CN105274109A - 一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示。本发明还提供了该启动子的制备方法，含有该启动子的载体和表达盒。本发明提供的启动子可以在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，可以在生产代谢产物的基因工程育种中的进行应用。因此，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子(proTPS8)及其在转基因植物中的应用。

背景技术

青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，从青蒿腺毛中提取的青蒿精油含有大量具有药理学或者生物灭杀活性的萜类化合物和黄酮类化合物。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandularsecretorytrichome，GST)和非分泌型腺毛(T-shapedtrichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御和花粉传播等都起到至关重要的作用。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前抗疟药中效果最好、毒性最低的药物。青蒿素联合疗法(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)已成为世界卫生组织推荐的治疗。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而，青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。

启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种在植物的组织器官中特异性表达的启动子，从而在时间和空间上调控目的基因的表达，从而用以深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。

本发明的一方面提供了一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。该启动子为既是诱导型启动子，又是特异型启动子。该启动子为萜类合成酶基因启动子。

进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：ABRE、HSE、LTR、MBS、TC-richrepeats、WUN-motif。

本发明的另一方面提供了一种制备上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，包括以下步骤：

步骤一、从青蒿基因组中克隆该启动子的基因组序列；其中，青蒿基因组从培养的青蒿无菌苗中获得；

步骤二、分析该启动子上的顺式作用元件，确定该启动子类型；

步骤三、将步骤一中获得的该启动子的序列与载体连接；

步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌；

步骤五、将步骤四中获得的带有上述载体的根癌农杆菌稳定转化植物；该植株为青蒿；

步骤六、检测上述启动子的转入，并确定上述启动子所引导的基因在植株中的表达部位；检测启动子转入的方法为PCR检测，启动子引导的基因为GUS报告基因。

进一步地，上述制备方法中，步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增所述启动子序列；其中，巢式PCR的引物为：

进一步地，上述制备方法中，步骤三中的载体为pCAMBIA1391z，利用引物对1391z-proTPS8-F和1391z-proTPS8-R，通过PCR在获得的启动子序列中引入酶切位点PstI和NcoI，从而连接到载体pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：

1391z-proTPS8-F：5’-AACTGCAGGAACTGGTAAACAAAATCTGTATGC-3’；

1391z-proTPS8-R：5’-CATGCCATGGTTCTTGAAGGCGTACTAATTACTTC-3’。

进一步地，上述制备方法中，步骤五包括：1)外植体的预培养；2)农杆菌与外植体的共培养；3)抗性再生植株的筛选。

本发明还提供了一种载体，该载体连接有上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

本发明还提供了上述调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子用于利用植物腺毛组织表达和在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

本发明还提供了上述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控研究中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子对于青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。本发明利用有效的青蒿表皮腺毛组织特异性启动子代替组成型启动子，构建在分子生物学中在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作以获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR阳性检测。其中，M：分子量标记；1-2泳道：以转基因阴性青蒿植株的基因组DNA为模板的PCR产物；3-7：以转基因青蒿植株基因组DNA为模板的PCR产物；+：阳性对照；-：阴性对照。

图2是本发明的一个较佳实施例的利用AaTPS8基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proTPS8通过农杆菌介导稳定转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中GUS组织染色图。

具体实施方式

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989年版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

实施例1

从青蒿基因组中克隆启动子的基因组序列

1、培养青蒿无菌苗：

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

2、基因组DNA的提取

在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm²左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μLTPSbuffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡100秒。再加入300μLTPSbuffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLddH₂O回溶，即获得基因组DNA，于4℃保存。

3、PCR扩增

以上述基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的AaTPS8基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；52℃退火30s；68℃延伸2min，35个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

表1巢式PCR引物

表2第一轮PCR反应体系

将第一轮PCR后的产物稀释50倍，作为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系见表3。PCR条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；68℃延伸1min40s，35个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DNA。然后连接到pJET载体用于测序，将该片段的序列与基因序列进行拼接，获得AaTPS8基因上游约1.6kb的片段。

表3第二轮PCR反应体系

获得的AaTPS8基因启动子的序列如下所示：

其中，所示序列的正义链即与SEQIDNo：1所示的序列一致。

实施例2

分析得到的AaTPS8基因启动子的顺式作用元件，确定AaTPS8基因启动子的类型

本发明中得到的AaTPS8基因启动子序列长度为1629bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaTPS8基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上具有除了TATAbox和CAATbox，还具有很多顺式作用元件：ABRE、HSE、MBS、LTR、TC-richrepeats、WUN-motif等。

启动子序列中顺式作用元件见表4：

表4：启动子序列中调控元件分析

表4中，-1378、-691和-1042的位置参见实施例1中列出的序列表中的相应位置。

ABRE在植物中能响应脱落酸；HSE响应热胁迫，LTR受低温诱导，MBS是受干旱诱导的MYB结合位点；TC-richrepeats是植物进行防御、响应干旱胁迫的元件；WUN-motif受到机械损伤诱导。以上结果分析表明，AaTPS8基因启动子是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。

实施例3

将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因

为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaTPS8基因的启动子proTPS8连接pCAMBIA-1391z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体pCAMBIA1391z-proTPS8的构建，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下表所示：

表5pCAMBIA1391z-proTPS8载体构建PCR引物

实施例4

将构建好的pCAMBIA1391z-proTPS8载体转化根癌农杆菌并检测

将含有构建完成的植物表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proTPS8的根癌农杆菌菌株。

实施例5

将带有pCAMBIA1391z-proTPS8载体的根癌农杆菌转化青蒿

1)外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS培养基中，该MS培养基为Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/LAS(乙酰丁香酮)组成的共培养培养基中，滴加含活化好的上述植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；

3)抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、0.05mg/LNAA(萘乙酸)、50mg/LKan(卡那霉素)和500mg/LCb(羧苄青霉素)组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0(无激素的MS培养基)和125mg/LCb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

实施例6

1、PCR检测转基因植株

根据目的基因所在表达盒promoter-GUS中的promoter和GUS序列分别设计正向引物(proTPS8:5’-TTTACACATCCAAGACCGAAACCGA-3’)和反向引物(GUSR:5’-GACATCGGCTTCAAATGGCGTA-3’)对GUS基因进行检测；结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，结果如图1所示。这表明，该转基因植株中包含了表达盒promoter-GUS。

2、启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定

对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2所示，结果表明，染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明AaTPS8基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的proTPS8基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。

2.一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子上的顺式作用元件包括：ABRE、HSE、LTR、MBS、TC-richrepeats、WUN-motif。

3.一种制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、从青蒿基因组中克隆所述启动子的基因组序列；

步骤二、分析所述启动子上的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

步骤三、将步骤一中获得的所述启动子的序列与载体连接；

步骤四、将步骤三中获得的载体转化根癌农杆菌；

步骤五、将步骤四中获得的带有所述载体的所述根癌农杆菌稳定转化植物；

步骤六、检测所述启动子的转入，并确定所述启动子所引导的基因在植株中的表达部位。

4.如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤一包括以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增所述启动子序列。

5.如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤三中的载体为pCAMBIA1391z，利用引物对1391z-proTPS8-F和1391z-proTPS8-R，通过PCR在获得的所述启动子序列中引入酶切位点PstI和NcoI，从而连接到载体pCAMBIA1391z上，其中引物序列如下所示：

1391z-proTPS8-F：5’-AACTGCAGGAACTGGTAAACAAAATCTGTATGC-3’；

1391z-proTPS8-R：5’-CATGCCATGGTTCTTGAAGGCGTACTAATTACTTC-3’。

6.如权利要求3所述的制备如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的方法，其特征在于，所述步骤五包括：

1)外植体的预培养；

2)农杆菌与外植体的共培养；

3)抗性再生植株的筛选。

7.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

8.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

9.一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子用于利用植物腺毛组织表达和在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

10.一种如权利要求1所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子在非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控研究中的应用。