CN109022482A - Trv载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法 - Google Patents

Trv载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法 Download PDF

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    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)

Abstract

本发明公开了一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法：利用TRV1载体、以及基于TRV2载体构建的TRV‑PDS、TRV‑GFP等载体对牡丹幼苗进行真空侵染，出现牡丹叶片漂白，叶片和根组织发荧光等症状，实现牡丹植株的基因沉默，本发明为研究牡丹生长发育过程中各个组织相关基因的功能提供了一种简单、快速、低成本的方法。

Description

TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种针对整株牡丹幼苗的TRV载体介导病毒诱导基因沉默的方法。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后的基因沉默技术，其作为一种有效的反向遗传学技术已经被广泛的应用于多种植物。VIGS的作用原理是植物在抵御病毒侵染的过程中会产生特异性核酸内切酶Dicer，将病毒复制过程中产生的双链RNA切割成21～24个核苷酸的小分子干扰RNA(siRNA)。siRNA在植物细胞内进一步扩增后，以单链形式与Agronaute 1(AGO1)蛋白等结合，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC能够特异地引起植物细胞质中与siRNA同源的mRNA的降解，从而导致目的基因的沉默。
VIGS技术主要借助病毒载体来实现对内源基因的沉默。烟草脆裂病毒(Tobaccorattle virus,TRV)是一类应用比较广泛的病毒载体，具有寄主范围广、沉默效率高、维持时间长等优点。VIGS实验常用沉默载体为烟草脆裂病毒(TRV)的RNA1和RNA2cDNA的双元表达载体TRV1和TRV2(Wang S B,Tian S L,Shah S N,et al.Cloning andcharacterization of the CarbcL gene related to chlorophyll in pepper(Capsicumannuum L.)under fruit shade stress.Frontiers in Plant Science,2015,6(6):850.)。TRV1包括编码RNA依赖的RNA聚合酶、运动蛋白和16kD蛋白的基因，是VIGS体系的辅助病毒载体。TRV2包括衣壳蛋白(Cp)基因、多克隆位点(MCS)等，用于插入目的基因。
牡丹(Paeonia suffruticosa)是多年生观赏植物，其花大、色艳，具有极高的观赏价值。然而，牡丹作为木本植物，突变体不易获得，且其遗传转化体系尚不成熟，限制了对牡丹等木本植物基因功能的研究，给这类植物的分子育种带来了诸多不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，该方法可以简单、高效、低成本的使TRV病毒载体或重组TRV病毒载体侵染牡丹幼苗，从而能够有效、快速的实现牡丹整株中目的基因的基因沉默。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)将病毒载体TRV1以及TRV2或者将病毒载体TRV1以及插入有目的基因或报告基因的重组TRV2分别转化农杆菌，将转化得到的含有TRV1的阳性农杆菌与含有TRV2或重组TRV2的阳性农杆菌经培养后于侵染缓冲液中混合，得转化菌液；
2)对牡丹幼苗依次进行清洗、消毒；
3)将经过清洗及消毒后的牡丹幼苗整株浸入转化菌液，然后进行真空侵染；
4)经过步骤3)后，将牡丹幼苗从转化菌液中取出并重新移栽，然后采用以下条件进行培养：温度为21～25℃，湿度为60～70％，光照强度为1800～2000Lx，16h光照/8h黑暗。
优选的，在步骤4)中，于牡丹幼苗培养过程中对牡丹幼苗进行表型观测，并定量检测牡丹幼苗各器官(例如，根、叶片)中目的基因表达情况。
优选的，所述牡丹幼苗选自2～3年生牡丹植株。
优选的，所述转化采用冻融法。
优选的，所述侵染缓冲液包括以下组分：10mM 2-吗啉乙磺酸(MES)、100μM乙酰丁香酮(AS)及10mM MgCl2。
优选的，将含有TRV1的阳性农杆菌与另一种阳性农杆菌(例如含有TRV2、TRV-GFP或TRV-PDS)分别培养至OD600值为0.6～0.8后，经侵染缓冲液重悬并调节OD600为1～1.5，然后按照体积比为1:1进行混合。
优选的，所述真空侵染的条件为：于侵染过程中抽真空，抽真空的目标压力为70～100KPa，侵染时间为15～20min。
优选的，所述报告基因选自荧光报告基因，所述目的基因选自牡丹八氢番茄红素脱氢酶基因等牡丹内源基因。
本发明的有益效果体现在：
本发明利用TRV病毒载体对木本植物牡丹整个幼苗植株进行真空侵染，侵染后幼苗在一定条件下继续培养，可针对牡丹幼苗整株实现侵染，进而实现牡丹植株内目的基因的基因沉默。本发明的侵染方法操作流程方便、快捷，从表型和分子水平对该方法的效果分析表明，该方法侵染效果良好。本发明为研究目的基因在木本植物，特别是牡丹植株根和叶片等组织中的功能提供了新途径。
附图说明
图1为TRV1、TRV2载体(pTRV1、pTRV2)结构图。
图2为TRV病毒载体侵染牡丹幼苗示意图；其中：(a)牡丹幼苗；(b)TRV病毒载体侵染流程。
图3为TRV-GFP侵染一周后的GFP荧光以及蛋白检测结果；其中：a、d、g、j为明场下照片；b、e、h、k为暗场下照片；c、f、i、l为叠加照片；泳道1、2、3均为叶片中GFP蛋白积累的检测，泳道4、5、6为根组织中GFP蛋白积累的检测；泳道1、4为对照组，对照为未经侵染处理的牡丹幼苗的叶片、根。
图4为TRV-PDS侵染4周后牡丹幼苗的叶片表型；其中：TRV是指用空载体侵染牡丹幼苗(对照)，空白指未经侵染处理的牡丹幼苗。
图5为半定量检测病毒载体的积累情况；其中：TRV2-1为目标区域在TRV2多克隆位点上游；TRV2-2为包含多克隆位点区域，产物的大小取决于插入片段的大小(通过这个结果可以证明侵染植物的TRV病毒是否包含目的基因的片段)。
图6为定量检测侵染后牡丹植株(幼苗)PDS基因的表达水平。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，其目的在于更好的理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
本发明基于VIGS系统，提出了一种TRV载体介导牡丹幼苗整株病毒诱导基因沉默的侵染方法
(一)原料和试剂来源
1)2～3生牡丹幼苗：牡丹品种为凤丹(种子购买自陕西中资国业牡丹产业发展有限公司)，种植于相同环境下并生长2～3年(从播种算起)的实生苗(种植地点：西北农林科技大学资源圃)。
2)EcoR I、BamH I，购自Thermo Fisher Scientific公司。
3)T4-DNA连接酶、DH5α感受态细胞、pUCm-T Vector购于上海生工；农杆菌GV3101购于上海生物。
4)VIGS实验所用沉默载体TRV1和TRV2(参见图1)及重组载体TRV-GFP，由清华大学刘玉乐教授馈赠(2011年10月)，但均可根据现有文献自行构建。
5)LB液体培养基配方：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl；
LB固体(平板)培养基：制作平板，则在LB液体培养基中再加入15g/L琼脂粉即可。
6)YEP液体培养基配方：10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl；
YEP固体(平板)培养基：制作平板，则在YEP液体培养基中再加入15g/L琼脂粉即可。
(二)TRV载体介导牡丹幼苗整株病毒诱导基因沉默
(1)用基因工程的方法克隆牡丹的八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)，并将克隆片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体TRV2中，得到TRV-PDS，具体步骤如下：
1.1 cDNA的合成
按照TaKaRa提取试剂盒操作说明，提取牡丹叶片的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链。
1.2 PDS基因扩增
以牡丹叶片的cDNA第一链为模板、用50μL体系进行扩增；
1)设计引物(引物于2018年3月完成设计)
上游引物：5’-CAGCCGATTTGATTTCCTTG-3’
下游引物：5’-CCTTGTTTTCTCATCCAGTC-3’；
2)扩增程序
94℃2min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，30次循环；72℃10min；4℃保存。PCR产物经电泳检测为单一条带(195bp)，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化，备用。
1.3 TRV-PDS载体的构建
纯化后的PCR扩增片段与pUCm-T Vector连接，连接按照T4-DNA连接酶的说明书进行(扩增片段通过T4-DNA连接酶连接到pUCm-T Vector载体的多克隆位点区域内，EcoR I、BamH I位于该多克隆位点区域的两端)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经阳性克隆筛选、质粒提取，及菌落PCR验证，得到重组质粒pUCm-T-PDS。
将构建好的pUCm-T-PDS进行双酶切(EcoR I、BamH I)，对包含目的片段(195bp)的酶切产物进行胶回收，并与经EcoR I、BamH I双酶切后的TRV2质粒用T4-DNA连接酶连接，连接产物(TRV-PDS)转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布于含有50mg/L Kan抗生素的LB平板培养基，37℃倒置过夜，挑取平板上长出的单克隆至含有50mg/L Kan抗生素的LB液体培养基中，37℃，210转/分钟振荡培养12小时，提取质粒，测序验证正确后备用；
(2)农杆菌的转化及培养：
2.1)将验证正确的TRV-PDS以及TRV-GFP、TRV2和TRV1质粒分别用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细胞中。
液氮冻融法转化农杆菌的具体方法为：取1～2μL病毒载体或重组载体质粒加入到1管GV3101的感受态细胞中，冰上放置30min；再放入液氮中速冻5min，取出置于28℃的水浴中5min，之后冰浴2min。加入900μL YEP液体培养基，180rpm，轻摇2～4h。室温下4000rpm离心1min，弃800μL上清，再轻轻吸打使细胞悬浮，得转化液。吸取转化液200μL均匀涂布于YEP固体培养基(含50μg/mL Rif+50μg/mL Gen+50μg/mL Kan)平板上，28℃倒置避光培养2天。从平板上挑取单菌落于300μL YEP液体培养基(含50μg/mL Rif+50μg/mL Gen+50μg/mLKan)中，培养5h(28℃，250rpm)。然后以菌液做模板，PCR检测阳性克隆。将得到的阳性菌株保菌备用。
2.2)将分别含有TRV-PDS、TRV-GFP、TRV2、TRV1的农杆菌GV3101接种于5mL YEP液体培养基(含50μg/mL Kan+50μg/mL Rif+50μg/mL Gen)中，分别于28℃振荡培养过夜。
2.3)第二天取500μL菌液接种于25mL YEP液体培养基(含50μg/mL Kan+50μg/mLRif+50μg/mL Gen)中，28℃振荡培养过夜，至OD600值为0.6～0.8，4000r/min离心20min，倒掉上清，保留菌沉淀。OD600值与培养物的侵染活性有关。
2.4)用20mL侵染缓冲液(10mM MES+100μM AS(Acetosyringone)+10mM MgCl2，溶剂是水)重悬菌体，并用侵染缓冲液调节OD600值为1.2～1.5。
2.5)经过2.4)后，将含有TRV1的GV3101菌液分别与含有TRV2、TRV-GFP、TRV-PDS的GV3101菌液按1:1比例(体积比)混匀，28℃、90r/min下放置3h(充分混匀)，得转化菌液。
(3)实验材料准备：
参见图2a，于春季牡丹展叶期(全树萌发的叶芽中有25％的芽的第一片叶展开，叶片尚处于红色)，取2～3年生牡丹幼苗(采集时间2018年3月)，用蒸馏水冲洗干净，并用1％的次氯酸钠消毒液进行消毒(浸泡5～10min)，备用。
(4)牡丹幼苗侵染和培养：
参见图2b，将消毒过的牡丹幼苗，整株完全浸泡在转化菌液中，对盛放转化菌液的容器进行抽真空，在压力为100KPa下侵染20min(真空侵染)。真空侵染结束后(停止抽真空，恢复容器内压力为常压)，将经过侵染的牡丹幼苗用无菌水清洗干净，种植于灭菌营养土(泥沙比例为1:1)中。培养条件为：温度为23±2℃，湿度为60～70％，光照强度为1800～2000Lx，16h光照/8h黑暗(该培养条件有利于TRV病毒载体的繁殖，以达到良好的侵染效果)。四周内观察表型，提取RNA使用半定量和定量的方法检测PDS基因转录本的沉默效果。
(5)结果分析：
参见图3，对用TRV-GFP侵染的牡丹幼苗植株进行荧光观测，其叶片和根部均发现了GFP荧光。在叶片的叶脉附近观察到GFP荧光，表明病毒载体的移动以及在牡丹叶片中的传播。同样，在根系组织中也观察到GFP荧光。为了进一步证实TRV-GFP的成功侵染，通过Western blot分析来检测GFP蛋白的积累情况，可以看出，在侵染植株的叶片和根部均检测到GFP蛋白，且根部的GFP蛋白的积累量要高于叶片中的。这些结果表明，TRV可以用于构建能够在牡丹幼苗各组织中高效的复制和传播的重组载体。这也为检测病毒载体在牡丹植株各组织的移动情况提供了可能，从而代替复杂的生化或分子实验。
参见图4，TRV-PDS侵染四周后，新生叶片开始出现光漂白的现象，老叶无明显变化。空载体侵染的植株，叶缘出现焦枯症状，可能是由于叶片被TRV侵染后失水所导致的(TRV-PDS侵染后，老叶也存在焦枯症状)。以上结果表明TRV载体介导的VIGS方法可以调控牡丹发育过程中的内源基因。
参见图5，对经过侵染处理的牡丹幼苗叶片进行病毒载体半定量检测，TRV1、TRV2均被检测到。然而在未处理牡丹幼苗的叶片中并未检测到TRV1、TRV2的转录本。由于PDS插入到TRV2载体上，较大的PCR产物在TRV-PDS侵染的组织扩增得到。参见图6，从定量结果看，相比于对照组，PDS的表达量在侵染TRV-PDS的叶片中有明显的下降。
总之，本发明首次利用TRV病毒载体、以及基于TRV病毒载体构建的TRV-PDS、TRV-GFP等载体对牡丹幼苗进行侵染，牡丹叶片出现漂白，叶片和根组织发荧光等症状，以上结果证明了本发明提出的牡丹幼苗整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默的侵染方法，能够实现TRV病毒载体对牡丹幼苗的侵染以及对牡丹幼苗中目的基因的沉默。本发明为研究牡丹等木本植物生长发育过程中各个组织相关基因的功能提供了一种简单、快速、低成本的方法。
<110> 西北农林科技大学
<120> TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagccgattt gatttccttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccttgttttc tcatccagtc 20

Claims (8)

1.一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：该侵染牡丹幼苗的方法包括以下步骤：
1)将病毒载体TRV1以及TRV2或者将病毒载体TRV1以及插入有目的基因或报告基因的重组TRV2分别转化农杆菌，将转化得到的含有TRV1的阳性农杆菌与含有TRV2或重组TRV2的阳性农杆菌经培养后于侵染缓冲液中混合，得转化菌液；
2)对牡丹幼苗进行清洗、消毒；
3)将经过清洗及消毒后的牡丹幼苗整株浸入转化菌液，然后进行真空侵染；
4)经过步骤3)后，将牡丹幼苗从转化菌液中取出并重新移栽，然后采用以下条件进行培养：温度为21～25℃，湿度为60～70％，光照强度为1800～2000Lx。
2.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述侵染牡丹幼苗的方法还包括以下步骤：在牡丹幼苗培养过程中对牡丹幼苗进行表型观测，并定量检测牡丹幼苗各器官中目的基因表达情况。
3.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述牡丹幼苗选自2～3年生牡丹植株。
4.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述转化采用冻融法。
5.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述侵染缓冲液包括以下组分：10mM 2-吗啉乙磺酸、100μM乙酰丁香酮及10mM MgCl2。
6.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：将对应阳性农杆菌培养至OD600值为0.6～0.8后，经侵染缓冲液重悬并调节OD600为1～1.5，然后按照体积比为1:1进行混合。
7.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述真空侵染的条件为：于侵染过程中抽真空，压力为70～100KPa，侵染时间为15～20min。
8.根据权利要求1所述一种TRV载体介导的病毒诱导基因沉默系统侵染牡丹幼苗的方法，其特征在于：所述报告基因选自荧光报告基因，所述目的基因选自牡丹八氢番茄红素脱氢酶基因。
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