KR102070128B1

KR102070128B1 - 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102070128B1
Application number: KR1020180070762A
Authority: KR
Inventors: 이호정; 이원제
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2020-01-28
Also published as: KR20190143157A

Abstract

본 발명은 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 MybC 유전자의 발현이 억제되거나 또는 MybC 유전자가 넉-아웃된 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체, 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃 시키는 단계를 포함하는 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

Description

질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 제조방법{Transgenic plant having improving nitrogen availability and its manufacturing method}

본 발명은 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, MybC 유전자가 제거된 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

식물의 생장과 발달에 가장 중요한 필수영양소인 질소는 식물의 건물 중 당 2-4% 비율을 차지하고 있으며, 아미노산, 단백질, 핵산, 효소 등의 유기화합물의 구성 성분이기 때문에 인산과 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다.

특히 질산(nitric acid)은 식물의 주된 질소원으로서 뿌리를 통해서 흡수된 후 질산환원효소(nitrate reductase)의 활성에 의해서 아질산(nitrous acid)으로 환원되고, 연속적으로 아질산환원효소(nitrite reductase)의 활성에 의해 암모늄으로 환원되어 핵산과 단백질을 포함한 식물생장에 필요한 다양한 대사물질로 동화된다.

따라서 매년 약 10억 톤 가량의 질소비료가 작물재배에 투입되고 있으나, 비료 성분 중 질소가 가장 비싼 영양성분이기 때문에 투입되는 비료의 양은 곧 농업 생산 비용을 증가시키는 원인이 된다. 뿐만 아니라 비료의 과다 사용으로 인해 미쳐 흡수되지 못한 비료는 유실되어 흙이나 강물의 오염원이 되고, 과도하게 사용될 경우 불완전 환원으로 지구 온난화의 원인이 되는 일산화질소(NO)를 생산한다. 농업환경의 오염은 농산물 생산에 있어서 양적 및 질적 저하를 가져올 뿐만 아니라, 생활환경도 오염시켜 국민 건강을 위협하므로 그 오염원의 제거는 매우 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 비료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있는데, 이러한 문제의 근본적인 해결 방안은 식물의 질소 흡수력을 향상시킴으로써 비료의 사용량을 줄이는 것이다.

그러므로 질소 결핍 조건에서도 효율적으로 생장이 가능한 새로운 작물의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1302375호

이에 본 발명자들은 질소 결핍 조건에서도 생장이 우수한 식물을 개발하기 위해 연구하던 중, MybC 유전자를 제거시킨 형질전환 식물체가 질소 이용 능력이 증진되어 질소 결핍 조건에서도 생육이 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 MybC 유전자의 발현이 억제되거나 또는 MybC 유전자가 넉-아웃된, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

그러므로 본 발명은 MybC 유전자의 발현이 억제되거나 또는 MybC 유전자가 넉-아웃된, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, MybC 유전자의 발현 억제 또는 MybC 유전자의 넉-아웃은 MybC 유전자에 대한 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 핵산서열, 리보자임, T-DNA 또는 트랜스포존을 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MybC 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질소 이용 능력 증진은 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류;일 수 있다.

또한, 본 발명은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, MybC 유전자의 발현 억제 또는 MybC 유전자의 넉-아웃은 MybC 유전자에 대한 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 핵산서열, 리보자임, T-DNA 또는 트랜스포존을 사용하는 것을 특징으로 하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 MybC 유전자가 제거된 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체에 관한 것으로, 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제시키거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시킬 경우, 질소가 결핍된 조건 또는 저질소 조건 하에서도 식물의 생장과 생육을 증진시킬 수 있는 효과가 있다. 따라서 MybC 유전자가 제거된 형질전환 식물체는 적은 질소 시비량에도 우수한 생장력을 보임에 따라 질소 비료의 사용 감축에 따른 환경오염 저감 효과를 도출할 수 있고, 환경 스트레스에 대해 저항성이 증대되어 있어 농작물 등 다양한 식물 또는 작물에 적용할 경우 생산량 증대 효과를 도출할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 야생형 애기장대(Col-0) 및 MybC 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)에 대해 저질소 조건 하에서 생성된 클로로필[a+b]의 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에서 야생형 애기장대(Col-0) 및 MybC 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)에 대해 저질소 조건 하에서 단백질의 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에서 야생형 애기장대(Col-0) 및 MybC 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)에 대해, 정상적인 질소 처리(20mM) 및 저질소(0.05mM) 조건 하에서 생성된 ABA 호르몬의 함량을 측정한 결과를 나타낸 이다.
도 4는 본 발명의 MybC 유전자 넉아웃에 의해 발현수준의 변화를 보이는 MybC 타겟 유전자를 스크리닝한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 충분한 질소 조건 및 질소 결핍 하에서 생육시킨 야생형 애기장대(Col-0) 및 MybC 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)의 형태를 관찰한 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 MybC 유전자에 돌연변이가 발생하여 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체를 제공함에 특징이 있다.

상기 MybC 유전자는 최근 발견 및 연구된 유전자로서 아직 그 기능에 대한 연구가 많이 보고되지 않고 있으며, 다만 식물의 뿌리에서 발현되는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 질소 이용 능력이 증진된 새로운 형질전환 식물체를 연구하던 중, MybC 유전자에 돌연변이가 발생한 경우, 질소 이용 능력이 증진되어 질소 결핍 또는 저질소 환경 하에서도 식물의 생장과 생육이 증진됨을 확인하였다.

따라서 MybC 유전자에 돌연변이를 발생시킬 경우, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 상기 MybC 유전자에 발생하는 돌연변이는, 바람직하게는 MybC 유전자의 발현이 억제된 돌연변이일 수 있다. 상기 용어 "억제된 발현"은 "감소된 발현" 또는 "발현의 실질적인 제거"와 상호 호환적인 의미이며, 억제된 발현은 대조군(즉, 야생형)에 비하여 내재적 유전자의 발현 및/또는 폴리펩티드 수준 및/또는 폴리펩티드 활성의 감소를 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 MybC 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 식물체는 쌍자엽 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류일 수 있으며, 더 바람직하게는 식량 작물류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 곡류 또는 두류일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 야생형 애기장대와 T-DNA를 이용하여 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대를 대상으로 저농도의 질소 처리 조건하에서 이들 애기장대에 함유된 클로로필의 함량, 총 단백질의 함량 및 앱시스산(ABA) 호르몬의 함량을 측정하였다.

그 결과, 저농도의 질소 처리 조건하에서 야생형 애기장대에 비해 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대가 클로로필 및 총 단백질의 함량이 더 우수한 것으로 나타났다. 따라서 저농도의 질소하에서도 본 발명의 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환된 식물체는 질소 이용 능력이 증진되어 식물의 생장과 생육이 야생형에 비해 더 향상되는 것을 알 수 있었다.

뿐만 아니라 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 MybC 유전자는 식물체 내에서 질소의 흡수를 음성적으로 조절하는 기능을 가진다는 것을 처음으로 규명하였다. 즉, 질소 흡수를 억제하는 기능을 갖는 다는 것을 알 수 있었다.

나아가 앱시스산(ABA) 호르몬 함량 측정 결과에서도, 본 발명의 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대가 야생형 애기장대에 비해 저농도의 질소 조건, 즉 환경스트레스 하에서 생성되는 식물 스트레스 호르몬인 앱시스산이 현저하게 낮은 것으로 나타났다.

이러한 결과는 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 식물체가 외부 환경스트레스에 대한 저항성이 우수하다는 것을 의미하며, 저질소 조건과 같은 환경 스트레스 하에서도 생장과 생육이 정상적으로 진행될 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공함에 특징이 있다.

상기 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면, 목적 핵산 서열이 스페이서 (spacer: non-coding DNA)로 분리되어 역반복 (inverted repeat)으로 클로닝된 유전자 구축물의 식물체로의 도입 및 발현에 의해 이루어질 수 있으며, 더욱 상세한 내용은 Grierson 등 (1998) WO 98/53083; Waterhouse 등 (1999) WO 99/53050를 참고하면 된다. 또한, 임의의 공지된 "유전자 침묵 (gene silencing)" 방법 중 하나가 동일한 효과를 얻기 위해 사용될 수 있다. 내재적 유전자 발현의 감소를 위한 상기 방법의 예는 유전자 발현의 RNA-매개 유전자 침묵 (RNA-mediaetd gene silencing)인 siRNA (short interfering RNA), 목적 유전자 핵산 서열의 센스 (sense) 방향 핵산 서열 또는 안티센스(antisense) 방향 핵산 서열의 식물체로의 도입, 리보자임 (ribozyme), 삽입 돌연변이 유발 (예를 들면, T-DNA 삽입 또는 트랜스포존 (transposon) 삽입) 또는 miRNA (microRNA) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 T-DNA 삽입방법을 사용하였다.

상기 기재된 방법은 내재적 유전자의 식물에서 특정 유전자의 발현 감소 또는 실질적인 제거를 위한 다양한 방법의 예이며, 당업자는 전체 식물 또는 그 일부에서 내재적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 침묵을 위해, 예를 들면, 적절한 프로모터를 사용하여 상기 언급된 방법을 용이하게 변형할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.

또한, 본 발명의 형질전환 식물체는 타겟 유전자의 식물체 내로의 도입을 통해 제조될 수 있는데, 타겟 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 벡터를 식물 숙주세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터, 바람직하게는 재조합 벡터는 MybC 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있는 MybC 유전자 핵산 서열의 역반복 (inverted repeat)으로 클로닝된 유전자, siRNA(short interfering RNA) 유전자, 목적 유전자 핵산 서열의 센스 (sense) 방향 핵산 서열 또는 안티센스(antisense) 방향 핵산 서열, 리보자임 (ribozyme) 코딩 유전자, 돌연변이 유발 유전자 (예를 들면, T-DNA 또는 트랜스포존) 또는 miRNA (microRNA) 유전자가 삽입된 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 목적 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있는 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 이용한 유전자 발현의 억제 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예는 상기에 기재된 바와 같다.

또한 본 발명에서 상기 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 MybC 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있는 유전자 서열이 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있는데, 여기서 상기 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

MybC 유전자의 발현을 억제 또는 감소시킬 수 있는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 방법으로 제조된 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체는 식물체 자체 또는 식물체의 종자를 모두 포함할 수 있다.

나아가 본 발명은 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법을 제공함에 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 야생형 애기장대와 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대를 대상으로 질소가 풍부한 조건 및 질소결핍 조건 하에서의 생육 정도를 관찰하였다.

그 결과, 질소가 풍부한 조건에서는 야생형 및 형질전환체 모두가 정상적인 생육 특성을 보이는 것으로 나타난 반면, 질소결핍 조건 하에서는 야생형 애기장대는 정상적인 생육이 진행되지 못하는 것으로 나타났고, 본 발명의 형질전환 애기장대만이 정상적인 생육이 진행되는 것으로 나타났다(도 5 참조).

그러므로 이러한 결과를 통해 식물체 내에서 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 MybC 유전자를 넉아웃시킴으로서 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명에서 규명한 식물체 내의 MybC 유전자 발현억제 또는 MybC 유전자의 넉아웃은 질소결핍 또는 저질소 조건 하에서도 식물 또는 작물의 질소 이용 능력을 증진시켜 뿌리 생장뿐만 아니라 식물 또는 작물의 전체적인 생육과 생장을 효과적으로 증진시킬 수 있으며, 종래 문제가 되고 있는 과도한 질소 비료 사용으로 인한 환경 오염도 저감화시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 준비예 >

식물준비 및 성장조건

식물체로는 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 사용하였으며, 야생형 (Col-0) 애기장대의 종자 및 MybC 엑손 SAIL_167_A06 (CS871725)와 SAIL_658_G04 (CS875727)가 각각 삽입된 T-DNA로 형질전환된 MybC 녹아웃 돌연변이체 (mybc-ko)인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 종자를 사용하였다. 상기 돌연변이체의 모체는 모두 동일한 야생형 (Col-0) 애기장대를 사용하였다. 종자는 멸균처리하고, 4℃에서 3일 동안 저장 후, 무질소(Nitrogen-free half)의 Murashige 및 Skoog (2% MS) 조건하에서 배양하였다. 종자 발아를 위한 성장 챔버 조건은 16시간 광/ 8시간 암 주기, 23±1 ℃, 50-55 μmol 광자 m^-2 s^-1 및 70%의 상대 습도 조건에서 배양시켰다. 무질소 1/2 × Murashige 및 Skoog 배지는 0.5% Phytagel 및 2% sucrose (pH 5.8)을 첨가한 것을 사용하였고, 식물을 질소가 없는(무질소) 1/2 × Murashige 및 Skoog 배지에 침지하였으며, 이때 저농도의 다양한 (0, 0.5, 0.05, 20 mM) 농도로 질산을 처리하였다

<실험방법>

① 형질전환 식물체 제조

MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대는 상기 기술된 바와 같이 야생형 애기장대에 MybC 엑손 SAIL_167_A06 (CS871725)와 SAIL_658_G04 (CS875727)가 각각 삽입된 T-DNA로 애기장대에 형질전환시켜 MybC 유전자가 녹아웃된 돌연변이체 (mybc-ko)인 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 사용하였다.

② 조직화학적 GUS 어세이

GUS 분석은 당업계에 공지된 방법(Jefferson et al. (1987))에 따라 수행하였는데, 구체적으로 상기 준비예의 종자들을 염색 후, Leica EZ4D 현미경 (Leica Microsystems, http://www.leica-microsystems.com/home/)을 이용하여 분석하였다.

③ qRT - PCR 분석

상기에서 준비한 애기장대 식물체(야생형 애기장대, MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대)로부터 총 RNA를 분리하였는데, 총 RNA의 추출은 저질소 처리가 완료된 9일차 식물을 대상으로 MMLV Reverse를 사용하여 cDNA를 각각 합성하였다. 이후 합성된 cDNA를 주형으로 하여 qRT-PCR을 진행하였으며, EvaGreen 2× qPCR MasterMix (Applied Biological Materials, Inc., Richmond, Canada) 키트를 이용하여 수행하였고, 이때 AtActin2 유전자를 하우스키핑 유전자 및 내부 컨트롤로 사용하였다.

④ 단백질 분리 및 브래드포드 어세이

애기장대 식물체(야생형 애기장대, MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대)로부터 총 단백질을 추출하였는데, 단백질의 추출은 PRO-PREP^TM 단백질 추출용액 500ul를 각 시료에 첨가하고 볼텍싱한 다음, 30분 동안 -20℃ 온도에서 세포 용해를 유도하였다. 이후 13000rpm의 속도로 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 새로운 튜브로 옮겨 단백질 추출액을 수득하였다.

또한, 단백질 농도측정을 위한 브래드포드 어세이는 BSA 용액(0.1mg/ml)을 표준 곡선을 만드는데 사용하였고, 상기 단백질 추출액 200㎕을 96 웰 마이크로플레이트에 옮긴 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 단백질 농도는 표준 곡선에 기초하여 계산되었다.

⑤ 클로로필 함량측정(Chlorophyll Assay)

Chlorophyll 함량은 80% 아세톤을 처리하여 추출 후, 분광 광도계를 이용하여 측정하였다. 구체적으로 저질소 처리가 완료된 9일차의 야생형 애기장대 종자(Col-0) 및 mybc 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대 종자(ko mutant)를 각 100 mg씩 샘플링하여 액체 질소처리 후 그라인딩하여 사용하였다. 이후 1.5ml의 e-tube에 80% 아세톤 용액 700㎕을 넣고 암 조건에서 30분간 젠틀리하게 교반시켰다. 이후 4°C에서 15분 동안 3,000rpm으로 원심분리 하였고 Chlorophyll 함량은 663 nm 및 645 nm에서의 흡광도로 측정하여 분석하였다. 이때 Chlorophyll의 농도 계산은 하기 계산식을 통해 계산하였다.

-Chlorophyll a (mg/g) = [12.7 * (A663) 2.69 * (A645)] * V/ 1000 * W

-Chlorophyll b (mg/g) = [22.9 * (A645) 4.86 * (A663)] * V/ 1000 * W

-총 chlorophyll (mg/g) = [8.02 * (A663) + 20.20 * (A645)] * V/ 1000 * W

(V: volume of the extract; W: weight of fresh leaves)

⑥ ABA 농도 측정

저질소 처리가 완료된 9일차 야생형 애기장대 종자(Col-0) 및 mybc 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대 종자(ko mutant) 각 200mg을 이용하여 ABA 함량을 측정하였는데, ABA 함량은 Phytodetek Elisa kit의 지침에 따라 수행하였다(Liu, N., Ding, Y., Fromm, M., & Avramova, Z. Endogenous ABA extraction and measurement from Arabidopsis leaves. Bio Protoc 5, pii: e1257 (2014)).

⑦ 질산염 농도 측정

저질소 처리가 완료된 9일차 야생형 애기장대 종자(Col-0) 및 mybc 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대 종자(ko mutant)를 대상으로 질소염 농도를 측정하였다. 각 애기장대의 종자를 액체 질소처리 후 그라인딩한 다음, 1ml의 증류수를 첨가하고, 이를 끓는 물에 첨가하여 20분 동안 가열시켰다. 이후 13000rpm으로 10분 동안 4°C에서 원심분리하였고, 100ul의 상층액을 15 ml falcon-tube 로 옮긴 후, 400 ㎕ salicylic sulfate acid을 첨가하여 볼텍싱하였다. 이후 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 9.5ml의 8% NaOH 용액을 첨가하여 4℃에서 5분간 방치 후, 410nm에서 흡광도를 측정하여 질산염 농도를 분석하였다.

⑧ ChIP(Chromatin immunoprecipitation) 분석

ChIP 분석은 Saleh et al. (2008)에 의한 방법을 기초로 수행하였는데, 야생형 애기장대 종자(Col-0) 및 mybc 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대 종자(ko mutant)를 대상으로 크로스-링킹(cross-linking) 및 핵 추출에 사용하였다. GFP에 대한 항체(G1544; Sigma, https://www.sigmaaldrich.com/)를 면역침강에 사용하였는데 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 역 크로스-링킹(reverse cross-linking) 후 DNA 정제 및 실시간 PCR을 수행하였다.

⑨ 단백질 정제 및 전기영동 이동도( electrophoretic mobility shift) 분석

전기영동 이동도(EMSA) 분석을 위한 재조합 단백질을 수득하기 위해, MybC 유전자를 pMAL-His-C2X 벡터에 서브 클로닝하였는데, 상기 pMAL-His-C2X 벡터는 pMAL-C2X (NEW ENGLAND BioLabs) 벡터의 MBP(maltose-binding protein) C 말단에 6x-histidine (His)을 표지한 재조합 벡터이다. 이후 MybC 유전자가 삽입된 pMAL-His-C2X- MybC 벡터를 대장균 B21(DE3)로 도입하여 대장균을 형질전환시키고 37℃에서 OD(600)가 0.7이 될 때까지 LB 액체 배지에서 배양시킨 다음, 0.1mM isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside을 첨가하여 세포를 18℃에서 18시간 동안 다시 배양시켰다. 이후 3500rpm에서 1시간 동안 원심분리 후, 상층액을 제거한 다음, 남은 대장균체를 단백질 정제에 사용하기 전까지 20℃에 보관하였다. 단백질의 정제는 Ni-His 표지된 컬럼을 사용하였다. 또한, NRT1.1 프로모터 프래그먼터는 5′ 및 3′ 바이오틴-표지된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. NRT1.1 프로모터 그래프먼터에 대한 프라이머 서열은 ChIP 분석에 사용한 NRT1.1pro q#1 프라이머와 유사하다. EMSA 분석은 LightShift^® Chemiluminescent EMSA kit insert (Thermo Scientific)의 지침사항에 따라 수행하였다.

<실시예 1>

MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대에서의 클로로필 함량 분석

야생형 애기장대 및 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대를 대상으로, 각 식물체 내에 함유된 클로로필 함량을 분석하였는데, 이때 상기 애기장대들은 저질소 조건 하에서 배양된 애기장대들을 대상으로 분석하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 저질소 조건 하에서 배양된 애기장대들의 경우, 야생형에 비해 본 발명에 따른 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)에서 클로로필 함량이 더 높게 측정되었다.

<실시예 2>

MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대에서의 단백질 함량 분석

또한 본 발명자들은 야생형 애기장대 및 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대를 대상으로, 각 식물체 내에 함유된 단백질 함량을 분석하였고, 이때 상기 애기장대는 저질소 조건 하에서 배양하여 분석하였다.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 저질소 조건 하에서 배양된 애기장대들의 경우, 야생형에 비해 본 발명에 따른 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대(#1, #10)에서 총 단백질의 함량이 더 높은 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 이러한 결과를 토대로, 식물체 내에서 MybC 유전자를 넉다운 또는 넉아웃 시킬 경우, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서도 식물의 생육과 생장이 원활히 이루어질 수 있음을 확인하였고, 나아가 야생형에 비해 더 우수한 생육 특성을 보임을 알 수 있었다.

그러므로 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 식물의 경우, 적은 양의 질소 비료를 사용해도 식물의 생육과 생장이 잘 이루어질 수 있어, 질소 비료 사용에 따른 환경 오염도 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 식물체의 환경스트레스 저항성 분석

ABA((abscisic acid)는 식물 또는 작물이 가뭄, 염, 저온 등 적절치 못한 환경에 노출되면 세포 내에서 생성이 증가하는 식물 호르몬이다. 이에 본 발명자들은 MybC 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 식물체와 야생형 식물체 내의 환경 스트레스 정도를 확인하기 위해 ABA의 함량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 20mM의 질소 조건 하에서 생육시킨 애기장대에 비해 0.05mM의 저질소 조건에 생육시킨 애기장대에서 ABA의 생성이 더 높은 것으로 나타났으나, MybC 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 애기장대가 야생형 애기장대에 비해 ABA의 생성이 더 감소한 것으로 나타났고, 특히 20mM 질소 조건 보다 0.05mM의 저질소 조건 하에서, MybC 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 애기장대가 야생형 애기장대에 비해 ABA의 생성이 월등하게 감소된 것을 확인할 수 있었다.

따라서 이러한 결과는, 본 발명의 MybC 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 식물체가 저질소 또는 질소 결핍과 같은 외부 환경의 스트레스에 대해 저항성이 우수하다는 것을 의미하며, 즉, 저질소 또는 질소 결핍 조건 하에서도 스트레스를 받지 않고 양호하게 생육하고 성장할 수 있음을 의미한다.

<실시예 4>

MybC 유전자의 타겟 유전자 스크리닝

나아가 본 발명자들은 상기와 같은 실험들을 통해 식물 또는 작물 내에서 MybC 유전자를 넉아웃 시킬 경우, 저질소 또는 질소 결핍과 같은 환경 스트레스 조건 하에서도 생육이 우수한 형질전환 식물체를 제조할 수 있음을 확인함에 따라 MybC에 의해 조절되는 타겟 유전자들을 스크리닝 하였다. 이를 위해 야생형 애기장대 및 MybC이 넉아웃된 형질전환 애기장대를 대상으로 각기 다른 농도의 질소 처리 하에서(20mM, 0.5mM, 0.05mM) NRT1.1, NRT1.2, NRT2.5, RD29A, NCED3 및 COR47 유전자들의 발현 변화를 측정하였다.

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 다른 유전자들에 비해 NRT1.1 및 NRT1.2의 유전자는 MybC 유전자가 넉아웃될 경우, 발현수준이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명자들은 MybC 유전자가 NRT1.1 및 NRT1.2 유전자들의 조절자임을 알 수 있었고, 이들 유전자의 양성 조절자로서 작용함을 알 수 있었다.

<실시예 5>

식물형질 분석

본 발명자들은 야생형 애기장대 및 MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대 각각을 충분하게 질소가 처리된 조건과 질소가 결핍된 조건 하에서 생육시킨 후, 이들 식물체의 형태를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 질소가 충분하게 처리된 조건에서는 야생형 및 형질전환 애기장대 모두가 정상적인 생육이 진행된 것으로 나타난 반면, 질소가 결핍된 조건에서는 야생형 애기장대는 생육과 성장이 정상적으로 진행되지 못한 것으로 나타났고, MybC 유전자가 넉아웃된 형질전환 애기장대만이 정상적인 생육과 성장이 진행된 것으로 나타났다.

이상의 결과를 통해, 본 발명자들은 MybC 유전자를 넉아웃시킨 형질전환 식물 또는 작물은 질소결핍 또는 저질소 조건 하에서도 질소 이용 능력을 증진시켜 뿌리 생장 뿐만 아니라 식물 또는 작물의 전체적인 생육과 생장을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 동시에 질소 비료의 과도한 사용으로 인해 문제가 되었던 환경 오염도 저감화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Korea University <120> Transgenic plant having improving nitrogen availability and its manufacturing method <130> NPDC69127 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MybC CDS sequence <400> 1 atgactcgtc ggtgttcgca ttgtagcaac aatgggcaca attcacgcac gtgtccaacg 60 cgtggtggtg gcacgtgcgg tggaagtggc ggaggaggag gaggtggtgg tggaggaggg 120 tctggttcct cctccgccgt gaagttattt ggtgtgaggt taacggatgg ctcgattatt 180 aaaaagagtg cgagtatggg taatctctcg gcattggctg ttgcggcggc ggcggcaacg 240 caccaccgtt tatctccgtc gtctcctctg gcgacgtcaa atcttaatga ttcgccgtta 300 tcggatcatg cccgatactc taatttgcat cataatgaag ggtatttatc tgatgatcct 360 gctcatggtt ctgggtctag tcaccgtcgt ggtgagagga agagaggtgt tccttggact 420 gaagaggaac atagactatt cttagtcggt cttcagaaac tcgggaaagg agattggcgc 480 ggtatttcga gaaactatgt aacgtcaaga actcctacac aagtggctag tcatgctcaa 540 aagtatttta ttcgacatac tagttcaagc cgcaggaaaa gacggtctag cctcttcgac 600 atggttacag atgagatggt aaccgattca tcgccaacac aggaagagca gaccttaaac 660 ggttcctctc caagcaagga acctgaaaag aaaagctacc ttccttcact tgagctctca 720 ctcaataata ccacagaagc tgaagaggtc gtagccacgg cgccacgaca ggaaaaatct 780 caagaagcta tagaaccatc aaatggtgtt tcaccaatgc tagtcccggg tggcttcttt 840 cctccttgtt ttccagtgac ttacacgatt tggctccctg cgtcacttca cggaacagaa 900 catgccttaa acgctgagac ttcttctcag cagcatcagg tcctaaaacc aaaacctgga 960 tttgctaaag aacgtgtgaa catggacgag ttggtcggta tgtctcagct tagcatagga 1020 atggcgacaa gacacgaaac cgaaacttcc ccttccccgc tatctttgag actagagccc 1080 tcaaggccat cagcgtttca ctcgaatggc tcggttaatg gtgcagattt gagtaaaggc 1140 aacagcgcga ttcaggctat ctaa 1164

Claims

서열번호 1의 염기서열로 이루어진 MybC 유전자의 발현이 억제되거나 또는 상기 MybC 유전자가 넉-아웃된, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체.
제1항에 있어서,
MybC 유전자의 발현 억제 또는 MybC 유전자의 넉-아웃은 MybC 유전자에 대한 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 핵산서열, 리보자임, T-DNA 또는 트랜스포존을 사용하는 것을 특징으로 하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 질소 이용 능력 증진은 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체.
제1항에 있어서,
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류;인 것을 특징으로 하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체.
식물체 내에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
제6항에 있어서,
MybC 유전자의 발현 억제 또는 MybC 유전자의 넉-아웃은 MybC 유전자에 대한 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 핵산서열, 리보자임, T-DNA 또는 트랜스포존을 사용하는 것을 특징으로 하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
삭제
제6항에 있어서,
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류;인 것을 특징으로 하는, 질소 이용 능력이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
식물체 내에서 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 MybC 유전자의 발현을 억제하거나 또는 상기 MybC 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법.
제10항에 있어서,
MybC 유전자의 발현 억제 또는 MybC 유전자의 넉-아웃은 MybC 유전자에 대한 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 핵산서열, 리보자임, T-DNA 또는 트랜스포존을 사용하는 것을 특징으로 하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법.
삭제
제10항에 있어서,
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료 작물류;인 것을 특징으로 하는, 질소 결핍 또는 저질소 조건 하에서 식물의 생육 또는 성장을 증진시키는 방법.