CN103045611B - 高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及含所述基因SbbHLH1的植物表达载体pSTART，还公开了所述基因及其植物表达载体在培育低木质素含量、高纤维素和半纤维素含量植物中的应用。实验比较分析证实，转入本发明所述高粱bHLH类转录因子基因SbbHLH1的转基因植株的木质素含量明显降低，且纤维素和半纤维素含量升高。预示本发明在应用于培育低木质素含量的能源植物中具有重要意义和社会及经济价值。

Description

高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及其应用。

背景技术

木质纤维素生物质是生物燃料的重要来源。主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。其中，纤维素和半纤维素可以被纤维素酶和半纤维素酶降解，发酵后可产生生物燃料（如乙醇、丁醇等）。而木质素不能被纤维素酶、半纤维素酶降解，并且经强酸、碱预处理后，虽然可以提高纤维素酶解效率，但其分解后产生的小分子酚类物质等产物对发酵过程还有一定的抑制作用。利用强酸、碱处理原材料，成本很高，环境污染严重，今后发展并不可取。因此，培育低木质素含量的植物新品种可以极大的减少预处理强度，降低生产成本，减少污染，增强纤维素酶的效率，提高乙醇的产量。是今后能源植物选育的重要方向之一。

利用转基因技术改良植物，将木质素含量调控基因转入植物中，以此开发低木质素、高纤维素、半纤维素含量的转基因植物新品种，用于生物能源制造是一项具有广阔应用前景的技术。

利用基因工程技术开展植物木质素合成调控方面研究已取得了较大的的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于进行降低木质素含量研究。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与木质素合成调控相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的木质素含量明显下降。

目前，已发现了一些表达改变之后能显著降低植物木质素含量的基因，其中包括木质素合成基因以及转录因子基因，转录因子之中又包括正调控和负调控因子。可通过直接阻断木质素的合成途径来降低木质素含量，也可以通过抑制某些正调控基因或者增强其他正调控基因的活性达到相同的目的。研究表明，针对不同的基因采用抑制或增强表达的策略，可以明显降低植物的木质素含量。

bHLH类转录因子是一类非常重要的蛋白质，根据序列特征可分为多种类型，已知的不同类型bHLH蛋白在植物中具有多种多样的功能，包括参与次生代谢产物的合成调控。但是高粱中bHLH基因的功能尚无研究，参与木质素合成的bHLH基因也未见报道。

发明内容

针对已有技术的不足，本发明的目的是提供一种高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及其应用。

本发明的技术方案在于从高粱中分离得到bHLH类转录因子基因——高粱bHLH类转录因子基因SbbHLH1，然后将该基因转到高粱等植物中以获得低木质素含量植物，作为制造生物能源的原料。

本发明提供的高粱木质素合成调控基因SbbHLH1，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种含有上述高粱木质素合成调控基因SbbHLH1的植物表达载体pSTART。

本发明所述高粱木质素合成调控基因SbbHLH1及含所述高粱木质素合成调控基因SbbHLH1的植物表达载体pSTART，在培育低木质素含量、高纤维素和半纤维素含量植物中的应用。

其中：上述植物优选是高粱或拟南芥

本发明所述的基因可广泛用于培育低木质素含量、高纤维素和半纤维素含量的植物品种。实验证实，将本发明所述基因导入植物细胞，就可以获得木质素含量较低的植物，同时伴随了的纤维素和半纤维素含量的增加（详见实施例及附图）。

为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对本发明中优选的含有所述基因SbbHLH1的植物表达载体pSTART进行加工，如可以加入选择标记（GUS等）或者具有抗性的抗生素标记物（潮霉素、bar基因、庆大霉素等）等。事实上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用本发明。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了高粱木质素合成调控基因——高粱bHLH类转录因子基因SbbHLH1，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入高粱和拟南芥，经过实验比较分析证明，转基因植株的木质素含量明显降低，且纤维素和半纤维素含量升高。预示本发明在应用于培育低木质素含量的能源植物中具有重要意义和社会及经济价值。

附图说明

图1SbbHLH1的蛋白结构及其表达特点

A:bHLH结构域位于SbbHLH1的76至128氨基酸残基；B：SbbHLH1基因在13种高粱bmr突变体中的表达情况，该基因至少在其中8种突变体中的表达量上调；C：SbbHLH1基因在高粱根茎叶中的表达分析，木质素化最强的的茎中的表达量最高。

图2SbbHLH1与其他植物中bHLH蛋白的序列同源性分析。SbbHLH1与燕麦中的Si_002720m同源性最高（92%）。

图3SbbHLH1在洋葱表皮中的瞬时表达

A-C：GFP蛋白对照均匀分布于整个洋葱表皮细胞中；B-D：SbbHLH1与GFP的融合蛋白集中分布于膜结构和细胞核中。

图4SbbHLH1的转录活性分析。黑色块为bHLH结构域，以SbbHLH1蛋白的不同部分构建在转录活性分析载体中，发现其转录活性取决于N端氨基酸残基1-75部分。

图5pSTART-SbbHLH1表达载体的构建及验证。M：分子量标准；1：SbbHLH1的PCR验证；2：大肠杆菌提取质粒的酶切结果；3：农杆菌提取质粒的酶切结果。均获得了目的条带。

图6拟南芥中过表达SbbHLH1有效降低了木质素含量。

A：转基因拟南芥的鉴定，转基因植株中扩增出了SbbHLH1特异的条带；B：过表达SbbHLH1的拟南芥株系植株强度明显下降，容易倒伏；C：木质素特异染色显示过表达SbbHLH1的转基因拟南芥木质素含量明显低于野生型和载体对照拟南芥；D：木质素含量的定量分析，转基因拟南芥的木质素含量明显低于野生型对照。WT：野生型拟南芥；VC：载体对照转基因拟南芥；OE1，OE2：两个SbbHLH1转基因拟南芥株系。

图7SbbHLH1转基因拟南芥中木质素合成基因和正调控基因的表达分析。

A：木质素合成相关基因的半定量RT-PCR分析，PAL1、4CL1、HCT、COMT、CCR1的表达量下降；B：木质素合成正调控基因的半定量RT-PCR分析，NST1、NST2、MYB46、MYB83、MYB58、MYB63的表达量上升；C：以上基因的定量PCR分析，表明木质素合成基因的表达量确实降低，而正调控基因的表达上升。WT：野生型拟南芥；OE1，OE2：两个SbbHLH1转基因拟南芥株系。

图8SbbHLH1在拟南芥中的表达还影响了类黄酮、花青素以及纤维素和半纤维素的合成。A：类黄酮合成基因的半定量RT-PCR分析，CHI和UGT的表达下调，FLS基因的表达上调；B：CHI和FLS基因的定量PCR分析，CHI在两个转基因株系中明显下调，而FLS基因则明显上调；C：类黄酮含量的测定，在两个转基因拟南芥株系中均明显下降；D：花青素含量的测定，在其中一个株系中明显低于野生型；E：纤维素含量在两个转基因株系中均明显增加；F：半纤维素含量在两个转基因拟南芥中明显上升；WT：野生型拟南芥；OE1、OE2：两个SbbHLH1转基因拟南芥株系。

图9SbbHLH1的作用模式。

A：在不含有过表达SbbHLH1的情况下，NST同源基因正调控木质素合成的MYB正调控因子，后者与木质素合成基因的启动子元件相结合从而促进了木质素的合成；B：当SbbHLH1在拟南芥中过表达之后，SbbHLH1可能直接与MYB转录因子竞争结合木质素合成基因启动子上相同的順式作用元件，或者与MYB转录因子结合成为复合体，从而抑制了木质素合成基因的转录，导致木质素合成下降。MYB转录因子的表达可能由于反馈调节作用而上升表达，但是并不能挽回木质素含量下降的趋势，说明SbbHLH1在木质素合成调节中具有主导地位。

具体实施方式

实施例1、SbbHLH1的克隆

I.高粱总RNA的提取

(1)将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，混匀后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡样品，使样品充分裂解，室温放置5min；

(3)加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15s，室温放置10min后4°C，12,000rpm离心15min；

(4)用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，再加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20°C,沉淀30min或过夜；

(5)4°C，12,000rpm离心10min，小心弃去上清液；

(6)RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4°C，8,000rpm离心10min收集沉淀；

(7)重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；

(8)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15min，RNA略显透明，加入适当体积（30-50μl）的RNase-free水充分溶解(可放于-80°C长期保存)；

(9)紫外分光光度计及1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，

1OD=40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9-2.1之间)。

b)用1%琼脂糖凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65°C变性5min。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNA Marker作为对照。

II.RNA中基因组DNA的去除

1)在冰上配置：

RNA提取产物20μg

10×DNase buffer4μl

DNase1μl

H₂O Up to 40μl

37°C孵育30分钟

2)加入60μl H₂O，使得总体积增大为100μl；

3)加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30°C下静置10分钟；

4)12,000g 4°C离心10分钟；

5)小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇，洗涤离心管管壁，12,000g 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇；

6)室温干燥沉淀2～5分钟，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。

III.cDNA反转录

1.所有试剂：

M-MLV逆转录酶(TakaRa)，

dNTPs(10mM each)，oligo(dT)18(500μg/ml)(TakaRa)

RNasin(40U/μl,TakaRa)

Ex Taq酶(5U/μl,TakaRa)

2.方法：

1)在离心管中配制下列模板RNA/引物混合液：

模板RNA（total RNA）5μg

Oligo（dT）18primer(50μM)1μl

RNase free dd H₂O Up to 13.5μl

2)70°C保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上；

3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部；

4)在上述离心管中配制下列反转录反应液：

上述模板RNA/引物变性溶液13.5μl

5×M-MLV buffer4μl

dNTP Mixture(各10μM)1μl

RNase inhibitor（40U/μl）0.5μl

RTase M-MLV（RNase H-）（200U/μl）1μl

5)42°C保温1小时；

6)70°C保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可用于RT-PCR及基因序列的克隆，PCR扩增时cDNA溶液的使用量建议使用1μl-2μl。

IV.PCR扩增目标基因

PCR反应体系

cDNA或模板1μl

10×PCR buffer2μl

dNTP0.5μl

Sense primer0.5μl

Antisense primer0.5μl

Taq0.2μl

H₂O Up to20μl

PCR反应程序

94°C5min

94°C30s

55°C30s 37 cycles

72°C2min

72°C10min

10°C保存

引物序列为：

HLH-XbaI-fF1AGTCTAGACATAGGCGTTCCAAATAGC

HLH-BamHI-fR1TAGGATCCTCTTCCCAGGTAAACAGTCC

v.PCR产物的克隆

1.电泳

扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，缓冲液为TAE[每升TAE含4.84gTris碱，1.14ml乙酸，100ml 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)]，在长波光紫外灯下切下预期大小的DNA片段。

2.凝胶电泳中DNA片段的回收

1)用干净刀片切下含有目的DNA片段的琼脂胶块，放入1.5ml离心管；

2)按300μL/100mg的比例加入琼脂糖凝胶溶胶Buffer，置于50-60°C水浴中10分钟使胶彻底融化。加热溶胶时,每隔2分钟充分混匀一次；

3)将融化的胶溶液转移到已经插到2mL收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟；

4)12000rpm室温离心1分钟；

5)取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放入同一个收集管中；

6)加入700μl含乙醇的纯化buffer，12000rpm室温离心1分钟；

7)加入500μl纯化buffer，12000rpm室温离心1分钟；

8)将UNIQ-10柱放入一个新的1.5mL的离心管中，在柱子膜中央加入70°C预热的水，室温或37°C放置2分钟；

9)12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20°C备用。

3.连接反应

选用pMD18-T，连接体系为如下：

pMD18-T0.5μl

PCR回收产物100-200ng

10×T4DNA ligation buffer1μl

T4 ligase1μl

H₂O Up to10μl

混匀后4-16°C连接过夜，进行转化。

4.感受态制备

1)取-80°C保存的DH5α菌种200μl，加入10ml LB培养基，37°C振荡培养过夜；

2)取500μl过夜培养的菌液加入到50ml LB培养基中，37°C振荡培养2-4小时至OD600=0.6，冰浴30min；

3)4°C,4000g离心5分钟，弃上清，沉淀用2ml冷的无菌0.1mol/L MgCl₂重悬；

4)4°C,4000g离心5分钟，弃上清，沉淀用5ml冷的无菌0.1mol/L CaC1₂重悬，冰浴20min；

5)4°C,4000g离心5分钟，弃上清，沉淀用1ml冷的无菌0.1mol/L CaC1₂(含15-20%甘油)重悬，分装后-80°C保存。

5.转化

1)取100μl感受态细胞，冰上解冻，均匀悬浮；

2)加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上静置30分钟；

3)42°C水浴中热击60-90秒后，冰上放置2分钟；

4)加入900μl LB液体培养基，37°C,200-250rpm振荡培养1小时；

5)室温，4000g离心5分钟，弃950μl上清，剩余上清悬浮细胞；

6)将50μl悬浮细胞涂布在含有合适抗生素、诱导物、底物的LB固体培养基上，37°C培养16-24小时；

7)克隆产物的鉴定采用PCR的方法，以不加模板的PCR体系为阴性对照。

VI.重组克隆的筛选

1.用菌落PCR法筛选有插入片段的克隆

1)挑取转化后白色菌落在平板上划短线，同时挑一个没有插入片段的菌落作对照，37°C培养过夜；

2)培养皿上长出的菌体可作为PCR反应的模板。用牙签刮取少量的菌体转入20μlPCR反应液中，用M13F和M13R引物进行PCR扩增鉴定；

3)扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳(缓冲液为TAE)后，在长波光紫外灯下观察是否有预期大小的DNA片段；

4)挑出有扩增预期大小的DNA片段的菌落微量提取质粒酶切验证。

2.质粒DNA的小量制备

1)挑取单菌落至5ml LB培养液中(含100pg/ml的氨苄青霉素)，37°C,200rpm摇床上过夜培养；

2)取出1.5ml细菌培养物移至离心管中，12,000rpm离心1分钟；

3)将细菌沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶液I中，(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl,pH 8.0,10mmol/L EDTA)，强烈震荡混匀，放置冰上5分钟；

4)加入200μ1溶液II(0.2mol/L NaOH,1%SDS新鲜配置)，上下轻柔颠倒5次，放置冰上5分钟；

5)加入150μ1溶液III(600ml 5mol/L KAc,1.5ml冰醋酸，蒸馏水28.5ml)，上下轻柔颠倒5次，冰上放置5分钟；

6)12,000rpm离心10分钟，取上清移至另一离心管中；

7)加入等体积的酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，12,000rpm离心2分钟，取上清移至另一离心管中；

8)加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3mol/L醋酸钠(pH 5.2),颠倒混匀，室温下放置2分钟沉淀，12,000rpm于4°C离心10分钟；

9)弃上清，加入1ml 70%乙醇振荡漂洗沉淀，12,000rpm离心2分钟，弃上清，超净台上吹干沉淀后，溶解于30μl超纯水(含20pg/ml的RNase)中，用于酶切。

3.重组克隆的酶切鉴定

用限制性内切酶进行酶切鉴定，看能否得到预期的目的片段。

质粒3-5μg

10×限制性酶切缓冲液5μl

每种限制性酶(考虑是否共用缓冲液，酶的总体积不要超过反应体系的10%，以避免甘油浓度过高）20U-30U

用无核酸酶纯水补足总体积Up to50μl。

实施例2.半定量RT‐PCR

以野生型高粱BTx623，及bmr突变体的cDNA为模板，用高粱Actin或Tublin基因的特异性引物进行PCR扩增，调节模板的添加量，直至不同样品扩增出的条带亮度一致，即认为模板的添加量是均一的。用基因特异性引物进行PCR扩增，使用调节好的模板添加量，选取合适的循环数，使条带差异显著，从而确定该基因表达的变化情况。

实施例3.基因的表达模式分析

I．材料

野生型高粱BTx623，及13个bmr突变体（bmr,bmr6,bmr12,bmr29,bmr30,bmr31,bmr32,bmr33,bmr34,bmr35,bmr36,bmr45和bmr49）七叶期的叶片材料；野生型高粱幼苗的根、茎、叶。

II．目的基因的RT-PCR

1)提取高粱样品的总RNA，并去除其中的DNA污染（方法同前）；

2)取5μg总RNA经行反转录；

3)以cDNA为模板进行RT-PCR：现将cDNA稀释10倍，用Actin和Tublin基因引物进行RT-PCR扩增。比较PCR不同的循环数(22，26，28)时各样品之间转录水平的差异。并以此作参照，微调用作模板的不同来源的cDNA的量，以达到Actin和Tublin基因引物进行RT-PCR扩增时，不同来源的PCR产物等量。之后进行RT-PCR扩增，以比较SbbHLH1基因在高粱野生型BTx623和bmr突变体中基因转录水平的变化趋势。引物序列为：

HLH-qF1：ACGACGACTACGACATACAC

HLH-qR1：GAAACAATGGGAGTTACGA。

实施例4.基因亚细胞定位

I：洋葱表皮亚细胞定位分析

1.材料

1)p326GFPs绿色荧光蛋白植物瞬时表达载体

2)洋葱

2.方法

p326GFP:35s::目的基因的载体构建

1)以引物（HLH-HindIII-F1 CCCAAGCTTATGGACCATCAGCTGTTCGAC，HLH-XhoI-R1CCGCTCGAGCGCCCCTGCTTTCTTCCTGAC）扩增目的基因的ORF（去除终止子）;

2)PCR扩增目的片段并电泳回收；

3)载体及目的片段的酶切；

4)酶切产物的回收、连接、转化、鉴定及测序，方法见前。

无内毒素的质粒提取

按macherey-nagel公司的Endotoxin-free plasmid DNA Purification Kit，（Xtra Midi EF）说明书进行，

1)将菌落划线后培养，挑取单菌落于10ml加了相应抗生素的LB培养基，37°C，200-250rpm振荡培养过夜,转接1/1000体积的菌液于新鲜的加了抗生素的LB培养基中震荡培养至OD600为4左右；

2)4°C 4,500–6,000g离心≥10min收集菌体；

3)将RNaseA提前加入重悬Buffer RES-EF中并混匀,加入8mL重悬Buffer RES-EF+RNase A，振荡混匀，使菌体沉淀重悬。注意不能留有菌体团，这样会影响裂解效果；

4)首先确认裂解Buffer LYS-EF中是否有SDS沉淀,如果溶液中有白色沉淀存在，将溶液30–40°C孵育几分钟直至沉淀全部溶解,然后将溶液冷却至室温(18–25°C)备用；

5)向重悬液中加入8mL裂解Buffer LYS-EF，轻柔的颠倒混匀5次,不要涡旋振荡以免染色体DNA被释放到液体中,室温(18-25°C)放置5min；

6)沿着filter的边缘加入15mL平衡Buffer EQU-EF,以平衡Xtra Column和里面的column filter,确保整个filter都被浸湿,将column垂直放置，使内部的液体通过重力作用排除；

7)向菌体重悬液中加入8mL中和BufferNEU-EF并迅速颠倒混匀10-15次,不要涡旋振荡,冰上静置5min≥5,000g离心10min；

8)将上清加入到Xtra Column Filter中，通过重力作用使column中液体清空；

9)沿着filter的边缘加入5mL Filter洗涤Buffer FIL-EF，使得filter上的细胞裂解产物被溶液洗过,通过重力作用使液体流过;

10)将Xtra Column中的filter去除；

11)加入35mL洗涤Buffer ENDO-EF洗Xtra ColumnIt。通过重力作用使液体流过；

12)加入15mL洗涤Buffer WASHEF洗Xtra ColumnIt。通过重力作用使液体流过；

13)将加入5mL预热到50°C的洗脱Buffer ELU-EF，用干净的15mL或50mL的离心管收集洗脱液；

14)选作：用UV分光光度法检测质粒的产量，以达到调节DNA最终浓度的目的；

15)向洗脱液中加入3.5mL室温的异丙醇，涡旋混匀后静置2min,4°C,15,000g离心30min,弃上清；

16)加入2mLendotoxin-free 70% ethanol清洗沉淀,5000g室温离心5min；

17)弃上清，并用移液枪小心地将液体清除干净。室温放置10-15min，使沉淀风干；

18)加入适量的Buffer TE-EF或H2O-EF溶解DNA沉淀；

19)通过UV分光光度法检测质粒浓度，并用凝胶电泳检测质粒的完整性。

洋葱表皮的铺板

将新鲜的洋葱，用刀片和镊子将新鲜内表皮2×2cm内层向下平铺在1/2MS固体培养基上，用于基因枪轰击。

钨粉的制备

1)称取60mg钨粉放入以1.5ml的离心管中；

2)加入1ml 70%的酒精，充分涡旋震荡15分钟，13,000rpm离心3分钟，去除上清；

3)重复步骤2)一次；

4)加入1ml无菌水重悬沉淀，13,000rpm离心3分钟，去除上清；

5)重复步骤4)三次；

6)加入1ml无菌水重悬沉淀，-20°C保存备用。

质粒的包埋

1)将10μl金粉(60mg/ml),0.5μg质粒、4μ1亚精胺和8μ10.2Mol/L CaC1₂加入一个灭菌的离心管涡旋震荡3分钟；

2)将管放在冰上10分钟；

3)加入140μl无水乙醇，充分涡旋震荡后，12,000rpm离心10秒；

4)去掉上清液，加入140μl 70%乙醇，涡旋震荡后，12,000rpm离心10秒；

5)去掉上清液，加入20μl 100%乙醇，将管放在冰上备用。

基因枪轰击

1)将高压气体基因枪放置在一个较大型号的超净台上，打开超净台的紫外灯，灭菌30分钟以上；

2)用浸泡消毒法将可裂膜（Rupture disk,1100psi）、载体膜（Macrocarrier）、阻挡网（Stopping screen）于无水乙醇中消毒15分钟，然后置于无菌滤纸上，在超净台中吹干；

3)打开氦气体瓶阀，调节压力至1300psi（高压表头数值）；

4)安装可裂膜于其托座上，顺时针拧到气体加速器上；

5)用20μl移液器将5μl制备好的DNA子弹微粒滴于载体膜正中上，吹干；

6)将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环安装好，旋紧盖子，插入基因枪；

7)用镊子将样品皿放入基因枪样品室内的样品架上，关好门;

8)按下真空开关，真空泵开始工作，真空表指示针指示真空度下降，当真空度达到26-28英寸汞柱时，即可按hold按钮，接着按发射钮并保持至听见气体冲破可裂膜的声音为止；

9)关闭真空按钮开关，按下真空释放按钮，使系统卸荷并将样品取出，这样一次基因导入试验完毕；

10)从阻挡板圆孔穴中取出载体膜；接着拧下封口螺母，从圆孔台肩上取出已经穿孔的可裂膜；

11)从步骤4开始重复操作，完成所有样品处理；

12)关机：把氦气瓶总开关旋紧，打一次空枪，到氦气表指针回零后，在逆时针旋转氦压表调解阀，关闭基因枪的总开关及变压器开关；

13)轰击过的洋葱表皮放于避光处24h，用荧光显微镜观察。

II：拟南芥原生质体的亚细胞定位

1.材料

拟南芥原生质体，p326GFPs绿色荧光蛋白植物瞬时表达载体无内毒素的质粒。

2.方法

1)提前2-3天将拟南芥悬浮系转接到新鲜的培养基中；

2)用无菌的药匙取适量的拟南芥悬浮细胞掷入预先配置好的酶解液中，并用镊子帮助，使拟南芥悬浮系完全浸入酶解液；

3)60rpm/min暗培养，随时用显微镜检查溶液中的原生质体，拟南芥原生质体大小大约30-50μm。当大部分原生质体都游离出来后，停止酶解；

4)先用W5溶液润湿35-75um的尼龙网或60-100目镍丝网筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液；

5)将过滤出的液体小心收集到30毫升的圆底离心管中，100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，尽量去除上清然后用10ml冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；

6)在冰上静至原生质体30分钟；

7)100g离心8-10min分钟使原生质体沉淀在管底；

8)在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液；

9)用适量MMG溶液（1ml）重悬原生质体，使之最终浓度在2×10⁵个/ml；

10)在2ml离心管中依次加入10ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA），100μl原生质体（2×10⁴个），轻柔混合；

11)加入110ul PEG溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）；

12)将混合物室温放置5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长的转化时间）；

13)室温下用400-440ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应；

14)室温下用台式离心机100g离心2分钟然后去除上清。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清；

15)用1ml WI溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中；

16)室温下（20-25°C）诱导原生质体18小时以上；

17)激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。

实施例5.基因体外转录活性分析

I.cDNA序列扩增

ORF设计特异性引物,以高粱BTx623cDNA作为模板分别扩增基因的不同片段及全长ORF。扩增片段电泳回收后先连入pEasyblunt载体，再测序。所用引物序列如下：

HLH-F1-EcoRI HLH-732R-BamHI1-732bp

HLH-F1-EcoRI HLH-225R-BamHI1-225bp

HLH-F1-EcoRI HLH-384R-BamHI1-384bp

HLH-226F-EcoRI HLH-732R-BamHI226-732bp

HLH-385F-EcoRI HLH-732R-BamHI385-732bp

II．目的基因-pGBKT7载体构建

BKT7和测序正确的T载体质粒，用EcoR1+BamHI酶切，片段回收后连接，转化DH10B。转化子用菌落PCR和EcoR1+BamHI酶切验证。

III．目的基因-pGBKT7载体的酵母转化

1.酵母感受体制备

1)挑取酵母AH109或Y187单菌落（直径2-3mm）于5ml YPD液体培养基中，30°C振荡培养过夜；

2)将50μl菌液转入50ml YPD培养基中，30°C振荡培养至OD600到0.15-0.30；

3)室温下，700g离心5min，去上清，用50ml YPD重悬菌体；

4)30°C振荡培养至OD600到0.4-0.5，室温700g离心5min，去上清液。加入50ml无菌水重悬，室温700g离心5min；

5)去上清液，用2ml无菌1×TE/LiAc溶液重悬菌体；

6)分装至两个1.5ml离心管中，以12000rpm转速离心15s，去上清液，后加入500μl无菌1×TE/LiAc溶液重悬菌体。

2.小量法转化酵母感受态

1)取50μl酵母感受体，加入5μl变性过的鲑鱼精DNA（100mg/ml），5μl构建好的质粒或对照，500μl无菌PEG/LiAc溶液，轻轻混匀；

2)于30°C振荡培养30min，中间轻轻混匀两到三次；

3)每管中加入50μl DMSO，轻轻混匀，42°C热激15min；

4)以12000rpm转速离心15s，去上清液，加入800YPD液体培养基；

5)30°C振荡培养2h，以12000rpm转速离心15s，去上清液，加入100μl无菌水重悬，涂板；

6)于30°C平板倒置培养2-3d，直到菌落长出。

3.阳性克隆鉴定

挑取单菌落，直接用质粒对应的特异引物做菌体PCR：

20μl体系基因特异sense引物1μl

基因特异antisense引物1μl

2×GC buffer I（Takara）10μl

LA taq（Takara）0.2μl

dNTP（10mM）0.2μl

菌落-水溶液7.6μl

IV．目的基因体外转录活性的鉴定

阳性克隆培养至特定状态后在选择培养基上培养，检测目的基因及基因片段是否有转录活性。

实施例6.拟南芥过表达转基因系的获得

I.过表达载体构建

pSTART载体是一个常用的过表达双元载体。扩增目的基因，产物连入pEasy blunt测序，测序正确的克隆和pSTART载体用XbaI和BamHI或者XbaI和SmaI两种内切酶酶切，回收目的片段，使用T4连接酶把目的基因连入切好的pSTART空载体。连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含有Kan 50μg/ml LB固体平板上37°C过夜培养。菌体PCR鉴定阳性菌落，使用基因特异引物PCR及酶切鉴定。

II．农杆菌感受态制备

1)从YEP平板（含50μg/ml利福平）上挑取根癌农杆菌单菌落(EHA105)，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm，28°C培养过夜；

2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD600达0.5；

3)将菌液移至50ml离心管，冰浴30min；

4)4°C下，以5000rpm转速离心10min，收集菌体；

5)去上清液，将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体；

6)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl₂溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，加入20%甘油，置液氮中速冻1min，-70°C保存备用。

III．冻融法转化农杆菌

1)冰上融化农杆菌EHA105感受态细胞；

2)加入3μl带有目的片段的载体质粒DNA，冰冻30分钟，液氮中冷冻1分钟，然后在37°C水浴5分钟；

3)加入1ml无抗生素的YEP培养基，28°C，200转/min，振荡培养4小时；。

4)10,000rpm离心1min以收集菌体，用l00μl YEP重悬菌体；

5)将重悬后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素〔Kanamycin sulfate)和l00mg/L利福平(Rifampicin)的固体YEP培养基上，28°C培养2-3天；

6)酶切或PCR检测阳性菌落。

IV．浸染法转化拟南芥植株

1.材料

1)将拟南芥Col-0种子在4°C条件下春化72小时。点种在加有蛭石的营养土中，播种后于培养箱中培养；

2)植物开花后，剪去其主枝顶端，促进侧枝发展。在剪枝后的4-6天内着手准备农杆菌转化，转化前将植物材料用水浇透。

2.方法

采用Flower dipping法转化拟南芥Col-0，具体如下：

1)转化前一天，接种第一次活化鉴定好的农杆菌到50ml YEP（50μg/mlKan+50μg/ml利福平），二次活化，28°C摇菌培养至OD600约为1.0-1.2；离心收集菌体，并重悬于浸染液（1×Ms，5%蔗糖，Silwet-177，0.02%KOH调至pH5.7）中，使OD600约为0.8；

2)将花序浸入转染液中，轻轻晃动1min左右，使花序上形成一层膜；

3)用薄膜包裹植株，倒放避光培养24h；

4)正常光照培养，一周后重复一次；

5)正常培养并小心收集种子用于转化子的筛选。

3.阳性转化株系的筛选

1)种子消毒:0.01%升汞悬浮种子，处理15min，最后用无菌水洗5次；

2)0.1%琼脂悬浮，将灭菌的种子均匀的铺在卡那霉素筛选培养基平板上（l×MS，0.8%琼脂，卡那霉素50mg/L），用封口膜将平皿包好；

3)将平皿放于4°C暗培养72h；

4)将平皿移至培养间中培养15-20d,然后将能长出真叶的抗性小苗移入营养土中继续生长；

5)取1-2片叶子，利用CTAB法提取基因组DNA，并以此为模板，用目的基因特异引物和表达载体上的特异引物进行PCR验证，PCR阳性的转基因植株单独收种（T2）；

6)T2代单株种子筛选同上述第1步，选择分离比符合3：1分离比的T2代株系，将抗性的幼苗移至图中，单株收种子（T3）；

7)T3代再用kan筛选，挑选没有抗性分离的株系经行表型鉴定或是进一步的繁种。

V.过量表达转基因植株的鉴定

1.CTAB法提取植物基因组DNA

1)取300mg新鲜的植物叶片，去掉主叶脉，于液氮中研磨成粉；

2)把粉末转到预冷的2ml离心管中，立即600μl 65°C预热的2×CTAB提取缓冲液，充分混匀，65°C保温60分钟，其间不时摇动；

3)加入等体积的氯仿，轻轻颠倒离心管混匀，室温下，12,000rpm，离心10-20分钟；

4)将上清液转入另一个1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温下12,000rpm离心10分钟；

5)将上相转入另一新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温下放置10分钟；

6)用枪头小心挑出沉淀，并将沉淀转移到1.5ml的离心管中；

7)用70%的乙醇洗沉淀两次，室温干燥沉淀；

8)用适当体积的水溶解DNA。

2.目标基因在过表达株系中的表达

1)提取过表达拟南芥的总RNA；

2)将拟南芥总RNA反转录成cDNA；

3)以cDNA为模板扩增目标基因的片段，检测目标基因是否表达。

实施例7.过表达转基因拟南芥表型分析

I.转基因拟南芥茎切片

材料：拟南芥转基因株系，拟南芥野生型Col-0。

方法：

1)将拟南芥放于湿润的滤纸上，4°C暗培养2-3天，点种在营养土中，温室培养；

2)当拟南芥长至6周时，取6周大的拟南芥茎基部，将茎切割成长约1cm的小段，放于F.A.A固定液（福尔马林(38%甲醛)5ml:冰醋酸5ml:70%酒精90ml）中固定至少24h，也可在FAA固定液中长期保存；

3)固定好的材料可以用于切片观察。

II．冷冻切片

1)取5mL离心管，将底部切除并倒置，取固定后的材料放于离心管中，小心的加入冷冻包埋剂，避免有气泡产生；

2)将加有冷冻包埋剂的材料静置过夜，使材料周围的气泡消失，然后用液氮将材料速冻。速冻后的材料放置在冷冻切片机的工作温度下至少两小时后开始切片；

3)将材料用冷冻包埋剂固定在切片机的托片上，修正材料，调整切片的厚度开始切片；

4)将切下的完整的切片转移到室温下的载玻片，由于温差，切片会自动附着在载玻片上；

5)将载玻片室温上放置3-5分钟，使冷冻包埋剂溶化并干燥固定；

6)将载玻片4°C保存，直至染色观察。

III．徒手切片

将固定好的材料直接用刀片切成厚度约为1mm的薄片，直接染色观察。也可用马铃薯切成适当的形状，将固定好的材料放于其中，然后再切片，这样可以使需要观察的材料得到一定的支撑，而不易切碎。

IV．Wiesner染色（Wiesner staining）

溶液：2%（w/v)间苯三酚溶液（间苯三酚用95%酒精配制）；50%HCl溶液。

方法：在载玻片上滴几滴间苯三酚溶液浸染材料1-5min，再用50%HCl冲洗并浸染后立刻在显微镜下观察。

V．溴乙酰紫外分光光度法测定木质素含量

1.材料

6周大或8周大的拟南芥（培养方法如前）。

2.方法

1)将植物材料加液氮研磨成粉后冷冻烘干；

2)筛取小于40目的一定量的冻干材料，加95%乙醇提取4次（至基本无色），每次加完乙醇后8000rpm，10min离心，收集沉淀；

3)用水抽提2-3次，离心同上；

4)50~80°C烘干；

5)提取后干燥物溶于25%溴乙酰：75%冰醋酸溶液中（2mL）；

6)70°C恒温水浴加塞保温30min；

7)依次加入0.9mL 2mol/LNaOH、3mL冰醋酸和0.1mL 7.5mol/L羟胺盐酸终止反应；

8)1000g 10min离心；

9)取上清液稀释（200μL样品提取液+5mL蒸馏水），测OD280（以NaOH作对照）；木质素含量用OD/g DW表示。

实施例8.过表达植株中相关的Marker基因的表达模式研究

I.材料

6周大转基因拟南芥，拟南芥野生型。

II．方法

1)RNA提取，方法见前；

2)第一链cDNA合成，方法见前；

3)RT-PCR，方法见前。

Claims (2)

1.高粱木质素合成调控基因SbbHLH1在培育低木质素含量、高纤维素和半纤维素含量植物中的应用，其中所述高粱木质素合成调控基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是高粱或拟南芥。