CN102453728A

CN102453728A - 一种调控植物木质素含量的方法

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Publication number: CN102453728A
Application number: CN2010105250109A
Authority: CN
Inventors: 孙越; 徐艳飞; 黄海
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明提供一种调控植物木质素含量的方法，其特征在于，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。URO基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；启动子的核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于构建含有URO基因及启动子序列的表达载体是含有T-DNA序列的双元载体。本发明通过改变转录调控因子基因的表达，使植物的向木质素合成方向的代谢大为降低，减弱细胞壁的加厚过程中木质素的合成，从而实现调控植物木质素的含量。

Description

一种调控植物木质素含量的方法

技术领域

本发明涉及农业作物的遗传育种技术领域，具体涉及一种在植物细胞中用载体引入URO基因及启动子序列从而调控植物细胞壁木质素含量的方法。

背景技术

降低植物中木质素的含量，是经济作物育种的方向之一。例如：造纸的一个重要环节就是取出植物中的木质素。造纸的原料植物的木质素含量降低可以提高制品质量，降低加工成本，减少碱的使用，有利于保护环境。植物中的木质素也是难以被人类和牲畜消化的，蔬菜或牧草种木质素含量的降低，提高牧草的利用率，也是重要的育种方向。

常规育种方法耗时时间长，需要几代的杂交、回交，且新性状的出现依赖已有的品种，可控性较差。转基因育种是国际新兴的育种策略。它的优点是耗时较短，可控性较强。缺点依赖于育种对象的转基因平台的建立，以及可以用于遗传改造的基因序列。目前，可用于木质素含量的遗传改造的基因序列报道很少。

现有技术中，影响植物木质素含量的基因序列主要参与木质素合成过程中的各种关键酶的表达量调控。这些序列对于调控木质素的含量均有一定的作用。由于植物体木质素合成的途径多样，参与的酶很多，而且往往是多条酶系统同时参与、协同工作，受多重生长发育和环境信号调控。在植物体内木质素的合成过程往往是多种酶参与、工作的。一定条件下，植物体内的木质素合成处于一定的动态平衡状态。因此，单一改变某一种酶的含量，对于改变植物体内木质素的含量作用非常有限。某一种酶含量的改变对整个合成方向的影响会受到其它酶和底物含量的限制，即，酶含量的改变对于改变木质素合成方向的影响是比较有限的。

本发明克服现有技术的以上缺陷，通过改变转录调控因子基因的表达，影响植物的整体发育，减弱细胞壁的加厚过程中木质素的合成，使植物的向木质素合成方向的代谢大为降低，从而实现调控植物木质素的含量。并且，本发明的调控方法中通过调控该基因的表达量多少，可以调控植物木质素合成降低的程度，具有明显的剂量效应。

发明内容

本发明提供一种调控植物木质素含量的方法，其特征在于，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物；其中，所述URO基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体含有T-DNA序列的双元载体。其中，所述含有URO基因及部分启动子序列的表达载体为pURO::URO::GUS；所述pURO::URO::GUS的构建包括如下步骤：以拟南芥的总DNA为模板，并设计引物：上游引物UROP-NF2：5’GGA AGG AAG AAG CAT GGA AC，下游引物UPRO-R：5’GTC TAG AAT GAT GAC GAT GAC CGC CGA GTC GAA。经PCR循环反应得到扩增产物，得到Puro::URO 的核酸片段，连接到T-Vector；将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆pURO::URO-T。pURO::URO-T质粒经SalI和XbaI酶切后，与经SalI和XbaI酶切后的含有GUS基因的双元载体pBI101.1进行连接，获得含有融合URO和GUS基因的重组载体pURO::URO::GUS。

其中，所述PCR循环反应的条件为：94℃5min；一次循环94℃30sec，55℃45sec，72℃90sec，30次循环；72℃10min。

其中，所述植物为草本或木本植物。所述植物为草本植物拟南芥。

其中，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法。

本发明调控植物木质素含量的方法中，所述URO基因是指拟南芥基因At3g23140的核酸序列从翻译起始密码ATG到终止密码TAA之前,不包括终止密码。所述启动子是指URO基因从起始密码ATG到上游2271个碱基序列。

其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列1所示，该序列1 由516个碱基组成。所述启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示，该序列由2271个碱基组成。所述GUS报道基因的多核苷酸序列如序列表中的序列3所示，该序列由1809个碱基组成。

本发明中，所述pURO基因是指URO基因的启动子区序列，指URO基因从起始密码ATG到上游2271个碱基序列。

本发明中，所述URO基因是指模式植物拟南芥基因At3g23140的核酸序列从翻译起始密码ATG到终止密码TAA之前,不包括终止密码。

本发明中，所述GUS基因是指GUS基因由大肠杆菌E．coli菌株K12中uidA(也称为gusA)基因座编码。该基因编码的B．葡萄糖苷酸酶，系统命名为B-D-glucuronide glucuronosohydrolase(EC 3．2．1．31)。该酶是一种外切水解酶，能催化多种B．D．葡萄糖苷酸类物质水解为D-葡萄糖醛酸和糖苷配基。底物分子的糖链部分决定了E．coli GUS酶的专一性。几乎任何糖苷配基与B．D．葡萄糖醛酸c1上游离的羟基通过半缩醛连接的物质都可以作为GUS的底物。

本发明中，所述T-DNA序列是指农杆菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中,已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。

本发明中，所述Puro::URO：：GUS融合基因是指URO基因上游2278碱基的启动子区与URO基因及GUS基因首尾相接形成的新的基因序列。

本发明中，所述Puro::URO：：GUS表达载体是指带有Puro::URO：：GUS融合基因的可以转化拟南芥的双元载体。

本发明中，所述T-Vector是指就是试剂公司提供的线性3’-T突出双链DNA片段。T载体利于PCR产物的连接。

本发明中，所述pURO::URO-T是指含有pURO::URO序列的T-Vector。所述pURO::URO-T质粒是指含有pURO::URO序列的T-Vector质粒。

本发明中，所述含有GUS基因的双元载体pBI101.1是指一个商业化的质粒载体名称为pBI101.1，该质粒的多克隆位点后面紧跟一个GUS基因。

本发明调控植物木质素含量的方法是将含有URO基因及启动子的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物，为培育木质素含量降低的植物及改良树木材性提供一条新的途径。

本发明调控植物木质素含量的方法，可以用于植物的遗传改造，获得木质素含量降低的性状。本发明的方法中，提取拟南芥的部分基因片段及一段启动子序列，通过特定启动子与基因的组合，可以驱动调控植物发育基因在特定生长阶段表达，使植物茎中细胞的次生加厚减弱，降低植物中木质素的含量。本发明的方法中基因序列的表达效果具有剂量效应，可以根据需要，调节基因的表达量，达到改变木质素含量的目的。因此，本发明的方法既可以单独转化植物，也可以对启动子区进行修饰，改变该基因的表达量，以获得最适木质素的含量。利用本发明的方法，可以通过对不同的经济作物进行遗传改造，达到在较短时间内获得木质素含量降低的转基因植物。

附图说明

图1为pURO::URO::GUS融合基因载体pBU2UGUS构建过程示意图；

图2为pURO::URO::GUS质粒的PCR鉴定图谱；

图3（a）表示野生型拟南芥植株；

图3（b）表示转pURO::URO：：GUS融合基因的转基因拟南芥植株；

图4为转pURO::URO：：GUS融合基因的转基因拟南芥的RT-PCR鉴定图谱；

图5为转pURO::URO：：GUS融合基因的转基因拟南芥植株与野生型对照茎横切的照片；

图6为转pURO::URO：：GUS融合基因的转基因拟南芥植株GUS染色的照片。

具体实施方式

以下实施例是对本发明进一步的详细阐述，而不是对本发明的限制。本发明并不局限于具体实施方式的内容，凡基于本发明在权利要求的范围内做出各种变形或修改，均属于本发明的保护范围。

本发明调控植物木质素含量的方法，具体如下：

培育含有木质素含量降低的转基因拟南芥，以拟南芥总DNA为模板；设计引物，其中，上游引物UROP-NF2：5’GGA AGG AAG AAG CAT GGA AC，下游引物UPRO-R：5’GTC TAG AAT GAT GAC GAT GAC CGC CGA GTC GAA。

进行PCR扩增，PCR反应条件为： 94度5min，一个循环；94度30sec,55度45sec,72度90sec,30循环；72度10min进行PCR扩增，然后，电泳、回收、纯化PCR扩增产物，得到pURO::URO的核酸片段。

将pURO::URO核酸片段连接到T-Vector(TAKARA),并转化至大肠杆菌，经PCR及酶切筛选获得阳性克隆（pURO::URO-T）。经测序，检测结果确定阳性克隆序列正确。

分别利用SalI和XbaI酶进行酶切测序正确的pURO::URO-T质粒，电泳、回收、纯化，与被SalI和XbaI酶切后的已含有GUS基因的双元载体pBI101.1连接。获得含有融合URO和GUS基因的重组载体pURO::URO-GUS,测序鉴定正确。之后，将该质粒转化入农杆菌中，并进行鉴定。pURO::URO::GUS 融合基因载体pBU2UGUS构建过程，参考图1所示，具体记载在实施例2、3、4、5、6、7中。

重组质粒pURO::URO::GUS质粒的PCR鉴定图谱，参考图2所示。其中，“+”表示为以基因组DNA为模板的阳性对照，“-”表示为以pBI101.1空质粒为模板的阴性对照，“1-10”表示为所选不同克隆。

用浸润法，转化并筛选拟南芥，获得稳定转化本序列的拟南芥植物。提取转化子的RNA,反转录并进行RT-PCR鉴定。参考图4，图4为转pURO::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥的RT-PCR鉴定图谱。其中Ler为野生型对照，其它样品为不同表型的转化子。从左至右表型依次增强，从左至右URO基因的表达量也依次增强。图4表明URO基因在转化子中的表达量明显上调。对转化子进行GUS染色可以观察到目的基因在转化子中有组织特异性的表达，如图六所示。

待转化子生长4周后，取同样生长时间和条件的野生型，进行茎的横切，经过甲苯胺蓝活体染色，显微镜下观察，如图5所示，结果表明，在转化子的茎中，被染成蓝色的木质素的面积与野生型相比大大降低。且URO基因表达量较高的植物，木质素含量更低。

实施例1，提取拟南芥基因组DNA

试剂：

Lysis Buffer：Tris-HCl，pH8.0(0.2M)；尿素(7M)；十二烷基肌氨酸钠(2 %)；EDTA(0.05M)

步骤：

（1）植株的绿叶或花等组织适量，置于1.5ml的离心管中，加200μl裂解液，用小棒研磨成浆，再用400μl裂解液冲洗小棒。

（2）加600μl的酚-氯仿，剧烈震荡20秒，使蛋白质变性。

（3）12000rpm离心5分钟后取上清。

（4）加50μl 醋酸钠，600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5 min。

（5）去上清，沉淀溶于400μl TE(Tris-EDTA)中。

（6）再加40μl 3mol/L NaAC(PH5.2)，1ml无水乙醇，混匀，12000rpm离心5min。

（7）去上清，用70%乙醇洗沉淀一次，离心；去清液。

（8）室温干燥，沉淀溶于50μl无菌水中，即为提取得到的植物基因组DNA。

实施例2，PCR方法获得目的基因片段

（1）以实施例1中提取的拟南芥DNA作为模板

URO基因的多核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

启动子的多核苷酸序列如序列表中的序列2所示。

（2）引物设计

根据URO基因及其启动子序列，以及购建克隆方便，设计一对引物，UROP-NF2和 UPRO-R，其中后者的引物上有一个Xbal的限制性内切酶酶切位点，引物序列为：

上游引物UROP-NF2：5’GGA AGG AAG AAG CAT GGA AC

下游引物UPRO-R：5’GTC TAG AAT GAT GAC GAT GAC CGC CGA GTC GAA

（3）PCR扩增目的片段

PCR试剂：KOD-Plus酶购自于TOYOBO公司

PCR反应体系：

KOP-Plus buffer 5μl

MgSO₄ 2μl

dNTPs 5μl

上游引物UROP-NF2（10pM） 2μl

下游引物UPRO-R（10pM） 2μl

模板 2μl

KOD-Plus 1μl

dddH₂O 31 μl

Total 50 μl

PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析正确后，进行割胶回收。

实施例2，PCR产物回收

PCR回收试剂盒购自于天根生物公司

PCR产物回收体系

1）将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中。

2）向胶块加入3倍体积的熔胶液（约300-400μl）50℃水浴中放置约10min使胶块完全溶解。

3）待胶块冷却至室温后将所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

4）向吸附柱中加入700μl 漂洗液，12000rpm离心30s，倒掉废液。

5）向吸附柱中加入500μl 漂洗液，12000rpm离心30s，倒掉废液。

将离心吸附柱放入收集管中12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，晾干。

6）向吸附膜中间位置滴加适量的洗脱液EB室温放置2min，12000rp离心1min，重复步骤6。

7）将所得液体合并，即为回收的PCR产物。

实施例3 PCT产物的克隆

试剂：使用的T-Vector 为pMD18-T Simple Vector，购自于Takara

连接体系：

T-Vector 0.5 μl

Insert（PCR回收产物） 4.5μl

Solution I Buffer 5 μl

Total 10 μl

将连接体系置于4℃或16℃过夜，或者25℃两个小时，获得重组质粒。

实施例4，大肠杆菌的转化

（1）大肠杆菌TOP10感受态制备：

试剂：1M CaCl₂母液，稀释为0.1MCaCl₂分装于1.5mlEp管中，-20℃保存。

TOP10菌液：挑取TOP10单克隆，接种到无抗性液体LB培养基中，37℃摇过夜，分装为4ml一管，-20℃保存。

氨卞青霉素(Ampicillin)，购自于北京鼎国生物技术公司

1）接40μl TOP10菌液到4ml 液体LB培养基中。

2）37℃精确摇2小时。

3）冰上放置10分钟。

4）将菌液分装到2ml离心管中，4℃ 4000rpm离心10分钟。

5）倒去上清，加入200μl 冰上预冷的0.1M CaCl₂，在冰上轻轻将菌分散。

6）4℃ 4000rpm离心10分钟。

7）倒去上清，加入70μl 冰上预冷的0.1M CaCl₂，在冰上轻轻将菌分散。

8）加入10μl连接产物，冰上放置30分钟。

9）42℃热激70秒，冰上放置3分钟。

10）加入300μl 液体LB培养基37℃复苏45分钟-1小时，涂布含有氨苄青霉素抗性的固体LB平板。

实施例5 阳性克隆(转化子) pURO::URO-T的鉴定：

试剂：

质粒提取试剂：

溶液I：

葡萄糖 50mM

Tris-Cl(pH8.0) 25mM

EDTA(pH8.0) 10mM

高压灭菌15分钟，保存于4℃。

溶液II：

NaOH 200mM

SDS 1.0%

现用现配，室温下使用。

溶液III:

5M KAc 60.0ml

冰乙酸 11.5ml

H2O 28.5ml

保存于4℃，用时置于冰浴中。

TE(pH8.0)：

Tris-Cl 10mM

EDTA 1mM

步骤：

挑取转化后的大肠杆菌克隆置于含Amp+的LB液体培养基中，37℃ 250r/min振荡培养过夜。抽提质粒。

质粒提取：

（1）将菌液移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30秒，弃上清，尽量将上

清去净。

（2）加入100μl 溶液I(视菌体浓度而定)，于振荡器上将菌体充分悬浮。

（3）加入200μl 溶液II，小心来回颠倒几次，静置4分钟，以溶菌。

（4）加入150μl 溶液III，小心来回颠倒几次，冰浴上15分钟，以中和碱液并

沉淀SDS、变性蛋白及染色体DNA。

（5）12000rpm离心10分钟，移取上清至另一1.5ml Eppendorf管中。

（6）加入等体积酚：氯仿（1：1），反复颠倒，12000rpm离心10分钟，取上清于1.5ml Eppendorf管中。

（7）加入1/10体积的NaAc和2倍的无水乙醇，-20℃静置20分钟-1小时。

（8）12000rpm离心10分钟，弃上清。

（9）70%乙醇洗涤一次，吹干，加入TE或dddH₂O溶解。

（10）1%琼脂糖电泳。

酶切鉴定：用内切酶SalI和XbaI对上述构建好的中间载体及目的表达载体进行双酶切。

酶切体系：

质粒 5μl

10×buffer 2 μl

XbaI 1μl

PstI 1μl

ddd H₂O 11μl

total 20μl

37℃水浴保温2小时。

酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离得到目的片段及载体酶切大片段。

实施例6表达载体的构建

试剂：限制性内切酶和连接酶购自于Takara

（1）用内切酶SalI和XbaI对上述构建好的中间载体及目的表达载体进行双酶切。

酶切体系：

质粒 5μl

10×buffer 2 μl

内切酶1 1μl

内切酶2 1μl

ddd H₂O 11μl

total 20μl

37℃水浴保温2小时。

酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离得到目的片段及载体酶切大片段，经试剂盒回收。

（2）连接体系：

载体酶切片段 2μl

目的基因片段 6μl

10×T4 连接酶buffer 1 μl

T4 DNA连接酶 1μl

Total 10 μl

将连接体系置4℃或16℃过夜，或25℃两个小时，获得重组表达质粒DNA。

（3）参照实施例5进行大肠杆菌的转化及筛选,PCR鉴定。

实施例7, 农杆菌的转化

（1）农杆菌感受态细胞的制备及转化：

农杆菌GV3101菌株可以从公开途径中获得。

1）将农杆菌GV3101细胞在LB(LB+20mg/LRif)固体培养基上划线，28℃培养36-48小时，出现单菌落。

2）挑取单菌落置于5ml LB(LB+20mg/L Rif)液体培养基中，250rpm，28℃培养。

3）将菌液转入装有500ml LB液体培养基的1L的培养瓶中，37℃培养至OD₆₀₀=0.5。

4）4℃，4000rpm离心，5分钟，去上清。

5）用灭菌的预冷dddH₂O小心悬浮细胞，冰上操作。

6）4℃，4000rpm离心，5分钟，去上清。重复两次步骤(5)和(6)。

7）加1/50 体积的灭菌20%甘油(dddH₂O)重悬浮。

8）立即使用或-70℃保存。

9）将电击杯流水冲3分钟，dddH₂O冲洗3次，70%乙醇冲洗一次，无水乙醇洗一次，工作台吹干，置于冰上预冷。

10）将50或100μl 的农杆菌感受态细胞与要转化的质粒混匀放入电击杯中，上放置5分钟。

11）将电击杯放入电击仪中，在电阻为25KU，电压为1.8MV的条件下电击数秒。

12）加1mlLB于电击杯中，然后将电击杯中的液体移入1.5ml的Eppendorf管中，28℃恢复2小时。

13）取400μl 体积涂布于LB(内含相应的抗生素)平板上，同时设置仅有感受态细胞而无外源DNA的负对照及感受态细胞细胞中加入完整质粒DNA的正对照。于28℃正向放置至液体被吸收，然后倒置平皿，于37℃暗培养36-48小时。

14）待长出单克隆后，提质粒，将质粒转入E.coil中，进行酶切和PCR鉴定。Puro::URO::GUS质粒的PCR鉴定图谱，参考图2所示。

实施例8，拟南芥的遗传转化

试剂

（1）渗透培养基：(每升)

MS大量(10×) 50 ml

MS微量(1000×) 500μl

MS有机(100×) 5 ml

MS铁盐(1000×) 500μl

蔗糖 50 g

6-BA(1mg/ml) 10 μl

SILWET-77 400μl

定容后调pH至5.8

(2)PNS营养液的配制：(每升)

1M 磷酸缓冲液(pH5.5) 2.5ml

1M KNO₃ 5 ml

MS微量元素(1000×) 1 ml

步骤：

（1）拟南芥的种植

（2）农杆菌的培养：

1）将保存于-70℃的含目的质粒农杆菌划板活化。

2）用无菌的牙签挑取5-6个农杆菌单克隆置入10ml的含有相应抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养36-48小时。

3）1/50至1/100体积重新接种于LB培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀=1.2-1.6。

4）4000rpm离心15分钟，收集菌体。

5）将菌体用相应体积的渗透培养基重悬，混合均匀，至OD₆₀₀=0.8。

（3）植物的转化

1）当植物刚抽出花序时，去除其顶生花序。注意要避免伤及腋生花序，去除顶生花序将刺激腋生花序的生长。转化必须在去除顶生花序4天后进行。

2）转化前将已授粉花以及果荚去除掉，并在转化前一天使土壤吸足水。

3）用喷雾器将农杆菌喷洒在待转化的植株上，移入恒温室竖直培养，可每隔6 天喷一次，可喷2-3次，以获得更高的转化率。

4）种子成熟后将其整株剪下，过筛，收入纸袋中置于干燥器中保存。

转基因植株的筛选

（1）种子消毒(方法同前)。

（2）在12cm的平板上倒入含有相应筛选抗生素(卡那霉素)的1/2MS的培养基凝固后，将灭好菌的种子混入0.1%的琼脂中均匀涂布于平板上。

（3）4℃低温处理3-4天后放入温室中。

（4）待长出绿色的转基因幼苗（转化子为绿色幼苗，且根较长；非转化子基本为黄色苗，或绿色无根幼苗，不能长期存活）后移栽入土。

（5）单株收获转基因植株。

将转pURO::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株进行对照，参考图3。其中，图3（a）表示野生型拟南芥植株；图3b表示转pURO::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥植株。

实施例9，植物组织提取RNA

试剂：

DEPC水；RNA Extraction Buffer；Tris-HCl pH 8.0（0.2M）； LiCl（0.4M）；EDTA（25mM）；1%SDS（DEPC水配制）；3M NaAc pH5.2（DEPC水配制）；（DEPC水配制）RNase free的水饱和酚，和酚氯仿。

步骤：

（1）液氮中将材料研磨充分。

（2）研好的材料用烘过的药勺拨适量到Ep管中，管中已预先加好400 μl RNA Extraction Buffer 和400 μl 水饱和酚。

（3）涡旋多次。

（4）13200rpm 离心5分钟，取上清(建议用酚抽两次)。

（5）加入0.5ml酚氯仿，震荡，离心5分钟。

（6）取上清，加入40μl 3M NaAc和1 ml乙醇，混匀，-20℃放置一段时间。

（7）13200rpm离心10分钟，弃上清。

（8）加入0.4ml 2M LiCl，尽量将DNA溶解。

（9）离心，10分钟，弃上清，加入100μl DEPC H₂O，10μl 3M NaAc，250μl预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃放置一段时间。

（10）离心，10分钟，弃上清。

（11）70%乙醇洗一次，离心，弃上清，超净台吹干。

（12）DEPC水溶解，-20°C短期保存，-70°C长期存放。

实施例10， RT-PCR

试剂:

TOYOBO反转录试剂盒，一般PCR试剂。

步骤：

（1）取1μg RNA 于70℃温育 10分钟，迅速短暂离心，置于冰上。

（2）在Eppendorf管中加入以下试剂：

5×buffer 4 μl

dNTP mixture(10mM) 2 μl

Rnase Inhibitor 1μl

逆转录酶 1μl

Oligo(dT)₁₅ 1μl

RNA 1μg

Nuclease-free water 补足到20μl

（3）42℃ 温育60分钟。

（4）95℃ 温育5分钟，0℃-5℃放置5分钟。

样品模板浓度的调节：

以第一链cDNA为模板，PCR扩增actin 基因，PCR循环数为25，不断的调整模板量直至扩增的actin基因的产量基本一致。然后，以同样的模板浓度PCR扩增目的基因，循环数为27-28 cycles。

转pURO::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥的RT-PCR鉴定图谱，参考图4所示。

实施例11， GUS染色

试剂：

GUS染液：750ug/ml X-Gluc，100mM NaHPO4 (pH 7)，3mM K3F3(CN)6，10mM EDTA，0.1% Nonidet-P40。

100ml GUS染液：5.77ml 1M Na2HPO4，4.23ml 1M NaH2PO4，加水 80ml，0.1g K3F3(CN)6，0.3g EDTA，0.1ml N-P40，定溶100ml，加入 0.075g X-Gluc

步骤：

（1）取新鲜组织，加入GUS染液中，500mmHg真空抽气10分钟。

（2）37℃染色过夜。

（3）室温下70%乙醇脱色6小时，期间更换乙醇数次

（4）脱色完全后更换为纯水，复水后，将材料放置于载破片上，40%甘油封片后解剖镜下观察、拍照。

转pURO::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥植株GUS染色的照片，如图6所示，其中，蓝色部分显示URO基因表达的位置。

实施例12，植物组织染色

(1) 取抽薹的野生型、转基因拟南芥进行徒手切片。切片厚度约0.5mm。

(2) 用0.01%甲苯胺兰染色2分钟，

(3) 清水冲洗，去掉浮色。

(4) 盖玻片封片，观察，拍照。

转Puro::URO：：GUS 融合基因的转基因拟南芥植株与野生型对照茎横切的照片，如图5所示，其中，蓝色部分显示木质化的细胞壁。

Claims

1.一种调控植物木质素含量的方法，其特征在于，所述方法是将含有URO基因及启动子序列的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物；其中，所述URO基因的多核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述启动子的多核苷酸序列如序列表中序列2所示；用于构建所述含有URO基因及启动子序列基因的表达载体是含有T-DNA的双元载体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有URO基因及启动子序列的表达载体为pURO::URO::GUS；所述pURO::URO::GUS的构建包括如下步骤：以拟南芥的总DNA为模板，设计引物，上游引物UROP-NF2：5’GGA AGG AAG AAG CAT GGA AC，下游引物UPRO-R：5’GTC TAG AAT GAT GAC GAT GAC CGC CGA GTC GAA；经PCR循环反应得到扩增产物，得到Puro::URO 的核酸片段，连接到T-Vector；将连接产物转化至大肠杆菌，经筛选得到阳性克隆pURO::URO-T；pURO::URO-T质粒经SalI和XbaI酶切后，与经SalI和XbaI酶切后的含有GUS基因的双元载体pBI101.1进行连接，获得含有融合URO和GUS基因的重组载体pURO::URO::GUS。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR循环反应的条件为：94℃5min；一次循环94℃30sec，55℃45sec，72℃90sec，30次循环；72℃10min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物为草本或木本植物。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化方法为农杆菌转化法，基因枪介导转化法，或花粉管通道法。