CN101223276A - 基因表达在植物中的转录后调节 - Google Patents

Abstract

本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包括编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，从而相对于在去稳定序列不存在时的表达，该多肽在转基因植物的种子中以较低水平表达。本发明还提供用于转录后降低植物中目标基因的信息稳定性的方法，该方法包括在目标基因的3’非翻译区添加去稳定序列。

Description

基因表达在植物中的转录后调节

发明背景

本申请要求申请日为2005年5月19日申请的美国临时专利申请顺序号60/682,471的权益，该申请的全部公开内容通过引用具体结合到本文中。

1.发明领域

本发明总的来讲涉及植物分子生物学，更准确地讲涉及基因表达在植物中的转录后调节的方法。

2.发明背景

在生物工程领域内，主要的焦点一向集中在提高转基因的表达水平以达到例如特殊的商业目标。减量调节基因表达的分子元件很大程度上被忽视了，因为一般认为它们没有商业价值。尽管如此，减量调节基因表达的元件，尤其是以可预测的方式减量调节基因表达的元件可能是有用的，特别是当需要达到特定的基因表达水平时。例如，给定基因非常高水平的表达并不总是需要的，人们可能希望给定转基因的表达高过某一水平但却低于另一水平。虽然基因表达的调节可以在转录步骤进行(例如通过选择合适的启动子或启动子元件与给定的转基因一起使用)，但是转录后调节基因表达也是可行的。这种基因表达的转录后控制还提供了仍然允许利用时间、空间或可诱导性特征的优势，这些特征是通过使用合适的启动子或启动子元件所获得的。

基因表达转录后控制的一种方法是控制由基因转录所产生的信使RNA(mRNA)的稳定性。包括在转录RNA的3’非翻译区(3’UTR)中的去稳定序列(destabilizing sequence)显示使烟草(Nicotiana tabacum)RNA和动物RNA的mRNA不稳定，减少mRNA的半寿期。例如，植物的SAUR(小分子植物生长素上调RNA(small auxin up RNA))基因含有DST元件，该元件为3’非翻译区(3’UTR)中的43个碱基对序列，在植物种间高度保守，据报道它至少在烟草植物中赋予SAURmRNA不稳定性。参见例如Newman等(1993)、Green(1993)、Gutiérrez等(1999)和Feldbrugge等(2001)，这些文献都通过引用结合到本文中。尚不清楚双子叶农作物或单子叶植物的SAUR终止子或DST元件是否对RNA具有相似的作用。

另一个保守RNA基序，即多拷贝AUUUA，据信能使动物的mRNA不稳定，在植物中也发现如此；据报道AUUUA重复序列能使烟草的mRNA不稳定，而AUUAA重复序列则不能，这表明这个基序的序列特异性，而不仅仅是AU含量。参见例如Ohme-Takagi等(1993)和Gutiérrez等(1999)，这些文献都通过引用结合到本文中。然而，尚不清楚AUUUA重复序列是否在其它双子叶植物或单子叶植物中具有类似作用。

发明概述

本发明提供在植物例如双子叶农作物和单子叶农作物中转录后调节基因表达的方法。更准确地说，本发明公开了转录后降低植物的信息稳定性的方法，该方法包括在植物的目标基因3’非翻译区添加去稳定序列，从而使目标基因的信息稳定性在转录后降低，优选导致相对于去稳定序列不存在时所观察到的表达水平，目标基因的表达水平较低。

一方面，本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有一个或多个去稳定序列，从而相对于在一个或多个去稳定序列不存在时的表达，该多肽在转基因植物的种子中以较低水平表达。

另一方面，本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含非组成型启动子及与其操作性连接的编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有一个或多个去稳定序列，从而相对于在一个或多个去稳定序列不存在时的表达，该多肽在转基因植物中以较低水平表达。

又一方面，本发明提供用于食物或饲料的转基因农作物，所述转基因农作物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有一个或多个去稳定序列，从而相对于在一个或多个去稳定序列不存在时的表达，该多肽在用于食物或饲料的转基因农作物中以较低水平表达。

再一方面，本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有一个或多个去稳定序列，所述去稳定序列包括重叠的ATTTAA重复序列，从而相对于所述一个或多个去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述转基因植物中以较低水平表达。

再一方面，本发明还提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包括编码邻氨基苯甲酸合酶的基因，所述基因在其3’非翻译区具有一个或多个去稳定序列，从而相对于在一个或多个去稳定序列不存在时的表达，邻氨基苯甲酸合酶在转基因植物中以较低水平表达。

本发明还提供转录后降低目标基因在用于食物或饲料的农作物中的信息稳定性的方法。在一个实施方案中，该方法包括在用于食物或饲料的农作物的目标基因3’非翻译区添加一个或多个去稳定序列，从而使目标基因的信息稳定性在转录后降低，优选导致目标基因表达的水平低于一个或多个去稳定序列不存在时的水平。

在下面的发明详述中将描述本发明的其它具体实施方案。

附图简述

图1.用于下面实施例中所述瞬时转化实验的含有去稳定序列的构建体的非限制性实例。图中给出总体设计并列举了构建体的相关元件。

图2.如实施例2所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件(destabilizing element)的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的Lea9启动子的构建体中，与NOS终止子(pMON63691)相比，SAUR终止子(pMON63688)的不同变异体有效地降低基因表达。

图3.如实施例2所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的7Sα’启动子的构建体中，与NOS终止子(pMON13773)相比，SAUR终止子(pMON63688，变异体1)有效地降低基因表达。

图4.如实施例4所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的USP启动子的构建体中，与仅有NOS终止子(pMON58101)相比，2XDST元件与NOS终止子的组合(pMON63687)可以有效地降低基因表达。

图5.如实施例4所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的7Sα’启动子的构建体中，与仅有NOS终止子(pMON13773)相比，2XDST元件与NOS终止子的组合(pMON63698)有效地降低基因表达。

图6.如实施例4所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的Lea9启动子的构建体中，与仅有NOS终止子(pMON63691)相比，2XDST元件与NOS终止子的组合(pMON63697)有效地降低基因表达。

图7.如实施例8所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在使用驱动GUS基因的Per1启动子的构建体中，与仅有NOS终止子(pMON64316)相比，不同拷贝数的DST元件与NOS终止子的组合(pMON78113、pMON78116、pMON78117)有效地降低基因表达。DST的拷贝数与基因表达的水平呈负相关。

图8.含有去稳定序列并用于产生本发明转基因植物的构建体的非限制性实例。图中给出总体设计并列举了实施例9中所述的构建体的关键元件。

图9.表示如实施例9所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。DST和富含AU的元件有效地降低瞬时玉米表达系统中的基因表达。SAUR终止子含有1X DST。图中显示了标准差。所示表达水平与含有NOS终止子、间隔区1或间隔区2的对照载体相关。

图10.表示如实施例10所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。在转基因大豆中在3’非翻译区包括去稳定元件(DST基序)，获得了较低水平的色氨酸(Trp)。图表采用统计软件JUMP绘制，表示从多次事件的单粒R1种子值所得出的结果。横轴表示Trp水平的平均值，用百万分之几(ppm)表示。标有“每对斯氏t检验(Each Pair Student’s t)”一栏中所表示的圆圈代表每粒种子Trp水平的变异性；圆圈大小表示变异性的程度。在没有一个圆圈与另一个圆圈重叠的情况下，彼此之间的平均值在统计学上有显著差异。

图11.如实施例9所述用于降低基因或多肽表达水平的去稳定元件的非限制性实例。较低水平的色氨酸(Trp)与转基因大豆中RNA水平较不稳定相关，这表明3’非翻译区包括2个拷贝的去稳定元件(DST基序)足以使转录物减少。从pMON63680(-DST)的两次生长植株和pMON66892(+DST)的两次生长植株中收获未成熟种子，采用常规方法提取总RNA，其中一部分RNA用于Taqman定量测定转录物水平，另一部分用于RNA印迹分析。图A表示用Taqman测定的转录物水平。对于-DST，s1-s4是从一次事件所产生的植株，s5-s7是从第二次事件所产生的植株。对于+DST，s8-s9是从一次事件所产生的植株，s10-s15是从第二次事件所产生的植株。图B表示用RNA印迹法所测定的相对转录物水平。用Agro AS作为探针。Taqman法结果和RNA印迹法结果彼此间是一致的。图B中的最下面表示印迹上RNA的相对上样量。

发明详述

I.转基因植物

本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，从而相对于去稳定序列不存在时的表达，该多肽在转基因植物的种子中以较低水平表达。

转基因植物可得自任何目标单子叶植物或目标双子叶植物，包括但不限于商业目的或农业目的的植物，例如农作物(尤其是用于人类食物或动物饲料的农作物)、生产木材或纸浆的树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目标植物的非限制性实例包括谷类作物，例如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、水稻、小米、高粱、昆诺阿藜、苋属植物和荞麦；饲草作物，例如禾本科牧草和苜蓿饲草；油料种子作物，例如棉花、红花、向日葵、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、花生和油椰；坚果类木本植物(例如胡桃、腰果、榛子、薄壳山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、海枣、橄榄、糖甜菜、茶和咖啡；生产木材或纸浆的树木；蔬菜作物，例如豆类作物(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、莴苣、芦笋、菊芋、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸薹属(例如甘蓝、羽衣甘蓝(kale)、芥菜和其它多叶芸薹属、青花椰菜、花椰菜、孢子甘蓝、芜菁、球茎甘蓝(kohlrabi))、可食用葫芦(例如黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、可食用葱蒜类(例如洋葱、大蒜、韭葱、火葱、北葱)、茄科(Solanaceae)可食用成员(例如番茄、茄子、马铃薯、胡椒、酸浆属(groundcherry))和藜科(Chenopodiaceae)可食用成员(例如甜菜、莙荙菜、菠菜、昆诺阿藜、苋属植物)；水果作物，例如苹果、梨、柑桔类水果(例如橙、来檬、柠檬、柚子等)、核果(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、番木瓜、鳄梨和浆果；及观赏植物，包括观赏花卉植物、观赏树木和灌木、观赏地被植物和观赏禾草。优选的双子叶植物包括但不限于油菜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋属植物、荞麦、红花、大豆、糖甜菜和向日葵，更优选大豆、油菜和棉花。在一个特别优选的实施方案中，转基因植物为转基因单子叶植物，更优选为转基因单子叶农作物，例如但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、水稻、观赏禾草和禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。

所谓“外源基因”是指以天然正常存在以外的方式存在的任何基因。因此，外源基因可以是非天然的基因，并可作为转基因导入本发明的转基因植物中，或者对本发明转基因植物而言可以是天然基因，但其位置并不是天然正常存在时的位置(例如与非天然启动子操作性连接并作为转基因导入植物中的天然基因)。术语“操作性连接(的)”，当用于涉及核酸序列和/或氨基酸序列之间的关系时，是指连接所述序列使它们执行其预定的功能。例如，将启动子序列与目标核苷酸序列操作性连接，是指启动子序列与目标核苷酸序列连接的方式使得启动子序列能够指导目标核苷酸序列的转录和/或由目标核苷酸序列编码的多肽的合成。该术语还指氨基酸序列连接的方式使得能产生功能性蛋白。

编码多肽的外源基因可以是任何转录成RNA转录物，RNA转录物中至少一部分可翻译成多肽的外源目标基因，优选转录成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以经改造含有3’非翻译区(3’UTR)，并且去稳定序列可位于3’UTR中。外源基因可包括天然存在的序列或该天然存在序列的衍生物或同源物。天然存在序列的衍生物或同源物可包括但不限于序列的缺失、单点突变、多点突变、特殊限制性内切酶位点的改变、功能性元件的添加或天然存在序列的其它方式的分子修饰。用于获得这些衍生物的技术是本领域众所周知的。参见例如Sambrook和Russell(2001)所介绍的方法(通过引用结合到本文中)。

合适外源基因的非限制性实例包括编码转录因子的基因和编码酶的基因，该酶参与目标分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物及生物多聚体)的生物合成或分解代谢。合适外源基因具体的非限制性实例包括编码邻氨基苯甲酸合酶的基因；参与多步骤生物合成途径(可能对调节一种或多种中间产物的水平是有益的)的基因，例如编码用于聚羟基链烷酸生物合成的酶的基因(参见例如美国专利第5,750,848号，该专利文献通过引用具体结合到本文中)；编码细胞周期控制蛋白(例如具有细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂样活性的蛋白质)的基因(参见例如WO 05007829所公开的基因，该专利文献通过引用具体结合到本文中)；当在转基因植物中表达时，使得转基因植物具有抗病虫害或病原体抗性的蛋白质编码基因基因(参见例如美国专利第5,763,245号所公开的胆固醇氧化酶的基因，该专利文献通过引用具体结合到本文中)；编码具有选择性性状(例如抗生素抗性，尤其是如果需要表达这种基因的水平足以能筛选携带该基因的细胞，但又不至于高到使相邻没有携带该基因的细胞“逃逸”或筛选后仍存活)的蛋白质的基因；当表达优选为瞬时表达的基因(例如参与抗病虫害或抗病原体的基因，尤其是当表达是病虫害或病原体诱导的基因)和可以诱导或恢复能育性的基因(参见例如美国专利第6,759,575号所公开的芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)/芽孢杆菌RNA酶(barnase)基因，该专利文献通过引用具体结合到本文中)。

例如，去稳定序列可包括赋予外源基因的转录RNA不稳定性(例如通过降低从内源基因转录的mRNA的稳定性或半寿期)的任何序列。在一个优选的实施方案中，去稳定序列为至少一个选自以下元件的序列：3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。ATTTA DNA基序或ATTTAA DNA基序被转录成AUUUA RNA基序或AUUUAA RNA基序。更优选去稳定序列的存在导致相对于在去稳定序列不存在时的表达，外源基因在转基因植物中以较低水平表达。可以使用不只一个去稳定序列或者多拷贝的一个或多个去稳定序列。在一个非限制性的实例中，本发明转基因植物在其基因组DNA内可包括外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有至少一个SAUR终止子、或多拷贝的DST元件、或SAUR终止子、DST元件的组合、或ATTTA与ATTTAA基序的组合。

3’SAUR终止子可以为已知序列的3’SAUR终止子，其非限制性的实例包括使用基于已公布的SAUR基因SAUR-AC1(参见Gil等(1994)，该文献通过引用结合到本文中)的引物，从拟南芥(Arabidopsis)基因组DNA通过PCR扩增的3’SAUR终止子变异体，在此作为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4予以公开。

3’SAUR终止子还可以是新的3’SAUR终止子同源物，本领域普通技术人员可以通过例如鉴定已知SAUR基因的同源物并对这些基因的3’UTR区进行测序，或者通过直接鉴定已知3’SAUR终止子的同源物，从而鉴定出新的3’SAUR终止子同源物。

同样，DST元件可以是已知的DST元件或新的DST元件同源物。DST元件的非限制性实例包括来自大豆基因15A的DST元件，例如在此作为SEQ ID NO：5(“1XDST”)、SEQ ID NO：6(“2XDST”)、SEQ ID NO：7(“3XDST”)、SEQ ID NO：8(“4XDST”)、SEQ ID NO：9(“5XDST”)和SEQ ID NO：10(“6XDST”)予以公开。

合适的ATTTA基序包括含有ATTTA重复序列的序列。合适的ATTTAA基序包括含有ATTTAA重复序列的序列。优选在重复序列中存在至少3个拷贝的ATTTA基序或ATTTAA基序。非限制性的实施方案包括在重叠的重复序列中包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和甚至15个拷贝以上的ATTTA基序或ATTTAA基序的去稳定序列。因此，非限制性的实例包括3x ATTTA(ATTTATTTATTTA(SEQ ID NO：27))、5x ATTTA(ATTTATTTATTTATTTATTTA(SEQ ID NO：28))、11x ATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA(SEQ ID NO：29))和7x ATTTA/ATTTAA组合(例如ATTTATTTATTTAATTTAATTTAATTTATTTAA(SEQ ID NO：30)和类似的组合)。所提供的这些实例是用来说明重复序列的重叠性质，不得解释为以任何方式进行限制。

可以对同源序列进行鉴定，例如运用本领域技术人员已知的比较工具，例如但不限于BLAST(Altschul等(1997)，该文献通过引用结合到本文中)。因此，可以对目标植物种、尤其是目标农作物的基因组DNA序列的SAUR同源物、已知3’SAUR终止子的同源物或已知DST元件的同源物进行检索。本领域技术人员应当了解的是，可以应用合适的方法例如本说明书所提供的方法，采用已知的SAUR序列、已知的3’SAUR终止子序列或已知的DST元件(例如Newman等(1993)、McClure等(1989)和Yamamoto等(1992)和Gil等(1994)提供的序列，以及本文以SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10提供的序列)，设计出各种各样的引物，以扩增并分离DNA，用于测序和测定使mRNA转录物不稳定的能力，从而提供用于本发明额外的新的SAUR序列、新的3’SAUR终止子序列或新的DST元件。

此外，本领域熟练技术人员可对已知的或新的去稳定序列进行修饰。修饰可以包括但不限于序列的缺失、单点突变、多点突变、特殊限制性内切酶位点的改变、功能性元件的添加、元件的重复或可能保持去稳定序列使mRNA转录物不稳定的能力不变化或甚至提高的其它分子修饰方法。用于获得这些衍生物的技术是本领域众所周知的。参见例如Sambrook和Russell(2001)所介绍的方法(通过引用结合到本文中)。用于在DNA区段进行诱变或产生缺失的技术为本领域技术人员所熟知，详见例如美国专利第6,583,338号，该专利文献通过引用全部结合到本文中。

在本发明的一个非限制性实施方案中，转基因植物为双子叶农作物(例如大豆)或单子叶农作物(例如玉米)，其中需要提供转基因农作物或转基因农作物种子中改良的氨基酸含量，外源基因是用于氨基酸(例如赖氨酸、色氨酸或甲硫氨酸)生物合成的基因；相对于在去稳定序列不存在时的表达，一个或多个去稳定序列可以用来在转基因农作物或其种子中以较低水平表达氨基酸生物合成基因，从而为转基因农作物或其种子中的氨基酸组成提供各种选择。

本发明还提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含与编码多肽的外源基因操作性连接的非组成型启动子，该外源基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，从而在相对于在去稳定序列不存在时的表达，该多肽在转基因植物中以较低水平表达。

转基因植物可以得自任何目标单子叶植物或目标双子叶植物；在某些优选的实施方案中，转基因植物为农作物。在“转基因植物I”标题下描述了适用于本发明的植物。

适于与本发明转基因植物一起使用的非组成型启动子包括空间特异性启动子、时间特异性启动子和诱导型启动子。空间特异性启动子可以包括细胞器特异性启动子、细胞特异性启动子、组织特异性启动子或器官特异性启动子(例如质体特异性启动子、根特异性启动子或种子特异性启动子，分别用于抑制质体、根或种子中靶RNA的表达)。时间特异性启动子可以包括往往会在植物生长周期的特定发育阶段或者在白天或夜间不同时间或者在一年的不同季节促进表达的启动子。诱导型启动子包括由化学品或环境条件诱导的启动子，例如但不限于生物性胁迫或非生物性胁迫(例如缺水或干旱、热、寒冷、养分或盐分水平、光照水平强弱或者病虫害侵染或病原体感染)。表达特异性启动子还可以包括一般为组成型表达但是表达程度或者“强度”不同的启动子，包括通常被视为“强启动子”或“弱启动子”的启动子。

许多在植物中起作用并可用于本发明方法的表达特异性启动子为本领域所知。例如美国专利5,837,848、美国专利6,437,217和美国专利6,426,446公开了根特异性启动子；美国专利6,433,252公开了玉米L3油质蛋白启动子；美国专利申请公告2004/0216189公开了编码质体定位醛缩酶(plastid-localized aldolase)的植物核基因的启动子；美国专利6,084,089公开了寒冷诱导型启动子；美国专利6,140,078公开了盐诱导型启动子；美国专利6,294,714公开了光诱导型启动子；美国专利6,252,138公开了病原体诱导型启动子；和美国专利申请公告2004/0123347公开了缺水诱导型启动子。每一个专利和出版物都公开了启动子及其用途，尤其是在植物中起作用的重组DNA构建体中的启动子及其用途，所有这些文献都通过引用具体结合到本文中。

不是天然存在的启动子或启动子元件或其同源物但可以调节基因表达的核酸序列，还可以用于与本发明转基因植物一起使用。“不依赖基因的”调节序列的实例包括天然存在的或人工设计的RNA序列，包括配体结合区或适体(aptamer)和调节区(可能是顺式作用的)。参见例如Isaacs等(2004)、Bayer和Smolke(2005)、Mandal和Breaker(2004)、Davidson和Ellington(2005)、Winkler等(2002)、Sudarsan等(2003)及Mandal和Breaker(2004)，所述各文献都通过引用具体结合到本文中。例如，可以根据特定的空间或时间特异性，来选择或设计这种“核糖核酸调节物”，用于仅在规定浓度的合适配体存在(或不存在)下，调节外源基因的翻译。

编码多肽的外源基因可以是任何转录成RNA转录物，RNA转录物中至少一部分可翻译成多肽的外源目标基因，优选转录成信使RNA (mRNA)的基因，含有或者可以经改造含有3’非翻译区(3’UTR)，并且去稳定序列可位于3’UTR中。在“转基因植物I”标题下描述了合适外源基因的实例。去稳定序列可以包括赋予外源基因的转录RNA不稳定性(例如通过降低从内源基因转录的mRNA的稳定性或半寿期)的任何序列。在一个优选的实施方案中，去稳定序列为至少一个选自以下元件的序列：3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合，还可参见“转基因植物I”标题下的内容。

本发明还提供用于食物或饲料的转基因农作物，该转基因农作物在其基因组DNA内包括编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，从而相对于在去稳定序列不存在时的表达，该多肽在用于食物或饲料的转基因农作物中以较低水平表达。

用于食物或饲料的转基因农作物可以是任何用于食物或饲料的单子叶农作物或双子叶农作物，在“转基因植物I”标题下描述了其合适的实例。优选的用于食物或饲料的双子叶农作物包括但不限于油菜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋属植物、荞麦、红花、大豆、糖甜菜和向日葵，更优选大豆、油菜和棉花。优选的用于食物或饲料的单子叶农作物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、水稻、禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。在某些具体实施方案中，特别优选的植物为大豆和玉米。

编码多肽的外源基因可以是任何转录成RNA转录物，RNA转录物中至少一部分可翻译成多肽的外源目标基因，优选转录成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以经改造含有3’非翻译区(3’UTR)，并且去稳定序列可位于3’UTR中。在“转基因植物I”标题下描述了合适外源基因的实例。去稳定序列可以包括赋予外源基因的转录RNA不稳定性(例如通过降低从内源基因转录的mRNA的稳定性或半寿期)的任何序列。在一个优选的实施方案中，去稳定序列为至少一个选自以下元件的序列：3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合，还可参见“转基因植物I”标题下的内容。

II.ATTTAA重复序列

另一方面，本发明提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，该外源基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，该去稳定序列包括重叠的ATTTAA重复序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述转基因植物中以较低水平表达。

转基因植物可以得自任何目标单子叶植物或目标双子叶植物；在某些优选的实施方案中，转基因植物为农作物。在“转基因植物I”标题下提供了适于本发明这一方面的植物的内容。

编码多肽的外源基因可以是任何转录成RNA转录物，RNA转录物中至少一部分可翻译成多肽的外源目标基因，优选转录成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以经改造含有3’非翻译区(3’UTR)，并且去稳定序列可位于3’UTR中。在“转基因植物I”标题下描述了合适外源基因的实例。

去稳定序列包括重叠的ATTTAA重复序列。在一个优选的实施方案中，去稳定序列包括至少3个重叠的ATTTAA重复序列，并在重叠重复序列中可以包括4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和甚至15个拷贝以上的ATTTAA基序。因此，非限制性实例包括3x ATTTAA(ATTTAATTTAATTTAA；SEQ ID NO：31)，5xATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA；SEQ ID NO：32)和11x ATTTAA(ATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAA；SEQ ID NO：29)。在另一个实施方案中，重叠的ATTTAA重复序列可与ATTTA重复序列组合，例如在“转基因植物I”标题下的所述组合。

III.具有适度邻氨基苯甲酸合酶表达的转基因植物

本发明还提供转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包括编码邻氨基苯甲酸合酶的基因，该基因在其3’非翻译区具有去稳定序列，从而相对于在去稳定序列不存在时的表达，邻氨基苯甲酸合酶在转基因植物中以较低水平表达。

转基因植物可以得自任何目标单子叶植物或目标双子叶植物，例如在“转基因植物I”标题下提供的植物。在某些优选的实施方案中，转基因植物可以是农作物，例如需要在整株植物或在具体的植物组织或细胞中提高色氨酸水平的农作物。非限制性的实例包括转基因植物为大豆或玉米的实施方案。

编码邻氨基苯甲酸合酶的基因可以是任何用于邻氨基苯甲酸合酶序列的天然存在的基因或这些基因的同源物，可以通过例如运用本领域技术人员已知的比较工具例如但不限于BLAST(Altschul等(1997)，该文献通过引用结合到本文中)，用序列数据库来鉴定。编码邻氨基苯甲酸合酶的基因可以包括基于天然存在的邻氨基苯甲酸合酶但却具有一个或多个修饰的衍生序列，所述修饰例如序列的缺失、单点突变、多点突变、特殊限制性内切酶位点的改变、功能性元件的添加、元件的重复或其它方式的分子修饰。可以进行这些修饰以提高或改变转基因植物中邻氨基苯甲酸合酶的性质。修饰的非限制性实例包括原核生物邻氨基苯甲酸合酶在转基因植物中表达的密码子优化。

邻氨基苯甲酸合酶的基因优选在其3’非翻译区含有去稳定序列，该去稳定序列可以包括赋予邻氨基苯甲酸合酶基因的转录RNA不稳定性(例如通过降低由邻氨基苯甲酸合酶基因转录的mRNA的稳定性或半寿期)的任何序列。在一个优选的实施方案中，去稳定序列为至少一个选自以下元件的序列：3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合，还可参见“转基因植物I”标题下的内容。更优选去稳定序列使得邻氨基苯甲酸合酶在转基因植物中以较低水平表达(相对于在去稳定序列不存在时的表达)。

IV.提供转基因植物

本发明各个方面涉及以上段落中所述的转基因植物。本发明包括和提供转基因植物(在许多实施方案中尤其是指转基因农作物)，两者都涉及直接从用包括外源基因(在其3’非翻译区具有去稳定序列)的转基因DNA转化的细胞再生的转基因植物以及这些转基因植物的子代(例如转化植物的近交子代和杂交子代)。

利用本领域公知的技术制备用于转化植物细胞和产生转基因植物的核酸构建体。参见例如Maliga等(1995)和Sambrook和Russell(2001)所介绍的方法，这些文献都通过引用具体结合到本文中。本领域普通技术人员应熟悉转化植物细胞以提供本发明转基因植物的技术。参见例如美国专利号5,550,318、5,538,880、6,160,208和6,399,861中公开的微粒轰击方法；美国专利第5,591,616号中公开的土壤杆菌（Agrobacterium)介导的转化方法，所述各文献通过引用具体结合到本文中。使用位点特异性整合来转化植物细胞的有用技术包括美国专利第4,959,317号中公开的cre-lox系统和美国专利第5,527,695号中公开的FLP-FRT系统，这两个专利文献都通过引用结合到本文中。

转化植物细胞再产生本发明的转基因植物优选用培养基中的组织培养物并在控制环境下实施。美国专利号6,194,636和6,232,526公开了产生本发明转基因植物的实用转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和能育转基因植物的后续再生，这些专利文献都通过引用结合到本文中。

在转基因DNA传递给受体植物细胞后，一般要对转化细胞进行鉴定，以便用于进一步培养和植物再生。为了改进鉴定转化体的能力，可以应用选择标记基因或可筛选标记基因，通过将细胞暴露在一种或多种选择试剂中或者筛选所需的标记基因性状，测定可能转化的细胞群。可筛选标记的非限制性实例包括表达有色蛋白或荧光蛋白(例如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP))的基因或者表达β-葡糖醛酸糖苷酶的基因或uidA基因(GUS)，其各种显色底物是已知的。选择标记的非限制性实例包括赋予抗生素(例如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aphIV)和庆大霉素(aac3和aacC4))抗性或赋予除草剂(例如草铵膦(glufosinate)(bar或pat)和草甘膦(aroA或EPSPS))抗性的选择标记；这些选择标记特别有用的实例参见美国专利号5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047，所有这些专利文献都通过引用具体结合到本文中。

本发明的转基因植物可以进一步改良或杂交以提供具有叠加性状(stacked trait)(例如其它农艺上所需的性状)的衍生的转基因植物，该技术为本领域普通技术人员所知。参见例如美国专利申请公告2003/0106096和2002/0112260及美国专利5,034,322、5,776,760、6,107,549和6,376,754，所有这些专利文献都通过引用具体结合到本文中。这些性状的非限制性实例包括但不限于非生物性胁迫(例如干旱或温度胁迫)的抗性或耐受性以及病虫害或病原体的抗性，参见美国专利5,250,515、5,880,275、6,506,599和5,986,175、美国专利申请公告2003/0150017 A1，所有这些专利文献都通过引用结合到本文中。可以从能育转基因植物收获转基因植物的种子，并用来栽培本发明转化植物(包括杂交植物系)的子代，例如用于筛选农艺性状增强的植物。除用重组DNA直接转化植物外，还可以通过使具有重组DNA的第一种植物与缺乏该DNA的第二种植物杂交，产生转基因植物。例如，可以将重组DNA导入适于转化以产生转基因植物的第一种植物系，可以使之与第二种植物系杂交，以将重组DNA渐渗入第二种植物系中。具有提供农艺性状增强(例如产量提高)的重组DNA的转基因植物，可与具有其它赋予另一种性状(例如除草剂抗性或病虫害抗性)的重组DNA的转基因植物系杂交，以产生具有赋予两种性状的重组DNA的子代植物。通常，在这种组合性状的育种中，赋予额外性状的转基因植物为雄性系，携带基础性状的转基因植物为雌性系。这个杂交的子代将分离，以致于某些植物将携带双亲性状的DNA，某些将携带一个亲代性状的DNA；可以通过与亲代重组DNA相关的标记对这些植物进行鉴定。携带双亲性状DNA的子代植物可以与母本系多次回交，例如通常6-8代，产生基因型与一个初始转基因亲代系基本相同但却有另一个转基因亲代系重组DNA的子代植物。

V.通过控制信息稳定性转录后调节基因表达

本发明还提供转录后降低用于食物或饲料的农作物的目标基因信息稳定性的方法，该方法包括在用于食物或饲料的农作物的目标基因3’非翻译区添加去稳定序列，从而转录后降低目标基因的信息稳定性。优选转录后信息稳定性的降低导致基因的表达水平比去稳定序列不存在时的表达水平低。

用于食物或饲料的转基因农作物可以是用于食物或饲料的任何单子叶农作物或双子叶农作物，在“转基因植物I”标题下提供了其合适的实例。优选的用于食物或饲料的双子叶农作物包括但不限于油菜、棉花、马铃薯、昆诺阿藜、苋属植物、荞麦、红花、大豆、糖甜菜和向日葵，更优选大豆、油菜和棉花。优选的用于食物或饲料的单子叶农作物包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、水稻、禾本科牧草、高粱、小米和甘蔗，更优选玉米、小麦和水稻。在某些具体实施方案中，大豆和玉米为特别优选的植物。

目标基因可以是借助去稳定序列进行转录后调节的任何基因，因此，任何转录成RNA转录物，RNA转录物中至少一部分可翻译成多肽的目标基因，优选转录成信使RNA(mRNA)的基因，含有或者可以经改造含有3’非翻译区(3’UTR)，并且去稳定序列可位于3’UTR中。合适目标基因的实例为“转基因植物I”标题下所述的外源基因。合适目标基因的非限制性实例包括参与目标分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂质、糖和其它碳水化合物)生物合成的基因。在本发明一个实施方案中，目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。

去稳定序列可以包括赋予目标基因的转录RNA不稳定性的任何序列，还可参见“转基因植物 I”标题下的内容。在一个优选的实施方案中，去稳定序列为至少一个选自以下元件的序列：3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。ATTTA DNA基序或ATTTAA DNA基序被转录成AUUUA RNA基序或AUUUAA RNA基序。更优选相对于在去稳定序列不存在时的表达，去稳定序列的存在导致目标基因在转基因植物中以较低水平表达。可以使用不只一个去稳定序列或多拷贝的一个或多个去稳定序列。在一个非限制性的实例中，本发明的转基因植物可以在其基因组DNA内包括目标基因，该目标基因在其3’非翻译区具有至少一个SAUR终止子或多拷贝的DST元件，或者SAUR终止子、DST元件或AUUUA或AUUUAA基序的任何组合。

VI.实施例

下面的实施例用来证明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当理解的是，实施例中所公开的根据代表性技术由本发明发明人揭示的技术在实施本发明时运作良好，因此，可认为构成其实施的优选方式。然而根据本说明书，本领域技术人员应当理解的是，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，仍可获得相同或相似的结果而又不偏离本发明的精神和范围。

所有的核酸序列按5’→3’方向给出，除非另有说明。本文所述构建体和载体作为说明性实例提供，不应视为任何方式的限制。

实施例1：

拟南芥SAUR终止子的克隆

本实施例说明用于本发明的去稳定序列。更准确地说，本实施例描述了拟南芥SAUR终止子的克隆。

使用引物SAURfor1，ACCAGCCTTTGTTTCAACAA(SEQ IDNO：11)和SAURrev1，CATAATCAATAAGAAAATAGATGTAC(SEQ ID NO：12)(按照已公开的基因序列设计并由Invitrogen(Carlsbad，CA)供应)，从拟南芥(cv.Columbia)基因组DNA，通过PCR扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)SAUR-AC1基因的终止子(Gil等，1994，该文献通过引用全部结合到本文中)。

用Expand高保真PCR系统(Expand High Fidelity PCR System)(目录号1 732 641，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)进行PCR。初次PCR的组分和条件见表1。

 表1

通过样品在94℃变性1分钟启动反应后，将反应混合物进行20次循环，每次循环由94℃15秒、68℃30秒(每次循环降低1℃)和72℃3分钟组成。然后，将反应混合物进行11次循环，每次循环由94℃15秒、48℃30秒、72℃3分钟组成。该过程在72℃10分钟的步骤后结束，反应混合物于4℃保存直到下一次实验。

从初次PCR反应得到的产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(目录号28104，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)纯化，用30微升H₂O洗脱。使用5微升由初次反应产生的纯化PCR产物作为模板，并使用引物SAURfor2EcoRI，

AAAGAATTCAACTAGTAGGATCCAGTACTATACTACAACATTTC

C(SEQ ID NO：13)和SAURrev2Not，

AAAGCGGCCGCCCGGGACCGGACTAACCGCAGTTCA(SEQ IDNO：14)(按照已公开的基因序列设计并由Invitrogen(Carlsbad，CA)供应)，用嵌套式PCR引物进行再次反应。

用Expand高保真PCR系统(目录号1 732 641，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)进行PCR。嵌套式PCR的组分和条件见表1；扩增反应按上述方法进行。

嵌套式PCR产物的产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(目录号28104，QIAGEN Inc.，Valencia，California)进行纯化，再用30微升双蒸水洗脱。等分的5微升洗脱DNA用NotI和EcoRI消化。消化产物用琼脂糖凝胶进行分离。切下预期大小的条带(～750bp)，用QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704，QIAGEN Inc.，Valencia，California)纯化。将推定的SAUR片段作为3’终止子克隆到包含Lea9作为启动子和GUS作为编码序列的PUC质粒上。所得构建体(pMON63688)见图1。对pMON63688构建体的多克隆进行测序，根据序列比较(Dnastar软件包，DNASTAR，Inc.，Madison，WI53715；www.dnastar.com)，鉴定出SAUR终止子的数个变异体。在一个独立的克隆实验中，NOS终止子被克隆到具有Lea9启动子和GUS编码序列的同一骨架载体中，得到pMON63691(图1)，它用作瞬时测定的对照，以对SAUR终止子的作用与NOS终止子的作用进行比较。

制备另一构建体pMON13773(图1)，其中含有驱动GUS的7Sα’启动子与NOS终止子。将SAUR的变异体1克隆到pMON13773以置换NOS终止子。新的构建体pMON63692含有驱动GUS的7Sα’启动子与NOS终止子(图1)。

实施例2：

SAUR终止子在大豆瞬时转化系统中的表征

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其在转基因植物模型中的用途。更准确地说，本实施例描述了SAUR终止子在大豆瞬时转化系统中的表征。

开花后25-28天，收获双子叶农作物大豆的种子(AsgrowA3244)，在GAMBORG培养基(目录号G5893，Sigma Company，St.Louis，MO)(pH 5.6)中，于25℃避光经渗透处理过夜，培养基中补充了50毫摩尔谷氨酰胺、111毫摩尔麦芽糖、125毫摩尔棉子糖、125毫摩尔甘露糖醇和3克/升纯化琼脂。分离所得子叶，采用基因枪技术(Maliga等，1995)，用pMON63691(NOS终止子)或pMON63688(SAUR终止子)的纯化超螺旋DNA轰击。作为使实验性差异归一化的内部对照，另外的e35S-驱动的萤光素酶构建体pMON19425(图1)也包括在内，浓度为1微克/微升，与各个试验构建体的摩尔比为1∶1。各板具有6片子叶，每个构建体轰击各板一式5-6份。经轰击的组织于25℃下孵育48小时。

用1毫升含有0.1摩尔磷酸钾(pH 7.8)、10毫摩尔DTT、1毫摩尔EDTA、5％甘油和蛋白酶抑制剂(1片/50毫升，目录号1 697 498，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，Indiana))的提取缓冲液，从6片经轰击的大豆子叶中提取蛋白质。100微升等分的蛋白提取物通过Promega(目录号E2510，Promega Corporation Madison，WI)的“Steady-Glo”步骤后，用于萤光素酶测定。将8.8毫克MUG(4-甲基伞花基-β-D-葡糖苷酸，目录号M9130，Sigma，St.Louis，MO)加入到10毫升提取缓冲液中，制备GUS测定缓冲液。将50微升等分的蛋白提取物与200微升GUS测定缓冲液混合。应用配有355纳米激发光、460纳米发射光和455纳米截止光的Softmax Pro软件的基础动力学方案(Basic Kinetic Protocol)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，用Spectramax Gemini分光光度读板仪进行GUS测定。在2小时内每间隔7分钟便记录荧光读数，得到每个样品的GUS V_最大值。每个样品测定两次，用平均值进行数据分析。根据每个样品的萤光素酶活性使GUS活性归一化，相对启动子强度通过将对照载体pMON63691(图1)任意设置为100％来表示。或者，该测定中还包括从转基因植物(目录号G8162，Sigma，St.Louis，MO)中纯化的GUS蛋白(已知浓度)，用来计算样品中GUS的绝对含量。结果(图2)表明，当与NOS终止子(转基因植物中基因表达的基准终止子)比较时，SAUR终止子的所有变异体都显著降低GUS的表达。

以类似方式进行的另一个瞬时测定显示，当7Sα’用作驱动GUS表达的启动子时，SAUR终止子有效地降低基因表达(图3)。

实施例3：

将多拷贝的DST元件克隆到带有不同启动子的载体中

本实施例进一步说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例描述了将多拷贝的DST元件克隆到带有不同启动子的载体中。

SAUR基因的DST元件被鉴定为负责使mRNA不稳定的关键元件。为了测试DST元件能否与与大豆的异源表达盒结合有效地发挥作用，设计出两条单链寡核苷酸片段(由Invitrogen(Carlsbad，CA)供应)，即2xDSTfor，

AAAGAATTCGCTAGCAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACA

TTTTGTATAATAAGGAGACTGACATAG(SEQ ID NO：15)和

2xDSTrev，

AAAGGATCCGATGGCCGCACTAGTTATTATACAAAATGTCTCCT

CCAATCTATGTCAGTCTCCTTATTAT(SEQ ID NO：16)，用于含有2个拷贝DST的双链DNA片段的组装。

用Expand高保真PCR系统(目录号1 732 641，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)进行PCR用于片段组装。因为两条单链DNA片段具有彼此互补的重叠区，所以不需要模板DNA。片段组装式PCR的组分和条件见表1；按照实施例1中所述方法进行反应。

3微升等分的PCR反应物用EcoRI和BamHI酶消化，并克隆到在GUS编码基因与NOS终止子之间的位点线性化的pMON58101(图1)中。通过测序鉴定出含有2XDST的克隆，并命名为pMON63687(图1)。预期pMON58101与pMON63687之间的比较可证实2XDST对基因表达的作用。通过用Lea9启动子或7Sα’启动子置换pMON63687的USP启动子，产生pMON63697和pMON63698(图1)，来制备两个额外的载体。将pMON63697与pMON63691进行比较，对照载体含有驱动GUS的7Sα’启动子与NOS终止子。将pMON63698与pMON13773进行比较，另一个对照载体含有驱动GUS的7Sα’启动子与NOS终止子。用瞬时测定法进行比较，见实施例4。

实施例4：

2XDST在大豆瞬时转化系统中的表征

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例描述了2XDST在大豆瞬时转化系统中的表征。

开花后25-28天，收获大豆植物的种子(Asgrow A3244)，并按照实施例2中所述方法进行渗透处理。分离所得子叶，采用实施例2中所述的基因枪技术，用pMON58101(NOS终止子)或pMON63687(2XDST和NOS终止子)的纯化超螺旋DNA轰击。对照载体为e35S-驱动的萤光素酶构建体pMON19425。

提取蛋白质，按实施例2中所述的“Steady-Glo”萤光素酶测定法和GUS测定法进行分析。根据每个样品的萤光素酶活性使GUS活性归一化，相对启动子强度通过将对照载体pMON58101(图1)任意设置为100％来表示。结果(图4)表明，当与仅有NOS终止子比较时，所包含的2XDST显著降低GUS的表达。

进行其它实验以对pMON13773与pMON63698(图5)及对pMON63691与pMON63697(图6)进行比较。结果始终显示，2XDST有效地降低大豆子叶中的基因表达。数据共同显示出，不论实验中所用的启动子，2XDST都能有效地起作用。

实施例5：

含有2XDST、4XDST或6XDST的Per1载体的克隆

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例描述了含有2XDST、4XDST或6XDST的Per1载体的克隆。

通过以下标准分子克隆方案(Sambrook和Russell，2001，该文献通过引用结合到本文中)，构建另外的载体以测试DST拷贝数对基因表达水平的作用。载体pMON42316(图1)，即对照载体，含有驱动GUS表达的Per1启动子与NOS终止子。切下pMON63697的Lea9启动子，用Per1启动子置换以制备pMON78113(图1)，它具有2XDST与NOS终止子组合。

为了制备多拷贝的DST，将实施例3产生的5微升等分的PCR产物用SpeI和NheI消化。经消化的DNA用琼脂糖凝胶进行分离，采用QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)提取，并连接到用SpeI线性化并用CIP碱性磷酸酶处理的pMON78113上。通过SpeI和NheI双重消化，筛选出含有4XDST的克隆，并命名为pMON78116(图1)。

pMON78116再次用SpeI线性化，用CIP碱性磷酸酶处理，并连接到早前制备的2XDST片段上。通过SpeI和NheI双重消化，筛选出含有6XDST的克隆，并命名为pMON78117(图1)。

实施例6：

2XDST、4XDST或6XDST在大豆瞬时转化系统中的比较

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例描述了2XDST、4XDST和6XDST在大豆瞬时转化系统中的比较。

开花后25-28天，收获大豆植物的种子(Asgrow A3244)，按实施例2中所述方法进行渗透处理。分离所得子叶，采用实施例2中所述的基因枪技术，用pMON42316(仅NOS终止子)、pMON78113(2XDST和NOS终止子)、pMON78116(4XDST和NOS终止子)或pMON78117(6XDST和NOS终止子)的纯化超螺旋DNA轰击。对照载体为e35S-驱动的萤光素酶构建体pMON19425。

提取蛋白质，按实施例2中所述的“Steady-Glo”萤光素酶测定法和GUS测定法进行分析。根据每个样品的萤光素酶活性使GUS活性归一化，相对启动子强度通过将对照载体pMON42316(图1)任意设置为100％来表示。结果(图7)表明，DST拷贝数与基因表达水平呈负相关。

实施例7：

1XDST、3XDST和5XDST的克隆

本实施例说明用于本发明的去稳定序列。更准确地说，本实施例描述了1XDST、3XDST和5XDST的克隆。

制备另外的载体以进一步评价DST拷贝数与基因表达水平的相关性。设计出两条单链寡核苷酸片段(由Integrated DNATechnologies，Inc.(Coralville，IA)供应)，即Forward退火1XDST，CTAGCTAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACATTTTGTATAATAGGA(SEQ ID NO：17)和Rev Comp退火1XDST，CTAGTCCTATTATACAAAATGTCTCCTCCAATCTATGTCAGTCTCCTAG(SEQ ID NO：18)，用于含有1个拷贝DST的双链DNA片段的组装。在Expand高保真PCR系统(目录号1 732 641，RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，Indiana)提供的1XPCR缓冲液中使2个片段进行退火。

通过样品在96℃变性10分钟启动反应后，以0.2℃/秒的速度使温度降低，分别于80℃、70℃、60℃、50℃、40℃和30℃暂停7分钟。该过程于4℃结束，混合物于4℃保存直到下一次实验。

然后，退火的1XDST片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(目录号28104，QIAGEN Inc.，Valencia，CA)进行纯化，再用32微升双蒸水洗脱。经洗脱的DNA用T4多核苷酸激酶试剂盒(目录号18004-010，Invitrogen，Carlsbad，CA)处理，保存为1XDST插入片段。为了产生1XDST构建体，pMON78113用SpeI和NheI消化，并用CIP碱性磷酸酶处理。然后，将骨架载体与1XDST插入片段连接在一起产生pMON78119(图1)。

为了产生3XDST和5XDST构建体，pMON78113和pMON78116用SpeI消化使之线性化并用CIP碱性磷酸酶处理。然后，将骨架载体与1XDST插入片段连接在一起。通过SpeI和NheI双重消化，筛选出含有3XDST或5XDST的克隆并分别命名为pMON78120和pMON78121(图1)。

实施例8：

1XDST、2XDST、3XDST、4XDST和5XDST

在大豆瞬时转化系统中的比较

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例描述了1XDST、2XDST、3XDST、4XDST和5XDST在大豆瞬时转化系统中的比较。

开花后25-28天，收获大豆植物的种子(Asgrow A3244)，按实施例2中所述方法进行渗透处理。分离所得子叶，采用实施例2中所述的基因枪技术，用pMON42316(仅有NOS终止子)、pMON78119(1XDST和NOS终止子)、pMON78113(2XDST和NOS终止子)、pMON78120(3XDST和NOS终止子)、pMON78116(4XDST和NOS终止子)或pMON78121(5XDST和NOS终止子)的纯化超螺旋DNA轰击。对照载体为e35S-驱动的萤光素酶构建体pMON19425。

提取蛋白质，按实施例2中所述的“Steady-Glo”萤光素酶测定法和GUS测定法进行分析。根据每个样品的萤光素酶活性使GUS活性归一化，相对启动子强度通过将对照载体pMON42316(图1)任意设置为100％来表示。结果(图7)表明，DST拷贝数与基因表达水平呈负相关。结果还显示1XDST足以降低基因表达。

实施例9：

去稳定序列在转基因农作物(大豆)中的有效性

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例证明了去稳定序列在转基因农作物(大豆)中的有效性。

为了进一步证实DST作为信息-去稳定序列在转基因大豆中的有效性，根据标准分子克隆方案(Sambrook和Russell，2001，该文献通过引用结合到本文中)，构建了多个土壤杆菌转化载体(图8)。表达盒由FMV启动子、CTP2和CP4编码基因组成，所有载体中都包括E9 3’UTR作为选择标记。用拟南芥SSU 1A CTP和土壤杆菌邻氨基苯甲酸合酶(AS)的融合蛋白作为编码基因使色氨酸生物合成途径去调节。用Per1、Lea9或7Sα’启动子来驱动AS基因的表达。在AS盒3’端使用NOS终止子与DST组合。

通过三亲杂交方法(Ditta等(1980)，该文献通过引用结合到本文中)，将上述载体转移到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株ABI中。通过本领域众所周知的方法制备用于转化的细菌细胞。

使市售的大豆种子(Asgrow A3244)在10-12小时内萌发。切取分生组织外植体，置于创伤容器(wounding vessel)内，通过超声处理使之受创伤。受创伤后，加入上述土壤杆菌培养物，孵育外植体约1小时。接种后，用移液管取出土壤杆菌培养物，将外植体置于共培养物中2-4天。然后，将外植体转移至由木本植物培养基(WPM)(参见McCown和Lloyd(1981)，该文献通过引用全部结合到本文中)、加上75微摩尔草甘膦和抗生素组成的选择培养基中，以控制土壤杆菌过度生长，5-7周后进行选择并使转基因苗生长发育。接种后约5-7周收获表型阳性苗，放入包含大豆生根培养基(BRM)与25微摩尔草甘膦的选择性生根培养基(参见美国专利第5,914,451号，该专利文献通过引用全部结合到本文)中2-3周。将生出根的苗移至温室内，栽培于盆栽土壤中。将选择时保持健康但不生根的苗转移至非选择性生根培养基(即无草甘膦的BRM)中再培养两周。完成选择后，测定任何生根苗组织内植物选择标记的表达，再移至温室内，栽培于盆栽土壤中。各植株维持在标准温室条件下直到收获R1种子。

采用下面的方法对每个转基因植株的游离氨基酸水平进行分析。将每个转基因植株的种子分别碾成细粉，将约50毫克所得粉末转移至预先称重的离心管中。记录样品的精确样品重量，向各样品管中加入1.0毫升5％三氯乙酸。将样品于室温下通过旋转混合，然后在Eppendorf微量离心机(5415C型，Brinkmann Instrument，Westbury，NY)中离心15分钟(14,000rpm)。取出上清液等分，应用Agilent Technical Publication“Amino Acid Analysis Using the ZorbaxEclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC(采用ZorbaxEclipse-AAA柱和Agilent 1100 HPLC进行氨基酸分析)”(2000年3月17日，该文献通过引用结合到本文中)所述的步骤，用HPLC(Agilent1100)进行分析。因为从各个转基因植株所收获的R1种子代表一群分离种子，从每次事件所分析的10粒种子中挑选出色氨酸水平最高的种子，作为纯合基因型(homozygous genotype)的代表。还对AsgrowA3244的10粒随机选择的非转基因种子进行了分析。从非转基因A3244中选择色氨酸水平最高的种子作为阴性对照。

实施例10：

SAUR 3’-UTR、2XDST、3XDST、4XDST、5XDST和6XDST

在玉米叶瞬时转化中的有效性

本实施例说明用于本发明的去稳定序列及其用途，其中目标基因与本发明转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。更准确地说，本实施例证明了SAUR 3’-UTR、2XDST、3XDST、4XDST、5XDST和6XDST在玉米叶瞬时转化中的有效性。在双子叶植物起作用的基因表达元件不一定也在单子叶植物起作用。在本发明前面的实施例中描述了应用SAUR 3′-UTR和DST元件减量调节双子叶农作物大豆中的基因表达。对单子叶植物，特别是单子叶农作物(玉米)的相同元件进行评价，以确定它们降低基因表达的有效性。

除了SAUR 3’-UTR和DST元件以外，还对瞬时转化单子叶系统中富含AU基序重叠的重复序列的两种不同排列(重叠AUUUA和新的重叠AUUUAA基序)的有效性进行了比较。在该非限制性的实例中，使用11个拷贝的富含AU基序；或者，可以使用较少(优选至少3个)或较多(11个以上)的拷贝。制备4个构建体，其中2个含有间隔序列(相同长度的随机序列)，用作对照。使用合成的互补寡核苷酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)来产生间隔控制序列和2种不同排列的11个拷贝的富含AU基序的序列。用于重叠AUUUA排列的寡核苷酸引物是

CTAGCATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTA

TTTAG(SEQ ID NO：19)和

GATCCTAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATA

AATAAATG(SEQ ID NO：20)。对于新的重叠AUUUAA排列的寡核苷酸引物是

CTAGCATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTA

ATTTAATTTAATTTAG(SEQ ID NO：21)和

GATCCTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAATTAAA

TTAAATTAAATTAAATG(SEQ ID NO：22)。对于第一间隔对照序列的寡核苷酸引物是

CTAGCATGAATACATCTGAATGTCTAGTATATTGATTGAAAGCT

TTGTATG(SEQ ID NO：23)和

GATCCATACAAAGCTTTCAATCAATATACTAGACATTCAGATGT

ATTCATG(SEQ ID NO：24)。对于第二间隔对照序列的寡核苷酸引物是

CTAGCATCTGATACTGACATGCATCATGCTAATTCAGACATGCA

TGAATTCAATACGTACG(SEQ ID NO：25)和

GATCCGTACGTATTGAATTCATGCATGTCTGAATTAGCATGATG

CATGTCAGTATCAGATG(SEQ ID NO：26)。

将这些互补寡核苷酸引物对一起在含有1微升各引物(100微摩尔)、10微升10X Invitrogen缓冲液10(150毫摩尔NaCl终浓度)和88微升无菌双蒸水的反应混合物中退火。循环变温器条件为95℃5分钟，随后从95℃开始70次循环(每次循环降低1℃)。

将退火产物设计成两端具有NheI和BamHI位点。退火后，产物按1∶50稀释，用1微升与pMON64263(之前已用NheI和BamHI切割)的骨架连接，进行凝胶纯化。所得构建体命名为pMON64264、pMON64265、pMON64266和pMON64267。按实施例10中所述方法，用表2所列构建体进行玉米叶瞬时测定。数据显示，2个富含AU基序的11个拷贝排列导致较低的表达(相对于富含AU基序重复序列不存在时的表达，大约降低50％)(图9)。

表2

构建体编号	启动子	编码序列	DST或富含AU基序的拷贝	终止子
					pMON64256	e35S	GUS	无	NOS
pMON64257	e35S	GUS		SAUR
					pMON64259	e35S	GUS	2X DST	NOS
pMON64260	e35S	GUS	3X DST	NOS
					pMON64261	e35S	GUS	4X DST	NOS
pMON64262	e35S	GUS	5X DST	NOS
					pMON64263	e35S	GUS	6X DST	NOS
pMON64264	e35S	GUS	11X AUUUA	NOS
					pMON64265	e35S	GUS	间隔区1	NOS
pMON64266	e35S	GUS	11X AUUUAA	NOS
					pMON64267	e35S	GUS	间隔区2	NOS
pMON19437	e35S	萤光素酶(对照)	无	NOS

在大豆子叶瞬时测定中进行分析的SAUR 3′-UTR和DST构建体(pMON63691、pMON63688、pMON63697、pMON78121、pMON78120、pMON78117、pMON781116)中所用的启动子为种子特异性启动子(图1)。其它空间特异性启动子、时间特异性启动子、诱导型启动子或组成型启动子也是适宜的。作为玉米叶原生质体瞬时系统中用于评价的初始构建体，可应用标准分子生物学技术，用增强型35S启动子置换这些构建体的种子特异性启动子。全部构建体见表2。

如下进行玉米叶原生质体瞬时转化实验：从黄化生长12天的LH200×H50玉米叶中分离出原生质体，用2％纤维素酶RS和0.3％离析酶R10(Karlan Research，Santa Rosa，CA)进行酶消化。原生质体用4皮摩尔质粒DNA进行电穿孔(1毫秒两次，120伏特，5秒间隔进行3次脉冲)，质粒DNA为实验DNA和内部对照DNA(萤火虫萤光素酶，pMON19437)的等量混合物。每个构建体一式三份进行电穿孔，在不同天数中重复(两个实验天之间至少24小时以使天与天之间的差异最小化)，共一式六份。孵育过夜后，通过将0.25体积的5X被动裂解缓冲液(双重萤光素酶报道分子测定系统(Dual-LuciferaseReporter Assay System)，目录号E1960，Promega，Madison，WI)加入到转化的原生质体细胞中来提取蛋白质，按照双重萤光素酶报道分子测定系统的方案，用20微升蛋白提取物进行萤光素酶测定。萤火虫萤光素酶(fLUC)活性用作内部对照。为测定GUS活性，将20微升1X MUG(目录号M9130，Sigma，St.Louis，MO)加入到20微升蛋白提取物中，于37℃孵育0.5小时。加入180微升0.2摩尔Na₂CO₃停止反应后，使用Wallac Victor2机器(PerkinElmer，Boston，MA)，于355纳米激发光和460纳米发射光下测量荧光。结果(图9)证实，导致基因在大豆瞬时系统中以较低水平表达的DST元件，也在单子叶植物系统起作用。与大豆结果相似，减量调节的程度一般与DST的拷贝数相关。在该具体的实施例中，3个拷贝以上的DST不会引起表达水平进一步降低(图9)，使用仅含有1个拷贝DST的SAUR终止子导致基因以相当低的水平表达。

发现DST元件有效地降低转基因大豆中的色氨酸水平(见实施例9)。相对于在DST序列不存在时所观察到的水平，2个拷贝(2X)的DST元件导致色氨酸水平大约降低30％(图10)，这与2个不同“亲本”构建体(pMON66892和pMON66891)所观察到的结果相似。瞬时转化和稳定转化植物数据都证实DST元件可以用来调节农作物的基因表达。

************

根据上述所公开的内容，无需过多实验就可以制备和使用本文公开和要求的所有材料和方法。虽然在优选的实施方案和说明性实施例中已经描述了本发明的材料和方法，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本发明所述材料和方法进行改变。对于本领域技术人员显而易见的所有类似的替换和修改也被认为落入由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和构思之内。

参考文献

下列参考文献，在某种程度上提供示例性的流程性资料或其它对本文所述方法予以补充的详细资料，都通过引用具体结合到本文中。

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<120>基因表达在植物中的转录后调节

<130>MONS：090WO

<140>未知

<140>2006-05-15

<150>60/682,471

<150>2005-05-19

<160>32

<210>1

<211>660

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

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<210>2

<211>662

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

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<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

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<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

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<211>43

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>5

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<210>6

<211>80

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>6

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<211>129

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>7

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<210>8

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<212>DNA

<213>合成构建体

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<213>合成构建体

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<212>DNA

<213>合成构建体

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<213>合成构建体

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<213>合成构建体

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<400>23

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<210>24

<211>51

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>24

gatccataca aagctttcaa tcaatatact agacattcag atgtattcat g           51

<210>25

<211>61

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>25

ctagcatctg atactgacat gcatcatgct aattcagaca tgcatgaatt caatacgtac  60

g                                                                  61

<210>26

<211>61

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>26

gatccgtacg tattgaattc atgcatgtct gaattagcat gatgcatgtc agtatcagat  60

g                                                                  61

<210>27

<211>13

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>27

atttatttat tta                                                    13

<210>28

<211>21

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>28

atttatttat ttatttattt a                                           21

<210>29

<211>56

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>29

atttaattta atttaattta atttaattta atttaattta atttaattta atttaa    56

<210>30

<211>33

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>30

atttatttat ttaatttaat ttaatttatt taa                             33

<210>31

<211>16

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>31

atttaattta atttaa                                                16

<210>32

<211>26

<212>DNA

<213>合成构建体

<400>32

atttaattta atttaattta atttaa                                    26

Claims (23)

1.一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，所述外源基因在其3’非翻译区具有至少第一去稳定序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述转基因植物的种子中以较低水平表达。

2.权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物为农作物，选自谷类作物、油料种子作物、饲草作物和蔬菜作物。

3.权利要求1的转基因植物，其中所述多肽包括邻氨基苯甲酸合酶。

4.权利要求1的转基因植物，其中所述去稳定序列选自3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。

5.一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含非组成型启动子及与其操作性连接的编码多肽的外源基因，所述外源基因在其3’非翻译区包含至少第一去稳定序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述转基因植物中以较低水平表达。

6.权利要求5的转基因植物，其中所述转基因植物为农作物。

7.权利要求5的转基因植物，其中所述非组成型启动子选自空间特异性启动子、时间特异性启动子或诱导型启动子。

8.权利要求5的转基因植物，其中所述去稳定序列选自3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。

9.一种用于食物或饲料的转基因农作物，所述转基因农作物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，所述外源基因在其3’非翻译区包含去稳定序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述用于食物或饲料的转基因农作物中以较低水平表达。

10.权利要求9的用于食物或饲料的转基因农作物，其中所述用于食物或饲料的转基因农作物为单子叶植物。

11.权利要求10的用于食物或饲料的转基因农作物，其中所述单子叶植物为玉米。

12.权利要求9的用于食物或饲料的转基因农作物，其中所述用于食物或饲料的转基因农作物为双子叶植物。

13.权利要求12的用于食物或饲料的转基因农作物，其中所述双子叶植物为大豆。

14.权利要求9的用于食物或饲料的转基因农作物，其中所述去稳定序列选自3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。

15.一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码多肽的外源基因，所述外源基因在其3’非翻译区包含去稳定序列，所述去稳定序列包含重叠的ATTTAA重复序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述多肽在所述转基因植物中以较低水平表达。

16.一种转基因植物，所述转基因植物在其基因组DNA内包含编码邻氨基苯甲酸合酶的基因，所述基因在其3’非翻译区包含去稳定序列，从而相对于所述去稳定序列不存在时的表达，所述邻氨基苯甲酸合酶在所述转基因植物中以较低水平表达。

17.一种转录后降低用于食物或饲料的农作物中目标基因的信息稳定性的方法，该方法包括在所述用于食物或饲料的农作物的所述目标基因3’非翻译区添加去稳定序列，从而使所述目标基因的信息稳定性在转录后降低。

18.权利要求17的方法，其中所述用于食物或饲料的转基因农作物为单子叶植物。

19.权利要求18的方法，其中所述单子叶植物为玉米。

20.权利要求17的方法，其中所述用于食物或饲料的转基因农作物为双子叶植物。

21.权利要求20的方法，其中所述双子叶植物为大豆。

22.权利要求17的方法，其中所述去稳定序列选自3’SAUR终止子、DST元件、ATTTA基序、ATTTAA基序和ATTTA基序与ATTTAA基序的组合。

23.权利要求17的方法，其中所述目标基因与转基因表达盒内的至少一个启动子元件操作性连接。

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