CN102433310B - 一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC及其基因和应用。本发明提供了一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明还提供了编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，以及包含该基因的重组载体及其应用。本发明的基因与植物育性相关，能提高植物花药开裂率和结实率，对于提高粮食产量及二系杂交小麦理论的发展具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC及其基因和应用。

背景技术

现代农业生产中，人们广泛利用杂种优势来改良品种。杂种优势是指两个遗传组成不同的亲本杂交产生的杂种一代在生活力、生长势、繁殖力、抗逆性、产量和品质上比其双亲优势的现象。杂种优势利用被认为是今后小麦生产水平大幅度提高的主要途径。

雄性不育是植物界一种普遍存在的现象。雄性不育(male sterility)是指植物因不能产生有功能的花粉囊、花粉或者雄配子而导致的不育。其主要特征是雄蕊发育异常，包括两种情况：1.不能产生正常的花粉、雄配子；2.花粉育性正常但花药开裂异常不能及时散粉。雄性不育植株的雌蕊通常发育正常，能接受正常花粉而受精结实。

茉莉酮酸酯类(Jasmonates，JA)做为植物应答外界生物或非生物胁迫以及调控植物生长发育过程的一种重要的植物激素，在植物体内广泛存在。MeJA做为茉莉酮酸酯类的甲基酯类化合物与1962年首次从素馨的精油中被分离出来(Demole et al.，1962)。然而20年后人们才真正发现了MeJA和它的自由酸类化合物：茉莉酸(JA)的生理效应。自JA等化合物的芳香激发效应及其做为生长调控因子分别与1980和1981年得到描述、鉴定及分离后(Ueda，Kato，1980；Dathe et al.，1981)，筛选抑制根生长发育的突变体成为与JA信号有关研究的主要内容。Vick和Zimmermann于1984年阐明了JA的代谢合成途径。植物体内存在六种调控酶参与JA代谢途径。六大调控基因共同维系JA代谢途径的畅通，其中任何一个基因的表达出现异常均会影响JA或MeJA的最终生成，而植物体内适当的内源JA或MeJA水平是均衡整个植物生长发育过程以及帮助植物应激外界刺激的必要保证。

丙二烯氧化物环化酶(AOC)特异性催化丙二烯氧化物转化成OPDA，是一种可溶性蛋白酶，分子量为45000(Hamberg M.，1988)。Simpson TD和Gardner HW发现AOC酶活性在正在发育的大豆种子种皮内活性最高，说明种子在发育过程中同化吸收JA主要依靠种皮完成(Simpson TD和Gardner HW，1995)。1997年Ziegler J等从干燥的玉米种子中纯化出AOC酶，并发现该酶活性不受二价离子影响并且不受其产物反馈调控，该酶专一催化酶促环化反应：将4，5-环氧树脂-1，3，7-辛三烯结构插入脂肪酸链，使双键生成于3号碳原子位置并在6、7号碳原子位置形成环氧化物。随后通过PCR获得从番茄中获得了AOC基因的全长cDNA序列，但该序列编码区所表达的蛋白并不具有AOC酶活性，而截取5’端的蛋白却显示出AOC酶活性，这表明编码区翻译出了额外的氨基酸以至于破坏了该酶的正常功能，最后还发现当番茄叶片受到外部机械损伤时AOC基因mRNA水平会被诱导上升(Ziegler J等，1997；Ziegler J等，1999；Ziegler J等，2000)。2000年Hause B等探索了AOC酶在番茄各个组织中的含量和酶活，发现AOC mRNA在茎、幼嫩叶片、幼嫩的花中含量较低，而在花芽、花柄和根含量较高(Hause B，2000)。YamadaA等在红树中表达转导的番茄AOC基因能提高红树在盐胁迫环境下的抗性(YamadaA，2002)。StenzelI等发现AOC活性受系统素和JA正向诱导并使JA的水平提高，随后他们在生态型哥伦比亚拟南芥中分离了四个AOC家族基因的全长cDNA，发现都具有AOC酶活性，并且受到外界机械损伤和外源JA两种处理的正向调控(Stenzel I等，2003)。Maucher H等在大麦中扩增出长717bp的AOC cDNA，对应的氨基残基携带一个推测的线粒体定位信号序列，该基因定位于染色体6H(Maucher H等，2004)。Kong F等通过免疫杂交技术分析了JA代谢途径中三个调控酶：LOX、AOS、AOC在牵牛中的水平发现AOC蛋白被活化开始于外源theobroxide处理30min内并伴随着JA水平的升高(Kong F等，2005)。2006年Hofmann E等描述了拟南芥中AOC2酶蛋白的晶体结构并阐明了AOC催化12，13-EOT生成OPDA的酶促反应动力学原理(Hofmann E等，2006)。2008年Jiang K等从天仙子中克隆到了天仙子AOC(HnAOC)，并通过RT-PCR分析该基因的表达水平在不同的胁迫环境和外界诱导物的情况下受诱导，其中以MeJA的诱导最为显著(Jiang K等，2008)。Pi Y等从喜树中克隆到CaAOC基因，实时定量PCR分析该基因在盐和低温胁迫下的表达水平受诱导；利用农杆菌将CaAOC转染烟草，所得的转基因植株在低温条件比野生型抗性更强(Pi Y等，2009)。前人的研究表明AOC基因在JA途径中催化下游关键的一步：将12，13-EOT环化生成OPDA，而OPDA是生成JA的唯一前体，AOC的重要性不言而喻。

AOC基因在旱、盐、冷胁迫及机械损伤等外界刺激下的表达水平受到诱导，说明该基因通过JA途径间接参与到了植物各种对环境的应激反应当中，是维持植物正常的生理活动必不可少的。但是，目前还未有小麦中AOC的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC。

本发明的另一目的是提供编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供上述调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC在调控植物育性方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种调控植物花药开裂的方法。

本发明提供了一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC，来源于杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MAAPPSSVSV RAGASVSAKL TPRQAARAGF GGRVSVSSGR KCGGPVRASL

FSPKPAVAMD       60

ARPTKVQELH VYELNERDRE SPAYLRLSAK QSQNALGDLV PFTNKVYNGS

LDKRIGITAG      120

ICILIQHVPE RNGDRYEAIY SIYFGDYGHI AVQGPYLTYE ESYLAVTGGS

GVFEGAYGQV       180

KLNQIVFPFK IFYTFYLKGI PDLPKELLCA APVPP SPTVE PTPAAKATEP

HACLSNFID         239

本发明的蛋白由239个氨基酸残基组成，具有1个酰胺化作用位点、1个N-糖基化作用位点、一个CK2磷酸化位点、4个N-豆蔻酰化作用位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、一个网格蛋白螺旋重复基序及一个丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)保守域。

为了使蛋白TaAOC便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaAOC可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明的编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因TaAOC，其表达受茉莉酸途径的诱导，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

catcatccgt tagccgtcgc caccaccacc agtccagcac catggcagcg cccccctcct     60

ccgtgtccgt cagggccggc gcgtccgtct cggcgaagct gacccctcgc caggccgcga    120

gggctgggtt cggtggcagg gtcagcgtca gctcgggcag gaagtgcggc ggccccgtgc    180

gggcgtcgct cttctcgccc aagcccgctg tggccatgga cgcgaggccg accaaggtgc    240

aggagctgca cgtctacgag ctcaacgagc gcgaccgcga gagccccgcg tacctccggc    300

tgagcgccaa gcagagccag aacgcgctcg gcgacctcgt ccccttcacc aacaaggtgt    360

acaacgggag cctggacaag cggatcggga tcacggcggg gatctgcatc ctgatccagc    420

acgtgccgga gcgcaacggc gaccgctacg aggccatcta cagcatctac ttcggcgact    480

acggccacat cgccgtgcag gggccctacc tcacctacga ggagtcctac ctcgccgtca    540

ccggcggctc cggcgtcttc gagggcgcct acggccaggt caagctcaac cagatcgtct    600

tccccttcaa gatcttctac accttctacc tcaagggcat ccccgacctg ccaaaggagc    660

tgctctgcgc ggcgcccgtc ccgccctccc ccaccgtcga gcccacgccc gccgccaagg    720

ccaccgagcc acacgcatgc ctcagcaact tcatagacta gctaccttag cttagcccaa    780

aatatctatt attgctcctg ctagtagttg aacttgcgtg cgtgt                    825

其中，5’末端第42至761位脱氧核糖核苷酸为TaAOC基因的开放阅读框(ORF)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

atggcagcgc ccccctcctc cgtgtccgtc agggccggcg cgtccgtctc ggcgaagctg     60

acccctcgcc aggccgcgag ggctgggttc ggtggcaggg tcagcgtcag ctcgggcagg    120

aagtgcggcg gccccgtgcg ggcgtcgctc ttctcgccca agcccgctgt ggccatggac    180

gcgaggccga ccaaggtgca ggagctgcac gtctacgagc tcaacgagcg cgaccgcgag    240

agccccgcgt acctccggct gagcgccaag cagagccaga acgcgctcgg cgacctcgtc    300

cccttcacca acaaggtgta caacgggagc ctggacaagc ggatcgggat cacggcgggg    360

atctgcatcc tgatccagca cgtgccggag cgcaacggcg accgctacga ggccatctac    420

agcatctact tcggcgacta cggccacatc gccgtgcagg ggccctacct cacctacgag    480

gagtcctacc tcgccgtcac cggcggctcc ggcgtcttcg agggcgccta cggccaggtc    540

aagctcaacc agatcgtctt ccccttcaag atcttctaca ccttctacct caagggcatc    600

cccgacctgc caaaggagct gctctgcgcg gcgcccgtcc cgccctcccc caccgtcgag    660

cccacgcccg ccgccaaggc caccgagcca cacgcatgcc tcagcaactt catagactag    720

本发明还提供了包含上述调控植物花药开裂相关蛋白基因TaAOC的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，优选将调控植物花药开裂相关基因TaAOC构建到pBI121载体CaMV 29A启动子之后的SacI和SpeI酶切位点之间，得重组质粒pBI35S-TaAOC；或者将调控植物花药开裂相关基因TaAOC构建到pAHC25载体CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得重组质粒pAHC-TaAOC。植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaAOC构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明还提供了上述调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC在调控植物育性方面的应用，优选其在调控植物花药开裂方面的应用。

本发明还提供了一种调控植物花药开裂的方法，所述方法包括将上述调控植物花药开裂相关基因TaAOC导入植物中并表达的步骤。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaAOC的编码基因导入植物细胞，可获得提高植物花药开裂比例的转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、新疆偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)为试验材料，得到茉莉酸调控途径中调控花药开裂的相关蛋白TaAOC及其编码基因TaAOC，并将基因TaAOC导入小麦光温敏不育系BS366，能够显著提高花药开裂率及结实率，从而通过基因工程方法验证其功能。该基因与植物育性相关，能提高植物花药开裂率和结实率，对于提高粮食产量及二系杂交小麦理论的发展具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1茉莉酸代谢途径育中调控花药开裂的相关蛋白TaAOC编码基因的cDNA克隆凝胶图，以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)为模板，PCR扩增TaAOC的cDNA片段，1，2，杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的TaAOC基因片段；M，DL2000 marker(100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)。

图2RT-PCR半定量分析凝胶图，A，B为凝胶图，C，D为凝胶图的IOD值分析。以小麦光温敏不育系BS366活体花药在0d、1d、2d、3d、4d、5d五个处理时间点的cDNA作为模板，用JA途径相关基因半定量特异引物进行PCR，在处理的5天中MeJA处理后的表达量比空白对照要高，受到MeJA的正向调控。

图3为转基因小麦的获得，A，通过基因枪法获得转基因的小麦愈伤，B，筛选、分化后获得的再生植株生根培养；C，转基因小麦植株的PCR检测，有带的为阳性植株。

图4为TaAOC基因引起的花药开裂情况，A1，京冬8正常植株的花药开裂情况，A2，京冬8转基因植株的花药开裂情况；B1，小麦光温敏不育系BS366正常植株的花药开裂情况，B2，小麦光温敏不育系BS366转基因植株的花药开裂情况。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：小麦茉莉酸代谢途径中调控花药开裂相关基因TaAOC的cDNA克隆与半定量分析

取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的花药，用Trizol法提取花药的总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)获得TaAOC基因，其序列全长为845kb。

用Trizol法提取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)花药的总RNA，用superscript II(购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaAOC基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CATCATCCGTTAGCCGTCGC-3’

P2：5’-ACACGCACGCAAGTTCAACTAC-3’

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.8-1.0kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(购自Promega公司)连接，参照Cohen等的方法(Proc NatlAcad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaAOC基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.3，即SEQ ID No.2的自5′末端第42至761位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。含序列SEQ ID No.3所示TaAOC基因的cDNA克隆结果如图1所示。

TaAOC基因的序列在Genabnk上进行比对，BLAST分析表明，TaAOC基因编码的蛋白与大麦中的AOC(HvAOC)酶蛋白亲缘关系最近，该序列包含一个丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)保守域，说明该基因所编码的蛋白具有AOC的活性。

以小麦光温敏雄性不育系BS366及常规品种京冬8为实验材料，在小麦药隔后期开始，用0.1mmol/L，0.3mmol/L，0.5mmol/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对小麦进行喷洒处理，以喷前时取样记作0d，以后每一天喷洒一次，以活体花药在0d、1d、2d、3d、4d、5d五个处理时间点的cDNA作为模板(其中常规品种京冬8作为对照组)，用JA途径相关基因半定量特异引物进行PCR，每个基因半定量PCR结果均由软件分析得到其IOD值，并利用SPSS进行方差分析，最后在Excel中做出柱状图(图2C，D)，在处理的5天中MeJA处理后的表达量比空白对照要高，受到MeJA的正向调控。总的表达量上看，京冬8中MeJA处理后的总表达量与空白对照相比没有显著变化。

实施例2：TaAOC单子叶植物转基因表达载体的构建

1、重组表达载体的构建

pAHC-TaAOC单子叶植物重组表达载体的构建：以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和SacI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后BamHI和SacI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pAHC25的CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得到重组载体pAHC-TaAOC。

引物序列如下：

AOC[BamHI]：5′-CGGGATCCTATCATCCGTTAGC-3′

AOC[SacI]：5′-CGAGCTCACGCACGCAAGTTC-3′

2、转基因小麦的获得与鉴定

1)将上述得到的重组质粒pAHC-TaAOC通过基因枪法介导小麦光温敏不育系BS366及京冬8幼胚的转基因，从而获得到转基因小麦的愈伤，并在生根培养基上进行生根培养(图3)，最终获得小麦光温敏不育系BS366及京冬8转基因小麦植株。

2)PCR检测转基因小麦植株，提取转基因小麦T0代植株基因组DNA；每株小麦提取三管，即做三个平行实验；利用TaAOC基因全长的引物对转pAHC-TaAOC基因的植株进行PCR检测，同时以克隆的目的基因作为阳性对照，未转基因的小麦基因组DNA为阴性对照，结果如图3C。

3)对转基因小麦的花药与对照进行比较(图4)，发现转基因植株的花药开裂程度较对照组有较大提升，且发现转基因小麦的花药开裂率也有明显提升(表2)，从而说明该基因对花药的开裂及提高小麦育性都起到了十分重要的作用。

表2花药开裂率的基本统计

注：0代表空白处理；M代表MeJA处理，0.1，0.3，0.5代表的是的MEJA的浓度，单位为mmol/L。

Claims (7)

1.一种调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种调控植物花药开裂相关基因TaAOC，其特征在于，所述相关基因TaAOC编码权利要求1所述的调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC。

3.根据权利要求2所述的调控植物花药开裂相关基因TaAOC，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2或3所述调控植物花药开裂相关基因TaAOC的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pBI35S-TaAOC或pAHC-TaAOC，

其中，

通过将所述调控植物花药开裂相关基因TaAOC的酶切产物正向插入载体pAHC25的CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得到重组载体pAHC-TaAOC；

将调控植物花药开裂相关基因TaAOC构建到pBI121载体CaMV 29A启动子之后的SacI和SpeI酶切位点之间，得重组质粒pBI35S-TaAOC。

6.权利要求1所述调控植物花药开裂相关蛋白TaAOC在调控植物育性方面的应用，所述植物为小麦。

7.一种调控植物花药开裂的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2或3所述调控植物花药开裂相关基因TaAOC导入植物中并表达的步骤，所述植物为小麦。

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