CN101503691A - 植物表皮毛特异表达启动子fif1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的植物表皮毛特异表达启动子，所述的启动子分离自亚洲棉(Gossypium arboreum)中。本发明还公开了含有所述启动子序列的载体以及宿主细胞。本发明还公开了所述启动子的用途，所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。

Description

植物表皮毛特异表达启动子FIF1及其应用

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域；具体地说，本发明涉及新的植物表皮毛特异表达启动子，本发明还涉及所述启动子的用途，尤其在棉纤维和腺毛次生代谢基因工程中的应用。

背景技术

植物表皮毛是单细胞水平上研究细胞分化、极性生长和形态建成的一个模式系统。植物表皮毛分为腺毛和非腺毛，主要的功能是保护植物，如抵御虫害、减少蒸发、提高抗冻力和防紫外线等。其中，棉纤维和腺毛还具有重要的经济价值。

棉纤维是棉花种子的表皮毛，它是纺织工业最重要的天然纤维原料。棉纤维的品质改良可依靠专化启动子与外源基因相连，导入棉花。如已有技术人员将来源于细菌的PhaB和PhaC基因导入棉花，这一转基因棉花的吸热性显著提高，而导热性降低，具有良好的市场前景。还有技术人员将黑色素合成酶基因导入棉花获得了产生褐色或黑色纤维的棉花。E6启动子是第一个分离到的棉纤维高表达启动子，E6启动子除了在棉纤维中优势表达外，在子房、花和叶中也有少量表达。E6启动子已用于改良棉纤维的基因工程。我国是目前世界上最大的棉花生产和消费国家，拥有具自主知识产权的启动子，可以更好的促进我国改良棉纤维的基因工程研究。与35S等组成型表达的启动子相比，组织特异性表达启动子可以驱动靶基因在特定的组织或细胞表达，而不影响植物其它组织的生理活动。

植物表皮毛作为植物体抵御外界生物的或非生物入侵的第一道天然屏障，在农业生产和植物病虫害防护方面起重要的作用。一些腺毛分泌的天然化合物还可以用于生产染料，杀虫剂，食品的调味剂，香料，或用于制药业，如抗疟疾的倍半萜内酯青蒿素，抗抑郁剂和抗病毒剂的倍半萜金丝桃素等。

目前，通过基因工程手段，利用表皮毛特异表达的启动子，对植物表皮毛特别是腺毛次生代谢进行遗传改良，以培育能够大量合成和积累目标次生代谢物的植物品种，受到愈来愈多的关注。

综上所述，为了改良棉纤维的品质性状或调控植物表皮毛次生代谢，本领域迫切需要开发新的特异性良好的植物表皮毛特异表达启动子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的植物表皮毛特异表达启动子，所述启动子可指导目的基因特异性地在植物表皮毛中表达。

本发明的目的还在于提供所述启动子的应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的核酸(启动子)，所述的核酸选自下组：

(1)由SEQ ID NO：1中(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列构成；

(2)具有SEQ ID NO：1中(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列且具有指导目的基因在植物表皮毛(包括腺毛或非腺毛)特异表达功能的核苷酸序列；

(3)在严格条件下能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；

(4)与(1)或(2)限定的核苷酸序列有70％以上(优选80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上)相同性且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；或

(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补(优选完全互补)的核苷酸序列。

在另一优选例中，(1)中，具有SEQ ID NO：1中(1-1830)～(2053-2062)位所示的核苷酸序列(较佳地由SEQ ID NO：1中(1-1830)～(2053-2062)位所示的核苷酸序列构成)。SEQ ID NO：1中(1-1830)～(2053-2062)位所示的核苷酸序列也即指所述序列可起始于SEQ ID NO：1中第1位至第1830位中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO：1中第2053位至第2062位的任一位的碱基。

在另一优选例中，所述核酸选自下组：具有SEQ ID NO：1中1～2062位序(对应于ATG上游-2062～-1位)；具有SEQ ID NO：1中63～2062位序列(对应于ATG上游-2000～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1063～2062位序列(对应于ATG上游-1000～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1313～2062位序列(对应于ATG上游-750～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1623～2062位序列(对应于ATG上游-440～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1703～2062位序列(对应于ATG上游-360～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1742～2062位序列(对应于ATG上游-321～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1837～2062位序列(对应于ATG上游-226～-1位)；具有SEQ ID NO：1中1830～2062位序列(对应于ATG上游-233～-1位)；或具有SEQ ID NO：1中1623～2062位且其中缺失1746～1832序列(对应于ATG上游第-440～-1位但缺失-231～-317位的序列)。

在另一优选例中，所述的核酸中含有至少一条T/G-盒序列，所述的T/G-盒作为植物表皮毛特异表达顺式调控元件。

在另一优选例中，所述的T/G-盒序列位于SEQ ID NO：1中第1837～1842位(对应于FIF1基因翻译起始位点ATG上游-226～-221位)。

在另一优选例中，所述的核酸含有3条T/G-盒序列，所述的T/G-盒序列分别位于SEQ ID NO：1中第96～101位(对应于FIF1基因翻译起始位点ATG上游-1967～-1962位)、第1452～1457位(对应于ATG上游-611～-606位)、第1837～1842位。

在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的核酸，作为启动子元件。

在另一优选例中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。

在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。

在本发明的另一优选例中，植物品质、抗性或代谢相关的基因。

在另一优选例中，所述的目的基因选自：FIF1基因、β-葡萄糖苷酶(GUS)基因、肌动蛋白1(Actinl)基因、细胞壁松弛蛋白(EXP1)基因或蔗糖合成酶(SUSY)基因等；或青蒿的紫穗槐二烯合酶(ADS)基因或细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)基因等。

在另一优选例中，所述的目的基因位于所述核酸的下游，且与所述启动子的间隔小于1000bp；优选的，小于500bp；更优选的，小于100bp；最优选的，小于50bp。

在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞：

含有所述的载体；或

其基因组中整合有外源的所述的核酸。

在本发明的第四方面，提供所述的核酸的用途，用于作为启动子元件，指导目的基因在植物表皮毛特异表达。

在另一优选例中，所述的植物选自(但不限于)：锦葵科棉属作物，菊科植物，茄科植物，唇形科植物或伞形科植物。

在另一优选例中，所述的植物选自(但不限于)：棉花、烟草、拟南芥、青蒿、薄荷或罗勒等。

在本发明的第五方面，提供一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物的表皮毛可特异表达目的基因，所述的方法包括：

将构建物(如载体或含构建物的载体片段)转化植物细胞、组织或器官，所述的构建物含有所述的核酸以及与所述的核酸可操作地连接的目的基因；

选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组织或器官；和

将所述植物细胞、组织或器官再生成植株。

在另一优选例中，所述的方法包括：

(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的核酸以及与所述的核酸可操作地连接的目的基因；

(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及

(d)将步骤(c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了FIF1启动子的序列。以翻译起始位点的A定义为“+1位”(对应于SEQ ID NO：1中第2063位)。5’-RACE推定FIF1基因的转录起始位点为-73位点的“C”；TATA盒和CAAT盒用斜体及下划线标记；3个T/G-盒用方框和粗体表示。

图2显示了FIF1：GUS(Fp2000)在棉花中的表达特征。

A：叶片；

B：茎；

C：开花当天胚珠；

D：开花后9天纤维和胚珠；

E：FIF1启动子驱动的GUS基因在转基因棉花不同组织的活性分析。

图3显示了FIF1：GUS(Fp2000)在拟南芥中的表达特征。

a：1周左右幼苗；

b：3周左右的拟南芥，图中显示在幼嫩叶片表皮毛表达；

c：茎；

d：成熟叶片；

e：放大的成熟叶片的表皮毛；

f：花序。

图4显示了FIF1：GUS(Fp2000)在烟草中的表达特征。

A：烟草叶片表皮毛；

B：烟草茎部表皮毛。

图5显示了拟南芥中FIF1启动子不同缺失片段的活性分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从亚洲棉(Gossypium arboreum)中分离到一个能够指导目的基因在植物表皮毛中特异性表达的启动子，该启动子来源于FIF1基因(GaMYB2/FIF1(Fiber Factor 1)，GENEBANK登录号：AY626160)的上游区域，因此本发明人将之命名为FIF1启动子。所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，包括(但不限于)：锦葵科棉属作物，菊科植物，茄科植物，唇形科植物，伞形科植物等。例如，所述的植物可以是但不限于：棉花、烟草、拟南芥、青蒿、薄荷、罗勒等。优选的，所述的植物是可利用本发明的启动子改善棉纤维品质的棉花，或可利用本发明的启动子改善腺毛代谢特性的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“可操作地连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性启动子”又称“器官特异性启动子”，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性启动子”是植物表皮毛(包括腺毛或非腺毛)特异表达启动子。

通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。

如本文所用，“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于：改良植物品质、性状或代谢相关的基因。

植物特异性启动子及其指导的基因表达

本发明提供一种植物表皮毛特异表达的核酸(启动子)，所述的核酸具有选自下组的序列：

(1)具有SEQ ID NO：1中(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列；

(2)在严格条件下能够与(1)限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物表皮毛(包括腺毛或非腺毛)特异表达功能的核苷酸序列；

(3)与(1)限定的核苷酸序列有70％以上相同性且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；或

(4)与(1)-(3)任一限定的核苷酸序列互补(优选完全互补)的核苷酸序列。

其中，(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列指定了一系列的序列，所述序列可起始于SEQ ID NO：1中第1位至第1837位中的任一位的碱基，终止于SEQ ID NO：1中第2043位至第2062位的任一位的碱基。

本发明所述的启动子序列中含有至少一条T/G-盒序列，所述的T/G-盒作为植物表皮毛特异表达顺式调控元件(即作为增强子)。所述的T/G-盒的序列为AACGTG。作为本发明的优选方式，所述的T/G-盒序列位于SEQ ID NO：1中第1837～1842位。作为本发明的另一优选方式，所述的核酸含有3条T/G-盒序列，所述的T/G-盒序列分别位于SEQ ID NO：1中第96～101位、第1452～1457位、第1837～1842位。

多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％(例如85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达的功能。

本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，最优选95％以上)相同性的核酸，所述核酸也具有指导目的基因在植物表皮毛特异性表达的功能。“相同性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。例如在本发明的实例中，含有ATG上游第-440～-1位但缺失ATG上游-231～-317位点87bp片段的序列，其也具有指导目的基因在植物表皮毛特异性表达的功能。

在本发明的实例中，本发明人发现，在所述的启动子的指导下，可以使β-葡萄糖苷酶(GUS)基因特异地在拟南芥、棉花、烟草的表皮毛中表达。因此可见，本发明的启动子是一种组织或器官特异性的启动子。所述的启动子对于定点地改良植物的品质是特别有用的。β-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因已被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。

本发明的组织特异性启动子在理论研究和农艺改良中具有重要的应用价值。这些启动子可以被应用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。本发明的启动子对于改良棉纤维品质或表型是特别有用的。

本发明的启动子对于改良腺毛次生代谢也是特别有用的。植物表皮毛作为植物体抵御外界生物的或非生物入侵的第一道天然屏障，在农业生产和植物病虫害防护方面起重要的作用。一些腺毛分泌的天然化合物还可以用于生产染料，杀虫剂，食品的调味剂，香料，或用于制药业，如抗疟疾的倍半萜内酯青蒿素，抗抑郁剂和抗病毒剂的倍半萜金丝桃素等。因此，在这些表皮毛中特异表达一些外源或本身的代谢相关基因，可以促进或调节腺毛中次生代谢物的合成。

本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。

合适的目的基因包括但不限于：改良植物品质、性状或代谢相关的基因。例如，所述的目的基因包括是改良棉纤维品质或抗性相关的基因(如棉花的Actinl基因、EXP1基因、SUSY基因等)、或改良表皮毛的次生代谢产物数量或成分相关的基因(如青蒿的ADS基因、CYP71AV1基因等)。

本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。

此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。

任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。

作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。

作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5到3方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3转录终止子，3多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。

重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。

包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的双元载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥、烟草和棉花。

在本发明的实例中，所述的重组载体是PBI101双元载体，其自带GUS基因，将本发明的启动子构建到该载体中US基因的上游，转化植株，启动子将激活GUS基因的表达，所述启动受到启动子区各顺式作用元件的调控，模拟了基因在体内被激活转录的状况。实验表明，本发明的启动子在棉花纤维中高表达，在拟南芥和烟草中为表皮毛特异表达，特别是在转基因烟草中，为表皮毛顶端分泌细胞特异表达的启动子。5’端系列缺失实验表明，FIF1启动子360bp的片段包含了调控该启动子表皮毛特异表达的所有关键cis元件，其中的T/G-box元件是决定FIF1启动子在表皮毛中特异表达的顺式调控元件。

本发明的主要优点在于：

揭示一种可指导目的基因在植物的表皮毛特异表达的启动子，所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：Alaboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 FIF1启动子的分离

1.棉花的DNA提取

采用如下方法：0.5克亚洲棉(G.arboreum)叶片，用液氮研磨至粉状，转移到8mL离心管中，加入5mL研磨缓冲液(1M葡萄糖，0.1M柠檬酸，5％Triton X-100(pH 5.0))，混匀。22℃、1000g离心10min，收集沉淀，重悬在研磨缓冲液中，再离心，重复三次，直至沉淀出现灰白色。5mL洗涤缓冲液(0.5M葡萄糖，0.05M柠檬酸(pH 5.0))洗涤沉淀，22℃、1000g离心10min，去除上清，重复2-4次直到沉淀呈现乳白色。加入5mL裂解缓冲液(1％ SDS，1.4M NaCl，0.1M EDTA(pH 8.3))，60℃水浴中裂解15min。22℃、5000g离心10min，收集上清，加入2倍体积的无水乙醇，4℃、10,000g离心5min。弃上清，沉淀吹干，溶于2mL 0.1×SSC溶液，充分溶解后离心去除不溶物。补充NaCl至终浓度达到1M(约0.058g NaCl/mL 0.1×SSC(0.015M NaCl，0.015M柠檬酸钠))。加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混匀，12,000rpm、4℃离心10min，取上清，重复抽提一次。上清中加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃静置10min，12,000rpm、4℃离心10min，沉淀溶于0.1×SSC。测定OD 260/280的比值，一般在1.8-2.0之间。DNA浓度(μg/mL)＝50×A260×稀释倍数。

2.通过染色体步查法得到FIF1基因ATG上游2062bp片段

采用Genome Walker Kits(Clontech，Palo Alto，CA)克隆FIF1基因ATG上游启动子片段，共步查了2次。亚洲棉基因组DNA采用合适的限制性内切酶进行酶切。100μL酶切反应液：10μL 10×缓冲液，100U酶和10μg DNA。37℃，24h。2倍体积的无水乙醇沉淀酶切产物，沉淀溶于15μL水中。60μL连接反应液：10μL DNA酶切产物，5μL接头(Adaptor)(来自于试剂盒)，30μL Soluti on I和15μL Solution II。16℃，30min。2倍体积的无水乙醇沉淀，沉淀溶于50μL TE，至此构建成不同基因组步查文库DNA(LibraryDNA)。

第一次步查：以含有接头的基因组DNA文库作为模板，用外侧接头引物(AP1)和外侧基因特异引物GSP1进行进行第一轮PCR扩增，50μL反应液：先将1μLDNA连接液加入33.5μL ddH₂O中，94℃加热10min，再加其它组分：5μL10×LA Taq缓冲液，8μL dNTP(每种2.5mM)，1μL AP1(接头引物1)(20pmol/μL)，1μL(基因特异引物1)(20pmol/μL)，和0.5μL LA Taq(5U/μL)。共进行30个循环反应，收获PCR产物。然后，用内侧接头引物(AP2)和内侧基因特异引物GSP2进行第二轮PCR扩增，50μL反应液：5μL10×LA Taq缓冲液，8μL dNTP(每种2.5mM)，1μL AP2(20pmol/μL)，1μL GSP2(20pmol/μL)，1μL前一轮PCR产物(稀释100倍)，0.5μL LA Taq(5U/μL)和33.5μL H₂O，30个循环反应，收获PCR产物。

第二次步查：经鉴定第一次步查获得上游1kb的序列，重新设计GSP3和GSP4，再进行第二次步查。实验步骤一样的重复，该次步查中第一轮PCR用引物AP1和GSP3，第二轮PCR用引物AP2和GSP4。

其中，引物序列为：

外侧接头引物(AP1)：5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(SEQ ID NO：2)；

内侧接头引物(AP2)：5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’(SEQ ID NO：3)；

外侧基因特异引物(GSP1)；5’-CTC AGC TGT CCA AGA ACC-3’(SEQ ID NO：4)；

第一次内侧基因特异引物(GSP2)；5’-TTT GTT AAA AAC CCT TTT GC-3’(SEQ ID NO：5)；

第二次外侧基因特异引物(GSP3)：5’-CCG CCA CAG GCC TAT CTT GAA CTATGC A-3’(SEQID NO：6)；

第二次内侧基因特异引物(GSP4)；5’-AGG AAA TTA ACC AAG CCG AAT CTGTGC A-3’(SEQ ID NO：7)。

最后获得的PCR产物进行常规凝胶电泳，割胶回收两轮PCR反应后所扩增的条带，将回收产物连接至pGEM-T easy载体(Promega)进行测序。通过2次染色体步查，获得FIF1基因ATG上游2062bp序列。

实施例2载体构建和农杆菌转化

1.载体构建

根据FIF1基因ATG上游序列设计不同正向引物和一条反向引物Fp-R，正向引物大于440bp的片段引入Xba I位点，440bp以下(含440bp)片段引入HindIII位点，反向引物引入BamH I位点。高保真酶PCR扩增获得不同大小的片段，这些片段分别含有图1所示序列中第-2000～-1位序列、第-1000～-1位序列、第-750～-1位序列、第-440～-1位序列、第-360～-1位序列、第-321～-1位序列、第-220～-1位序列。克隆至PBI101载体(Takara)GUS基因上游多克隆位点相应位点之间，驱动GUS报告基因，构建成包含不同长度启动子序列的转基因表达载体，依次分别命名为Fp2000、Fp1000、Fp750、Fp440、Fp360、Fp321、Fp220。

还构建缺失图1所示序列中第-214～-233位序列、第-231～-317位序列的缺失载体。缺失载体Fpab1、Fpab2的构建采用PCR方法，在要缺失的片段两端设计两条引物，分别与Fp440正向引物及Fp-R反向引物扩增出缺失片段两端的两个小片段，然后以两个小片段的混合物做模板，Fp440正向引物和Fp-R反向引物扩增出目的片段，目的片段两端分别有HindIII/BamH I酶切位点，克隆至PBI101载体GUS基因上游多克隆位点的相应位点。测序验证缺失片段为正确序列。Fpab1载体含有ATG上游第-440～-1位但缺失-214～-233位点20bp片段的序列；Fpab2载体含有ATG上游第-440～-1位但缺失ATG上游-231～-317位点87bp片段的序列。

2.根癌农杆菌的转化

根癌农杆菌的转化采用冻融法。农杆菌菌株采用常用根癌农杆菌LBA4404(可参见US7321031)。前述构建的植物表达载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25mg/L利福平、50μg/ml卡那霉素和100mg/L链霉素)，2天后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例3 植物转化以及转基因后代的筛选

在本实施例中，以棉花、烟草、拟南芥的转基因为例，其他植物的转化可以此为参照。

a.棉花的转基因

采用农杆菌介导的方法转化棉花。

含载体质粒(Fp2000)的农杆菌于添加卡那霉素50mg/L、利福平100mg/L、链霉素300mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3天后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm/min的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm/min离心10min，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

棉花R15(常规的陆地棉)种子经常规消毒后置于1/2MSO(1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉，pH 6.0)培养基，在黑暗中萌发培养，5～7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20分钟，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2，4-D+2.2g/LGelrite(固化剂)，pH 6.0)上，22℃暗培养2天后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite，pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/L Gelrite，pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

b.拟南芥的转基因

拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)。农杆菌培养方法同上，菌液于4000rpm/min离心10min后，菌体重悬于500ml含0.02％ Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5秒，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24小时。T0代种子在4℃春化2～4天，用20％漂水处理15分钟，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭：蛭石：珍珠岩1：1：1)中生长。

c.烟草的转基因

烟草转基因采用叶盘法。

农杆菌菌液制备同棉花转化法。野生型烟草叶片切成0.5cm见方的小块，MS基本培养附加1.0mg/L的培养基上，22℃暗培养2天后，转入MS+6BA1.0mg/L+500mg/L头孢霉素+100mg/L卡那霉素培养基上诱导不定芽，3周后将不定芽转移到MS+50mg/L卡那霉素+100mg/L头孢霉素上生根。

实施例4 转基因植物的分子生物学鉴定

在本实施例中，选取实施例3获得的转基因后代植株，采用抗生素筛选、PCR、GUS染色对转基因植株进行验证。

a.PCR分析

DNA提取方法见实施例1。

PCR检测正向引物为根据FIF1启动子序列-360位置附近序列设置：

5’-CGG CCT GTC CAA AAC TGA-3’(SEQ ID NO：8)。

反向引物序列根据转基因植物表达载体上FIF1启动子驱动的GUS基因5’端40bp位点设计，序列为：

5’-TTG ATT TCA CGG GTT GGG-3’(SEQ ID NO：9)。

PCR反应条件：94℃预变性5m；然后94℃预变性30S，55℃复性30S，72℃延伸30秒，共32个循环；最后72℃延伸10m，扩张片段大小约400bp。

经PCR分析，获得的植株中含有FIF1启动子片段。

b.GUS染色分析

用GUS染色液(100mM pH7.0磷酸缓冲液，50mM K₃[Fe(CN)₆]，50mMK₄[Fe(CN)₆]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％ Triton X-100)浸泡植物材料，37℃，12～24小时。70％乙醇脱色，样品在70％乙醇中保存。

结果见图2-图4。

图2为由FIF1指导的GUS基因(FIF1:GUS(Fp2000))在棉花中的表达特征。有图2A-D可知，GUS基因特异性表达在棉花叶(A)、茎(B)、开花当天的胚珠(C)的表皮毛中；或表达在开花后9天棉纤维(D)中。图2E为FIF1启动子驱动的GUS基因在转基因棉花不同组织(叶、茎、花瓣、苞、雄蕊、根)的活性分析。结果表明FIF1启动子在棉纤维起始和发育过程中高表达。

图3为由FIF1指导的GUS基因(FIF1:GUS(Fp2000))在拟南芥中的表达特征。其中a：1周左右幼苗；b：3周左右的拟南芥，图中显示在幼嫩叶片表皮毛表达；c：茎；d：成熟叶片；e：放大的成熟叶片的表皮毛；f：花序。结果表明，拟南芥中棉花FIF1启动子是一个表皮毛特异表达的启动子

图4为由FIF1指导的GUS基因(FIF1:GUS(Fp2000))在烟草中的表达特征。其中A：烟草叶片表皮毛；B：烟草茎部表皮毛。结果表明，FIF1启动子在转基因烟草中的表达主要是在腺毛中表达，并且特异的在腺毛顶端的腺体细胞表达。

实施例5 GUS活性荧光测定

本实施例中，检测携带不同长度FIF1启动子片段的表达载体(Fp2000、Fp1000、Fp750、Fp440、Fp360、Fp321、Fp220、Fpab1、Fpab2)被导入拟南芥并制备拟南芥转基因植物后，各启动子片段指导GUS基因表达的活性。

100mg转基因拟南芥植物叶片材料，液氮冷冻，加100μL GUS提取缓冲液用电转头磨成粉末。4℃，12000g离心5min。取50μL GUS提取液，加500μL反应缓冲液(含1mM MUG(购自SIGMA公司)的GUS提取缓冲液)，混匀。每隔1小时取100μL，加终止缓冲液(200mM Na₂CO₃)。测定用Hoferminifluorometer(Hofer，San Franci sco，CA)荧光测定仪器。蛋白测定采用Bradford法。20μL GUS提取液，加1mL考马斯亮蓝溶液(100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95％乙醇，加100mL磷酸和水定容至1000mL，过滤保存于4℃)，2min后测定OD₅₉₅值。GUS活性以pmol MU/min/mg蛋白为单位。

其中，GUS提取缓冲液：50mM pH7.0磷酸缓冲液，10mM EDTA，0.1％Sarcosyl(硅鱼精)，0.1％巯基乙醇，0.1％ Triton X-100。

结果见图5，结果表明：FIF1启动子360bp的片段足以驱动GUS基因在转基因拟南芥表皮毛中表达，其中Fpab1载体中包含T/G-盒元件内的20bp的缺失可以导致该启动子活性明显降低，表明T/G-盒为调控FIF1启动子表皮毛特异表达的一个关键元件。

此外，通过常规PCR方法，本发明人还获得了对应于图1序列中-360～-8位序列的启动子片段，如前述方法构建载体并转化棉花，检测所述启动子片段指导GUS的表达活性。结果发现，所述启动子片段也可较好地指导GUS的表达。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>植物表皮毛特异表达启动子FIF1及其应用

<130>080298

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2119

<212>DNA

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<400>1

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

Claims (10)

1.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸序列选自下组：

(1)由SEQ ID NO：1中(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列构成；

(2)具有SEQ ID NO：1中(1-1837)～(2043-2062)位所示的核苷酸序列且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；

(3)在严格条件下能够与(1)或(2)限定的核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；

(4)与(1)或(2)限定的核苷酸序列有70％以上相同性且具有指导目的基因在植物表皮毛特异表达功能的核苷酸序列；或

(5)与(1)-(4)任一限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述的核酸序列选自下组：

具有SEQ ID NO：1中1～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中63～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1063～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1313～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1623～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1703～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1742～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1837～2062位序列；

具有SEQ ID NO：1中1830～2062位序列；或

具有SEQ ID NO：1中1623～2062位且其中缺失1746～1832序列。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的核酸，作为启动子元件。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。

5.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因选自：FIF1基因、β-葡萄糖苷酶基因、肌动蛋白1基因、细胞壁松弛蛋白基因、蔗糖合成酶基因等、紫穗槐二烯合酶基因、或细胞色素P450单加氧酶基因。

6.如权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的目的基因位于所述核酸的下游，且与所述启动子的间隔小于1000bp。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞：

含有权利要求3所述的载体；或

其基因组中整合有外源的权利要求1所述的核酸。

8.权利要求1所述的核酸的用途，其特征在于，用于作为启动子元件，指导目的基因在植物表皮毛特异表达。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的植物选自：锦葵科棉属植物，菊科植物，茄科植物，唇形科植物或伞形科植物。

10.一种制备转基因植物的方法，所述转基因植物的表皮毛可特异表达目的基因，其特征在于，所述的方法包括：

将构建物转化植物细胞、组织或器官，所述的构建物含有权利要求1所述的核酸以及与所述的核酸可操作地连接的目的基因；

选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组织或器官；和

将所述植物细胞、组织或器官再生成植株。

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