CN107937358A

CN107937358A - 一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1及其编码基因和应用

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Publication number: CN107937358A
Application number: CN201711201476.1A
Authority: CN
Inventors: 张立平; 苑国良; 赵昌平; 苑少华; 白建芳; 王娜; 高世庆; 张风廷; 单福华; 孙辉; 马锦绣
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2017-11-27
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-11-27
Also published as: CN107937358B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种诱导植物花粉败育相关蛋白TaPaO1及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。本发明的诱导花粉败育相关蛋白及其编码基因对研究光温敏雄性不育小麦的不育机理有一定的作用，对于研究及开辟小麦杂种优势利用新途径提供十分重要的理论和实际意义。

Description

一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1及其编码基因和应用。

背景技术

脱镁叶绿(甲酯)酸加氧酶(PaO)是迄今为止发现的参与叶绿素降解代谢的酶中最重要的关键酶(Hortensteiner S et al.，1998；Curty C et al.，1995)。

目前关于PaO的报道包括：从呈现坏死斑点的玉米lls1(lethal leaf-spot 1)突变体和拟南芥acdl(accelerated cell death 1)突变体中得到克隆(Gray et al.，1997；Yanget al.，2004)；李鹏丽等(2006)从大豆中克隆了玉米LLS1的同源基因，全长1817bp，命名为Gmlls1，但是，目前还未有小麦PaO在影响花粉育性的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1。

本发明的再一目的是提供编码上述诱导植物花粉败育相关蛋白TaPaO1的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述诱导植物花粉败育相关蛋白TaPaO1的应用。

本发明所提供的诱导植物衰老和雄性不育的相关蛋白TaPaO1，来源于小麦光温敏雄性不育品种BS366，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

MRAFSSSDLPAALLLPCRHATSLPSRPPLLLFTSTCHSQNSDGILPRFGCEEDLSPNKTSDPRSLLRRSRGRKEADRMPVVAMPSASLPLLSPRHRPLLRPSTLPASRLGSGLLRPRRGRAGSTRLRVAAPTSVPGEAERAEEPTTSASTSPESPGEKFVWRDHWYPVSLVEDLDPRVPTPFQLLNRDLVIWNDPNSGEWVALDDRCPHRLAPLSEGRIDETGGLQCSYHGWSFDGSGACTRIPQAAPKGPEARAVRSPRACATKFPTLLSQGLLFVWPDENGWDKAKATKPPMLPKEFDDPAFSTVTIQRDLFYGYDTLMENVSDPSHIEFAHHKVTGRRDRAKPLPFKMESSGAWGYSGANTGNPRITATFEAPCYALNKIEIDTKLPIVGDQKWVIWICSFNIPMAPGKTRSIVCSARNFFQFTMPGKAWWQFVPRWYEHWTSNLVYDGDMIVLQGQEKVFLSASKESSADVNQQYTKLTFTPTQADRFVLAFRAWLRKFGNSQPDWYGSPSQDALPSTVLSKREMLDRYEQHTLKCSSCRGAHKAFQTLQKVFMGATVVFGATSGIPADVQLRILLGAGALVSAALAYVFYDRQKHFVFVDYVHADID

本发明的蛋白由612个氨基酸残基组成，具有保守的Rieske[2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端的CxxC结构基序。自SEQ ID NO.1的氨基末端第152-264位氨基酸残基是保守的Rieske结构域。

为了使TaPaO1蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的基因TaPaO1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

根据本发明的TaPaO1编码基因具有如SEQ ID NO.2或3所示核苷酸序列。TaPaO1的表达会诱导植物花粉败育。

SEQ ID NO.2：

ACGTTGCGTGTGGGTGGCTGGCCCAAGCTCCACCACAGAAACACACGGCTGGCCGCCGGGAAAACGCCATGCGTGCGTTCTCCAGTTCTGATCTACCCGCGGCCCTGCTTCTGCCCTGCCGTCACGCAACCTCCCTCCCCTCGCGCCCGCCGCTTCTTCTCTTCACCTCCACTTGTCACTCACAAAATTCCGACGGAATTCTTCCTCGCTTCGGCTGCGAGGAAGATCTCAGCCCAAACAAAACCTCGGACCCCCGCTCCCTCCTCAGACGATCCCGAGGAAGGAAGGAGGCAGATCGAATGCCGGTGGTGGCGATGCCGTCCGCCTCCCTCCCCCTCCTCTCCCCGCGGCACCGGCCGCTGCTGCGCCCGTCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCGGCAGCGGACTCCTCCGTCCACGCCGCGGCCGCGCCGGGAGCACCCGCCTCCGCGTGGCCGCGCCGACGTCGGTCCCCGGCGAGGCGGAGCGGGCGGAGGAGCCGACCACGAGCGCGAGCACCTCGCCTGAATCGCCGGGCGAGAAGTTCGTGTGGCGGGACCACTGGTACCCGGTCTCCCTCGTGGAGGACCTGGACCCGCGCGTGCCCACCCCGTTCCAGCTCCTCAACCGCGACCTCGTCATCTGGAACGACCCCAACTCCGGCGAGTGGGTCGCGCTCGACGACCGCTGCCCGCACCGCCTCGCCCCGCTCTCGGAGGGCAGGATCGACGAGACGGGTGGCCTGCAGTGCTCCTACCACGGCTGGTCCTTCGACGGCTCCGGCGCCTGCACCAGGATCCCGCAGGCGGCGCCCAAGGGGCCCGAGGCCCGGGCGGTGCGCTCGCCCAGGGCCTGCGCCACCAAGTTCCCCACCCTCCTCTCCCAGGGCCTGCTCTTCGTCTGGCCTGACGAGAATGGATGGGACAAGGCCAAGGCCACCAAGCCTCCAATGCTGCCGAAGGAGTTCGATGACCCGGCCTTCTCCACCGTGACGATCCAGAGGGACCTCTTCTATGGGTATGACACGTTGATGGAGAACGTCTCTGATCCCTCGCATATAGAATTTGCTCACCACAAGGTCACTGGACGAAGAGATAGAGCCAAGCCTTTGCCATTTAAAATGGAATCAAGTGGCGCATGGGGATATTCAGGGGCAAATACCGGCAATCCTCGCATCACTGCAACTTTCGAGGCCCCTTGCTATGCACTGAACAAAATAGAGATTGACACCAAATTACCGATTGTGGGAGATCAGAAATGGGTCATATGGATTTGCTCCTTCAACATTCCAATGGCCCCAGGGAAAACTCGTTCTATTGTCTGTAGTGCTCGAAACTTTTTCCAGTTTACAATGCCAGGAAAGGCATGGTGGCAGTTTGTCCCTCGATGGTACGAACATTGGACCTCAAATTTGGTCTACGACGGCGATATGATCGTGCTTCAAGGCCAAGAGAAGGTTTTCCTGTCTGCATCCAAGGAGTCGTCTGCAGATGTTAATCAGCAGTACACAAAGCTCACATTCACACCCACACAGGCCGACCGATTTGTTTTAGCATTCCGGGCATGGCTACGGAAATTCGGAAATAGCCAGCCTGACTGGTATGGAAGTCCTAGCCAAGATGCATTGCCTTCTACGGTCCTTTCAAAGCGAGAGATGCTAGACAGATACGAGCAGCACACGCTGAAATGCTCGTCCTGCAGAGGAGCGCACAAGGCCTTTCAGACTTTGCAGAAGGTGTTCATGGGGGCGACGGTGGTGTTTGGCGCGACATCCGGGATCCCTGCGGATGTTCAGCTCAGAATATTGCTCGGTGCCGGTGCTCTGGTCAGCGCCGCTCTGGCCTATGTCTTCTACGACCGCCAGAAGCATTTCGTGTTTGTGGACTACGTGCACGCTGACATTGATTGATTAGGGAGATAAACATTAGTTATTTTTGTGAGGATCTGGTGTGGTGTGGTGTGGAGACATCCCACGATCAATCATGTGCATAACCTAGCCAAGGAGTACATATAGCTTTCAGTGGGTACATGAGATTGGCCCAGTATGTTGTTTATAACTTTATACTAGGCGCTGTATGAGCACTTACCAGGCTACTTTGTAAGAAAGAAAAGTCGGGATGAAAATCGATAGATAGACCATATCTTTTGTCTATT

SEQ ID NO.3：

ATGCGTGCGTTCTCCAGTTCTGATCTACCCGCGGCCCTGCTTCTGCCCTGCCGTCACGCAACCTCCCTCCCCTCGCGCCCGCCGCTTCTTCTCTTCACCTCCACTTGTCACTCACAAAATTCCGACGGAATTCTTCCTCGCTTCGGCTGCGAGGAAGATCTCAGCCCAAACAAAACCTCGGACCCCCGCTCCCTCCTCAGACGATCCCGAGGAAGGAAGGAGGCAGATCGAATGCCGGTGGTGGCGATGCCGTCCGCCTCCCTCCCCCTCCTCTCCCCGCGGCACCGGCCGCTGCTGCGCCCGTCGACCCTCCCGGCCTCCCGCCTCGGCAGCGGACTCCTCCGTCCACGCCGCGGCCGCGCCGGGAGCACCCGCCTCCGCGTGGCCGCGCCGACGTCGGTCCCCGGCGAGGCGGAGCGGGCGGAGGAGCCGACCACGAGCGCGAGCACCTCGCCTGAATCGCCGGGCGAGAAGTTCGTGTGGCGGGACCACTGGTACCCGGTCTCCCTCGTGGAGGACCTGGACCCGCGCGTGCCCACCCCGTTCCAGCTCCTCAACCGCGACCTCGTCATCTGGAACGACCCCAACTCCGGCGAGTGGGTCGCGCTCGACGACCGCTGCCCGCACCGCCTCGCCCCGCTCTCGGAGGGCAGGATCGACGAGACGGGTGGCCTGCAGTGCTCCTACCACGGCTGGTCCTTCGACGGCTCCGGCGCCTGCACCAGGATCCCGCAGGCGGCGCCCAAGGGGCCCGAGGCCCGGGCGGTGCGCTCGCCCAGGGCCTGCGCCACCAAGTTCCCCACCCTCCTCTCCCAGGGCCTGCTCTTCGTCTGGCCTGACGAGAATGGATGGGACAAGGCCAAGGCCACCAAGCCTCCAATGCTGCCGAAGGAGTTCGATGACCCGGCCTTCTCCACCGTGACGATCCAGAGGGACCTCTTCTATGGGTATGACACGTTGATGGAGAACGTCTCTGATCCCTCGCATATAGAATTTGCTCACCACAAGGTCACTGGACGAAGAGATAGAGCCAAGCCTTTGCCATTTAAAATGGAATCAAGTGGCGCATGGGGATATTCAGGGGCAAATACCGGCAATCCTCGCATCACTGCAACTTTCGAGGCCCCTTGCTATGCACTGAACAAAATAGAGATTGACACCAAATTACCGATTGTGGGAGATCAGAAATGGGTCATATGGATTTGCTCCTTCAACATTCCAATGGCCCCAGGGAAAACTCGTTCTATTGTCTGTAGTGCTCGAAACTTTTTCCAGTTTACAATGCCAGGAAAGGCATGGTGGCAGTTTGTCCCTCGATGGTACGAACATTGGACCTCAAATTTGGTCTACGACGGCGATATGATCGTGCTTCAAGGCCAAGAGAAGGTTTTCCTGTCTGCATCCAAGGAGTCGTCTGCAGATGTTAATCAGCAGTACACAAAGCTCACATTCACACCCACACAGGCCGACCGATTTGTTTTAGCATTCCGGGCATGGCTACGGAAATTCGGAAATAGCCAGCCTGACTGGTATGGAAGTCCTAGCCAAGATGCATTGCCTTCTACGGTCCTTTCAAAGCGAGAGATGCTAGACAGATACGAGCAGCACACGCTGAAATGCTCGTCCTGCAGAGGAGCGCACAAGGCCTTTCAGACTTTGCAGAAGGTGTTCATGGGGGCGACGGTGGTGTTTGGCGCGACATCCGGGATCCCTGCGGATGTTCAGCTCAGAATATTGCTCGGTGCCGGTGCTCTGGTCAGCGCCGCTCTGGCCTATGTCTTCTACGACCGCCAGAAGCATTTCGTGTTTGTGGACTACGTGCACGCTGACATTGATTGA

含有TaPaO1基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有TaPaO1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元表达载体系统和可用于植物微弹轰击法的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用本发明的基因构建植物重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育花粉败育植株的方法。

本发明所提供的培育花粉败育植物的方法，是将上述任一种含有TaPaO1基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到部分雄性不育植物，优选所述植物为小麦。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的脱镁叶绿酸加氧酶TaPaO1的编码基因导入植物细胞，可获得带有叶片斑状失绿以及雄性部分不育的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以杂交小麦品种BS366为实验材料，利用PCR扩增方法得到了小麦雄性不育相关的脱镁叶绿酸加氧酶(pheophorbide a oxygenase，TaPaO1)蛋白及其编码基因，得到了小麦来源的脱镁叶绿酸加氧酶基因，并将TaPaO1基因导入烟草，借助一个诱导型启动子RD29A，在低温诱导下，导致转基因植株花粉败育，从而通过基因工程的方法验证其功能。在其他物种中，对于该基因的研究结果多为诱导叶片产生斑状失绿现象，基本没有侧重于植株育性相关方面的研究。对于TaPaO1这个新基因，本发明研究发现它在低温诱导下，可以诱导转基因烟草花粉败育，研究该基因与育性的关系是本发明的一个重要创新点。

本发明的诱导衰老与雄性不育相关蛋白及其编码基因对培育光温敏雄性不育小麦有很大的推进作用，使二系法育种更加实际，对杂种优势的利用和推广十分重要的理论和实际意义。总之，运用基因工程方法构建雄性不育转基因植株，可以简化育种程序，改进育种模式。尤其是对光温敏雄性不育有关基因的研究和利用，可以推进二系法育种，从而加速杂种优势在小麦遗传育种中的应用。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1显示诱导衰老和雄性不育相关蛋白TaPaO1编码基因的cDNA克隆，以光温敏不育系BS366为模板，PCR扩增TaPaO1的cDNA片段，1，TaPaO1基因片段；M，DL2000marker(100，250，500，750，1000，2000)。

图2显示Realtime-PCR定量分析TaPaO1基因分别在可育环境与不育环境下的表达特征，该基因的表达在不同育性环境以及不同发育时期的幼穗中存在明显差异，在不育环境下，四个时期都表达，且随着穗部的发育呈现逐步上调趋势；而在可育环境下的四个穗部发育时期中表达量也有表达。其中A.F1-F4代表北京可育环境；B.S1-S4代表安徽不育环境。

图3显示转基因烟草植株的PCR检测以及表达检测，其中A为基因组PCR检测，1为野生型对照；2为pCambia2300-RD29A阳性对照；3-8为转基因阳性植株；B为检测TaPaO1在转基因烟草中的表达情况。

图4低温处理转基因烟草表型分析，A.pCambia2300-RD29A-TaPaO1转基因烟草低温(16℃)培养下出现花粉败育表型，常温(25℃)则表现正常；B.转基因植株花粉染色分析，转基因烟草低温(16℃)培养下几乎没有花粉产生，常温(25℃)则有正常花粉产生。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：小麦诱导衰老与光温敏雄性不育相关基因TaPaO1的cDNA克隆与半定量分析

取杂交小麦品种BS366的花药，用Trizol法提取花药的总RNA。利用大麦PaO(GenBank:AK365037)作为探针从小麦BS366文库中筛选获得TaPaO1基因片段。

用Trizol法提取杂交小麦品种BS366(京审麦2009003)花药的总RNA，用superscript II(购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaPaO基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-GTTGCGTGTGGGTGGCTG-3’

P2：5’-TCTCCCTAATCAATCAATGTC-3’

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.9kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(购自Promega公司)连接，参照Cohen等的方法(Proc Natl Acad Sci，69:2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaPaO1基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.3，即SEQ ID No.2的自5＇末端第69至1907位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.3所示TaPaO1基因的重组载体命名为pCambia2300-RD29A-TaPaO1，其cDNA克隆结果如图1所示。

TaPaO1基因的序列在Genabnk上进行比对，确定为新基因。

用Trizol法提取杂交小麦品种BS366花药的总RNA，反转录成cDNA用做荧光定量PCR分析。TaPaO1荧光定量选用的引物：

TaPaO1-RTFP1 5’TGGTGGCAGCTTGTCCCTC 3’

TaPaO1-RTRP1 5’CGACTCCTTGGATGCAGACAGG 3’

利用小麦中稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)的特异引物：

WAC-F：5’TACTCCCTCACAACAACCG 3’

WAC-R：5’AGAACCTCCACTGAGAACAA 3’

以actin作为内参，进行特异引荧光定量PCR扩增(图2)。结果表明，该基因的表达在不同育性环境以及不同发育时期的幼穗中存在明显差异，在不育环境下，四个时期都表达，且随着穗部的发育呈现逐步上调趋势；而在可育环境下的四个穗部发育时期中也有表达。三次重复结果基本一致。

实施例2：用TaPaO1基因培育雄性不育转基因植物

1、重组表达载体的构建

pCambia2300-RD29A-TaPaO1双子叶植物重组表达载体的构建

以杂交小麦品种BS366的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SacI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SacI和SpeI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pCambia2300-RD29A启动子之后的SacI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pCambia2300-RD29A-TaPaO1。

引物序列如下：

TaPaO1[SacI]：5’–TCCGAGCTC CCC TAA TCA ATC AAT GTC AGC-3’

TaPaO1[SpeI]：5’–CGGACTAGT ACG CCA TGC GTG CGT TCT CCA G-3’

2、转基因烟草的获得和鉴定

1)转基因烟草的获得

将上述构建的重组表达载体pCambia2300-RD29A-TaPaO1用冻融法转化根癌农杆菌C₃₈C₁，再用叶盘法将整合有pCambia2300-RD29A-TaPaO1的根癌农杆菌C₃₈C₁转化烟草W38，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行2轮筛选，每轮筛选10-15天，得到阳性转基因植株(如图3中的A)。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4,扩增RD29A启动子。

P3：5’GGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG 3’

P4：5’AAACAGAGGAGGGTCTCAC 3’

对pCambia2300-RD29A-TaPaO1转基因烟草进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得0.5kb左右条带，结果获得转pCambia2300-RD29A-TaPaO1烟草22株。

同时将pCambia2300-RD29A空载体导入烟草W38，方法同上，作为对照，获得11个株系的转空载体烟草(筛选获得的转基因烟草用T₀代表示)。

图3中B为检测TaPaO1在转基因烟草中的表达情况，下图为所用的引物：

TaPaO1RTFP2 5’ATGCCGGTGCTGGCGATG 3’

TaPaO1RTRP2 5’ACGATTCAGGCGAGGTGC 3’

NtGAPDH FP 5’GGTGTCCACAGACTTCGTGG 3’

NtGAPDH RP 5’GACTCCTCACAGCAGCACCA 3’

2)转TaPaO1基因植株衰老与雄性不育鉴定

将T₀代转pCambia2300-RD29A-TaPaO1基因烟草植株及T₀代转空载体对照植株的3周苗龄的根系分别移入含有营养土的花盆中分别进行高低和温处理，一部分在25℃(正常温度)下生长，一部分在16℃(低温)下生长，观察表型并拍照。在开花期结合花药的生长情况，做花粉萌发实验，观察花粉的育性。

结果表明：pCambia2300-RD29A-TaPaO1转基因植株在低温条件下，转基因植株与空白对照植株在开花期表现出明显的不同，主要表现在花药的生长发育和萌发上。转基因植株部分花药形态正常，极少有花粉产生。而低温条件培养的空白对照植株，花药发育正常，且花粉较多(如图4所示)。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1及其编码基因和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 612

<212> PRT

<213> Triticum aestivuml.

<400> 1

Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Asp Leu Pro Ala Ala Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Cys Arg His Ala Thr Ser Leu Pro Ser Arg Pro Pro Leu Leu Leu Phe

20 25 30

Thr Ser Thr Cys His Ser Gln Asn Ser Asp Gly Ile Leu Pro Arg Phe

35 40 45

Gly Cys Glu Glu Asp Leu Ser Pro Asn Lys Thr Ser Asp Pro Arg Ser

50 55 60

Leu Leu Arg Arg Ser Arg Gly Arg Lys Glu Ala Asp Arg Met Pro Val

65 70 75 80

Val Ala Met Pro Ser Ala Ser Leu Pro Leu Leu Ser Pro Arg His Arg

85 90 95

Pro Leu Leu Arg Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Arg Leu Gly Ser Gly

100 105 110

Leu Leu Arg Pro Arg Arg Gly Arg Ala Gly Ser Thr Arg Leu Arg Val

115 120 125

Ala Ala Pro Thr Ser Val Pro Gly Glu Ala Glu Arg Ala Glu Glu Pro

130 135 140

Thr Thr Ser Ala Ser Thr Ser Pro Glu Ser Pro Gly Glu Lys Phe Val

145 150 155 160

Trp Arg Asp His Trp Tyr Pro Val Ser Leu Val Glu Asp Leu Asp Pro

165 170 175

Arg Val Pro Thr Pro Phe Gln Leu Leu Asn Arg Asp Leu Val Ile Trp

180 185 190

Asn Asp Pro Asn Ser Gly Glu Trp Val Ala Leu Asp Asp Arg Cys Pro

195 200 205

His Arg Leu Ala Pro Leu Ser Glu Gly Arg Ile Asp Glu Thr Gly Gly

210 215 220

Leu Gln Cys Ser Tyr His Gly Trp Ser Phe Asp Gly Ser Gly Ala Cys

225 230 235 240

Thr Arg Ile Pro Gln Ala Ala Pro Lys Gly Pro Glu Ala Arg Ala Val

245 250 255

Arg Ser Pro Arg Ala Cys Ala Thr Lys Phe Pro Thr Leu Leu Ser Gln

260 265 270

Gly Leu Leu Phe Val Trp Pro Asp Glu Asn Gly Trp Asp Lys Ala Lys

275 280 285

Ala Thr Lys Pro Pro Met Leu Pro Lys Glu Phe Asp Asp Pro Ala Phe

290 295 300

Ser Thr Val Thr Ile Gln Arg Asp Leu Phe Tyr Gly Tyr Asp Thr Leu

305 310 315 320

Met Glu Asn Val Ser Asp Pro Ser His Ile Glu Phe Ala His His Lys

325 330 335

Val Thr Gly Arg Arg Asp Arg Ala Lys Pro Leu Pro Phe Lys Met Glu

340 345 350

Ser Ser Gly Ala Trp Gly Tyr Ser Gly Ala Asn Thr Gly Asn Pro Arg

355 360 365

Ile Thr Ala Thr Phe Glu Ala Pro Cys Tyr Ala Leu Asn Lys Ile Glu

370 375 380

Ile Asp Thr Lys Leu Pro Ile Val Gly Asp Gln Lys Trp Val Ile Trp

385 390 395 400

Ile Cys Ser Phe Asn Ile Pro Met Ala Pro Gly Lys Thr Arg Ser Ile

405 410 415

Val Cys Ser Ala Arg Asn Phe Phe Gln Phe Thr Met Pro Gly Lys Ala

420 425 430

Trp Trp Gln Phe Val Pro Arg Trp Tyr Glu His Trp Thr Ser Asn Leu

435 440 445

Val Tyr Asp Gly Asp Met Ile Val Leu Gln Gly Gln Glu Lys Val Phe

450 455 460

Leu Ser Ala Ser Lys Glu Ser Ser Ala Asp Val Asn Gln Gln Tyr Thr

465 470 475 480

Lys Leu Thr Phe Thr Pro Thr Gln Ala Asp Arg Phe Val Leu Ala Phe

485 490 495

Arg Ala Trp Leu Arg Lys Phe Gly Asn Ser Gln Pro Asp Trp Tyr Gly

500 505 510

Ser Pro Ser Gln Asp Ala Leu Pro Ser Thr Val Leu Ser Lys Arg Glu

515 520 525

Met Leu Asp Arg Tyr Glu Gln His Thr Leu Lys Cys Ser Ser Cys Arg

530 535 540

Gly Ala His Lys Ala Phe Gln Thr Leu Gln Lys Val Phe Met Gly Ala

545 550 555 560

Thr Val Val Phe Gly Ala Thr Ser Gly Ile Pro Ala Asp Val Gln Leu

565 570 575

Arg Ile Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Val Ser Ala Ala Leu Ala Tyr

580 585 590

Val Phe Tyr Asp Arg Gln Lys His Phe Val Phe Val Asp Tyr Val His

595 600 605

Ala Asp Ile Asp

610

<210> 3

<211> 2152

<212> DNA

<213> Triticum aestivuml.

<400> 3

acgttgcgtg tgggtggctg gcccaagctc caccacagaa acacacggct ggccgccggg 60

aaaacgccat gcgtgcgttc tccagttctg atctacccgc ggccctgctt ctgccctgcc 120

gtcacgcaac ctccctcccc tcgcgcccgc cgcttcttct cttcacctcc acttgtcact 180

cacaaaattc cgacggaatt cttcctcgct tcggctgcga ggaagatctc agcccaaaca 240

aaacctcgga cccccgctcc ctcctcagac gatcccgagg aaggaaggag gcagatcgaa 300

tgccggtggt ggcgatgccg tccgcctccc tccccctcct ctccccgcgg caccggccgc 360

tgctgcgccc gtcgaccctc ccggcctccc gcctcggcag cggactcctc cgtccacgcc 420

gcggccgcgc cgggagcacc cgcctccgcg tggccgcgcc gacgtcggtc cccggcgagg 480

cggagcgggc ggaggagccg accacgagcg cgagcacctc gcctgaatcg ccgggcgaga 540

agttcgtgtg gcgggaccac tggtacccgg tctccctcgt ggaggacctg gacccgcgcg 600

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gcgagtgggt cgcgctcgac gaccgctgcc cgcaccgcct cgccccgctc tcggagggca 720

ggatcgacga gacgggtggc ctgcagtgct cctaccacgg ctggtccttc gacggctccg 780

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<210> 3

<211> 1839

<212> DNA

<213> Triticum aestivuml.

<400> 3

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gtcgcgctcg acgaccgctg cccgcaccgc ctcgccccgc tctcggaggg caggatcgac 660

gagacgggtg gcctgcagtg ctcctaccac ggctggtcct tcgacggctc cggcgcctgc 720

accaggatcc cgcaggcggc gcccaagggg cccgaggccc gggcggtgcg ctcgcccagg 780

gcctgcgcca ccaagttccc caccctcctc tcccagggcc tgctcttcgt ctggcctgac 840

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ttcgtgtttg tggactacgt gcacgctgac attgattga 1839

Claims

1.一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1，其特征在于，编码权利要求1所述的诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1。

3.如权利要求2所述的诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2或3所示。

4.包含权利要求2或3所述诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体通过将权利要求2或3所述诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1插入载体pCambia2300-RD29A而得。

6.包含权利要求2或3所述诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1的转基因细胞系。

7.一种培育花粉败育植株的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2或3所述诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1导入植物细胞中，获得花粉败育或部分不育植株的步骤。

8.根据权利要求7所述的培育花粉败育植株的方法，其特征在于，所述植物为小麦。

9.权利要求1所述诱导植物花粉败育的相关蛋白TaPaO1在小麦杂交育种中的应用。