CN109810988B - 一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法，具体公开了茄子花青素合成代谢相关基因SmANS和SmMYB1基因CDS序列在构建茄子果实VIGS体系中的应用，CDS序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明建立了一种高效快速的茄子果实病毒介导的基因沉默系统，可以用于茄子果皮色素代谢、果皮光泽和单性结实等果实重要性状调控基因功能验证分析。明确了环境温度、注射用果实大小、目的基因插入片段大小以及注射量对茄子果实VIGS体系的影响。本发明的基因沉默体系简便、快速、高效，可以应用到茄子果实发育及其它含花青素组织基因功能验证。

Description

一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法。

背景技术

病毒介导的基因沉默Virus Induced Gene Silence(VIGS)是用来揭示RNA介导的抗病毒防御机制，是一种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象，是植物体内固有的、普遍存在的遗传免疫机制。未加修饰的病毒侵染植物时，其机制是特异性的以病毒基因组为防御目标；但当寄主基因片段插入病毒载体时，其攻击目标增加了植物寄主基因片段相对应的mRNA。VIGS作为一种反向遗传学技术，近20年来广泛的应用于植物发育、生物逆境、非生物逆境、细胞代谢、信号传导等基因功能的研究。

茄子是以果实为商品的蔬菜作物，其果实发育过程中许多重要的功能基因决定着重要的农艺性状，如果皮花青素代谢途径上的基因决定着果皮颜色，单性结实性状相关基因决定着不良环境条件下茄子的坐果率等。

从已有报道来看，茄子上有关病毒介导的基因沉默基本上是以子叶(Liu HP,FDQ,Zhu BZ,et al.Virus-induced gene siliencing in eggplant(Solanum melongenaL.).Journal of Integrative Plant Biology,2012,54(6):422-429；赵祯，刘富中，张映等.茄子Sm MsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析.园艺学报，2015，42(8)：1495-1504)为受体，直接以茄子果实为VIGS受体组织尚未见相关报道。Fu等(Fu DQ,Zhu BZ,Zhu HL,etal.Virus-induced gene siliencing in tomato fruit.Plant journal,2005,43(2):299-308)利用改良的TRV载体研究发现与茄子同属茄科的番茄果实生物素合成或乙烯信号转导途径相关基因的沉默造成了果实颜色与细胞壁结构的改变，并且发现果实表现型的改变是由目的基因转录水平的减少所致。因此，开展茄子果实病毒介导的基因沉默研究，可以为茄子果实发育相关的重要性状基因功能验证提供快速有效的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法。

本发明利用自有的茄子转录组序列信息，从茄子果皮中扩增花青素合酶SmANS基因和转录因子SmMYB1的编码区。通过酶切连接重组技术，各构建了2个含SmANS和SmMYB1基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体。表达载体转入农杆菌GV3101后，用注射压迫法侵染茄子幼果。采用表型观察、和qPCR技术，评价构建的VIGS体系对SmANS和SmMYB1基因的沉默效果。

本发明所采取的技术方案是：

茄子花青素合成代谢相关基因SmANS和SmMYB1基因CDS序列在构建茄子果实VIGS体系中的应用，CDS序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中

SEQ ID NO.1：

ATGGTGAGTGAAGTGGTTCCAACTCCTTCAAGAGTTGAAAGCTTGGCTTAAAGTGGAATCCAGGTCATTCCTAAAGAGTATGTGAGGCCACAAGAAGAGTAAAATGGTATAGGAAACATCTTTGAGGAAGAGAAGAAAGAAGAAGGACCTCAAGTACCGACGATTAATCTGAAAGAAATTGACTCGGAGGACAAGGAAATTCGCGAAAAATGCCACCAAGAGCTGAAAAGAGCAGCCATGGAATGGGGTGTCATGCATCTTGTTAACCATGGCATATCAGATGAGCTAATTGATCATGTCAAGGTTGCCGGAGGTACCTTCTTTGATCTGCCTGTTGAAGAGAAGGAGAAGTATGCTAATGATCAACCCTCTGGTAATGTCCAAGGCTATGGAAGCAAGCTAGCAAATAATGGTTGTGGTCAACTTGAGTGGGAGGATTACTTCTTCCATTGTGTTTTCCCCGAGGACAAGCGCGATTTGGCCATCTGGCCTAAAACCCCTGCTGATTACATACTAGCAACAAGTGAATATGCAAAGCAGATCAGGAACCTAGCAACAAAGATTTTTGCAGTGCTTTCGATTGGGTTGGGATTGGAAGAAGGAAGACTAGAGAAGGAAGTTGGAGGCATGGAAGACTTGATGCTTCAAATGAAGATTAACTACTACCCCAAATGCCCCCAACCAGAACTAGCACTTGGCGTCGAAGCTCATACTGATGTGAGTGCACTGACTTTCATCCTCCACAATATGGTGCCTGGCTTGCAACTCTTCTATGAAGGAAACTGGGTAACAGCAAAGTGTGTGCCTAATTCCATAATCATGCACATTGGCGATACCGTTGAAATCCTAAGCAACGGAAAGTACAAGAGCATCCTTCACAGAGGGGTTGTGAACAAGGAGAAAGTAAGGATTTCATGGGCGATTTTCTGTGAGCCTCCGAAGGAGAAAATCATCCTTAAGCCCCTACCTGAGACTGTCAATGAGGCTGAGCCCCCTCGATTCCCACCTCGGACCTTTGCACAGCACATGGCACACAAGCTCTTCAAGAAGGATGATCAGGATTCTACTGCAGAGCAGAAAGCATTCAAGAAGGATGATCAGGATGTTGTTGCTGAGCGCAAAGTCCTCAGGGACGACAAACAGGACGCTGCAGCTGAGCACAAAATCTTCAAGAAGGATGATCAGGATGTTGTTGCTGAGCACAAAGTCCTCAAGGATGTTCCTGCCGAAGAATCTAAATAG；

SEQ ID NO.2：

ATGAATAATCCTCCTATAATCTGTACGTCTGTGCGAGTGAGGAAAGGTTCATGGACTGAAGAAGAAGATTTACTCTTGAGGAAATGTATGGAAAAATATGGTGAAGGCAAGTGGCATCTTGTTCCTGCTAGAGCAGGTCTGAATAGATGCAGAAAAAGTTGTAGGCTGAGGTGGTTGAATTATTTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTTCGGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCGCAAACGATGTAAAGAACTACTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGCAAAGAAATAACAAGTGACAAGCAAACTACCGATGCATCGATGGATAACGGAGATCAATGGTGGAAAAGTTTACTGGAAAATTTCAATGACGACGCTGTTGAAGGAGAAGAAGAAGCTGTAACTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTATTACATGAGGAAATATCATCACCACCATTAAATGGTGGAGGCAACTCCATGCAACAAGAACAATGTGATAATTGGGATGATTTTTCTGCTGATATTGATTTATGGAATCTACTTGATTAA。

一组特异性引物，根据上述的CDS序列特征设计得到，其特征在于，特异性引物序列如引物组1～4中的任一组所示：

引物组1：

GCTAGCGAATTCGTGCTTTCGATTGGGTTGG(SEQ ID NO.3)，

GCTAGCGGATCCGTGCAAAGGTCCGAGGTG(SEQ ID NO.4)；

引物组2：

GCTAGCGAATTCTTCTTTGATCTGCCTGTT(SEQ ID NO.5)，

GCTAGCGGATCCTGTACTTTCCGTTGCTTA(SEQ ID NO.6)；

引物组3：

GCTAGCGAATTCTCACTTATTGCTGGTAGA(SEQ ID NO.7)，

GCTAGCGGATCCCATCCCAATTATCACATTGTTC(SEQ ID NO.8)；

引物组4：

GCTAGCGAATTCTGTACGTCTGTGCGAGTG(SEQ ID NO.9)，

GCTAGCGGATCCCAGCGTTCTTCCTTGTCT(SEQ ID NO.10)。

一种核苷酸序列，由上述的特异性引物以茄子的cDNA为模板进行PCR扩增反应得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.14任一种所示；

SEQ ID NO.11：

GCTAGCGAATTCGTGCTTTCGATTGGGTTGGGATTGGAAGAAGGAAGACTAGAGAAGGAAGTTGGAGGCATGGAAGACTTGATGCTTCAAATGAAGATTAACTACTACCCCAAATGCCCCCAACCAGAACTAGCACTTGGCGTCGAAGCTCATACTGATGTGAGTGCACTGACTTTCATCCTCCACAATATGGTGCCTGGCTTGCAACTCTTCTATGAAGGAAACTGGGTAACAGCAAAGTGTGTGCCTAATTCCATAATCATGCACATTGGCGATACCGTTGAAATCCTAAGCAACGGAAAGTACAAGAGCATCCTTCACAGAGGGGTTGTGAACAAGGAGAAAGTAAGGATTTCATGGGCGATTTTCTGTGAGCCTCCGAAGGAGAAAATCATCCTTAAGCCCCTACCTGAGACTGTCAATGAGGCTGAGCCCCCTCGATTCCCACCTCGGACCTTTGCACGGATCCGCTAGC；

SEQ ID NO.12：

GCTAGCGAATTCTTCTTTGATCTGCCTGTTGAAGAGAAGGAGAAGTATGCTAATGATCAACCCTCTGGTAATGTCCAAGGCTATGGAAGCAAGCTAGCAAATAATGGTTGTGGTCAACTTGAGTGGGAGGATTACTTCTTCCATTGTGTTTTCCCCGAGGACAAGCGCGATTTGGCCATCTGGCCTAAAACCCCTGCTGATTACATACTAGCAACAAGTGAATATGCAAAGCAGATCAGGAACCTAGCAACAAAGATTTTTGCAGTGCTTTCGATTGGGTTGGGATTGGAAGAAGGAAGACTAGAGAAGGAAGTTGGAGGCATGGAAGACTTGATGCTTCAAATGAAGATTAACTACTACCCCAAATGCCCCCAACCAGAACTAGCACTTGGCGTCGAAGCTCATACTGATGTGAGTGCACTGACTTTCATCCTCCACAATATGGTGCCTGGCTTGCAACTCTTCTATGAAGGAAACTGGGTAACAGCAAAGTGTGTGCCTAATTCCATAATCATGCACATTGGCGATACCGTTGAAATCC TAAGCAACGGAAAGTACAGGATCCGCTAGC；

SEQ ID NO.13：

GCTAGCGAATTCTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCGCAAACGATGTAAAGAACTACTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGCAAAGAAATAACAAGTGACAAGCAAACTACCGATGCATCGATGGATAACGGAGATCAATGGTGGAAAAGTTTACTGGAAAATTTCAATGACGACGCTGTTGAAGGAGAAGAAGAAGCTGTAACTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTATTACATGAGGAAATATCATCACCACCATTAAATGGTGGAGGCAACTCCATGCAACAAGAACAATGTGATAATTGGGATGGGATCCGCTAGC；

SEQ ID NO.14：

GCTAGCGAATTCTGTACGTCTGTGCGAGTGAGGAAAGGTTCATGGACTGAAGAAGAAGATTTACTCTTGAGGAAATGTATGGAAAAATATGGTGAAGGCAAGTGGCATCTTGTTCCTGCTAGAGCAGGTCTGAATAGATGCAGAAAAAGTTGTAGGCTGAGGTGGTTGAATTATTTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTTCGGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCGCAAACGATGTAAAGAACTACTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGGGATCCGCTAGC。

上述的核苷酸序列在构建茄子果实基因沉默体系中的应用。

一种茄子果实基因沉默体系，包含在VIGS沉默载体上插入SEQ ID NO.11～14任一项所示的核苷酸序列得到的重组载体。

进一步地，VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。

上述的茄子果实基因沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

1)根据SmANS的CDS序列(SEQ ID NO.1)和SmMYB1的CDS序列(SEQ ID NO.2)序列特征设计特异性引物(SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10)；

2)特异性引物以茄子的cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得SmANS、SmMYB1基因沉默片段SmANS1-1(SEQ ID NO.11)、SmANS2-2(SEQ ID NO.12)、SmMYB1-1(SEQ ID NO.13)，SmMYB1-2(SEQ ID NO.14)；

3)将步骤2)获得的基因沉默片段与TRV2载体连接，获得pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2、pTRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2重组质粒；

4)将步骤3)获得的任一种重组质粒转化到农杆菌中，即得到VIGS沉默体系。

一种茄子果实VIGS侵染转化的方法，使用上述的茄子果实基因沉默体系或上述的构建方法构建得到的茄子果实基因沉默体系。

进一步地，侵染缓冲液配置比例为98mL灭菌蒸馏水中加入1mL浓度为1M的MgCl₂，1mL浓度为1M的MES，1mL浓度为200mM的乙酰丁香酮，调至pH 5.6；优选的，侵染受体果实的以授粉4～6天的幼果；优选的，农杆菌菌液注射量以200μL。

本发明的有益效果是：

本发明建立了一种高效快速的茄子果实病毒介导的基因沉默系统，可以用于茄子果皮色素代谢、果皮光泽和单性结实等果实重要性状调控基因功能验证分析。明确了环境温度、注射用果实大小、目的基因插入片段大小以及注射量对茄子果实VIGS体系的影响。在华南露地春秋两季栽培条件下，气温介于20～30℃，可以进行茄子果实VIGS研究，适合果实大小为授粉4～6天刚刚膨大可见的幼果，农杆菌菌液注射量以200μL为宜，注射后1周即可以观察到表型改变。本发明的基因沉默体系简便、快速、高效，可以应用到茄子果实发育及其它含花青素组织基因功能验证。

附图说明

图1为植物材料3316F1，A：茎、叶脉呈现紫红色、花为紫色，B：果色为紫红色；

图2为目标载体EcoRⅠ和BamHⅠ酶切电泳检测结果，A为SmANS基因VIGS载体酶切，M1为100bp DNA ladder，P1和P2分别为pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2酶切结果，B为SmMYB1基因VIGS载体酶切，M2为DL 2000DNA ladder，P3和P4分别为pTRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2酶切结果；

图3为花青素代谢相关基因VIGS载体侵染茄子果实后的沉默表型，A为未处理对照，B为阴性对照，C为pTRV2-SmANS-1沉默效果，D为pTRV2-SmANS-2沉默效果，E为pTRV2-SmMYB1-1沉默效果，F为pTRV2-SmMYB1-2沉默效果；

图4为SmANS基因在不同处理中的相对表达量；

图5为SmMYB1基因在不同处理中的相对表达量。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括RNA提取和反转录、PCR扩增、PCR产物及载体的酶切、连接、转化感受态大肠杆菌DH5a和农杆菌GV3101等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、供试材料、VIGS载体和基因

1.植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所选育的杂交组合3316F1，其下胚轴、叶脉、花色和果实均含有花青素，果皮颜色为紫红色(图1)。2018年7月10日进行穴盘育苗，8月10日定植于露地，10月10日对茄期开始对幼果进行VIGS侵染实验。

2.载体：沉默载体pTRV-RNA2(pYL156)和辅助载体pTRV-RNA1(pYL192)由美国加州大学DAVIS校区Dinesh-Kumar教授馈赠，本实验室保存。

3.沉默目的基因：序列来源自有茄子转录组数据(未发表)，从中挑选1个编码茄子花青素代谢途径的关键结构基因花青素合酶基因SmANS的Unigene0020595(如SEQ ID NO.1所示)，还有另1个编码花青素代谢途径调节基因SmMYB1的Unigene0010939(如SEQ ID NO.2所示)。从自有转录组数据分析结果及已有文献(Docimo1T,Francese G,Ruggiero1A,etal.Phenylpropanoids Accumulation in Eggplant fruit:characterization ofBiosynthetic Genes and Regulation by a MYB Transcription Factor.Frontiers inPlant Science,2016,1233)报道来看，转录因子SmMYB1基因在茄子果皮花青素代谢途径上发挥重要作用。

二、VIGS表达载体构建

1.RNA提取及反转录

采用TransZol Plant试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)提取样品的总RNA，然后以各样品的1μg总RNA为模板，利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)试剂盒(宝生物工程有限公司，Takara)去除基因组DNA并反转录合成cDNA第一链，于-20℃储藏备用。

2.引物设计

根据茄子果皮花青素合成相关的Unigene0020595(编码茄子花青素合酶SmANS)和Unigene0010939(茄子转录调控因子SmMYB1)的CDS序列信息在序列不同区段设计特异性引物，在上、下游引物的5′端分别加上EcoR I和BamH I酶切位点。具体引物序列及目标片段大小详见表1。

表1引物序列及大小

3.目标片段PCR扩增体系与反应程序

2×Mix(PrimeSTAR Max Premix，Takara)10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA2μL，ddH₂0 6μL，总体积20μL。

PCR反应程序为:94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次；72℃再延伸7min。反应结束后，分别取6μL产物在1.2％琼脂糖上电泳，Goldview染色后用凝胶成像系统观察。

引物组1扩增得到基因沉默片段SmANS1-1：GCTAGCGAATTCGTGCTTTCGATTGGGTTGGGATTGGAAGAAGGAAGACTAGAGAAGGAAGTTGGAGGCATGGAAGACTTGATGCTTCAAATGAAGATTAACTACTACCCCAAATGCCCCCAACCAGAACTAGCACTTGGCGTCGAAGCTCATACTGATGTGAGTGCACTGACTTTCATCCTCCACAATATGGTGCCTGGCTTGCAACTCTTCTATGAAGGAAACTGGGTAACAGCAAAGTGTGTGCCTAATTCCATAATCATGCACATTGGCGATACCGTTGAAATCCTAAGCAACGGAAAGTACAAGAGCATCCTTCACAGAGGGGTTGTGAACAAGGAGAAAGTAAGGATTTCATGGGCGATTTTCTGTGAGCCTCCGAAGGAGAAAATCATCCTTAAGCCCCTACCTGAGACTGTCAATGAGGCTGAGCCCCCTCGATTCCCACCTCGGACCTTTGCACGGATCCGCTAGC(SEQ IDNO.11)；

引物组2扩增得到基因沉默片段SmANS2-2：GCTAGCGAATTCTTCTTTGATCTGCCTGTTGAAGAGAAGGAGAAGTATGCTAATGATCAACCCTCTGGTAATGTCCAAGGCTATGGAAGCAAGCTAGCAAATAATGGTTGTGGTCAACTTGAGTGGGAGGATTACTTCTTCCATTGTGTTTTCCCCGAGGACAAGCGCGATTTGGCCATCTGGCCTAAAACCCCTGCTGATTACATACTAGCAACAAGTGAATATGCAAAGCAGATCAGGAACCTAGCAACAAAGATTTTTGCAGTGCTTTCGATTGGGTTGGGATTGGAAGAAGGAAGACTAGAGAAGGAAGTTGGAGGCATGGAAGACTTGATGCTTCAAATGAAGATTAACTACTACCCCAAATGCCCCCAACCAGAACTAGCACTTGGCGTCGAAGCTCATACTGATGTGAGTGCACTGACTTTCATCCTCCACAATATGGTGCCTGGCTTGCAACTCTTCTATGAAGGAAACTGGGTAACAGCAAAGTGTGTGCCTAATTCCATAATCATGCACATTGGCGATACCGTTGAAATCCTAAGCAACGGAAAGTACAGGATCCGCTAGC(SEQ ID NO.12)；

引物组3扩增得到基因沉默片段SmMYB1-1：GCTAGCGAATTCTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCGCAAACGATGTAAAGAACTACTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGCAAAGAAATAACAAGTGACAAGCAAACTACCGATGCATCGATGGATAACGGAGATCAATGGTGGAAAAGTTTACTGGAAAATTTCAATGACGACGCTGTTGAAGGAGAAGAAGAAGCTGTAACTAATTATGAAAAAACACTAACAAGTTTATTACATGAGGAAATATCATCACCACCATTAAATGGTGGAGGCAACTCCATGCAACAAGAACAATGTGATAATTGGGATGGGATCCGCTAGC(SEQID NO.13)；

引物组4扩增得到基因沉默片段SmMYB1-2：GCTAGCGAATTCTGTACGTCTGTGCGAGTGAGGAAAGGTTCATGGACTGAAGAAGAAGATTTACTCTTGAGGAAATGTATGGAAAAATATGGTGAAGGCAAGTGGCATCTTGTTCCTGCTAGAGCAGGTCTGAATAGATGCAGAAAAAGTTGTAGGCTGAGGTGGTTGAATTATTTAAGGCCACATATCAAGAGAGGTGACTTTGCTTCGGATGAAGTGGATCTCATCTTGAGGCTTCATAAGCTCTTAGGCAACAGATGGTCACTTATTGCTGGTAGACTTCCGGGAAGGACCGCAAACGATGTAAAGAACTACTGGAACACTAACCTTCTAAGGAAGTTCACTATTGCTCCTCAAAAGATTAATAATACATGCAAAGACATCATTAGTACGAATGAAATAATAAGACCTCAACCTCGGAAATACTTGTCAAGCATAAAGAAGAATAATTTGACAAACAATAATGTAATTGTAGACAAGGAAGAACGCTGGGATCCGCTAGC(SEQ ID NO.14)。

4.目标片段和载体酶切连接

(1)酶切体系：10μL纯化DNA(或pTRV2载体)，4μLNEB Buffer，0.5μL EcoRⅠ，0.5μLBamHⅠ，25μL ddH₂O，总体积40μL。混匀后，37℃酶切过夜。

(2)连接体系：2μL T4DNA ligase buffer，11μL DNA(酶切回收纯化)，6μL pTRV2载体(酶切回收纯化)，1μL T4Ligase，总体积20μL。混匀后，22℃连接过夜。

5.pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2、pTRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2构建结果由图2A可见，P1(pTRV2-SmANS-1)、P2(pTRV2-SmANS-2)载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切分别得到了475bp和571bp的目标片段，说明目的基因已经成功连接到VIGS载体pTRV-RNA2上。从图2B的酶切电泳检测结果可见，P3(pTRV2-SmMYB1-1)和P4(pTRV2-SmMYB1-2)酶切后也分别得到了484bp和503bp的目标片段，说明重组载体构建成功。

三、农杆菌侵染菌液制备及侵染

(1)菌液扩繁：分别取500μL含有目标基因片段的TRV2阳性克隆、TRV1、TRV2的农杆菌菌液加入到5mL LB液体培养基，加入相应的抗生素(卡那霉素,庆大霉素和利福平)、100μL MES(1M)和100μL乙酰丁香酮(200mM)。28℃200rpm震荡培养10h。

(2)侵染缓冲液配制：在98mL灭菌蒸馏水中加入1mL的MgCl₂(1M)，1mL的MES(1M)，1mL乙酰丁香酮(200mM)，调至PH 5.6。

(3)配制侵染液：5000rpm离心收集细菌，弃上清，用侵染缓冲液悬浮细菌，并调浓度OD600至2.0左右，等体积混匀TRV1和TRV2(阴性对照，pTRV2)，TRV1和TRV2+目的基因，室温放置或28℃摇床100rpm振荡培养3h。

(4)注射侵染果实：在侵染液中加入Silwet L 77(2mL侵染液中加1μL)，立即混匀。用1mL的无菌注射器注射200μL的侵染液到茄子的幼果中，注射后1周观察果皮的颜色变化。

实施例2

茄子果实VIGS体系的应用

1、茄子果皮中SmANS基因的沉默效果

(1)结构基因SmANS沉默对表型性状茄子果皮颜色的影响

从图3B可见，阴性对照pTRV2(等体积混匀TRV1和TRV2)农杆菌菌液侵染的茄子果实较对照未侵染果实(图3A)果型略有改变，但果皮颜色未发生改变。花青素代谢途径中关键结构基因SmANS在两个不同的目标区段构建VIGS载体pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2，经农杆菌转化后，注射侵染区域周围果皮花青素合成受到了明显抑制，果皮颜色由紫红色变为白色(图3C，图3D)，说明茄子果皮中的SmANS基因被有效地沉默。

(2)qPCR检测不同处理对茄子果皮SmANS基因表达量的影响

利用q-PCR技术对不同沉默茄子果实果皮中SmANS基因的表达水平进行相对定量分析，结果如图4所示，结果表明，侵染后2周，与阴性对照pTRV2相比，含有2个不同SmANS目标基因片段载体(pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2)的菌液侵染的3316果实中SmANS基因表达水平均显著下降，说明SmANS基因的mRNA在沉默该基因的茄子果皮中被显著降解，证明构建的茄子VIGS体系能够有效的降低茄子花青素代谢途径的结构基因SmANS基因转录水平。

2、茄子果皮中SmMYB1基因沉默效果

(1)转录因子SmMYB1基因沉默对茄子果皮颜色的影响

从图3E和图3F可见，pTRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2载体经农杆菌转化侵染茄子果实后，茄子果皮颜色发生了改变，注射区域周围，果皮色由紫红色变为白色，说明茄子果皮中的SmMYB1基因表达受到了明显抑制。

(2)qPCR检测不同处理对茄子果皮SmMYB1基因表达量的影响

利用q-PCR技术对不同沉默茄子果实果皮中SmMYB1基因的表达水平进行相对定量分析，结果如图5所示，与阴性对照pTRV2相比，受到含有TRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2载体农杆菌侵染的茄子果皮中SmMYB1基因表达量均显著降低，说明SmMYB1基因的mRNA在沉默该基因的茄子果皮中被显著降解，证明构建的茄子VIGS体系能够有效的降低茄子花青素代谢途径的调控基因SmMYB1基因转录水平，进而影响整个花青素代谢通路，最终引起花青素合成受到抑制。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

华南农业大学

<120> 一种茄子果实基因沉默体系及其构建方法

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1242

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 1

atggtgagtg aagtggttcc aactccttca agagttgaaa gcttggctta aagtggaatc 60

caggtcattc ctaaagagta tgtgaggcca caagaagagt aaaatggtat aggaaacatc 120

tttgaggaag agaagaaaga agaaggacct caagtaccga cgattaatct gaaagaaatt 180

gactcggagg acaaggaaat tcgcgaaaaa tgccaccaag agctgaaaag agcagccatg 240

gaatggggtg tcatgcatct tgttaaccat ggcatatcag atgagctaat tgatcatgtc 300

aaggttgccg gaggtacctt ctttgatctg cctgttgaag agaaggagaa gtatgctaat 360

gatcaaccct ctggtaatgt ccaaggctat ggaagcaagc tagcaaataa tggttgtggt 420

caacttgagt gggaggatta cttcttccat tgtgttttcc ccgaggacaa gcgcgatttg 480

gccatctggc ctaaaacccc tgctgattac atactagcaa caagtgaata tgcaaagcag 540

atcaggaacc tagcaacaaa gatttttgca gtgctttcga ttgggttggg attggaagaa 600

ggaagactag agaaggaagt tggaggcatg gaagacttga tgcttcaaat gaagattaac 660

tactacccca aatgccccca accagaacta gcacttggcg tcgaagctca tactgatgtg 720

agtgcactga ctttcatcct ccacaatatg gtgcctggct tgcaactctt ctatgaagga 780

aactgggtaa cagcaaagtg tgtgcctaat tccataatca tgcacattgg cgataccgtt 840

gaaatcctaa gcaacggaaa gtacaagagc atccttcaca gaggggttgt gaacaaggag 900

aaagtaagga tttcatgggc gattttctgt gagcctccga aggagaaaat catccttaag 960

cccctacctg agactgtcaa tgaggctgag ccccctcgat tcccacctcg gacctttgca 1020

cagcacatgg cacacaagct cttcaagaag gatgatcagg attctactgc agagcagaaa 1080

gcattcaaga aggatgatca ggatgttgtt gctgagcgca aagtcctcag ggacgacaaa 1140

caggacgctg cagctgagca caaaatcttc aagaaggatg atcaggatgt tgttgctgag 1200

cacaaagtcc tcaaggatgt tcctgccgaa gaatctaaat ag 1242

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> 茄子

<400> 2

atgaataatc ctcctataat ctgtacgtct gtgcgagtga ggaaaggttc atggactgaa 60

gaagaagatt tactcttgag gaaatgtatg gaaaaatatg gtgaaggcaa gtggcatctt 120

gttcctgcta gagcaggtct gaatagatgc agaaaaagtt gtaggctgag gtggttgaat 180

tatttaaggc cacatatcaa gagaggtgac tttgcttcgg atgaagtgga tctcatcttg 240

aggcttcata agctcttagg caacagatgg tcacttattg ctggtagact tccgggaagg 300

accgcaaacg atgtaaagaa ctactggaac actaaccttc taaggaagtt cactattgct 360

cctcaaaaga ttaataatac atgcaaagac atcattagta cgaatgaaat aataagacct 420

caacctcgga aatacttgtc aagcataaag aagaataatt tgacaaacaa taatgtaatt 480

gtagacaagg aagaacgctg caaagaaata acaagtgaca agcaaactac cgatgcatcg 540

atggataacg gagatcaatg gtggaaaagt ttactggaaa atttcaatga cgacgctgtt 600

gaaggagaag aagaagctgt aactaattat gaaaaaacac taacaagttt attacatgag 660

gaaatatcat caccaccatt aaatggtgga ggcaactcca tgcaacaaga acaatgtgat 720

aattgggatg atttttctgc tgatattgat ttatggaatc tacttgatta a 771

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctagcgaat tcgtgctttc gattgggttg g 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gctagcggat ccgtgcaaag gtccgaggtg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctagcgaat tcttctttga tctgcctgtt 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gctagcggat cctgtacttt ccgttgctta 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gctagcgaat tctcacttat tgctggtaga 30

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gctagcggat cccatcccaa ttatcacatt gttc 34

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gctagcgaat tctgtacgtc tgtgcgagtg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctagcggat cccagcgttc ttccttgtct 30

<210> 11

<211> 475

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gctagcgaat tcgtgctttc gattgggttg ggattggaag aaggaagact agagaaggaa 60

gttggaggca tggaagactt gatgcttcaa atgaagatta actactaccc caaatgcccc 120

caaccagaac tagcacttgg cgtcgaagct catactgatg tgagtgcact gactttcatc 180

ctccacaata tggtgcctgg cttgcaactc ttctatgaag gaaactgggt aacagcaaag 240

tgtgtgccta attccataat catgcacatt ggcgataccg ttgaaatcct aagcaacgga 300

aagtacaaga gcatccttca cagaggggtt gtgaacaagg agaaagtaag gatttcatgg 360

gcgattttct gtgagcctcc gaaggagaaa atcatcctta agcccctacc tgagactgtc 420

aatgaggctg agccccctcg attcccacct cggacctttg cacggatccg ctagc 475

<210> 12

<211> 571

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gctagcgaat tcttctttga tctgcctgtt gaagagaagg agaagtatgc taatgatcaa 60

ccctctggta atgtccaagg ctatggaagc aagctagcaa ataatggttg tggtcaactt 120

gagtgggagg attacttctt ccattgtgtt ttccccgagg acaagcgcga tttggccatc 180

tggcctaaaa cccctgctga ttacatacta gcaacaagtg aatatgcaaa gcagatcagg 240

aacctagcaa caaagatttt tgcagtgctt tcgattgggt tgggattgga agaaggaaga 300

ctagagaagg aagttggagg catggaagac ttgatgcttc aaatgaagat taactactac 360

cccaaatgcc cccaaccaga actagcactt ggcgtcgaag ctcatactga tgtgagtgca 420

ctgactttca tcctccacaa tatggtgcct ggcttgcaac tcttctatga aggaaactgg 480

gtaacagcaa agtgtgtgcc taattccata atcatgcaca ttggcgatac cgttgaaatc 540

ctaagcaacg gaaagtacag gatccgctag c 571

<210> 13

<211> 484

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

gctagcgaat tctcacttat tgctggtaga cttccgggaa ggaccgcaaa cgatgtaaag 60

aactactgga acactaacct tctaaggaag ttcactattg ctcctcaaaa gattaataat 120

acatgcaaag acatcattag tacgaatgaa ataataagac ctcaacctcg gaaatacttg 180

tcaagcataa agaagaataa tttgacaaac aataatgtaa ttgtagacaa ggaagaacgc 240

tgcaaagaaa taacaagtga caagcaaact accgatgcat cgatggataa cggagatcaa 300

tggtggaaaa gtttactgga aaatttcaat gacgacgctg ttgaaggaga agaagaagct 360

gtaactaatt atgaaaaaac actaacaagt ttattacatg aggaaatatc atcaccacca 420

ttaaatggtg gaggcaactc catgcaacaa gaacaatgtg ataattggga tgggatccgc 480

tagc 484

<210> 14

<211> 503

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gctagcgaat tctgtacgtc tgtgcgagtg aggaaaggtt catggactga agaagaagat 60

ttactcttga ggaaatgtat ggaaaaatat ggtgaaggca agtggcatct tgttcctgct 120

agagcaggtc tgaatagatg cagaaaaagt tgtaggctga ggtggttgaa ttatttaagg 180

ccacatatca agagaggtga ctttgcttcg gatgaagtgg atctcatctt gaggcttcat 240

aagctcttag gcaacagatg gtcacttatt gctggtagac ttccgggaag gaccgcaaac 300

gatgtaaaga actactggaa cactaacctt ctaaggaagt tcactattgc tcctcaaaag 360

attaataata catgcaaaga catcattagt acgaatgaaa taataagacc tcaacctcgg 420

aaatacttgt caagcataaa gaagaataat ttgacaaaca ataatgtaat tgtagacaag 480

gaagaacgct gggatccgct agc 503

Claims (1)

1.一种茄子果实VIGS侵染转化的方法，其特征在于：使用如下构建方法构建得到茄子果实基因沉默体系，所述方法包括如下步骤：

1)根据SmANS的CDS序列SEQ ID NO.1和SmMYB1的CDS序列SEQ ID NO.2序列特征设计特异性引物SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.10；

2)特异性引物以茄子的cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得SmANS、SmMYB1基因沉默片段SmANS1-1 SEQ ID NO.11、SmANS2-2 SEQ ID NO.12、SmMYB1-1 SEQ ID NO.13，SmMYB1-2SEQ ID NO.14；

3)将获得的SmANS、SmMYB1基因沉默片段与TRV2载体连接，获得pTRV2-SmANS-1、pTRV2-SmANS-2、pTRV2-SmMYB1-1和pTRV2-SmMYB1-2重组质粒；

4)连接之后转化到农杆菌中，即得到所述VIGS沉默体系；

侵染缓冲液配置比例为98mL灭菌蒸馏水中加入1mL浓度为1M的MgCl₂，1mL浓度为1M的MES，1mL浓度为200mM的乙酰丁香酮，调至pH 5.6；

侵染液的注射量为200μL；

侵染受体果实为授粉4-6天的幼果，侵染液注射到茄子的幼果中。

Images