CN100567494C - 来源于棉花的基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个植物基因启动子及其应用。该启动子碱基序列如SEQ ID NO：1所示。烟草转基因试验证明pGhGlcat1能赋予GUS报告基因在表皮毛、顶端分生组织区和植物花器官的雄蕊和雌蕊中高水平表达，表明GhGlcat1在棉纤维初生细胞壁合成期、细胞伸长、花器官发育及胁迫响应中发挥重要作用，pGhGlcat1的功能研究为揭示GhGlcat1的表达调控机理提供了线索。此外，pGhGlcat1还可用于植物品质及抗性的基因工程改良中。

Description

来源于棉花的基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因启动子及其应用，特别是涉及一个来源于棉花的植物基因启动子及其在植物品质改良中的应用。

背景技术

糖基转移酶(Glycosyltransferases，GTs)催化糖基连接到不同的受体分子上，基于其序列相似性、催化特异性、保守序列和供体糖种类的不同，这类酶被分成不同的家族(T.Vogt，P.Jones，Glycosyltransferases in plant natural productsynthesis：characterization of a supergene family，Trends Plant Sci.5(2000)380-386；W.G.T.Willats，L.McCartney，W.Mackie，J.P.Knox，Pectin：cellbiology and prospects for functional analysis.Plant Mol.Biol.47(2001)9-27.)。在植物中，糖基转移酶能将光合作用的产物转变成二糖、寡糖、多糖等不同类型的糖类小分子物质，因而在植物的发育过程中起重要作用。葡萄糖醛酸转移酶属于糖基转移酶家族，由4个独立的家族GT1、GT43、GT47和GT70组成。根据对碳水化合物有活性的酶分类数据库(Carbohydrate-Active Enzymes，CAZy)中的数据进行归类，植物葡萄糖醛酸转移酶主要属于GT47家族(J.A.Campbell，G.J.Davies，V.Bulone，B.Henrissat，A classification of nucleotide-diphospho-sugarglycosyl transferases based upon amino-acid similarities，Biochem.J.326(1997)929-942.)。

葡萄糖醛酸转移酶可催化转移一个尿苷5’二磷酸葡萄糖醛酸基团(GLCA)到不同的受体底物。这些底物主要是糖苷配基类物质，如木聚糖、花青素或果胶等。经研究发现：在木聚糖骨架上，每隔6个木聚糖残基就加入一个葡萄糖醛酸基团到葡萄糖醛酸木聚糖分子中，形成I型细胞壁，并且，α-D-葡萄糖醛酸基团以侧链形式加到木聚糖骨架的O-2位置上(N.Carpita，D.M.Gibeaut，Structural models ofprimary cell walls in flowering plants：consistency of molecular structurewith the physical properties of walls during growth，Plant J.3(1993)1-30.)。Sawada等证明BpUGAT(B.perennis glucuronosyltransferases)催化葡萄糖醛酸基团专一性地结合到底物花青素的2’羟基基团上(S.Sawada，H.Suzuki，F.Ichimaida，M.Yamaguchi，T.Iwashita，Y.Fukui，H.Hemmi，T.Nishino，T.Nakayama，UDP-glucuronic Acid：Anthocyanin Glucuronosyltransferase from Red Daisy(Bellis perennis)Flowers，J.Biol.Chem.280(2005)899-906.)。由于底物不同，葡萄糖醛酸转移酶可能参与分化和次生代谢等许多重要生理调节过程(R.S.Bandurski，J.D.Cohen，J.Slovin，D.M.Reinecke，Hormone biosynthesis andmetabolism，in：P.J.Davies(ed)，Plant Hormones：Physiology，Biochemistry，and Molecular Biology，Dordrecht，The Netherlands，Kluwer Academic Publishers，1995，pp.39-65.)。

在植物中，葡萄糖醛酸转移酶或其相关基因被认为在植物生长和代谢过程中起重要作用。在豌豆下胚轴延伸期，葡萄糖醛酸转移酶的活性达到最大值，且在伸长几乎完全停止后仍然活性很高。据报导豌豆葡萄糖醛酸转移酶(Pisum sativumglucuronosyltransferases，PsUGT1)催化UDP-葡萄糖醛酸基团与未知的底物结合，且该基因与有丝分裂有关，并在分裂的细胞中高效表达。通过组成性表达反义mRNA抑制PsUGT1基因的表达，能显著性地延缓转基因苜蓿(alfalfa)的生长和发育。在烟草(Nicotiana plumbaginifolia)中，Iwai等通过T-DNA插入的方法，获得一个命名为nolac-H18(nonorganogenic callus with loosely attached cells，nolac-H18)突变体，它编码一个花药葡萄糖醛酸转移酶，该酶参与果胶的合成，并在植物分生组织和器官的细胞间粘附(intercellular attachment)中起至关重要的作用(H.Iwai，N.Masaoka，T.Ishii，S.Satoh，A pectin glucuronyltranferase gene is essentialfor intercellular attachment in the plant meristem，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(2002)16319-16324.)。虽然这些报导表明葡萄糖醛酸转移酶在植物中呈现不同的表达谱和功能，但是对调控其表达的启动子结构特征还知道得很少，而且，还没有见到有对植物葡萄糖醛酸转移酶启动子区域鉴定的研究报导。

棉花是一种重要的经济作物，其纤维来自于胚珠外表皮细胞极性延长和次生加厚，也是研究细胞壁和多糖合成的极好材料(H.Liu，R.G.Creech，J.N.Jenkins，D.Ma，Cloning and promoter analysis of the cotton lipid transfer protein geneLtp3.Biochim.Biophy.Acta 1487(2000b)106-111.)，因而研究棉花细胞壁合成相关的酶将对了解棉花纤维的发育调控具有重要的参考价值。本发明的发明人先前通过差异显示和RACE方法获得了一个棉花葡萄糖醛酸转移酶基因(GhGlcat1)，并对该基因的序列特征和表达谱进行了分析(Y.T.Wu，J.Y.Liu.Molecular cloning andcharacterization of a cotton glucuronosyltranferase gene，J.Plant Physiol.162(2005)573-582.)。

发明内容

本发明的目的是提供一个来自于棉花的植物基因启动子，是一个棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子。

本发明所提供的棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子，名称为pGhGlcat1，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有转录起始作用的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1677bp个碱基组成。自5’端第1617位碱基为转录起始位点；自5’端第1544-1548位碱基为CAAT盒；自5’端第1579-1584位碱基为TATA框；自5’端第198位碱基开始是1个淀粉酶元件(asmylase-box)，自5’端第851和1091位碱基开始是2个反向淀粉酶元件；分别自5’端第428、859、1264和1524位碱基开始是4个E-box；自5’端第1343位碱基开始是CARE；分别自5’端第198、851和1091位碱基开始是3个GAREs；自5’端第13位碱基开始是GCN₄；自5’端第850位碱基开始是AACA；4个ACGT序列分别位于自5’端第215-218位碱基，第302-305位碱基，第1004-1007位碱基和第1023-1026位碱基；6个MYB响应元件分别位于自5’端第124-129位碱基，第257-262位碱基，第268-273位碱基，第856-858位碱基，第859-864位碱基和第1349-1354位碱基；8个W-box元件分别位于自5’端第15-19位碱基，第156-160位碱基，第176-180位碱基，第293-297位碱基，第618-622位碱基和第1065-1069位碱基，第1115-1119位碱基，第1250-1254位碱基；一个反向的生长素元件AuxRE位于自5’端第1516-1521位碱基。

含有本发明启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增pGhGlcat1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明提供了一个来源于棉花的植物基因启动子pGhGlcat1，该启动子中含有6个MYB-Like基因识别位点和4个E-box，表明GhGlcat1可能被MYB和bHLH类转录因子共同调控。此外，烟草转基因试验证明pGhGlcat1能赋予GUS报告基因在表皮毛、顶端分生组织区和植物花器官的雄蕊和雌蕊中高水平表达，而在维管束组织几乎不表达，且受胁迫响应，分生组织是初生细胞壁合成的主要器官，表明GhGlcat1在棉纤维初生细胞壁合成期、细胞伸长、花器官发育及胁迫响应中发挥重要作用，pGhGlcat1的功能研究为揭示GhGlcat1的表达调控机理提供了线索。此外，pGhGlcat1还可应用于植物(包括单子叶和双子叶植物，尤其是棉花)的品质及抗性的基因工程改良中，具有较高的实际应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为pGhGlcat1的序列分析结果

图2为pBI-pGhGlcat1::GUS转基因烟草不同发育时期GUS活性的组织化学分析结果

图3为生长4周的pBI-pGhGlcat1::GUS转基因烟草中的GUS报告基因的定量分析结果

图4为经非生物胁迫处理的pBI-pGhGlcat1::GUS转基因烟草的GUS相对活性测定结果

图5为含有不同长度pGhGlcat1启动子缺失片断和GUS基因的植物表达载体的构建示意图与转基因烟草的GUS活性分析结果

图6为转化有含不同长度pGhGlcat1启动子缺失片断和GUS基因的植物表达载体的转基因烟草表皮毛的GUS染色结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海生工合成，所述百分含量均为质量百分含量。

实施例1、棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子pGhGlcat1的克隆及序列分析

一、棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子pGhGlcat1的克隆

参照Paterson等的方法(Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF.A rapid methodfor extraction cotton(Gossypium spp.)Genomic DNA suitable for RFLP or PCRanalysis.Plant Mol Biol Rep 1993；11：122-7.)提取棉花品种中棉12(Gossypiumhirsutum cv.CRI 12)叶片的核基因组DNA，然后用改良的染色体步行法(A.M.Wu，J.Y.Liu，An improved method of genomic walking for promoter sequences cloning，Chin.J.Biochem.Mol.Biol.22(2006)243-246.)克隆棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子序列。将克隆并经纯化的DNA片段连接至载体pGEM-T Easy(Promega公司)中，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，用Qiagen公司的QIAprep Spin Mini Prop试剂盒对所提质粒进行纯化后，用ABI PRISMTM 377DNA测序仪进行测序。结果获得一个长度为1677bp的DNA片段，具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。与已克隆的GhGlcat1的cDNA序列进行比较，结果该1677bp的DNA片段含有GhGlcat1cDNA序列5’端非编码区的60个核苷酸，即5’端非编码区部分重叠，表明所克隆到的长度为1677bp的DNA片段就是目标基因GhGlcat1的启动子序列，将该启动子命名为pGhGlcat1。而将上述含有pGhGlcat1的重组载体命名为pGEM-T Easy-pGhGlcat1。

二、pGhGlcat1的序列分析

对棉花葡萄糖醛酸转移酶基因GhGlcat1的启动子pGhGlcat1的核苷酸序列(序列表中的SEQ ID №：1)进行初步的序列分析，分析结果见图1，将用5’-RACE法扩增分离到的GhGlcat1cDNA序列的第一个碱基定义为转录起始位点(记为+1，见图1中带箭头的碱基)，即序列表中SEQ ID №：1自5’端的第1617位碱基，其中TATA框位于转录起始位点上游的-39至-34位碱基，而CAAT框位于-74至-70位碱基，这些元件在转录中是基本启动子元件。再用PLACE(Higo K，Ugawa Y，Iwamoto M，Korenaga T.Plant cis-acting regulatory DNA-elements(PLACE).Nucl Acids Res1999；27：297-300.)和PlantCARE(Lescot M，Déhais P，Thijs G，Marchal K，MoreauY，Van de Peer Y，RouzéP，Rombauts S.PlantCARE，a database of plantcis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysisof promoter sequences.Nucl Acids Res 2002；30：325-7.)软件对pGhGlcat1的核苷酸序列进行进一步的序列分析，分析结果如表1所示，启动子pGhRGP1中含有众多与已知真核生物的顺式作用元件的同源序列，如在种子/胚乳特异表达的顺式作用元件，包括淀粉酶元件(asmylase-box)、E-box、CARE、GARE、GCN₄元件、ACGT元件和AACA元件，其中，淀粉酶元件位于转录起始位点上游的-1420位、-527位和一个反向淀粉酶元件位于-767位，它被认为与在种子中高表达相关(N.Huang，T.D.Sutliff，J.C.Litts，R.L.Rodriguez，Classification and characterization ofthe rice alpha-amylase multigene family，Plant Mol.Biol.14(1990)655-668.)；4个E-box位于转录起始位点上游的-1190位，-759位，-354位和-94位，它被认为与种子特异表达的种子储藏蛋白有关(Y.Kawagoe，N.Murai，Fourdistinct nuclear proteins recognize in vitro the proximal promoter of thebean seed storage protein P-phaseolin gene conferring spatial and temporalcontrol，Plant J.2(1992)927-936.；K.Stalberg，M.Ellerstom，I.Ezcurra，S.Ablov，L.Rask.Disruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolishedhigh transcription of the napA storage-protein promoter in transgenicBrassica napus seeds，Planta 199(1996)515-519.)；碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)蛋白可结合到E-box上，并且bHLH蛋白与种子中花青素的表达有关(S.R.Ludwig，L.F.Habera，S.L.Dellaporta，S.R.Wessler，Lc，amember of the maize R gene family responsible for tissue-specific anthocyaninproduction，encodes a protein similar to transcriptional activators andcontains the myc-homology region，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)7092-7096.)，因而bHLH蛋白可能与E-box元件相结合，调控种子蛋白基因的特异表达；1个CARE和3个GAREs分别位于启动子转录起始位点上游的-275位、-561位和反向的-767位、-527位，它们与种子的萌发有关(K.Sutoh，D.Yamauchi，Twocis-acting elements necessary and sufficient for gibberellin-upregulatedproteinase expression in rice seeds，Plant J.34(2003)635-645.；M.Ogawa，A.Hanada，Y.Yamauchi，A.Kuwahara，Y.Kamiya，S.Yamaguchi，Gibberellinbiosynthesis and response during Arabidopsis seed germination，Plant Cell15(2003)1591-1604.)；启动子中还含有1个GCN₄、1个AACA序列和4个ACGT序列，而组合的GCN4、ACGT和AACA序列足以赋予高水平的胚珠特异表达(H.Washida，C.Y.Wu，A.Suzuki，U.Yamanouchi，T.Akihama，K.Harada，F.Takaiwa，Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expressionof the rice storage protein glutelin gene GluB-1.Plant Mol.Biol.40(1999)1-12.；C.Y.Wu，H.Washida，Y.Onodera，K.Harada，F.Takaiwa，Quantativenature of the prolamin-box，ACGT and AACA motifs in a rice glutelin genepromoter：minimal cis-element requirements for endosperm-specific geneexpression，Plant J.23(2000)415-421.)；此外，启动子pGhGlcat1中还含有6个MYB响应元件(图1中阴影处序列)分别位于启动子转录起始位点上游的-269位，-762位，-1361位，-1350位，-1494位和-759位，与表皮毛特异表达有关(E.Wang，S.Gan，G.J.Wagner，Isolation and Characterization of the CYP71D16trichomes-specific promoter from Nicotiana tabacum L.J.Exp.Bot.53(2002)1891-1897；S.Wang，J.W.Wang，N.Yu，C.H.Li，B.Luo，J.Y.Gou，L.J.Wang，X.Y.Chen，Control of plant trichomes development by a cotton fiberMYB gene，Plant Cell 16(2004)2323-2334.)；一些花粉特异表达的元件，如AGAAA、AAATGA和GTGA序列(K.Weterings，J.Schrauwen，G.Willems，D.Twell，Functional dissection of the promoter of the pollen-specific gene Ntp303reveals a novel pollen-specific and conserved cis-regulatory element.PlantJ.8(1995)55-63.)；pGhGlcat1启动子中还含有一些可能与诱导调节相关的元件，如W-box和AuxRE，8个W-box元件(TGACT)分别位于转录起始位点上游-1603位，-1462位，-1442位，-1325位，-1000位，-553位，-503位和-368位(图1中方框内序列)，它们可能与糖诱导响应相关(C.Sun，S.Palmqvist，H.Olsson，M.Boren，S.Ahlandsberg，C.Jansson，A novel WRKY transcription factor，SUSIBA2，participates in sugar signaling in barley by binding to thesugar-responsive elements of the isol promoter，Plant Cell 15(2003)2076-2092.)，一个反向的生长素元件AuxRE(GAGACA)位于-102位(图1中斜体表示的序列)(T.Ulmasov，G.Hagen，T.J.Guilfoyle，Dimerization and DNA bindingof auxin response factors，Plant J.19(1999)309-319.)。上述启动子pGhGlcat1的序列分析结果表明GhGlcat1基因可能在棉花纤维发育和胁迫诱导中受到复杂因素的调控。

表1GhGlcat1启动子序列中的调控元件分析

序列<sup>①</sup>	位置	名称和功能	参考文献
				TAACARA	-1420(+)，-767(-)，-527(-)	amylase box，种子特异	(N.Huang，T.D.Sutliff，J.C.Litts，R.L.Rodriguez，Classification and characterization of the ricealpha-amylase multigene family，Plant Mol.Biol.14(1990)655-668.)
AACAAAC	-768(-)	AACA motif，胚乳特异调控	C.Y.Wu，H.Washida，Y.Onodera，K.Harada，F.Takaiwa，Quantative nature of the prolamin-box，ACGT and AACA motifs in a rice glutelin genepromoter：minimal cis-element rcquirements forendosperm-specific gene expression，Plant J.23(2000)415-421.
				ACGT	-1403(+)-1316(+)，-614(+)，-595(+)	ACGT motif，胚乳特异调控	T.L.Thomas，Gene expression during plantembryogenesis and germination：an overview，PlantCell 5(1993)1401-1410.
TGAGTCA	-1605(+)，	GCN4，胚乳特异调控	H.Washida，C.Y.Wu，A.Suzuki，U.Yamanouchi，T.Akihama，K.Harada，F.Takaiwa，Identification ofcis-regulatory elements required for endospermexpression of the rice storage protein glutelin geneGluB-1.Plant Mol.Biol.40(1999)1-12
				CANNTG	-1190(+)，-759(+)，-354(+)，-94(+)	E-box，种子特异	K.Stalberg，M.Ellerstom，I.Ezcurra，S.Ablov.L.Rask.Disruption of an overlappingE-box/ABRE motif abolished high transcriptionof the napA storage-protein promoter intransgenic Brassica napus seeds，Planta 199(1996)515-519.
CAACTC	-275(+)	CARE，种子萌发	K.Sutoh，D.Yamauchi，Two cis-acting elementsnecessary and sufficient forgibberellin-upregulated proteinase expressionin rice seeds，Plant J.34(2003)635-645.

TAACAAR	-1420(+)，-767(-)，-527(-)	GARE，种子萌发	M.Ogawa，A.Hanada，Y.Yamauchi，A.Kuwahara，Y.Kamiya，S.Yamaguchi，Gibberellinbiosynthesis and response during Arabidopsisseed germination，Plant Cell 15(2003)1591-1604.
				TGACT	-1603(-)，-1462(-)，-1442(-)，-1325(+)，-1000(-)，-553(+)，-503(+)，-368(-)	W-box，糖响应元件	C.Sun，S.Palmqvist，H.Olsson，M.Boren，S.Ahtandsberg，C.Jansson，A novel WRKYtranscription factor，SUSIBA2，participates in sugarsignaling in barley by binding to the sugar-responsiveelements of the isol promoter，Plant Cell 15(2003)2076-2092.
TGTCTC	-102(-)	AuxRE，生长素响应元件	T.Ulmasov，G.Hagen，T.J.Gilfoyle，Dimerization and DNA binding of auxin responsefactors，Plant J.19(1999)309-319.
				CNGTTR	-269(+)，-762(-)，-1361(+)，-1350(-)，-1494(+)，-759(+)	Myb识别位点调控的多个基因表达	T.Urao，K.Yamaguchi-Shinozaki，S.Urao，K.Shinozaki，An Arabidopsis myb homolog isinduced by dehydration stress and its geneproduct binds to the conserved MYB recognitionsequence，Plant Cell 5(1993)1529-1539.
AGAAA	-328，-25	Pollen-responsive，花粉特异表达	Bate N，Twell D.Functional archl tectue of alate pollen promoter：pollen-specifictranscription is developmentally regulated bymultiple stage-specific and co-dependentactivator elements.Plant Molecular Biology1998；37：859-869.
				AAATGA	-989(+)，-950(+)，-634(+)，-586(+)	花粉特异表达	K.Weterings，J.Schrauwen，G.Willems，D.Twell，Functional dissection of the promoter ofthe pollen-specific gene Ntp303 reveals a novelpollen-specific and conserved cis-regulatoryelement.Plant J.8(1995)55-63.
GTGA	-1550(+)，-1536(+)，-1390(+)，-504(+)，-91(+)	GTAG motif，花粉特异表达	Rogers HJ，Bate N，Combe J，Sullivan J，SweetmanJ，Swan C，Lonsdale DM，Twell D.Functionalanalysis of cis-regulatory elements within thepromoter of the tobacco late pollen gene g10.Plant Mol Biol 2001；45：577-585.

①N代表A，C，G或T；R代表A或G。

实施例2、将含有pGhGlcat1启动子及GUS基因的植物表达载体转化烟草及GUS活性测定和组织化学定位

一、含有pGhGlcat1启动子及GUS基因的植物表达载体pBI-pGhGlcat1::GUS的构建

为检测GhGlcat1启动子pGhGlcat1在转基因烟草中的活性，现构建含有pGhGlcat1和GUS基因的烟草表达载体，具体方法为：以实施例1构建的含pGhGlcat1的重组载体pGEM-T Easy-pGhGlcat1为模板，在正向引物1：5’-CAAGCTTCAGACCTGAGTCATTC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)和反向引物2：5’-CTGGATCCCTTATGAGTAAAATGGAATT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)的引导下，PCR扩增pGhGlcat1，并在序列两端分别添加上限制性内切酶Hind III和BamHI的识别位点。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1647bp的目的片段，对回收片段用限制性内切酶Hind III和BamH I酶切后，与经相同酶双酶切的载体pBI121(Clontech公司)连接，将pGhGlcat1取代载体pBI121中的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，并位于GUS报告基因的上游，得到含有pGhGlcat1和GUS基因的烟草表达载体，命名为pBI-pGhGlcat1::GUS。同时，以含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和GUS基因(35S::GUS)的载体pBI121作为阳性对照，以不含启动子、仅含有GUS报告基因(promoterless::GUS)的载体pBI101(Clontech公司)作为阴性对照。

二、将烟草表达载体pBI-pGhGall::GUS转化烟草及转基因烟草的鉴定

将步骤一构建的双元植物表达载体载体pBI-pGhGlcat1::GUS，阳性对照pBI121和阴性对照pBI101分别通过冻融法转化农杆菌LBA4404，经筛选得到农杆菌转化子，再用叶盘法将农杆菌转化子转化烟草(N.tabacum cv.shangxi)，包括以下步骤：

1)挑取携带目标质粒的农杆菌单菌落过夜培养，次日扩大培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8；

2)4500g离心5min收集菌体，用1/2MS液体培养基(大量元素和微量元素是MS液体培养基的一半，其余成分不变)洗涤菌体一次，并将其稀释到新的1/2MS液体培养基中(至OD₆₀₀＝0.1-0.2)，准备侵染用；

3)取烟草无菌苗叶片，用直径6mm的打孔器制取叶盘外植体，并将其浸入准备好的农杆菌菌液中，缓慢振荡侵染15min；

4)将侵染的叶盘经过2天共培养后转到的再生培养基(MS+2.0mg/L BA+0.5mg/L IAA)上进行筛选培养，直至分化出抗性芽；

5)切下抗性芽转接含有500mg/L羧苄青霉素(Carb)和150mg/L卡那霉素(Kan)的生根培养基(MS+0.5mg/L IAA)上诱导生根，获得转基因烟草植株。

根据GUS基因的编码区序列，设计一对内部引物(正向引物3：5’-CTCATTACGGCAAAGTGTGGG-3’和反向引物4：5’-GTGCACCATCAGCACGTTATCG-3’)，以卡那霉素抗性小苗的基因组DNA为模板，在引物3和引物4的引导下进行PCR扩增，以检测GUS报告基因表达盒是否已整合进再生苗。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，得到665bp扩增片段，表明GUS报告基因已整合进再生苗。筛选阳性T₀代植株，在25℃、16h光照/8h黑暗的温室内培植、开花、结籽。

三、GUS活性的组织化学定位分析和荧光定量测定

取步骤二在温室中生长不同时期的pBI-pGhGlcat1::GUS转基因烟草的幼苗，将转基因烟草的不同组织分别置于研钵中加入液氮研磨成匀浆。然后将匀浆悬浮于GUS提取缓冲液(含50mM Na₃PO₄缓冲液(pH 7.0)，0.1％Triton X-100，10mM β-巯基乙醇，10mM 1，2-diaminocyclohexane-N，N，N，N-tetraacetic acid以及0.1％月桂酸钠)中，在12,000g、4℃离心10min后收集上清。参考Jefferson等的荧光组织化学定位法(Jefferson RA，Kavanagh TA，Bevan MW.GUS fusions：p-Glucuronidaseas a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.EMBO J1987；6：3901-7.)测定GUS活性，具体方法为：将待测上清样品在含0.5％多聚甲醛的0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中固定30min，然后置于GUS反应液(含0.1mol/L Na₃PO₄缓冲液(pH 7.0)，10mmol/L EDTA，5mmol/L铁氰化钾，1.0mmol/L X-gluc及0.1％Triton X-100)中3-12h，直至着色达到足够强度，再将光合组织用70-100％系列乙醇脱色以去掉叶绿素，最后用尼康8700相机(Nikon公司)或体视镜(Leica公司)照相，进行观察。GUS荧光的定量测定方法为：参照Bradford的方法(Bradford MM.A rapidand sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 1976；72：248-54.)对提取液中的蛋白质进行浓度定量，用牛血清白蛋白(BSA)作标准曲线。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone，4-MU)为单位。GUS活性数据是5个不同转基因株系测定值的平均值。收集的样品可置于液氮中速冻，于-70℃储存备用。

不同时期取样并进行的GUS荧光组织化学定位结果如图2所示，萌发1d大的幼苗，GUS在整个小植株中都很深着色(图2中的图A)；而萌发后还发现GUS着色在萌发种子的种皮上(图2中的图B)。植物的种皮含有大量的花青素，并且有报导证明葡萄糖醛酸转移酶基因参与了花青素的合成(Sawada S，Suzuki H，Ichimaida F，et al.UDP-glucuronic Acid：Anthocyanin Glucuronosyltransferase from Red Daisy(Bellis perennis)Flowers.J.Biol.Chem.2005，280：899-906.)，GUS基因在种皮上的表达暗示了棉花GhGlcat1基因可能也与花青素的生物合成有关。更进一步，启动子pGhGlcat1中含有4个E-box，而调控E-box的转录因子bHLH类蛋白，正好与花青素的合成有关(Ludwig S R，Habera L F，Dellaporta S L，et al.Lc，a member ofthe maize R gene family responsible for tissue-specific anthocyanin production，encodes a protein similar to transcriptional activators and contains themyc-homology region.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989，86：7092-7096.)，因而E-box可能参与启动子调控种皮的表达。此外，2d大的幼苗，GUS染色主要分布在根分生区和子叶，但根毛较少着色(图2中的图C)；当幼苗3周大时，GUS着色主要在根尖，包括主根和侧根(图2中的图D和图E)以及上半部份茎(图2中的图F)中，仔细观察GUS在茎部的着色，其主要位于茎部节间的维管束(图2中的图F)和外层表皮细胞的表皮毛(图2中的图G)中；而叶片中GUS活性非常低，未见有着色(结果未显示)。GUS在茎部维管束高表达也与先前报导该基因的RNA杂交检测结果在茎部有较高的信号相一致(Y.T.Wu，J.Y.Liu.Molecular cloning and characterization of acotton glucuronosyltranferase gene，J.Plant Physiol.162(2005)573-582.)，上述GUS荧光组织化学定位结果表明了GhGlcat1基因在植物体内的表达是一个动态变化的过程。为了更准确地给出pGhGlcat1转基因植株中GUS报告基因表达的量化指标，以4周大的烟草为材料对GUS报告基因进行定量分析。根和茎分别取靠近分生组织的顶部，叶片取第4张叶片，结果如图3中的图A和图B所示(图A：根尖部(rt)、茎顶部(st)和第4片叶(1f)在转基因烟草中的位置图；图B：相应部位的GUS活性测定结果)，GUS活性在根尖和茎顶部较高，而在叶片中的活性非常低，其中根中的GUS活性是叶中活性的5.19倍。此结果也与上述组织化学定位分析结果相一致，暗示了GhGlcat1基因可能主要在分生组织区和维管束中表达。

在生殖生长阶段，GUS可着色在花粉囊和花粉粒中(图2中的图H和图I)；由于该实施例所用的转基因植株为T1代，所以在单倍体的花粉中着色和不着色的分离比平均值接近1∶1，表明T1代植株是单拷贝插入。10d大的果实横切面中，GUS着色在种子上，而胎座中没有着色(图2中的图J-图L)。统计结果表明，有73.2％的种子表现出较强的GUS着色，接近于3∶1的分离比例。与GUS组织化学定位结果相符，启动子中也含有多个与种子/胚乳特异表达相关的元件，如amylase-box、CARE、GARE、GCN4、ACGT元件等(N.Huang，T.D.Sutliff，J.C.Litts，R.L.Rodriguez，Classification andcharacterization of the rice alpha-amylase multigene family，Plant Mol.Biol.14(1990)655-668.；K.Sutoh，D.Yamauchi，Two cis-acting elements necessaryand sufficient for gibberellin-upregulated proteinase expression in riceseeds，Plant J.34(2003)635-645.；M.Ogawa，A.Hanada，Y.Yamauchi，A.Kuwahara，Y.Kamiya，S.Yamaguchi，Gibberellin biosynthesis and responseduring Arabidopsis seed germination，Plant Cell 15(2003)1591-1604.；H.Washida，C.Y.Wu，A.Suzuki，U.Yamanouchi，T.Akihama，K.Harada，F.Takaiwa，Identification of cis-regulatory elements required for endosperm expressionof the rice storage protein glutelin gene GluB-1.Plant Mol.Biol.40(1999)1-12.)，而阴性对照中，相对应的组织中都没有GUS着色(结果未显示)。花器官的GUS定量分析结果如图3中的图C和图D所示(图A：花器官包括花粉囊(ant)、柱头(sti)、花柱(sty)、萼片(sep)、花瓣(pet)、子房(ova)、花托(rec)和花梗(ped)；图B：相应部位的GUS活性测定结果)，报告基因最高水平表达在花粉囊中，其次是柱头和花柱，低水平表达在萼片、花瓣、花梗、花托和子房中，其中花粉囊中的GUS活性是203.12±25.42pmol/mg protein/min，是柱头中的2倍，花梗中的7.1倍。表明GhGlcat1启动子指导GUS基因高表达在花粉囊中，与组织化学染色GUS着色在花粉囊和花粉粒中相一致，也与启动子中含有一些花粉特异表达的元件(AGAAA，AAATGA和GTGA)相符。

实施例3、检测pGhGlcat1转基因烟草对非生物胁迫的影响

取在温室中生长3周的T2代pBI-pGhGlcat1::GUS转基因烟草，做非生物胁迫处理，将植株根部分别浸于下列以MS培养液为溶剂的溶液中：200mM蔗糖(Suc)、200mM葡萄糖(Glu)、200mM果糖(Fru)、200mM甘露醇(Man)、200mM山梨醇(Sor)、50μM萘乙酸(NAA)、10μM赤霉素(GA)、50μM脱落酸(ABA)、20％PEG8000(PEG)、250mM NaCl、50μM甲基茉莉酸(MeJA)和1mM乙烯(Eth)，放在25℃的培养箱中处理24h，然后测定GUS活性，设MS培养液为对照(CK)，所有GUS活性数据是5个不同转基因株系测定值的平均值±SE(标准误)。

经上述不同溶液胁迫处理的转基因植物的GUS相对活性分析结果如图4所示(将对照(CK)组的GUS活性定为100％)，在所有胁迫处理中，葡萄糖和蔗糖处理的转基因植株，GUS活性明显地提高，它们比MS对照植株的GUS活性提高大约80％，而果糖处理的转基因植株，GUS活性只获得小幅提高；甘露醇和山梨醇则完全没有诱导作用。上述结果也与葡萄糖醛酸转移酶具有转糖基的功能相符(Campbell J A，DaviesG J，Bulone V，et al.A classification of nucleotide-diphospho-sugarglycosyl transferases based upon amino-acid smilarities.Biochem J.1997，326：929-942；Vogt T，Jones P.Glycosyltransferases in plant natural productsynthesis：characterization of a supergene family.Trends Plant Sci.2000，5：380-386.)，同时说明了这种酶的表达是受底物(糖)诱导的，而且对底物糖是有选择性的。同样，经GA和NAA处理的转基因植株，GUS活性也增加，它们分别比MS处理的对照植株的GUS活性提高大约31％和18％；ETH、NaCl和MeJA处理植株与对照植株相比，GUS活性变化不大；而经ABA和PEG8000处理后反而降低了转基因植株的GUS活性，PEG8000处理的主要用途是脱水作用，ABA和PEG8000在植株中的作用与GA和NAA的作用相反，这也正好与上述诱导效果相一致，暗示了GhGlcat1受到GA和NAA的正调控。因而，推测GhGlcat1基因在纤维发育过程中可能受到糖(葡萄糖和蔗糖)和激素(NAA和GA)的诱导，并共同调控它的表达。

实施例1的pGhGlcat1的序列分析结果表明，该启动子含有1个与生长素响应有关的AuxRE，与非生物胁迫启动子受生长素诱导的结果相一致。GUS染色结果又进一步表明该启动子能指导报告基因在根和茎的顶端组织区表达。茎顶端生长点是生长素的合成部位，而根尖中的生长素的浓度也相对较高。与茎生长点一样，根尖也是细胞分裂活跃的部位。因而推测，GhGlcat1基因在顶端组织表达，也是受这两个部位的激素浓度精细调控的。

实施例4、启动子pGhGlcat1的缺失分析和对糖的响应区域分析

一、含有不同长度pGhGlcat1启动子缺失片断及GUS基因的植物表达载体的构建

以实施例1构建的含pGhGlcat1的重组载体pGEM-T Easy-pGhGlcat1为模板，上游引物pF1、pF2、pF3、pF4、pF5、pF6和pF7(图1中pF1到pF77个上游引物为带下划线序列)分别与反向引物pR1配对作为引物组合(引物序列见表2)，PCR扩增7个不同长度的GhGlcat1启动子pGhGlcat1缺失序列，其对应的长度分别是1617bp、1355bp、1049bp、813bp、635bp、457bp和281bp(核苷酸长度值是转录起始位点至上游扩增位点长度，5’非翻译区的长度是30bp)，并在序列两端分别添加上限制性内切酶Hind III和BamH I的识别位点。反应结束后，对PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化上述缺失片段，对不同长度回收片段用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切后，与经相同酶双酶切的载体pBI121(Clontech公司)连接，将不同长度的pGhGlcat1缺失片断取代载体pBI121中的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，并位于GUS报告基因的上游，得到含有不同长度pGhGlcat1启动子缺失片断和GUS基因的烟草表达载体，分别命名为P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)，P1355(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1355/+30)，P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)，P813(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-813/+30)，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)，P457(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-457/+30)和P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)。同时，以含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和GUS基因(35S::GUS)的载体pBI121作为阳性对照，以不含启动子、仅含有GUS报告基因(promoterless::GUS)的载体pBI101(Clontech公司)作为阴性对照。

表2构建中所用的引物名称及序列

①引物pF1、pF2、pF3、pF4、pF5、pF6和pF7中带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点，引物pR1中带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点。

二、转基因烟草的获得及GUS活性检测

用与实施例2相同的方法将上述含有不同长度pGhGlcat1启动子缺失片断和GUS基因的烟草表达载体P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)，P1355(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1355/+30)，P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)，P813(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-813/+30)，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)，P457(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-457/+30)和P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)，以及对照质粒pBI121和pBI101转化烟草，经筛选得到转化有上述不同质粒的阳性转基因植株。选取3周大的每种阳性转基因植株至少5个不同的T1代转基因株系测定整株GUS活性。

GUS活性测定结果如图5所示(横线代表不同缺失长度的GhGlcat1启动子，左边数字代表启动子长度，右边为载体的命名。转录起始位点被定义为+1，并用小竖线标出。GUS活性为5个不同转基因株系的平均值，误差为标准误(±)。GUS活性的比值是指糖诱导的转基因植株GUS活性除以未诱导的转基因植株GUS活性。)，P1617(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1617/+30)至P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)3种转基因烟草的GUS活性有一定的上升，暗示了可能有负调控元件位于-1049bp之前；而P1049(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-1049/+30)至P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)3种转基因植株的GUS活性有较明显的降低，P635(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-635/+30)至P281(pBI-pGhGlcat1-1617::GUS；-281/+30)3种转基因植株的GUS活性变化不大。由此认为，311bp长(P281)的pGhGlcat1启动子缺失片断仍然有活性。另外，当缺失P1617(-1617/+30)、P457(-457/+30)和P281(-281/+30)bp时，转基因植株中仍然可见GUS着色在表皮毛中(见图6中的图A-C)，而不含启动子的pBI101未见GUS着色(见图6中的图D)。因而，推断决定表皮毛中特异表达的元件可能位于311bp(-281/+30)之内。进一步分析发现，在这段序列中含有一个MYB和一个E-box，推测这两个元件可能与P281(-281/+30)启动子在表皮毛中的表达相关。

三、启动子pGhGlcat1对糖的响应区域分析

实施例3的实验结果表明GhGlcat1的启动子pGhGlcat1能被糖(葡萄糖和蔗糖)诱导，因而用不同长度的启动子pGhGlcat1缺失片断的转基因烟草进行糖诱导试验，以研究其响应糖诱导的区域。上述每种转基因植株至少取5株，用与实施例3相同的方法用含0.2M葡萄糖的MS溶液进行处理，样品均被放置在25℃培养箱内，在黑暗条件下处理24h后测定GUS活性。结果如图5所示(横线代表不同缺失长度的GhGlcat1启动子，左边数字代表启动子长度，右边为载体的命名。转录起始位点被定义为+1，并用小竖线标出。+代表有诱导作用，-代表没有诱导作用。)对于含有P1617(-1617/+30)，P1355(-1355/+30)，P1049(-1049/+30)，P813(-813/+30)和P635(-635/+30)的5个转基因植株在含蔗糖的MS溶液中，GUS活性能被较强诱导。可是在P457(-457/+30)转基因烟草中，诱导作用明显下降；而含有P281(-281/+30)的转基因烟草完全失去糖诱导作用(结果见图5)。这些结果暗示了对糖诱导起主要作用的元件可能位于pGhGlcat1的转录起始位点上游-635至-457位之间，而起次要作用的元件可能位于-457和-281位之间。糖对阴性对照和阳性对照的转基因植株没有任何诱导作用。

实施例1的启动子pGhGlcat1的序列分析结果表明：GhGlcat1启动子中含有8个W-box，而W-box被认为与糖胁迫响应有关(C.Sun，S.Palmqvist，H.Olsson，M.Boren，S.Ahlandsberg，C.Jansson，A novel WRKY transcript ion factor，SUSIBA2，participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsiveelements of the isol promoter，Plant Cell 15(2003)2076-2092.)。这8个W-box中，有2个正向元件位于转录起始位点上游-635至-457位之间，一个反向元件位于-457至-281位之间，而-281位的下游则没有W-box。序列分析结果刚好与上述GhGlcat1启动子的糖诱导特征相吻合，暗示了该启动子中的W-box可能与糖诱导存在较密切的关系，并且位于-635至-457位之间的2个正向W-box可能在糖诱导中起主要作用，而-457和-281位之间的反向W-box起相对较弱的诱导作用。

序列表

<160>1

<210>1

<211>1677

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>1

aagcttcaga cctgagtcat tcttgcttcg ttaacatcat gaattcattg ccagtctcta      60

gttccttgtg aagttagaaa agtgaggcat caattaaatt aaaattaagg ttaattacac     120

aaacagttac tcaattttga tctcaatgac aaaatagtca ctcaactttt aattcagtca     180

ctcaactttt aaaacagtaa caaatcggtc actaacgtta ttaaaaagtg acaaatcagt     240

cattcattaa tattttccgt tacagtctaa cgggttagtt gatgtggctt gttgacttcc     300

cacgttgaac atgaggagca gaaaggtctt cctcttcttc ttcttcttct aaaattggtc     360

ccttctttct tttcccctct tttcttcatt ttttttctgt ttgtgtgttc tatatctaga     420

ataatctcat ttggtagagt ttgaatttga agttgaaaat ttgggtttta ttatactcgt     480

taagttttac caccaaacca cgccgattat acttgttttc ccattaaaca aagagaaatt     540

aaagataaaa aatcaaacaa taactcaaaa aacttaaacc ccaattccga aatgggttgc     600

ttcaatttca agaaagaagt caaagaataa atgaaacctt aaaatttttt ttaagaaatg     660

agaaaggaaa tgaggtaaaa ataattgttt gatacaaaac acaaaagcaa atagacaaac     720

gaaacaaaat acaaatttca tgaaattaaa ggattaaaat ggggggaaaa tcaagaaaat     780

aatatctaga tttcctctct attttctcta tatgatagtt ggcagaaact ttatcttcct     840

ctttctaggg tttgttaaca gttgtattgg atttttggaa gaaaagattg ttctaaagag     900

agaaaaataa aacggagaaa agaattttaa tttttggtaa taaacactaa ctttgatttc     960

tttttcttct tttggggtta tttaaatgac agcatagact ccaacgtaac tagttaaatg    1020

tcacgttaat ttgctattat gtctgtaatg aaaaattttt agcatgactg atttaaaagt    1080

taaataatta tttgttattg agatcaaaat tgagtgactg aagtacgaaa gaaatgataa    1140

gtgcaccctt acttcaatca acaaattaat agttaccatt ggtaaaacgg ctttctaagc    1200

gaagtttttc ttactcttgc atcatataat aaattccagt aacatgaaga gtcagcatgc    1260

cgccacctga aaaacattct gcatctacct ggtcatggca actaaacatt tctcatccag    1320

taagtattaa aacataccaa gccaactcct gttattacaa aaacgaatca tgacagcatg    1380

taaaatatgg tataaattgt ttttgcaatc atatttagtt gatgggttcc atctcaacaa    1440

ctatttggtg cagacagcaa ccgaatccct cgtatctgtt gtatcttttt tttccccatt    1500

tttcttttac ttcaagagac aaccaagtga agaaaatgcc tccccaatta aacaacaacc    1560

tcccaaagcc aacttaatta taaaaccaaa ccccattgct cctggtcttc taaatttcct    1620

gacttaaaat tccattttac tcataagatg gggtctgctg agagaacaaa gaaggaa       1677

Claims (8)

1、一个植物基因启动子，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2、含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3、含有权利要求1所述启动子的转基因细胞系。

4、含有权利要求1所述启动子的宿主菌。

5、权利要求1所述的启动子在双子叶植物品质改良中的应用。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为棉花。

7、权利要求1所述的启动子在双子叶植物抗性改良中的应用。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为棉花。

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