CN109852614B - 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，涉及基因工程技术领域，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供了该启动子的制备方法，含有该启动子的载体和表达盒。本发明提供的启动子能引导报告基因在植物非分泌型腺毛中特异表达，对利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。

青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。

莰烯是一种双环单萜烯类化合物，存在许多香精油内。莰烯是一种多用途的中间体，除用于乙酸异龙脑酯、合成樟脑外，近年来被广泛应用于合成檀香、香料及农药制造。莰烯合成酶是青蒿中催化崁烯生物合成过程中的关键酶。

启动子是位于结构基因5’端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。由于非分泌型腺毛特异表达的启动子只对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成危害。因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

因此，本领域的技术人员致力于开发植物腺毛组织特异表达的启动子。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种植物腺毛组织特异表达的启动子，其可以用于研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。

为实现上述目的，本发明提供了一种调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子及其应用，具体为一种青蒿崁烯合成酶基因启动子。

在一个具体实施方式中，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，该启动子为特异型启动子。

进一步地，该启动子的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、G-box、ARE、GA-motif、G-Box和MBS等，所述启动子能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型腺毛中特异表达，启动子序列中调控元件见下表1：

表1启动子序列中调控元件分析

本发明提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用，对植物的腺毛系统进行遗传操作，其使用如上所述的启动子本发明提供一种表达盒，所述表达盒连接有如上所述的启动子。

本发明提供一种载体，所述载体连接有如上所述的启动子。

本发明提供的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备方法包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；

步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

步骤七、PCR检测转基因植株；

步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。

进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。

进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下所示：

PstI-Pro-PDR1-FP：GACTGCAGAAGATCTTCGCCTACAACCA

Pro-PDR1-BamHI-RP：CGGGATCCGTTAACTCACAATCAAGAT

进一步地，所述步骤六具体包括：

1)外植体的预培养；

2)农杆菌与外植体的共培养；

3)抗性再生植株的筛选。

技术效果

经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明基因启动子序列相关的报道，由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。

本发明具有如下有益效果：本发明利用有效的青蒿表皮毛组织特异性启动子代替组成型启动子，可以用于构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作，获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

附图说明

图1是本发明的一个实施例中转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；

图2是本发明的一个实施例中利用青蒿腺毛特异性基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z–proCAM通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行详尽说明，以下实例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明而不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

实施例1青蒿莰烯合成酶基因启动子(proAaCAM)的获得

具体包括如下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆

1、基因组DNA的提取

在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm²左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μL TPS buffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLddH₂O回溶，4℃保存。

2、PCR扩增

以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。

为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据本实验室基因组测序得到的青蒿莰烯合成酶基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表2所示，首轮PCR反应体系如表3所示。PCR条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

表2巢式PCR引物设计

表3第一轮PCR反应体系

首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是FP2和RP2，反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃2min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pJET1.2载体用于测序，将该片段的序列与青蒿莰烯合成酶基因的序列进行拼接，结果获得了青蒿莰烯合成酶基因上游约2kb的序列；

表4第二轮PCR反应体系

分析得到的青蒿莰烯合成酶基因启动子的顺式作用元件，确定青蒿莰烯合成酶基因启动子的类型：

本实施例中得到的青蒿莰烯合成酶基因启动子序列长度为2528bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)对青蒿莰烯合成酶基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有出了TATA box和CAAT box，还具有很多顺式作用元件：G-box、ARE、GA-motif、G-Box和MBS等；G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，GA-motif受光调控，ABRE在植物中能够响应脱落酸；MBS是MYB转录因子结合位点；以上结果分析表明，青蒿莰烯合成酶基因启动子是一个特异型的启动子，能受多种因素诱导。

实施例2青蒿莰烯合成酶基因启动子与GUS报告基因融合及表达实验1、将克隆到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因，形成双元表达载体pCAMBIA1391z-proAaCAM。为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将青蒿莰烯合成酶基因的启动子青蒿莰烯合成酶连接pCAMBIA-1391z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下表5所示：

表5 pCAMBIA1391z-pro青蒿莰烯合成酶载体构建PCR引物

2、将构建好的pCAMBIA1391z-proAaCAM青蒿莰烯合成酶载体转化根癌农杆菌并检测。将含有构建完成的植物双元表达载体pCAMBIA1391z-proAaCAM转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体pCAMBIA1391z-proAaCAM成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaCAM青蒿莰烯合成酶的根癌农杆菌菌株。

3、将带有pCAMBIA1391z-proAaCAM青蒿莰烯合成酶载体的根癌农杆菌转化青蒿

1)外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含proAaCAM青蒿莰烯合成酶基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；

3)抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LKan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS₀和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；

3、PCR检测转基因植株

根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(proCAM-F:ATAATGAGTGGACGTGCTT，序列如SEQ ID NO.8所示)和反向引物(GUS-R:CTTTGCCGTAATGAGTGA，序列如SEQ ID NO.9所示)对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图1所示；

4、启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定

对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2所示，结果表明，染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明青蒿莰烯合成酶基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在非分泌型腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proAaCAM基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 11

<120> 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2531

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 1

caaatggagc agtagaagcg gaaatgttac cgatcggtaa tgctgagaac tgtgcaagtt 60

tacaaccact acagtcagat atatcatgag tttctagttg tctcaatgct cctgtcgatg 120

ctaaaaaccg taaacaagat ccggagacgt gacataaatg agagtgccat aaataaaatg 180

ctgaagaaga atgattcaac caaaaacaag acaactccac attagattat gcggtatcat 240

gaatgtctct aacgtgatcc aaaacataaa gatcctcttg cctatgaccg gtctcaacga 300

catcctgtgt ttttcagtca tatatagaac aaacgaaaac aataaatttg acatcgtatc 360

tagaacccca actattacta acacaagtaa gattcatagt aagactcggt atgtagtaaa 420

catcatataa aacaacagat tgtttatcaa ccgaaccaat acatgctaat ggcatagaat 480

caccattaac gactcaattg atttcaaaga attgagattc atcaaaataa attgtggcaa 540

aatatgagac atgtgatgag tggcacccga atctaatatc catttagaaa gaaaatgctg 600

atgtcaaatg tttatcatag gaggttgaca aagcacgagg ctgaaagtct ataaacttct 660

taaattactc aaacatgttt aaaaatatct aaaactactc atatatatct acaaacttct 720

taaactactc aaacgatgac gaatctgact tcaaatcatt gttacaatta tccatattaa 780

ctagcaaata caacccaata ataaacagat tcgaagaaca aagaatgatt agacttttca 840

atcaaacaaa taccaatagc ctcttctgta acaattatgc ctaaaatcga agaaaaccta 900

aaatccaaga aaacaaaatc gtctggaaaa atatgtgcca aaacaattac gtctaaaatc 960

aaactgaagc aaagcgtcta aacgaatttg ccacacccaa acttttatgg tcggtaactg 1020

gtttcataca aaattttgaa atgaatgatt ttttgttgtc aaaagaaaat aaagacttcg 1080

aagatataaa tgtttttgaa aaaatttcaa aattttctgc gaaatagatg atgttgggga 1140

aataacaggt tgcgatagga gtttttaata ttttgtgctt ttaagctttt ctttatgcac 1200

taaatgaaaa tttggttaag aaataataag aaaacttagt gtatatataa aatatggatg 1260

aacaaaaatt cgcacaactt tttttcacac atatttgaaa aaagggctaa tggcctctaa 1320

atgtatcata gttgtcatca tttccttcta tatgtatcga acaatttttt ttgctattat 1380

gtgtactaaa cttgatgttt tgggcatttt tgtgtatttg tgaccatttt gcgtactttg 1440

tgaccatttt gcccctacca tgttaataaa ataaggggca aaatcgtcat aaagtaaaca 1500

aaaatgccaa aaataaagtt tagtacacat aatagcaaaa aaaaaaaaaa aaatagttcg 1560

gtacatataa aaagaataag tgacaactat gatacatttt ggtgcaagta gcccttgaaa 1620

aaatagtgat ttttgttacc ataaactcct accatgcttt caaaaactta tttttccact 1680

tcgattgtat tcacaataaa aagtaaaggg gtattgcata tatattctta caaaactcaa 1740

aattatatcg actttttttc cataaaaact tgaataatta aaacatgcta gtatccgata 1800

aacactttaa cattcaaaat aataaaaact ttcactacga cattttttga acacctagca 1860

cacatcatca atgttcgttg ataacgtact tgttcatctt catcaaagag aaaagcttca 1920

aaaaagtttc acgaagaagt attactgttg catgtcatag atgaagctta atagcaaagt 1980

tttaagttct tgcaaacatt ttcactaaaa tattcaaaaa aaaaaaaaaa tattgattta 2040

tgcatttcat cgaatgccct atagttgttc taaaacacac ttgatttgtt taaaaattaa 2100

aaaaaaaaaa actttttgaa aaatcataaa cagtgattga tttaagattt agagaagatt 2160

ttatgaaaat tatctatttt gagcttttaa tttgagattt gagggaaatt ttggtttatg 2220

ataaccataa tattggagga tgtggtaccg tggatgacac gaattcctcc atctagtctt 2280

ctagactttt aaagaatcct cattctacac tagagagggg ttaggctata atgagtggac 2340

gtgcttaatt atcttattaa accttatatt aagattttca aaccatggtt gcacatttaa 2400

tgttaatgtg tggttttgtt gaaatgtgtc atctcatgca aacctacctc cctttatata 2460

aatgtacatt atcataactt taagcaccat cgtcaactga atacattaag gttttgtctt 2520

ttgcagtaat g 2531

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 2

tacacctaaa tctcagggaa agca 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 3

ggtgacacag tagcaacatc cg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 4

caaatggagc agtagaagcg gaaa 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 5

gcacacattg aggccattac tgc 23

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 6

caggtcgacg gatcccaaat ggagcagtag aagcg 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 7

tcagatctac catggtactg caaaagacaa aacct 35

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 8

ataatgagtg gacgtgctt 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 9

ctttgccgta atgagtga 18

Claims (8)

1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在青蒿生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

3.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子。

5.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备方法包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；

步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

步骤七、PCR检测转基因植株；

步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。

6.如权利要求5所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。

7.如权利要求5所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下所示：

BamHI-Pro-CAM-FP：CAGGTCGACGGATCCCAAATGGAGCAGTAGAAGCG Pro-CAM-NcoI-RP：TCAGATCTACCATGGTACTGCAAAAGACAAAACCT。

8.如权利要求5所述的一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，所述步骤六具体包括：

1)外植体的预培养；

2)农杆菌与外植体的共培养；

3)抗性再生植株的筛选。

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