CN114480486A - 一种植物抗病毒rna沉默相关转录因子筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用，以植物矮牵牛作为研究对象，采用转录组测序和VIGS相结合的技术，首先构建TRV病毒侵染的差异表达基因数据库，从中选择极显著差异表达转录因子作为候选基因；分别构建至TRV‑GFP‑PhPDS载体，利用双报告基因分别监测病毒积累与RNA沉默过程；接种矮牵牛后，以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达转录因子中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为正调控转录因子，在下调表达转录因子中，造成绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为负调控转录因子。本发明为研究植物抗病毒RNA沉默转录调控机理提供了一种简单、快速、有效的基因筛选方法。

Description

一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及应用。
背景技术
RNA沉默是植物抵抗病毒入侵的重要防御机制，该沉默机制需要多种关键酶基因的参与，包括DCLs、AGOs、RDRs、DRBs等，它们分别负责病毒dsRNA的识别与剪切、siRNA的形成与稳定、dsRNA的二次合成等过程。然而至今，针对这些酶基因表达起着重要调控作用的转录因子却少有报道。因此，采用何种技术挖掘RNA沉默通路关键转录因子是一个亟待解决的重要科学问题。
目前，上游转录因子的筛选多采用酵母单杂交技术，通过对酵母细胞内报告基因表达情况的分析来鉴别特定的DNA结合位点，帮助发现潜在的结合蛋白(即转录因子)。但是，该技术操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差，目的基因片段可能会被漏检，有一定假阳性或假阴性的比率，且每次实验仅能针对单一基因进行筛选，难以筛选出同时调控同一途径中多个基因的转录因子。
基于RNA沉默的病毒防卫原理，科研人员开发出了一种下调基因表达的反向遗传学技术，即病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)。该技术以人工改造的病毒为载体，将目标基因片段构建其中，依靠农杆菌介导侵染后，可引起寄主植物体内同源基因表达水平的下降。VIGS技术具有操作简单、成本较低、便于表型快速观察等优势，现已发展成为高通量基因筛选与功能研究的强有力工具。
由于VIGS技术是抗病毒RNA沉默机理的一种外在应用形式，两者原理共通，VIGS沉默效率可以准确反映出RNA沉默程度，因此以模式植物矮牵牛为研究对象，以VIGS技术为实验手段，采用候选转录因子与报告基因联合构建方式，以可观察的报告基因沉默表型差异作为判断依据，是一种筛选调控抗病毒RNA沉默途径关键转录因子的新方法。发明人前期研究发现，将矮牵牛抗病毒RNA沉默正调控转录因子PhOBF1和PhERF2基因片段构建至TRV-PhPDS载体中，侵染后导致光漂白表型受到抑制，提高了病毒积累量，并降低了RNA沉默通路中相关基因的表达水平，从而在理论和实践上证明了该方法的有效性。目前，该筛选方法还存在如下不足和缺陷：1)用于抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选的候选基因来源十分缺乏；2)在VIGS技术中用于监测抗病毒RNA沉默过程的报告基因类型尚待确定；3)以VIGS沉默表型为关键转录因子的判断依据仍然不够细化。
发明内容
针对上述现有技术不足与缺陷，本发明的目的在于，提供一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选方法及其应用，解决了现有技术中存在的操作繁琐、成本偏高、灵敏度较差、筛选效率低下、针对基因单一等问题。
为了达到上述目的，本申请采用如下技术方案予以实现：
本发明公开一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，包括以下步骤：
步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；
步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；
步骤3：以烟草脆裂病毒为载体，绿色荧光蛋白和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体中，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；
步骤4：将烟草脆裂病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；
以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。
具体的，步骤1中采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株具体包括：首先采集保存烟草脆裂病毒的活体植株叶片，研磨后加入磷酸缓冲液，过滤，制备病毒侵染液；
接着在4-6叶期的矮牵牛植株幼嫩叶片表面撒上金刚砂，采用机械摩擦法，蘸取病毒侵染液，在叶片表面轻抹数次进行病毒接种。
具体的，所述磷酸缓冲液浓度为95～105mM，pH为6.8～7.2。
进一步的，步骤3具体包括：采用酶切连接法，首先将矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因片段构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白载体SacI、XhoI酶切位点之间，形成烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体，然后将候选转录因子的基因片段构建至载体的BamHI、KpnI酶切位点之间，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒。
具体的，步骤4中所述农杆菌菌株为GV3101。
具体的，步骤4中接种的矮牵牛小苗放在20℃光照时长15～17h，18℃黑暗时长7～9h条件下培养。
本发明还公开了植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法筛选得到的转录因子。
本发明还公开了采用所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法进行筛选植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子的应用。
本发明与现有技术相比，有益的技术效果是：
本发明依据高通量的转录组学和VIGS瞬时沉默技术，在获得大量受病毒侵染差异表达的候选转录因子基因来源的基础上，进而通过VIGS方法开展目标转录因子筛选，并利用可视化的报告基因GFP和PhPDS引起的表型，同时监测病毒抗性和RNA沉默过程，与传统的酵母单杂交筛选方法相比，具有操作简便、成本低廉、筛选效率高、针对性强等优点，且容易筛选到调控单一或多个RNA沉默功能基因的关键转录因子。本发明可为获得植物抗病毒RNA沉默相关转录因子，进一步解析基于RNA沉默的抗病毒转录调控机制提供崭新途径。
附图说明
图1为植物抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选示意图。
图2为用于转录组测序的TRV病毒侵染不同时期矮牵牛叶片，即野生型矮牵牛植株接种TRV病毒0(S0)、3(S3)、6(S6)天的叶片症状。
图3为TRV病毒侵染的矮牵牛差异表达基因数量统计；(a)TRV病毒接种不同时期差异表达基因数量。Up，上调；Down，下调。(b)TRV病毒接种不同时期差异表达基因数量维恩图。
图4为基于TRV-GFP-PhPDS体系的矮牵牛抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选；接种不同TRV-GFP-PhPDS构建的矮牵牛叶片绿色荧光信号(左，接种4天后)及光漂白表型(右，接种3周后)；图中方框标记为筛选出的抗病毒RNA沉默正调控转录因子构建侵染后的植株情况。
图5为候选转录因子的VIGS沉默影响矮牵牛叶片绿色荧光统计，即接种不同TRV-GFP-PhPDS构建4天后的矮牵牛叶片相对荧光区域。
图6为候选转录因子的VIGS沉默影响矮牵牛叶片光漂白表型统计，即接种TRV-GFP-PhPDS不同构建3周后的矮牵牛光漂白叶片占所有叶片的百分率。
以下结合附图和实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：采用烟草脆裂病毒(TRV)接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立TRV病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；
步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；
步骤3：以TRV病毒为载体，绿色荧光蛋白(GFP)和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因(PhPDS)为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至TRV-GFP-PhPDS载体中，得到TRV病毒载体的重组质粒；
步骤4：将TRV病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；
以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。
在本发明中，TRV病毒属于双粒正向RNA杆状病毒，核酸结构包括TRV1和TRV2，相应的TRV病毒载体分别是TRV1和TRV2载体，它们是携带35S启动子的双元转化病毒载体。TRV2载体上含有多克隆位点，可用于目标基因片段的插入构建，而在VIGS具体应用的时候，还需要和TRV1载体共同接种，才能成功实现VIGS沉默。
TRV病毒是一种寄主范围较广的常见植物病毒，可造成叶片失绿、花瓣畸形、植株矮小等症状，严重影响植物生长及产品质量。人工改造的TRV病毒载体是VIGS技术应用的诸多载体之一，具有沉默效率高、侵染症状小、持续时间长等优点，因此广泛用于不同类型植物的候选基因筛选及功能鉴定。
矮牵牛是分子生物学研究的常用模式植物，也是最早发现RNA沉默现象的植物之一，其生命周期短，遗传背景清晰，稳定遗传转化及VIGS技术成熟，且全基因组测序完成，可提供充分的基因序列信息，这为植物抗病毒RNA沉默转录调控机理的深入研究提供了良好的平台。
“极显著上调表达”或“极显著下调表达”是指在转录组数据中基因差异表达较大的类型，即范围在十几倍至上百倍之间的基因表达变化，在“极显著”的筛选条件下，可更大概率获得所需要的抗病毒RNA沉默的候选转录因子，用于后续的VIGS技术筛选，即有效缩小了筛选范围。
“非抗性相关基因”是指其所属的转录因子家族或同源基因被诸多研究证实，与植物抗病毒或抗其它病原菌不具有明显的相关性，其调控抗病毒RNA沉默的可能性较小，需要排除。
“农杆菌介导法”是指以植物的分生组织、生殖器官等作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。
“酶切连接法”是指通过酶切的方式将DNA片段构建至特定载体上的方法，主要用于基因工程中，其基本原理是限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
在本发明中所用到的TRV病毒菌株分离自感染该病毒的烟草植株，人工改造的病毒载体由美国加州大学戴维斯分校蒋才忠教授提供，矮牵牛品种‘Primetime Blue’种子购自美国Goldsmith Seed公司，限制性内切酶、抗生素、乙酰丁香酮等试剂均购自国内生物科技公司。
实施例1
结合图1，本实施例给出一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：采用烟草脆裂病毒(TRV)接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立TRV病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；
具体包括：1)采集保存TRV病毒的活体植株叶片，在研钵中研磨成糊状，加入95～105mM，pH为6.8～7.2的的磷酸缓冲液，具体可以为100mM，pH＝7.0，利用2-3层无菌纱布过滤，制备TRV病毒侵染液；
2)接着在4-6叶期的矮牵牛植株幼嫩叶片表面撒上少许金刚砂(400-600目)，采用机械摩擦法，用纱布蘸取少量病毒侵染液，在叶片表面轻抹2-3次，用无菌水将叶片冲洗干净，完成病毒接种；
3)分别在接种后0(S0)、3(S3)、6(S6)天采集叶片样品(图2)，每个样品设置3个重复，提取总RNA，送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Illumina转录组测序分析，建立病毒侵染的矮牵牛差异表达基因数据库；
步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；
具体的，转录组数据分析显示，在TRV病毒侵染的每个时期样本，分别产生145,011,112、121,488,068、120,055,408个原始reads，去除接头序列、模糊不清及低质量reads，分别最终获得141,740,216、118,866,564、117,466,686个高质量reads，通过进一步de novo组装，共计产生34,486个unigenes，其中32,928个unigenes能够匹配于矮牵牛基因组序列，1,558个unigenes为新基因(表1)。
表1.TRV病毒侵染的矮牵牛叶片转录组数据统计
Figure BDA0003479452630000061
Figure BDA0003479452630000071
为了鉴定TRV病毒的矮牵牛叶片差异表达基因，以fold change(FC)≥2.0和falsediscovery rate(FDR)≤0.05作为筛选标准，对比分析了3个不同侵染时期的unigenes表达水平。
结果显示，在S0-vs-S3时期，3,413个基因上调表达，1,275个基因下调表达；在S0-vs-S6时期，4,153个基因上调表达，1,782个基因下调表达；在S3-vs-S6时期，895个基因上调表达，784个基因下调表达(图3a)。维恩图显示TRV病毒侵染的矮牵牛叶片转录组总共产生7,402个显著差异表达基因(图3b)。基于基因差异表达水平，并将抗病毒RNA沉默正调控因子作为重点筛选方向，从中选择39个受TRV病毒侵染极显著上调表达的候选转录因子，用于后续的VIGS筛选实验(表2)。
表2.选择的39个用于后续筛选的抗病毒RNA沉默相关候选转录因子
Figure BDA0003479452630000072
Figure BDA0003479452630000081
步骤3：以TRV病毒为载体，绿色荧光蛋白(GFP)和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶(PhPDS)基因为报告基因(GFP标记病毒积累，PhPDS标记RNA沉默)，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至TRV-GFP-PhPDS载体中，得到TRV病毒载体的重组质粒；
具体包括：以矮牵牛cDNA为模板，分别PCR扩增100-400bp长度的PhPDS(NCBI登录号：KP677483)和候选转录因子基因片段，胶回收及纯化PCR产物，采用酶切连接法，首先将矮牵牛PhPDS基因片段构建至基于TRV2载体的TRV2-GFP载体SacI、XhoI酶切位点之间，形成TRV2-GFP-PhPDS载体，然后将步骤2获得的39个候选转录因子的基因片段构建至TRV2-GFP-PhPDS的BamHI、KpnI酶切位点之间，得到39个TRV病毒载体的重组质粒。
步骤4：将TRV病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；
以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子的基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子，完成筛选。
进一步的，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗的具体步骤包括：1)采用电激法将上述39个TRV病毒载体(TRV2)的重组病毒质粒转化进农杆菌菌株GV3101中，将菌液均匀涂于含有抗生素卡那霉素(40mg/L)的LB固体培养基上，倒置于28℃培养箱中培养，待2天后长出菌斑，用无菌牙签挑取单菌落，置于添加相同浓度抗生素的LB液体培养基中摇菌，通过菌液PCR验证菌落是否阳性，将阳性菌液与甘油混合后保存于-80℃备用。
2)吸取上述39个重组质粒的农杆菌菌液少许，置于含有40mg/L卡那霉素、20mg/L庆大霉素、10mM MES盐、20μM乙酰丁香酮的LB液体培养基中，28℃、180rpm进行过夜震荡培养，并吸取少量保存的转化有TRV1载体的农杆菌同时摇菌；
3)取出1ml菌液用紫外分光光度计测量其OD600值，常温、4000rpm离心20分钟，倒掉上清液，保留菌沉淀，加入渗透缓冲液(10mM氯化镁、10mMMES盐、200μM乙酰丁香酮)，将OD600值调至4.0，置于摇床上轻轻震荡3-4小时，使菌沉淀重悬浮；
4)将转化有TRV1和TRV2重组质粒的菌液按1:1比例混合均匀，使用一次性无菌注射器将菌液接种至4-6叶期矮牵牛叶片背面，得到39个接种后的矮牵牛小苗。接种转化有TRV1和TRV2-GFP-PhPDS空载体的混合农杆菌菌液作为对照。将上述接种的矮牵牛小苗放在20℃光照时长16h，18℃黑暗时长8h条件下培养。
进一步的，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度结果分析如下：
接种4天后，使用手提式LUYOR-3430激发光源照射矮牵牛叶片，在滤光镜辅助下，观察GFP表达的绿色荧光信号强度，统计绿色荧光区域相对面积。
结果显示，与接种TRV-GFP-PhPDS植株相比，携带转录因子基因PhARF11、PhbHLH41、PhbHLH93、PhZPT4-3、PhCOL4、PhGATA11、PhHSF-B3A、PhLOB1、PhNAC90和PhWRKY75的TRV-GFP-PhPDS接种植株，显示了增强的绿色荧光信号(图4)以及较大的荧光区域相对面积(图5)，表明这些转录因子基因的VIGS沉默提高了TRV病毒积累。
接种3周后，观察矮牵牛植株系统侵染叶片中PhPDS基因沉默引起的光漂白表型情况，统计光漂白叶片占所有叶片百分率。
结果显示，与接种TRV-GFP-PhPDS植株相比，携带转录因子基因PhbHLH41、PhbHLH93、PhZPT4-3、PhZAT10、PhCOL4、PhBBX20、PhERF3、PhKD1-3、PhHSF-B3A、PhHSF-B3B、PhNAC90、PhJUB1B和PhWRKY75的TRV-GFP-PhPDS接种植株，显示了抑制的光漂白表型(图4)以及较小的光漂白叶片百分率(图6)，表明这些转录因子基因的VIGS沉默抑制了报告基因沉默效率。
综合以上结果，最终发现7个转录因子基因PhbHLH41、PhbHLH93、PhZPT4-3、PhCOL4、PhHSF-B3A、PhNAC90和PhWRKY75的VIGS沉默，导致了绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制，基于已制定的抗病毒RNA沉默相关转录因子筛选依据，因此将这7个转录因子判定为抗病毒RNA沉默正调控转录因子。
上述步骤为抗病毒RNA沉默正调控转录因子的筛选实施例，同理，关于负调控转录因子的筛选可按如下步骤进行：首先在TRV病毒侵染的差异表达基因数据库中，选择极显著下调表达的候选转录因子，用于TRV-GFP-PhPDS载体构建；农杆菌介导侵染矮牵牛后，观察叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和原理，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，所述植物抗病毒RNA沉默相关转录因子包括植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株，接种后取样，利用转录组测序技术建立烟草脆裂病毒侵染的矮牵牛叶片差异表达基因数据库；
步骤2：从所述矮牵牛叶片差异表达基因数据库中选择极显著上调表达的转录因子和极显著下调表达的转录因子，排除非抗性相关基因，剩余作为候选转录因子；
步骤3：以烟草脆裂病毒为载体，绿色荧光蛋白和矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因为报告基因，将步骤2中所述候选转录因子的基因片段依次构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体中，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒；
步骤4：将烟草脆裂病毒载体的重组质粒转化进农杆菌菌株中，利用农杆菌介导法注射接种矮牵牛小苗，观察接种后矮牵牛小苗叶片绿色荧光信号强度及系统叶片光漂白表型程度；
以绿色荧光和光漂白表型作为筛选依据，在上调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光增强、光漂白表型受到抑制的基因认定为植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子；在下调表达的转录因子基因中，导致绿色荧光减弱、光漂白表型受到促进的基因认定为抗病毒RNA沉默负调控转录因子，完成筛选。
2.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤1中采用烟草脆裂病毒接种矮牵牛植株具体包括：首先采集保存烟草脆裂病毒的活体植株叶片，研磨后加入磷酸缓冲液，过滤，制备病毒侵染液；
接着在4-6叶期的矮牵牛植株幼嫩叶片表面撒上金刚砂，采用机械摩擦法，蘸取病毒侵染液，在叶片表面轻抹数次进行病毒接种。
3.如权利要求2所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液浓度为95～105mM，pH为6.8～7.2。
4.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤3具体包括：采用酶切连接法，首先将矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶基因片段构建至烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白载体SacI、XhoI酶切位点之间，形成烟草脆裂病毒-绿色荧光蛋白-矮牵牛八氢番茄红素脱氢酶载体，然后将候选转录因子的基因片段构建至载体的BamHI、KpnI酶切位点之间，得到烟草脆裂病毒载体的重组质粒。
5.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤4中所述农杆菌菌株为GV3101。
6.如权利要求1所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法，其特征在于，步骤4中接种的矮牵牛小苗放在20℃光照时长15～17h，18℃黑暗时长7～9h条件下培养。
7.一种由权利要求1～6任一所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法筛选得到的转录因子。
8.一种采用权利要求1～6任一所述的植物抗病毒RNA沉默相关转录因子的筛选方法进行筛选植物抗病毒RNA沉默正调控转录因子和植物抗病毒RNA沉默负调控转录因子的应用。
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