基因转基因植物。

本发明的有益效果如下：

在本发明中，我们通过cDNA文库筛选获得的番杏编码脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的TtASR基因的进行应用性探索，发现该基因以下应用方式：(1)该基因在酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性；(2)通过诱导番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白在大肠杆菌中表达后，能够提高大肠杆菌的耐盐性和耐旱性；(3)该基因在拟南芥中的超量表达能够提高转基因拟南芥对高盐和干旱胁迫的耐受性。

本发明也可推广至农业生物技术领域，通过改变TtASR基因在农作物中的表达，调控农作物对高盐和干旱胁迫的耐受，以及参与农作物对多种逆境胁迫的适应性改变。

附图说明

图1示酿酒酵母重组表达载体TtASR-pYES-DEST 52示意图。

图2示转化TtASR-pYES-DEST 52的转基因酵母W303对盐胁迫的耐受性提高。

图3示转化TtASR-pYES-DEST 52的转基因酵母对H₂O₂敏感的突变株yap1Δ(A)和skn7Δ(B)对氧化胁迫的耐受性提高。

图4示大肠杆菌重组蛋白表达载体TtASR-pGEX 6p-1示意图。

图5示GST-TtASR融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

图6示转化TtASR-pGEX 6p-1的转基因大肠杆菌BL21对高盐胁迫、高渗透压和氧化胁迫的耐受性提高。

图7示模式拟南芥植物转基因超表达载体TtASR-pEGAD示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

我们在番杏cDNA文库筛选过程中发现一个代表脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的克隆能够提高酵母菌株的耐盐性，本发明克隆了该脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR，通过功能研究表明，该基因可提高生物体的耐盐和抗旱能力。

实施例1：通过番杏cDNA酵母表达文库单克隆测序获得番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA全长

1.1番杏全长cDNA表达文库的构建

番杏cDNA文库的构建主要参考CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书，采用

(Invitrogen)技术进行。具体包括以下步骤：总RNA提取、mRNA的分离、cDNA初级文库的构建和cDNA次级文库的构建。各步骤主要概述如下：

(1)总RNA提取

取2g等量的番杏叶片、叶芽、藤及幼根，在预冷的研钵中用液氮研磨成粉末，将粉末适量移至多个RNase-free的1.5mL离心管中，每个离心管加入1mL Trizol Reagent，迅速震荡混匀，并按照试剂说明书操作，获得番杏不同组织的总RNA混合样。将干燥后的总RNA溶于100μL RNase-free的水中。用紫外分光光度计和1％的琼脂糖凝胶电泳测定总RNA的浓度和质量。

(2)mRNA的分离

取大于500μg的番杏总RNA，按照FastTrack MAG mRNA isolation Kit说明书分离纯化mRNA，用紫外分光光度法测定mRNA浓度，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。

(3)cDNA初级文库的构建

取约3μg的番杏mRNA，加入RNase-free的水至总体积为9μL；然后加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer(30pM)1uL和dNTPs(10mM each)1uL混匀，70℃5min，45℃孵育2min；加入SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR的5×FirstStrand Buffer 4μL和DTT(0.1M)2μL，最后加入3μL的SuperScript III逆转录酶至中反应体积为20μL，混匀后置于PCR仪上反应45℃20min；50℃20min；55℃20min。以上步骤为合成cDNA第一链。

在cDNA第一链反应液中依次加入DNA Ligase，DNA Polymerase I，RNaseH和T4DNAPolymerase等合成第二链，此时即获得番杏双链cDNA。将双链cDNA纯化后与attB1重组接头连接，连接好接头的番杏双链cDNA使用CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的分级分离层析柱，去除分子量小于500bp的小片段cDNA，保留大于500bp的cDNA片段用于后续的cDNA文库的构建。

参照CloneMiner II cDNA Library Construction Kit的说明书进行BP重组反应构建cDNA初级文库。具体步骤包括：在洁净的PCR管中依次添加cDNA(100ng/μL)13μL，pDONR222(250ng/μL)2μL，BP

II enzyme mix 5μL至总体积20μL，混合均匀后，置于25℃下进行BP重组反应16～20h。通过电穿孔仪将纯化后的BP重组反应产物导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2ml SOC培养基，经预培养后，即为初级文库菌液。

(4)cDNA次级文库的构建

采用LR重组反应进行cDNA次级文库的构建，具体步骤包括：初级文库用LB培养基扩增培养后，然后用PureLink^TMHQ Mini Plasmid DNA Purification Kit提取质粒。初级cDNA文库质粒使用适量的TE溶解，并采用紫外分光光度法测定浓度。将初级文库质粒浓度调整至300ng/μL，取1μL文库质粒依次加入pYES-DEST 52(300ng/uL)1μL，LR Clonase IIMix 1μL，补加双蒸水12μL至总体积20μL。置于25℃下进行LR重组反应16～20h。之后使用电穿孔仪将纯化后的LR重组反应产物导入大肠杆菌DH10B感受态细胞中，电击后迅速向电转杯中加入2mL SOC培养基，经预培养后，即为次级文库菌液。

1.2番杏cDNA文库的单克隆测序

番杏cDNA次级文库菌液涂布于LB培养基平板上(含100μg mL^-1的氨苄青霉素)，37℃倒置生长16小时，挑取单克隆，采用碱裂解法分离单克隆质粒，并送测序。测序引物为pYES DEST52上的T7通用引物。

1.3番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA全长的获得及序列分析

测序后的cDNA核苷酸序列比较、翻译等在DNAStar7.0生物软件上进行，序列同源性分析采用BLAST程序，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行。结果表明，其中一个克隆含有编码番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的cDNA全长，其结构示意图如图1所示。去掉pYES-DEST 52载体序列后，番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的cDNA全长序列为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其最长阅读框为编码氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的番杏TtASR蛋白。

SEQ ID NO.1

氨基酸序列

>TtASR protein MAESRDRGFFHHNKKTEEDTTTGGYGSTENTGGYGSTEGNRYGSENTTIGGGYGSTEGNRYGSENTTTGGGYGSTENNTGGGYGSTEGNRYGSSDDTTTGGGYGATGGGYGSTETKPYGSEETTGTGYGGGGGDGEYEKKVSESSEEEPKDYEKEEKHHKHLEQLGGAGALASGAYALYEKHQAKKDPEHAHRHKIAEEVAAAAAVGAGGFAFHEHHEKKESKEERKEAEGEGEKKHHFF

cDNA阅读框SEQ ID NO.2

cDNA序列(涂阴影部分为cDNA阅读框SEQ ID NO.2，上游为5’非翻译区，下游为3’非翻译区)

SEQ ID NO.7

>TtASR

实施例2：TtASR基因在酵母中超表达提高酵母的耐盐性和对氧化胁迫的耐受性

2.1 TtASR-pYES-DEST 52转化酵母菌株

将测序结果得到验证的TtASR-pYES-DEST 52重组质粒调整浓度至0.1μg/μL，采用乙酸锂法的方法分别转化野生型酵母株系W303，以及转化酵母对H₂O₂敏感的突变株yap1Δ和skn7Δ和对应的野生型酵母株系WT。同时采用酵母表达载体空载体pYES2做对照，分别转化上述酵母株系。

2.2 TtASR基因在酵母野生型菌株W303中表达可以提高转基因酵母的耐盐性

挑取酵母菌株W303转化空载体pYES2和TtASR基因超表达载体TtASR-pYES-DEST52的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床(200rp m)培养至菌液OD₆₀₀值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有1M NaCl的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。

如图2所示，超表达TtASR基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的酵母菌株W303而言，能够在添加1M NaCl的培养基平板上生长；而未表达番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR的酵母(转化空载体pYES2)则不能生长，表明TtASR基因在酵母中的表达能够提高酵母对盐胁迫的耐受性。

2.3 TtASR基因在酵母对H₂O₂敏感突变株yap1Δ和skn7Δ中表达均可以提高转基因酵母对氧化胁迫的耐受性。

挑取酵母对H₂O₂敏感突变株yap1Δ和skn7Δ转化空载体pYES2和TtASR基因超表达载体TtASR-pYES-DEST 52的单克隆，同时也挑取野生型酵母WT转化空载体pYES2的单克隆作为对照，将上述克隆分别接种于2ml添加了半乳糖的酵母极限液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养至菌液OD₆₀₀值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有0.75mM的H₂O₂的酵母极限固体培养基平板上。30℃培养7天，观察酵母生长情况。

如图3所示，超表达TtASR基因的转基因酵母相比较于转化空载体pYES2的yap1Δ酵母突变株而言，能够在添加0.75mM H₂O₂的培养基平板上生长；而未表达番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR的酵母yap1Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图3A)。同样，超表达TtASR基因的转基因酵母skn7Δ也能够在添加0.75mM H₂O₂的培养基平板上生长；而未表达番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR的酵母skn7Δ(转化空载体pYES2)则几乎不能生长(图3B)。这些结果表明TtASR基因在H₂O₂敏感酵母突变株yap1Δ和skn7Δ中的表达能够提高酵母对氧化胁迫胁迫的耐受性。

实施例3：TtASR基因在大肠杆菌中超表达提高大肠杆菌的耐盐性和耐高渗透压能力

3.1大肠杆菌重组蛋白表达载体TtASR-pGEX 6p-1的构建

以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.3(5′-GGGGCCCCTGGGATCCATGGCCGAAAGCCGTGACAG-3′)和SEQID NO.4(5′-GGAATTCCGGGGATCCTTAAAAGAAGTGGTGCTTCT-3′)为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增TtASR基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HSDNA Polymerase with GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel PureDNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至大肠杆菌重组蛋白表达载体pGEX 6p-1中。pGEX 6p-1质粒经BamHI单酶切处理，回收线性化质粒。回收后的TtASR的cDNA阅读框PCR片段和线性化pGEX 6p-1质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的In-

HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析后，TtASR的cDNA核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。构建好的大肠杆菌重组蛋白表达载体TtASR-pGEX 6p-1如图4所示。

3.2番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

采用碱裂解法提取TtASR-pGEX 6p-1重组质粒，并转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，挑取单克隆至液体LB培养基(含终浓度为100μg mL^-1的氨苄青霉素)中，培养过夜。之后取1mL菌液转接于100mL新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，37℃培养2-6小时至OD600约为0.5，通过添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导GST-TtASR融合蛋白在大肠杆菌中的表达。经诱导4小时后，转化空载体pGEX 6p-1(表达GST标签蛋白)和重组质粒TtASR-pGEX 6p-1的BL21(DE3)大肠杆菌的SDS-PAGE图谱如图5所示，表明在0.2mM的IPTG诱导条件下，经过4小时的表达时间，GST-TtASR融合蛋白在细菌中得到了大量的表达。

3.3表达有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR的大肠杆菌的耐盐性检测。

挑取转化番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白表达载体TtASR-pGEX 6p-1的大肠杆菌单克隆，以转化pGEX 6p-1空载体的大肠杆菌单克隆为对照，分别接种于液体LB培养基中(添加终浓度为100μg mL^-1的氨苄青霉素)，在恒温摇床(37℃，200rpm)中培养12小时。之后按照1:100的比例转接于新鲜的液体LB培养基(添加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素)中，培养2到4小时至OD₆₀₀值达0.5，之后添加终浓度为0.2mM的IPTG诱导培养2到4小时至OD₆₀₀值达1。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有标准LB培养基(对照，170mM NaCl)、3％NaCl(高盐胁迫，510mM NaCl)和4％NaCl(高盐胁迫，680mM NaCl)的LB培养基(培养基中添加终浓度为0.2mM的IPTG和100μg/ml的氨苄青霉素)上，37℃培养12至36小时，观察大肠杆菌生长情况。

取上述按照1:1、1:10、1:100、1:1000比例稀释的菌液，分别吸取2μl逐级稀释的菌液滴至添加有1M Sorbitol(山梨醇，提供高渗透压)和1.5M Sorbitol(山梨醇，提供高渗透压)的LB培养基平板(培养基中添加终浓度为0.2mM的IPTG和100μg/ml的氨苄青霉素)，37℃培养12至24小时，观察大肠杆菌生长情况。

如图6所示本土发生了调换，在添加低浓度NaCl(LB培养基，1％NaCl)的正常生长条件下，转化空载体pGEX 6p-1和表达TtASR蛋白(转化TtASR蛋白表达载体TtASR-pGEX6p-1)的大肠杆菌的生长状况一致，但在高盐浓度(LB培养基，3％NaCl和4％NaCl)的生长条件下，转化表达GST-TtASR融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pGEX6p-1(只表达GST标签蛋白)的大肠杆菌，表明番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐盐性。同样，在含有1M Sorbitol和1.5M Sorbitol的LB培养基平板上，转化表达GST-TtASR融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pGEX 6p-1(只表达GST标签蛋白)的大肠杆菌(图6)，表明番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌的耐高渗透压的能力。

我们同时还检测了表达GST-TtASR融合蛋白的大肠杆菌对氧化胁迫的耐受性。如图6所示，在添加有2mM和4mM的H₂O₂的培养基中，表达GST-TtASR融合蛋白的大肠杆菌的生长状况要远远优于仅转化空载体pGEX 6p-1的大肠杆菌，表明番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR在大肠杆菌中能够提高大肠杆菌对氧化胁迫的耐受性。

实施例4：TtASR基因在拟南芥中超表达提高拟南芥的耐盐性和耐旱性

4.1拟南芥转基因超表达载体TtASR-pEGAD的构建

以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST 52重组质粒为模板，以SEQ ID NO.5(5′-GGCAGCGGCCGAATTCATGGCCGAAAGCCGTGACAG-3′)和SEQID NO.6(5′-CAGTTATCTAGGATCCTTAAAAGAAGTGGTGCTTCT-3′)为引物，采用高保真的Taq酶通过PCR扩增TtASR基因的cDNA阅读框全长。采用的PCR体系参考TaKaRa公司PrimeSTAR HSDNA Polymerase with GC Buffer说明书。扩增的DNA片段依照Magen公司HiPure Gel PureDNA Kits说明书。回收得到的片段用于插入至拟南芥转基因超表达载体pEGAD中。pEGAD质粒经EcoRI和BamHI双酶切处理，回收线性化质粒。回收后的TtASR的cDNA阅读框PCR片段和线性化pEGAD质粒经Nanodrop公司紫外分光光度计测定浓度，采用TaKaRa(Clontech)公司的In-

HD Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒TtASR-pEGAD(参见图7)备用。

4.2拟南芥转基因超表达植株的获取

采用冻融法将植物转基因超表达载体TtASR-pEGAD转化进入农杆菌GV3101中，得到重组农杆菌。

然后利用重组农杆菌，通过花浸泡法(Clough SJ,Bent AF.1998.Floral dip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.16:735-743)将TtASR基因导入哥伦比亚生态型(Col)拟南芥，得到T1代种子。

T1代种子收获后在MS培养基(按照每100mL培养基中添加30μL的膦丝菌素PPT浓度为13.5％的Basta溶液，德国拜耳公司生产)中筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子。将T2代种子培育为植株(T2代植株)，提取叶片的基因组DNA，用引物对SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即为T2代转基因植株。T2代转基因植株自交产生T3代种子，对T3代种子进行Basta抗性筛选，全部具有Basta抗性的即为纯合体。随机选取三个转基因纯合体株系的T3代种子进行耐盐和耐旱性的鉴定。

4.3拟南芥转基因超表达植株后代的耐盐性和耐旱性检测

随机选取三个转基因植株纯合株系(OX1、OX2、OX3)的T3代种子(每个株系50粒)，以野生型拟南芥(WT)的种子(50粒)为对照，分别进行如下耐盐性鉴定：将各个株系植株的种子同时播种在含有200mM的NaCl的MS培养基平板上，置于22光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中，萌发6天后，统计萌发率。与野生型相比，转基因超表达TtASR基因的转基因株系种子的萌发率均高于野生型拟南芥对照的种子，其中野生型萌发率为30％，而3个转基因株系的萌发率分别为60％、70％和68％，表明转基因超表达TtASR的拟南芥种子萌发过程能够提高对盐胁迫耐受性。

同样，随机选取三个转基因植株纯合株系(OX1、OX2、OX3)的T3代幼苗(每个株系20株)，以野生型拟南芥幼苗(20株)为对照，栽种于营养土中并于温室中(22℃，16小时光照/8小时黑暗)正常培养20天，之后进行干旱处理(不浇水)20天，随后复水处理后7天统计存活率。与野生型相比，转基因超表达TtASR基因的转基因株系复水后的存活率显著高于野生型对照，其中野生型复活率为10％，而3个转基因株系的复活率分别为70％、85％和90％，表明转基因超表达TtASR的拟南芥植株具有较强的耐旱性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 番杏TtASR基因及其编码蛋白和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 番杏(Tetragonia tetragonioides)

<400> 1

Met Ala Glu Ser Arg Asp Arg Gly Phe Phe His His Asn Lys Lys Thr

1 5 10 15

Glu Glu Asp Thr Thr Thr Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Asn Thr Gly

20 25 30

Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Gly Asn Arg Tyr Gly Ser Glu Asn Thr Thr

35 40 45

Ile Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Gly Asn Arg Tyr Gly Ser Glu

50 55 60

Asn Thr Thr Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Asn Asn Thr Gly

65 70 75 80

Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Gly Asn Arg Tyr Gly Ser Ser Asp Asp

85 90 95

Thr Thr Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser

100 105 110

Thr Glu Thr Lys Pro Tyr Gly Ser Glu Glu Thr Thr Gly Thr Gly Tyr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Glu Tyr Glu Lys Lys Val Ser Glu Ser

130 135 140

Ser Glu Glu Glu Pro Lys Asp Tyr Glu Lys Glu Glu Lys His His Lys

145 150 155 160

His Leu Glu Gln Leu Gly Gly Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ala Tyr

165 170 175

Ala Leu Tyr Glu Lys His Gln Ala Lys Lys Asp Pro Glu His Ala His

180 185 190

Arg His Lys Ile Ala Glu Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala

195 200 205

Gly Gly Phe Ala Phe His Glu His His Glu Lys Lys Glu Ser Lys Glu

210 215 220

Glu Arg Lys Glu Ala Glu Gly Glu Gly Glu Lys Lys His His Phe Phe

225 230 235 240

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 番杏(Tetragonia tetragonioides)

<400> 2

atggccgaaa gccgtgacag aggtttcttc caccacaaca agaagaccga ggaagacacc 60

accactggtg gctatggttc caccgagaac accggtggct atggttcaac tgagggtaac 120

cgttatgggt ccgaaaacac caccattggt gggggctatg gctctactga gggtaaccgt 180

tatggttctg aaaacaccac cactggtggg ggctatggtt caactgagaa taacactggt 240

gggggttatg gttcaactga gggtaaccgt tatggttctt ctgatgatac aaccacaggc 300

gggggttatg gtgccactgg gggtggctat gggtctactg agactaaacc ctatggctcc 360

gaggagacca caggtaccgg ctatggcggt ggcggtggcg atggcgagta tgagaagaag 420

gttagtgaga gtagtgagga agaacctaag gattatgaaa aggaagagaa gcatcacaaa 480

catcttgagc agcttggtgg tgccggtgct cttgcttctg gtgcttatgc tctgtatgag 540

aagcaccaag caaagaagga cccagagcat gctcacaggc acaagatagc agaagaagtg 600

gccgccgcag ctgcggtcgg ggcaggtggc tttgcattcc atgagcatca tgagaagaag 660

gaatccaagg aagagagaaa ggaagctgag ggtgagggag agaagaagca ccacttcttt 720

taa 723

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggcccctg ggatccatgg ccgaaagccg tgacag 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaattccgg ggatccttaa aagaagtggt gcttct 36

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcagcggcc gaattcatgg ccgaaagccg tgacag 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cagttatcta ggatccttaa aagaagtggt gcttct 36

<210> 7

<211> 1112

<212> DNA

<213> 番杏(Tetragonia tetragonioides)

<400> 7

accatttctc acaaaattca acttgatcag tgatcactta actttttaaa ctctttcttc 60

aaaaaatctc ccaaaatggc cgaaagccgt gacagaggtt tcttccacca caacaagaag 120

accgaggaag acaccaccac tggtggctat ggttccaccg agaacaccgg tggctatggt 180

tcaactgagg gtaaccgtta tgggtccgaa aacaccacca ttggtggggg ctatggctct 240

actgagggta accgttatgg ttctgaaaac accaccactg gtgggggcta tggttcaact 300

gagaataaca ctggtggggg ttatggttca actgagggta accgttatgg ttcttctgat 360

gatacaacca caggcggggg ttatggtgcc actgggggtg gctatgggtc tactgagact 420

aaaccctatg gctccgagga gaccacaggt accggctatg gcggtggcgg tggcgatggc 480

gagtatgaga agaaggttag tgagagtagt gaggaagaac ctaaggatta tgaaaaggaa 540

gagaagcatc acaaacatct tgagcagctt ggtggtgccg gtgctcttgc ttctggtgct 600

tatgctctgt atgagaagca ccaagcaaag aaggacccag agcatgctca caggcacaag 660

atagcagaag aagtggccgc cgcagctgcg gtcggggcag gtggctttgc attccatgag 720

catcatgaga agaaggaatc caaggaagag agaaaggaag ctgagggtga gggagagaag 780

aagcaccact tcttttaatt taagtgcttc atcaaccact ctgaatgaag gtctttgctt 840

gatacaattt actatgttgt attttctatt atgaagctgt gttttttaat tcagcttttg 900

attatgcatg tgtatgtgtg ctatagcatg agcgtcatgc tctatgttca aatctgttca 960

cagtgagtga gagatataca tatgttgctt ttgtacttaa atatctcatc cacaaactgg 1020

tttatctggt ttggttgtaa ttagtgcagt gtgttaataa taatattaca tgtttattta 1080

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1112

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR和/或TtASR基因在提高拟南芥对高盐/干旱的耐受中的应用，所述TtASR基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的核苷酸序列。

2.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白TtASR和/或TtASR基因在植物转基因育种中改良拟南芥对高盐/干旱耐受性的应用，所述番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白的核苷酸序列。

3.插入有TtASR基因的酿酒酵母重组表达载体，其特征为，所述TtASR基因的cDNA为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或编码为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏TtASR蛋白的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体在提高工程菌株酿酒酵母对高盐和氧化胁迫的耐受性中的应用。

5.插入有TtASR基因的大肠杆菌表达载体，其特征为，所述TtASR基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的番杏TtASR蛋白的核苷酸序列。

6.转入有权利要求5所述的插入有TtASR基因的大肠杆菌表达载体的农杆菌。

7.一种提高拟南芥耐盐和/或抗旱性的生物制剂，其特征是，其活性成份含有调控番杏TtASR基因表达的生物制品，所述番杏TtASR基因的cDNA阅读框为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或所述TtASR基因为编码序列氨基酸序列如SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

8.一种提高拟南芥的耐盐和/或抗旱性的方法，其特征为，包括以下步骤：

（1）获得番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因TtASR的cDNA全长，其cDNA阅读框序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将含有TtASR的cDNA全长的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒转化野生型酵母菌株W303，在含盐量1 mol L^-1 NaCl的培养基上测试转基因酵母的耐盐性；

（3）以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，以引物分别扩增TtASR基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1的cDNA阅读框片段；

并将得到的目的DNA片段进行回收，连接于大肠杆菌蛋白表达载体pGEX 6p-1上，形成重组载体TtASR- pGEX 6p-1；

（4）将所述重组载体TtASR- pGEX 6p-1转化进入大肠杆菌BL21感受态菌株中，诱导TtASR基因在大肠杆菌中的超表达；

（5）以含有番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因cDNA的酵母表达载体pYES-DEST52重组质粒为模板，以引物扩增TtASR基因的cDNA全长阅读框序列，用于获取插入至拟南芥转基因超表达载体pEGAD的cDNA阅读框片段，用于构建番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白基因转基因超表达重组载体TtASR- pEGAD；

将上述番杏脱落酸/胁迫/成熟诱导蛋白转基因超表达重组载体TtASR-pEGAD转化进入农杆菌GV3101感受态菌株中，通过拟南芥花序侵染法转化拟南芥植株，通过Basta抗性筛选获得拟南芥后代转基因后代。

9.根据权利要求8所述的方法，根据，其特征是，步骤（3）中的引物为SEQ ID

NO. 3 和SEQ ID NO. 4，和/或步骤（5）中的引物为SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6。