CN114107374A

CN114107374A - 一种鸢尾科植物红葱vigs沉默体系的构建方法及其应用

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Publication number: CN114107374A
Application number: CN202111408255.8A
Authority: CN
Inventors: 王丛丛; 林国森; 何春梅; 王洪峰; 苏凌业; 徐明锋
Original assignee: Guangdong Academy of Forestry
Current assignee: Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN114107374B

Abstract

本发明公开了一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。本发明以烟草脆裂病毒TRV作为VIGS体系的载体，以红葱八氢番茄红素脱氢酶基因作为目的基因，利用真空渗透处理方法成功创建了适合红葱的VIGS沉默体系；将该体系应用于开展红葱色素合成相关基因EbMYB5和EbMYB52基因功能研究，被侵染的沉默处理组样品叶片中EbMYB5、EbMYB52基因表达量显著降低，且与色素合成途径相关的关键基因表达量呈现出不同程度的显著变化，表明本发明的红葱VIGS沉默体系可以成功应用于红葱基因功能验证。本发明构建的红葱VIGS沉默体系对于红葱基因功能研究具有重要意义。

Description

一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。

背景技术

鸢尾科植物红葱(Eleutherine bulbosa(Mill.)Urb.)原产于西印度群岛、美洲等地，后经云南民间引入栽培，发展成为云南、广西等西南地区传统民间药用植物。红葱具有抗菌、消炎等多重功效(Padhi and Panda,2015)，亦可作为野菜食用(潘俊等,2011；王晓艺等,2015；徐巧林等,2014)。鸢尾科红葱与人们熟知的蔬菜葱科葱属植物红葱(香葱)(Allium ascalonicumL.)，在其鳞茎外观、名称均相似，易被混淆。上世纪80年代已经开展了对红葱化学成分和药理活性的研究，目前从红葱中分离得到的化合物主要有萘酚、萘醌、蒽醌及其衍生物、甾体、葡萄糖苷及其他小分子类化合物(Gallo et al.,2010；Han etal.,2008；段文娟等,2016；邱峰等,2005)。红葱其化学成分具有多种药理作用，包括血管舒张、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等一系列的活性(Padhi and Panda,2015；Kamarudin et al.,2020；Nugrohoet al.,2018)。红葱的红色素色泽纯正柔和，作为天然红色素的来源具有广阔的发展前景；其中蒽醌类是提取物红色素的主要成分，可为新型天然红色素的开发供理论依据。红葱提取物应用广泛，在食品加工、功能食品、植物饲料添加剂、功能性化妆品、植物源药品等方面有很好的应用前景(何云等,2014)。

虽然红葱化学成分及药理活性方面早有研究开展(Jiang et al.,2018；徐晓梅等,2018)，但是关于其分子生物学方面的研究甚少，特别是基因序列信息的匮乏和自身遗传转化体系尚未构建，导致其基因表达分析、功能研究及有效活性成分合成机理等研究相对滞后。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是一种RNA介导的防御机制，即转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)，是植物体内普遍存在的遗传免疫机制。该技术利用携带植物功能基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默从而引起表型改变，以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与转基因等方法相比，VIGS具有简便高效、周期短、可沉默基因家族、不需获取转基因植株、高通量等优点，同时可在不同遗传背景的植物间进行基因功能比较，是研究功能基因组和特定基因功能的有效工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用。

因此，本发明的第一个目的是提供一种红葱VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

a.将红葱目的基因特异性片段连接至pTRV2载体的多克隆位点上，获得pTRV2-目的基因特异性片段重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，获得pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌，培养收集菌体备用；

b.用缓冲液分别将pTRV1农杆菌、pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌的菌体重悬分散制成农杆菌菌液，然后将pTRV1农杆菌菌液与pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌菌液混合为侵染液；

c.将红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，进行真空渗透处理；

d.用无菌水清洗植株上多余的侵染液，然后将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常培养，构建得到红葱的目的基因VIGS沉默体系。

优选，所述的缓冲液含有10mM MES、200μM乙酰丁香酮和10mMMgCl₂，余量为水，pH5.6。

优选，所述的pTRV1农杆菌菌液、pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌菌液的OD600＝1，pTRV1农杆菌菌液与pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液。

优选，所述的用于真空渗透处理的红葱植株为6～8个月生长期的红葱植株。

优选，所述的真空渗透处理为：于真空渗透装置中，在真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s，随后缓慢放气恢复正常气压；然后重复上述步骤一次。

优选，所述的红葱VIGS沉默体系的构建方法，还包括对照，所述的对照是用pTRV2农杆菌替换pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌，其余步骤均相同。以空白侵染液真空渗透处理的红葱植株为对照，观察侵染液真空渗透处理的红葱植株表型，检测目的基因表达情况。

本发明还提供红葱VIGS沉默体系的构建方法在研究红葱色素合成相关基因功能中的应用。

本发明还提供一类红葱色素合成相关功能基因，为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的八氢番茄红素脱氢酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的EbMYB5基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的EbMYB52基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的查尔酮异构酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的查尔酮合成酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的无色花色素双加氧酶基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的黄酮糖基转移酶基因和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的类黄酮3’-羟化酶基因。

本发明中，筛选侵染范围比较广泛的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)作为VIGS体系的载体。TRV是广泛应用于各种植物物种中最常见的病毒载体，它具有侵染后症状较轻、基因沉默效率高、可在多个组织产生沉默且效果长久等优点。

本发明以红葱八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因作为目的基因来创建适合红葱的VIGS沉默体系；八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase，PDS)基因调控类胡萝卜素合成途径，PDS是类胡萝卜素合成途径的一个中间体，当PDS被沉默后，植物体的类胡萝卜素合成受抑制，植物呈现光漂白现象。利用基于TRV病毒的VIGS表达载体(图1)，创建红葱整体植株VIGS沉默体系。本发明在红葱中建立病毒诱导的VIGS实验体系，VIGS沉默体系的建立对于红葱基因功能研究具有重要意义。

附图说明

图1是烟草脆裂病毒TRV的VIGS载体图谱，包括图A的pTRV1载体和图B的pTRV2载体。

图2是EbPDS与其他物种氨基酸序列比对分析；注：AtPDS，拟南芥PDS基因；NoPDS，西洋菜PDS基因；BnPDS，油菜PDS基因；BoPDS，芥蓝PDS基因；SlPDS，番茄PDS基因。

图3是EbPDS目的片段克隆；注：M，Marker；1、2泳道为EbPDS目的片段条带。

图4是VIGS沉默红葱植株pTRV2-EbPDS PCR鉴定；注：M，Marker；1、2、3泳道为沉默红葱植株生物学重复样。

图5是EbPDS基因相对表达水平；注：CK为空白对照组；EbPDS为处理组；竖线柱表示标准误(n＝5)，T-检验，*表示同列数据间在P≤0.05水平上差异显著。

图6是pTRV2-EbPDS沉默的红葱植株叶片表型；其中，图A为对照组红葱样品叶片；图B为pTRV2-EbPDS处理组红葱叶片出现漂白表型。

图7是TRV2-EbMYB5和TRV2-EbMYB52沉默红葱植株表型；其中，图A：对照组红葱植株；图B、C：TRV2-EbMYB5处理组红葱植株；图D：对照组红葱植株；图E、F：TRV2-EbMYB52处理组红葱植株。

图8是TRV2-EbMYB5和TRV2-EbMYB52 PCR鉴定；注：M，Marker；图A：泳道1、2、3为TRV2-EbMYB5处理红葱植株生物学重复样，图B：泳道1、2、3为TRV2-EbMYB52处理红葱植株生物学重复样。

图9是TRV2-EbMYB5沉默植株后目的基因及其他色素合成相关基因表达水平；其中，图A为EbMYB5转录因子表达水平；图B为查尔酮异构酶(CHI)表达水平；图C为查尔酮合成酶(CHS)表达水平；图D为黄酮糖基转移酶(UFGT)表达水平；图E为无色花色素双加氧酶(LDOX)表达水平；图F为类黄酮3’-羟化酶(F3’H)表达水平。

图10是TRV2-EbMYB52沉默植株后目的基因及其他色素合成相关基因表达水平；注：图A为EbMYB52转录因子表达水平；图B为查尔酮异构酶(CHI)表达水平；图C为查尔酮合成酶(CHS)表达水平；图D为黄酮糖基转移酶(UFGT)表达水平；图E为无色花色素双加氧酶(LDOX)表达水平；图F为类黄酮3’-羟化酶(F3’H)表达水平。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：红葱PDS基因VIGS体系建立

一、方法

(1)菌种

大肠杆菌DH5α感受态细胞(产品规格CAT#:DL1001)与农杆菌GV3101感受态细胞(产品规格CAT#:AC1001)购于上海唯地生物技术有限公司；pTRV1载体(货号：BiovectorPTRV1)、pTRV2载体(货号：BioVectorPTRV2)购自普如汀生物技术(北京)有限公司。

(2)试剂

RNA提取试剂盒：北京华越洋超快型植物RNA提取试剂盒；反转录试剂盒：StarScript IIcDNA第一链合成预混试剂(含去基因组)；DNA胶回收试剂盒：DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒；质粒提取试剂盒：SanPerp柱式质粒DNA小量抽提试剂；酶切与连接：ClonExpressII One Step Cloning Kit。

(3)实验过程

①为验证VIGS体系在研究红葱基因功能方面的可行性，利用八氢番茄红素脱氢酶(PDS)进行VIGS体系建立，PDS是类胡萝卜素合成途径的一个中间体，当PDS被沉默后，植物体的类胡萝卜素合成受抑制，植物呈现光漂白现象。本发明根据NCBI上公布的拟南芥AtPDS基因序列，利用本地Blast软件检索红葱全长转录组数据库中的同源基因，并与已报道的几个物种的PDS基因进行比对，筛选出红葱的EbPDS，利用Primer5.0设计红葱EbPDS的VIGS实验用载体构建引物，正向引物F(5’-3’)：TACCGAATTCTCTAGACACATATTCTTTGGAGCTTATCCC；反向引物R(5’-3’)：CTTCGGGACATGCCCGGGATCCATGTTTTTCCTGAAGAAAAC，使用PrimerstarMaxPremix(2×)高保真酶对EbPDS目的片段进行特异性扩增。

②pTRV2病毒载体线性化：

pTRV2病毒载体的限制性酶切位点选择SmaⅠ和XbaⅠ，限制性酶切反应体系如下(表1)；

表1 pTRV2载体酶切反应体系

体系中依次加入DEPC-ddH₂O、质粒DNA、0.1％BSA、10×Buffer、SmaⅠ和XbaⅠ，混匀体系，短暂离心；在PCR仪中进行反应，37℃、60min。反应结束后，加入3倍体积的异丙醇混匀，平放于4℃冰箱，静置4h，12000g离心10min收集pTRV2线性化载体，倒掉上清液，加入100μL DEPC-ddH₂O稀释备用。

③pTRV2线性化病毒载体与目的片段连接：

按照ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒操作说明，连接反应体系如下(表2)；

表2连接反应体系

使用移液枪吸打混匀体系，短暂离心后，在PCR仪中进行反应，37℃、30min；反应结束后，获得的pTRV2-EbPDS重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌DH5α；阳性菌落鉴定及转化农杆菌，获得含有pTRV2-EbPDS重组质粒的农杆菌。

④农杆菌侵染液准备

取-80℃保存的菌种以1/100的比例于1mL LB液体培养基中进行活化摇菌，28℃、200rpm，2h后取150μL于LB培养基固体平板(25mg/L Rif+50mg/L Kana)上涂布培养12-16h；挑取单克隆于5mL LB液体培养基(25mg/L Rif+50mg/L Kana)中，28℃、220rpm过夜培养，12-16h；将1mL过夜培养的农杆菌液接种至200mL LB液体培养基(25mg/L Rif+50mg/LKana)中，分别摇菌pTRV1、pTRV2、pTRV2-EbPDS农杆菌液，于28℃、220rpm培养至OD600＝1～2；5000rpm离心10min收集菌体，配制侵染液：用缓冲液(每100mL无菌水加入1mL 1M MES(终浓度10mM)、400μL乙酰丁香酮(终浓度200μM)、1mL MgCl₂(终浓度10mM))重悬菌体至OD600＝1，pH调至5.6；将OD600＝1的pTRV1农杆菌菌液与OD600＝1的pTRV2农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液(作为对照，不含EbPDS目的片段)、将OD600＝1的pTRV1农杆菌菌液与OD600＝1的pTRV2-EbPDS农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液，20℃放置4h后，进行侵染。

⑤pTRV2-EbPDS农杆菌侵染红葱植株

1、注射法侵染：无菌注射器(无针头)吸取pTRV1农杆菌菌液与pTRV2-EbPDS农杆菌菌液的混合侵染液，从叶背面注射，每株红葱注射3片成熟叶；以pTRV1农杆菌菌液与pTRV2农杆菌菌液的混合侵染液注射组为对照。接种后26℃避光培养2d，转入光照培养箱，培养条件：22℃/16h光照、20℃/8h黑暗，持续观察。由于红葱属于单子叶植物，叶片表皮光滑，注射法侵染过程压力过小无法注入叶片内部，注射压力过大会造成注射口区域叶片可见性损伤。

2、真空法侵染：将6～8个月生长期的红葱植株洗净，吸干表面水分，完全浸泡于侵染液中，侵染液对照组为pTRV1农杆菌菌液与pTRV2农杆菌菌液的混合侵染液、实验组为pTRV1农杆菌菌液与pTRV2-EbPDS农杆菌菌液混合侵染液。利用真空渗透装置(真空泵型号：品牌：台湾洛科Rocker，型号：Rocker410；)，使植株在侵染液中保持，真空处理方法分别设计：a，真空渗透30s，渗透1次；b，真空渗透30s，渗透2次；c，真空渗透60s，渗透1次；d，真空渗透60s，渗透2次；渗透处理过程设置为，以真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s、1min，随后缓慢放气，恢复正常气压(真空渗透2次时，重复操作)。用无菌水清洗植株上多余的菌液。将植株于20℃下黑暗培养24h，25℃黑暗条件下平衡24h，随后正常光照培养，期间观察红葱植株表型变化。

⑥EbPDS基因沉默对红葱植株表型的影响及检测

VIGS侵染处理后的红葱植株正常培养2周左右，观察记录pTRV2-EbPDS处理的植株表型变化，比较pTRV1与pTRV2的混合侵染液沉默植株和pTRV1与pTRV2-EbPDS混合侵染液沉默植株叶片表型变化，包括叶色、叶斑和叶片衰老等表型变化。同时，以沉默植株内是否含有TRV病毒为依据，分别提取对照组植株叶片、实验组具有沉默表型的植株叶片总RNA、逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板，分别用JC-pTRV2跨越酶切位点两端的特异性检测引物，正向引物F(5’-3’)：GGACATTGTTACTCAAGGAAGCAC，反向引物R(5’-3’)：GTCGAGAATGTCAATCTCGTAGG)、pTRV2-PDS目的片段的载体构建引物：正向引物F(5’-3’)：TACCGAATTCTCTAGACACATATTCTTTGGAGCTTATCCC；反向引物R(5’-3’)：CTTCGGGACATGCCCGGGATCCATGTTTTTCCTGAAGAAAAC，两种特异性引物进行PCR分子检测，检测pTRV2、pTRV2-EbPDS是否成功导入植株，并分析沉默表型是否是TRV病毒所诱导。

⑦qRT-PCR分析EbPDS基因的表达

为了研究pTRV2-EbPDS沉默植株的效果，利用qRT-PCR检测红葱沉默样品中EbPDS的相对表达水平，EbPDS的qRT-PCR检测引物如下：引物序列5’-3’，F：ACTTTGCCTCCCAGAACATCTCTTG，R：CGGTTTGGCTGGACTATCTACTGC。

二、结果

(1)EbPDS氨基酸序列比对分析

以拟南芥AtPDS进行Blastx比对，筛选获得红葱全长转录组数据库中的同源序列EbPDS(八氢番茄红素脱氢酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，使用DNAMAN将EbPDS与几种植物已知PDS基因进行多序列比对，黑色阴影区域代表非常保守，灰色阴影区域代表相对保守，图中氨基酸序列标记黑色阴影的占大比例，说明红葱EbPDS与拟南芥AtPDS、西洋菜NoPDS、油菜BnPDS、芥蓝BoPDS和番茄SlPDS氨基酸序列同源性非常高，如(图2)。

(2)目的基因片段扩增及载体构建

以红葱混合样cDNA为模板，通过同源克隆的方法，扩增获得目的基因序列片段(图3)，其中红葱的EbPDS目的片段扩增产物大小为448bp。

(3)EbPDS基因沉默红葱植株的基因表达分析

使用pTRV2-EbPDS重组病毒载体的农杆菌对红葱植株进行侵染后14天，使用JC-pTRV2、pTRV2-PDS引物进行PCR分子检测，检测TRV病毒是否可以成功侵染红葱植株，结果表明注射法叶片内未检测到目的基因，而真空法仅处理b(真空渗透30s，渗透2次)的叶片内可检测到目的基因导入，说明TRV病毒成功进入红葱体内并存活，真空法检测结果(图4)表明，pTRV2-EbPDS成功导入植株。

在真空渗透侵染法中，对PDS基因沉默红葱的叶片和pTRV2对照组处理的红葱叶片分别进行叶片的总RNA提取。qRT-PCR分析结果(图5)中，沉默处理组的EbPDS平均表达水平相比pTRV2对照组下降了54.4％，呈显著下降。表明真空处理b法(真空渗透30s，渗透2次)沉默处理后，红葱EbPDS基因的表达受到抑制，说明真空渗透30s，渗透2次可以实现TRV病毒沉默红葱植株的目标基因。

(4)沉默红葱植株的表型分析

八氢蕃茄红素脱氢酶(PDS)是类胡萝卜素合成途径的关键酶，PDS基因沉默后叶片会出现光漂白现象。使用真空法进行VIGS处理后，4种真空渗透处理中，(a，真空渗透30s，渗透1次；b，真空渗透30s，渗透2次；c，真空渗透60s，渗透1次；d，真空渗透60s，渗透2次；)仅处理b(真空渗透30s，渗透2次)出现光漂白表型。对成功出现漂白表型的红葱植株，红葱叶片显现不同程度的变化，叶片失绿，出现光漂白表型，叶片中间部位主要开始出现白化现象，而叶斑则在靠近叶梢处呈现(图6)。对照组红葱植株叶片未见光漂白表型，此结果表明，使用真空渗透法，设置真空渗透30s，渗透2次，TRV病毒介导的VIGS体系可将红葱PDS基因成功沉默。

本发明中首次利用八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因，验证VIGS体系可应用于红葱，并构建了pTRV2-EbPDS的VIGS沉默载体，对红葱植株进行沉默处理，结果表明VIGS体系可以成功应用于红葱基因功能验证。实验中进行真空渗透处理方法的探索，设计了2个影响因素，分别为真空渗透时间、真空渗透次数。实验结果中，处理b，真空渗透30s，渗透2次，这一真空处理后，红葱植株出现了光漂白表型，其他三个处理均未出现光漂白表型。

实施例2：利用VIGS体系开展红葱EbMYB5和EbMYB52基因功能研究

1、EbMYB5和EbMYB52引物设计及载体构建

载体构建方法同实施例1。EbMYB5(该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和EbMYB52(该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)，在VIGS实验中，pTRV2-EbMYB5的载体构建使用引物：引物序列5’-3’F:TACCGAATTCTCTAGAGTGTGGCACACCCACTTAAAG；R:CTTCGGGACATGCCCGGGTCAGATATCAGGCAATTCCAGAG，目的片段长度300bp。pTRV2-EbMYB52的载体构建使用引物：引物序列5’-3’F:TACCGAATTCTCTAGACGACCCGTGTCCGTCGCCTCCCC；R:CTTCGGGACATGCCCGGGTCATGATCTATAGTATCTAATCAC，目的片段长度351bp。在pTRV2载体中选用的酶切位点均为Xba I：TCTAGA，上游；Smal I：CCCGGG，下游。利用VIGS技术沉默后，分别侵染得到TRV2-EbMYB5或TRV2-EbMYB52沉默红葱植株，利用实时荧光定量(所用引物如表3中所示)分析沉默后红葱植株中色素合成相关的EbMYB5和EbMYB52基因的表达水平。另外，选择红葱花色素苷生物合成的其他关键酶基因，分别为查尔酮异构酶基因(CHI，该基因核苷酸序列如SEQID NO.5所示)、查尔酮合成酶基因(CHS，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、无色花色素双加氧酶基因(LDOX，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、类黄酮3’-羟化酶基因(F3’H，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、黄酮糖基转移酶基因(UFGT，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)等色素合成相关基因进行检测，引物见表3。

表3 VIGS qRT-PCR引物表

2、利用VIGS体系进行EbMYB5和EbMYB52基因沉默

利用实施例1筛选的优化的真空转化法侵染红葱植株，侵染后，于25℃、16h/8h光照/黑暗、相对湿度75％的人工气候箱中培养2～3周后进行表型观察(图7)。

对EbMYB5、EbMYB52基因沉默红葱植株进行取样，利用跨越所选载体酶切位点两端通用的检测引物JC-pTRV2(引物序列5’-3’，F：GGACATTGTTACTCAAGGAAGCAC，R：GTCGAGAATGTCAATCTCGTAGG)检测沉默植株中的TRV2-EbMYB5和TRV2-EbMYB52成功导入植株(图8)。

采用表3中的实时荧光定量引物检测非沉默样品(CK)、沉默对照组样品(TRV2)和沉默处理组样品(TRV2-EbMYB5)的EbMYB5、EbMYB52基因表达水平(图9，图10)，与红葱非沉默样品、以及沉默对照组叶片相比，沉默处理组样品被侵染的叶片中EbMYB5、EbMYB52基因表达量显著降低。花色素苷生物合成的关键酶查尔酮异构酶(CHI)、查尔酮合成酶(CHS)、无色花色素双加氧酶(LDOX)、黄酮糖基转移酶(UFGT)的基因表达水平也显著降低。类黄酮3’-羟化酶(F3’H)基因表达水平却出现上调。在分子水平上说明红葱VIGS成功沉默EbMYB5、EbMYB52基因后，对红葱花色素苷生物合成的途径产生了一定的影响。

序列表

<110> 广东省林业科学研究院

<120> 一种鸢尾科植物红葱VIGS沉默体系的构建方法及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 546

<212> PRT

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 1

Met Asn Leu Ala Gly Phe Ala Ser Ser Glu Cys Met Gly Tyr Pro Leu

1 5 10 15

Thr Leu Arg Ala Pro Val Ser Ser Ser Phe Pro Lys Arg Lys Val Gly

20 25 30

Ser Ser Thr Leu Lys Val Phe Cys Lys Asp Phe Pro Arg Pro Glu Leu

35 40 45

Asp Ser Ala Val Asn Phe Leu Glu Ala Ala Gln Phe Ser Ser Ser Phe

50 55 60

Arg Ser Ala Pro Arg Pro Lys Lys Pro Leu Glu Val Val Ile Ala Gly

65 70 75 80

Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr Ala Lys Tyr Leu Ala Asp Ala Gly

85 90 95

His Ile Pro Ile Leu Leu Glu Ala Arg Asp Val Leu Gly Gly Lys Val

100 105 110

Ala Ala Trp Lys Asp Lys Asp Gly Asp Trp Tyr Glu Thr Gly Leu His

115 120 125

Ile Phe Phe Gly Ala Tyr Pro Asn Val Gln Asn Leu Phe Gly Glu Leu

130 135 140

Gly Ile Asp Asp Arg Leu Gln Trp Lys Glu His Ser Met Ile Phe Ala

145 150 155 160

Met Pro Asn Lys Pro Gly Glu Phe Ser Arg Phe Asp Phe Pro Glu Val

165 170 175

Leu Pro Ala Pro Leu Asn Gly Ile Trp Ala Ile Leu Arg Asn Asn Glu

180 185 190

Met Leu Thr Trp Pro Glu Lys Val Arg Phe Ala Ile Gly Leu Leu Pro

195 200 205

Ala Met Leu Gly Gly Gln Ser Tyr Val Glu Ala Gln Asp Gly Leu Thr

210 215 220

Val Lys Glu Trp Met Lys Arg Gln Gly Val Pro Asp Arg Val Asn Asp

225 230 235 240

Glu Val Phe Ile Ala Met Ser Lys Ala Leu Asn Phe Ile Asn Pro Asp

245 250 255

Glu Leu Ser Met Gln Cys Ile Leu Ile Ala Leu Asn Arg Phe Leu Gln

260 265 270

Glu Lys His Gly Ser Lys Met Ala Phe Leu Asp Gly Asn Pro Pro Glu

275 280 285

Arg Leu Cys Met Pro Ile Val Asp His Ile Gln Ser Leu Gly Gly Gln

290 295 300

Val His Leu Asn Ser Arg Ile Gln Lys Ile Glu Leu Asn Ser Asp Gly

305 310 315 320

Thr Val Lys His Leu Ser Leu Ser Gly Gly Asn Ile Ile Ser Gly Asp

325 330 335

Val Tyr Val Ser Ala Thr Pro Val Asp Ile Phe Lys Leu Leu Val Pro

340 345 350

Gln Glu Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Phe Lys Lys Leu Asp Lys Leu Val

355 360 365

Gly Val Pro Val Ile Asn Val His Ile Trp Phe Asp Arg Lys Leu Arg

370 375 380

Asn Thr Tyr Asp His Leu Leu Phe Ser Arg Ser Pro Leu Leu Ser Val

385 390 395 400

Tyr Ala Asp Met Ser Val Thr Cys Lys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Arg

405 410 415

Ser Met Leu Glu Leu Val Phe Ala Pro Ala His Glu Trp Ile Ser Cys

420 425 430

Ser Glu Ser Glu Ile Ile Asp Ala Thr Met Asn Glu Leu Ala Lys Leu

435 440 445

Phe Pro Asp Glu Ile Ser Ala Asp Gln Ser Lys Ala Lys Ile Leu Lys

450 455 460

Tyr His Val Val Lys Thr Pro Arg Ser Val Tyr Lys Thr Val Pro Gly

465 470 475 480

Cys Glu Pro Cys Arg Pro Leu Gln Arg Ser Pro Val Glu Gly Phe Tyr

485 490 495

Leu Ala Gly Asp Tyr Thr Lys Gln Lys Tyr Leu Ala Ser Met Glu Gly

500 505 510

Ala Val Leu Ser Gly Lys Leu Cys Ala Gln Ala Ile Val Gln Asp Tyr

515 520 525

Asp Leu Leu Ala Ala Arg Arg Glu Lys Arg Ala Arg Ala Glu Met Thr

530 535 540

Val Ala

545

<210> 2

<211> 1641

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 2

atgaatctcg cggggttcgc gagcagcgag tgcatgggat accccttgac cttgagagct 60

ccagtttcgt cctccttccc gaaacggaaa gtcggcagca gcactctgaa ggtcttctgc 120

aaggatttcc ctcggcccga actcgatagc gccgtaaatt ttctagaagc tgctcagttc 180

tcttcgtctt tccgatcagc tccccgcccc aagaaaccgc tcgaggtcgt gattgccggt 240

gccggtttgg ctggactatc tactgcaaaa tatcttgctg atgcaggcca tatacctata 300

ttgctggagg caagagatgt tctgggaggc aaagttgctg catggaagga caaggatgga 360

gattggtacg agacaggcct ccacatattc tttggagctt atcccaacgt gcagaacttg 420

ttcggagaac ttggaattga tgatcgtctg caatggaagg aacattctat gatttttgca 480

atgccaaaca agccaggaga gttcagccgc ttcgattttc ctgaggttct tcctgcaccg 540

ttaaatggaa tttgggccat cttaagaaac aacgaaatgc tgacttggcc agagaaagtg 600

agatttgcta ttggactatt accagctatg cttgggggac agtcttacgt cgaggctcaa 660

gacggtttaa ctgttaagga gtggatgaaa aggcagggtg tgcctgaccg agtcaatgat 720

gaagttttca tcgccatgtc taaggctctt aatttcataa acccagacga gctttctatg 780

cagtgcattt taatcgcttt aaatcgtttt cttcaggaaa aacatggatc taaaatggcc 840

ttcttggatg gaaatccacc tgagaggcta tgcatgccaa ttgttgatca cattcagtca 900

ctgggtggcc aggtccacct aaactcacgc atacaaaaga ttgagctgaa ctctgatgga 960

acagtgaagc acctttcact cagcggtggg aatattatca gtggagatgt ttatgtctcc 1020

gctactccag ttgatatctt taagcttctt gtgcctcaag aatggagtga aatttcttat 1080

ttcaaaaagt tggacaagct agtgggagtc ccggtgatca atgtccatat ttggttcgac 1140

aggaagctaa gaaatacata tgaccacctc cttttcagca ggagtcctct tctaagtgtc 1200

tatgcagaca tgtctgtgac ttgcaaggaa tattatgatc ctaaccgctc tatgctggag 1260

ttagtttttg ctccagcaca tgaatggatc tcatgcagtg agagtgaaat cattgatgct 1320

accatgaatg agctggcaaa gctatttcct gatgaaatat ctgcagatca gagtaaagcc 1380

aaaattttga agtatcatgt tgttaaaaca ccaagatctg tatacaaaac tgttcctggc 1440

tgtgaaccat gccgcccatt gcagagatct ccagtcgaag ggttctacct ggctggtgat 1500

tacacgaagc aaaagtattt agcttccatg gagggtgctg ttttatctgg aaaactttgt 1560

gcacaagcta ttgtacagga ttatgacttg ctggctgcac ggagggaaaa gcgtgcccga 1620

gcagagatga ccgttgccta g 1641

<210> 3

<211> 861

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 3

agagtactat aagagataca tagagagaga gagagagaga gagagagaat tacaatggtg 60

agagctccgt gctgcgagaa gatgggcctg aagaagggcc cgtggacgcc ggaggaggac 120

caggtgctcg tcgcgtacat caccaagttc ggccacggca actggcgcgc tctgcccaaa 180

caagccggac tcttgaggtg cggcaagagt tgcaggctgc gatggacgaa ctacctgcgg 240

ccggatatca aaagaggaaa ctttacaaga gaagaagagg agacgatcat caatttgcat 300

gaaatgctgg gaaatagatg gtctaggatt gcggcaaagc tgccggggag gaccgacaac 360

gagatcaaga acgtgtggca cacccactta aagaaacggc tcgcttcgtg cgagccggcc 420

gttgaatcgc ccaagcgaag aatcaagaaa agcgtggtat cggatcagtc cccagcacgg 480

tcgtacagcg aggatgtatc gacggagagc aacgagtcgg ggacgaaaga agagtgcacg 540

gattcgttag aagggttccc tgaaatcgac gagtgcttct ggtccgacgc gctgtggacg 600

gattattgtg ctgattatgg ctctgttacc gatccgtttg ccgatagtaa tggcgaagat 660

atgagttact ggttgaaggt gttcatggaa gccggtgaat ctctggaatt gcctgatatc 720

tgaatttttg aagtattgcg aaatcgaaag aaatcgtgag gagaataatt tgagagtaga 780

ttaggggtta gaatggagta gaaactaaca ttgtaagaag acttgattct tcaaaaaatg 840

aggaatttgt atggtgtttg c 861

<210> 4

<211> 820

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 4

gaagggcgat cgatagcagg aaaggaatgg gaaggtcccc gtgctgcgag aaggctccac 60

gaacaagggg gcgtggacca aggaggagga cgagcggctg gtgtcctaca tccgggccca 120

cggggagggg tgctggcggt ccctaccgaa ggccgcgggc ctctcgcgct gcggcaagag 180

ctgccgcctc cgctggatca actacctccg ccccgacctc aagcgcggca acttcaccga 240

cgacgaggac gagctcatca tcaagctcca cgccctcctc ggcaacaaat ggtcgcttat 300

tgccggacga ctgcccggga ggacggacaa cgagatcaag aactactgga acacccacat 360

aaagcggaag ctcctcagcc gcggcgtcga cccgcagacc caccgacccg tgtccgtcgc 420

ctcccccttc gctcccgtcg ccaagccgtt gtcgaccgtg gagtcggcgg aagagagcgg 480

aacgagcacg gacgagggag agcggtgtcc ggacctaaac ctggacctct ccatcagcct 540

gccctgcgct tcgtacgatc ggaaggaggc ggtggcggcg gcgacgggtt cggaggatgg 600

gagcgtatgc ttgtgctaca atttagtgtt tgggaggagt gagggatgca gttgccagag 660

agtgtcgaat cctcggcatg tgattagata ctatagatca tgatcaccct tgtaagatgg 720

gcaacacaaa ggctaaatta aattagggtt tgtattctac tgatccaacg taaatgtgtg 780

tatgtataat gtggttactc tactacttga aaaattattc 820

<210> 5

<211> 705

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 5

atgggagagg tgccattggc aataacagag ctcgaagtgg aaggagttgt cttccctcca 60

tccctctctc cgcccggttc ttccaagtcc catttcctcg gcggcgcagg tgtgagggga 120

atggagattg gcggcaactt cgtccgcttc acctccatcg gggtctattt ggagagcggt 180

acggcggtcg aggcgctcgc cgagaaatgg aaaggcaagt ctggggagga cctcgccgcc 240

tccctcgact tcttccgaga tatttctcta ggacaattcg agaaattcac gaaagtaacg 300

atgatcctcc cgctgaccgg caaacagtac gccgaaaagg tcagcgagaa ctgcgtggcc 360

atctggaagg caatcggaat ttacaccgac gcggaagccg cagccgtcga caagttcaag 420

caagtcttcg aaaaggagac gttcccgccc ggcgcctcca tcctcttcac ccattccccg 480

gccggttcgc ttacgattgc gttctccaag gacgggtcga ttcctgaagc cggcgctgcc 540

gtgatcgaga accggccgct gacgattggg gtcctggagt ctataatcgg cgagcacggc 600

gtatcacccg aggcgaagcg gagcctcgcg ctgcgagtgt cgagccttct gaatgatgtc 660

aaggacgcag aaaaagtcac ggcggaacaa accgtgagcg cgtga 705

<210> 6

<211> 999

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 6

atgtgcgaga agtccatgat taagaagcgg tacatgtacc taaccgagga cattctcagg 60

gacaacccta acatttgtgc ctacatggcc ccctccctcg acgcccgcca ggacatggtg 120

gtcgtcgagg tgccgaagct cgggaaggag gccgcgacga aggcaatcaa ggagtggggc 180

caggccaagt cgaagatcac ccatctggtc ttctgcacca ccagcggcgt cgacatgccc 240

ggcgctgact accagctcac ccgcctcctc ggcctccgcc cctccgtcaa gcgcctcatg 300

atgtaccagc agggctgctt cgccggcgac accgtgctcc gcgtcgcaaa ggacctcgcc 360

gagaacaacc gcggggctcg cgtccttgtc gtctgctccg agatcactgc agtcacgttc 420

cgcgggccct cggagtccca cctcgacagc atggttggac aggcgctgtt cggggacggc 480

gcagccgcgc tcatcgtcgg tgccgaccct gtcgagaacg tggagcggcc aatattcgag 540

atggtgtccg cggcgcagac gatactcccg gacagcgagg gggcgatcga tggccacctg 600

agggaagttg gccttacgtt ccacctgctc aaggacgtgc cggggttgat atcgaagaac 660

atcgagaaga gcctccagga ggcgttcaag ccgttgggga tcgcggactg gaactcgctg 720

ttctggatcg ctcacccggg aggcccggcg atactggacc aggtggaggc gaagatcggg 780

ctgaaggcag agaagctgag ggcgacgagg cacgtgctga gcgagtacgg caacatgtcg 840

agcgcgtgcg tgctcttcat actggacgag atgaggaagc ggtcggcgga ggaggggagc 900

gcgacaacag gggaaggtct ggagtgggga gtgctgttcg gattcgggcc ggggctgacg 960

gtggagacgg tggtgctgca cagcgttgcc acagcctga 999

<210> 7

<211> 867

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 7

atggccgacc tctccgccgc ctgcagagac tggggagcgc tccaggtcgt caaccacggc 60

gtacccatcg gcctcctcga cgccgtgagg tcgtgcggcc tcgccttctt cgccgcctcc 120

gctcccgaag agcgggcccg gtacgcgtgc gatccctcca agcccgcatc ggaggggtac 180

gggagccgta tgctctccaa ggacgacggg gtgctcgatt ggagggacta cttcgaccac 240

cacaccctcc ctgagtcgcg gcggaaccct agccgctggc cccacttccc tcccaattac 300

agagatgtca tggtagagta cagtgacatg atgaaagtcc ttgctcaaag gttgttacga 360

atgatatctg aaagtcttga tttaccatct acatatattg aagaggctgt tggggaagtc 420

taccaaaaca ttactatcag ttattattct ccctgccccc aaccggatct tgctctcggt 480

ttgcaagcac attctgatat gggtgccata actcttctta tacaagatga tgtgggtggt 540

cttgaggtac tgaaggatgg ggaatgggta ctggcacaac ctttgtctga tgccattatt 600

gtcattttgg ccgaccaaac tgagatcata accaatggca aatacagaag ttctgagcat 660

cgtgctgttg tgaacgccaa tcgtgcccgg ctctctgtgg caacgttcta cgacccagca 720

aagacgatga aaatatttcc cgcaccctta ctcatcacca agcaatcccc cctcaagtac 780

aaggaggttc tttatgggga ctacgtctct tcgtggtaca gcaagggccc tgagggaaag 840

cgcaatatcg atgccctcaa gatctaa 867

<210> 8

<211> 1440

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 8

atggaaaaag taggagttat cttcatgcca acccccggaa tcgggcatct gatctcgact 60

gtggagtttg ccaagtgcct cctcaagggc cgcgacggtg gccgcttctc ggttgctata 120

ttcacaatgc agagtccttt ggcttcgaac accgactcct acatcgagtc agtcgtctct 180

tcgggcttga acatcaactt tgaggagctc ccgcccgtcg aacctcctcc tacctctgac 240

acccagaaag gagagacatt cgtcagcctc ctcatcgagg ctcataaacc tgtcttcaag 300

gatgcggtct cgcggtacat ctcctcctct tcaactcccc gcgtcggtgc catagtcctc 360

gacttgtttt gcaccacgat gatcgacgta gcgaacgacc ttggcctccc gtcgtatata 420

ttcttcacgt ccactgccgc tatgctcagt cttatgctct atctgccttc ctattactca 480

cgggatgttg aaggggatat cgatctcccc ggcctccctc ctctcccgag gcagtatcta 540

ccattaatca tgagggacaa gaacgacgct gattgtgcaa aatttcttca gcatggccaa 600

cggttttggg aggccaaagg tataatagtg aacacctttg cagagctgga gtccgcatcg 660

ctaaaagcct tggcggacgg gaaatgcctg cctgaccatc caacgccgcc tgtctttgcg 720

gtggggcctt tgctcgcggt cgaccccatc aaggaggagc aggagaagca tgaactgatc 780

aagtggcttg atgagcaacc tcaggcttca gtggtgttct tatgctttgg aagttttggc 840

tgctttggta ttcctcagat taaggagatt gctgacgggc tagagaggag cggccacagg 900

ttcttgtggg ccataaggac gactcctaca caaaagtttc agatgcctac tgattgcgat 960

ctcgacgcgg tccttcccga tggattcttg aacagaattc acggcagggg ggtggtttgg 1020

ccaacctggg caccccaact ggagatactg gctcattcgt ccgtgggggc gttcgtgaca 1080

cactgcggat ggaactcgtg cttggagagc ttgtggttcg gggtgccgat gctcgggtgg 1140

ccgctctacg cggagcaaca cttgaatatg tttgagatga ggagggaact gggagtggcg 1200

ttggagctgg agttggacta cgagagaggg gggttcgtgg ggtcggagga agtggagagg 1260

ggagttaggg aggtgatggg ggagggcgag gaaggattga aggtgagaag aagggtgaaa 1320

gaaatgaaag acgcagcaag agaggcttta caagaaggag ggtcttcggt tgcgtccatg 1380

gagagcttcg tgcagaagct aatcaaggaa atgccgacgc gaggatgctt tagccagtag 1440

<210> 9

<211> 1134

<212> DNA

<213> 红葱(Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.)

<400> 9

atggctcctc caaccgctac gcctttcctc ccgaccgtct ccaccgagcc cacgctgcgc 60

gcgacgttcg tgcgcgacga ggacgagagg ccgaaggtgg cctacaacgt gttcagcagc 120

gaaatcccgg tgatatcgct cgcggggctc gacgagggga acgacggggg gaggaggagg 180

gcggaaatac gcgagagggt cgtggcggcg tgcgaggact ggggggtgtt ccaggtggtc 240

gaccacgggg tcgacgcggg gctggtcgcg gacatgacgc ggctcgcgcg ggagttcttt 300

gcgctgccgc ccgaggagaa gctgaggctc gacatgtccg gagggaagaa gggaggcttc 360

atcgtatcca gccacctcca gggagaagcc gtgcaggact ggagggagat cgtgacatac 420

ttctcttacc cgattaagtc ccgcgactac tcgcggtggc ccgacaagcc ggaggagtgg 480

cggtccgtga cggagaaata cagcgagaag ctgatggagc tggcgtgcaa gctactcggc 540

gtactctccg aagcgatggg actcgagacg gaagcactga cgaaggcctg cgtggacatg 600

gaccagaagg tggtggtcaa cttctacccg aagtgccccc aaccggacct cacgctcggc 660

ctcaagcgcc acaccgaccc cggcaccatc accctcctac ttcaagatca agtcggcgga 720

ctgcaagcca ccaaggacgg cggcaagacg tggatcaccg ttcaacccgt cgaaggcgcg 780

ttcgtcgtca acctcggcga ccatgggcac tacctgagca acggccgatt caagaatgcg 840

gaccaccagg cggtcgtgaa ctcgaactcc accaggctat cgatcgccac gttccagaac 900

cccgcaccgg acgcgatcgt gtacccgctg gcgattcggg agggcgagaa gccggtgctg 960

gaggagccga tcacgttcgc ggagatgtac aggaggaaga tgagccgcga cctcgagctc 1020

gcgaagctga agaagcaagc gaggttggag agcggggagg ctgcggccga gaaggtcgag 1080

gccaagcccg accccgtgcc gcaacccaaa ggcctcaatg agatcctggc atga 1134

Claims

1.一种红葱VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的缓冲液含有10mM MES、200μM乙酰丁香酮和10mMMgCl₂，余量为水，pH 5.6。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的pTRV1农杆菌菌液、pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌菌液的OD600＝1，pTRV1农杆菌菌液与pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌菌液按体积比1：1混合为侵染液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的用于真空渗透处理的红葱植株为6～8个月生长期的红葱植株。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的真空渗透处理为：于真空渗透装置中，在真空度到达0.5～0.7atm后，保持30s，随后缓慢放气恢复正常气压；然后重复上述步骤一次。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括对照，所述的对照是用pTRV2农杆菌替换pTRV2-目的基因特异性片段农杆菌，其余步骤均相同。

7.权利要求1-6任一项所述的红葱VIGS沉默体系的构建方法在研究红葱色素合成相关基因功能中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的红葱色素合成相关基因为核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的八氢番茄红素脱氢酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的EbMYB5基因、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的EbMYB52基因、核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的查尔酮异构酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的查尔酮合成酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的无色花色素双加氧酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的黄酮糖基转移酶基因和核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的类黄酮3’-羟化酶基因。

9.一类红葱色素合成相关功能基因，其特征在于，为核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的八氢番茄红素脱氢酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的EbMYB5基因、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的EbMYB52基因、核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的查尔酮异构酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的查尔酮合成酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.7所示的无色花色素双加氧酶基因、核苷酸序列如SEQIDNO.8所示的黄酮糖基转移酶基因和核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的类黄酮3’-羟化酶基因。