MX2007014611A - Regulacion post-transcripcional de la expresion del gen. - Google Patents

Abstract

La invencion provee plantas transgenicas que tienen dentro de su genoma ADN que incluye un gen exogeno que codifica un polipeptido y que tiene en su region no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante, por medio de la cual el polipeptido se expresa a un nivel mas bajo en una semilla de las plantas transgenicas en relacion con la expresion en la ausencia de secuencia desestabilizante; tambien se describen metodos para la disminucion post-transcripcional de la estabilidad del mensajero de un gen de interes en una planta que incluye la adicion de una secuencia desestabilizante a la region no traducida hacia 3' del gen de interes.

Description

REGULACIÓN POST-TRANSCRIPCIONAL DE LA EXPRESIÓN DEL GEN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de archivo de la solicitud de patente adicional de E.U.A. número de serie 60/682,471 , presentada el 19 de mayo de 2005, la descripción total de la cual se incorpora específicamente en la presente invención como referencia.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere generalmente a la biología moleoular vegetal, y más específicamente a los métodos para la regulación post-t anscripcional de la expresión del gen en plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el campo de la biotecnología, un objetivo principal ha sido el incremento en el nivel de expresión de los transgenes, por ejemplo, para lograr un blanco comercial específico. Los elementos moleculares que sub-regulan la expresión del gen se han investigado extensamente debido a que se ha percibido generalmente que no tienen valor comercial. No obstante, los elementos que sub-regulan la expresión del gen, especialmente los elementos que sub-regulan la expresión del gen de una manera que se puede predecir, pueden ser útiles, particularmente cuando es deseable alcanzar un nivel específico de la expresión del gen. Por ejemplo, no siempre se desea una expresión muy alta de un gen dado, y uno puede desear lograr la expresión de un traisgén dado por arriba de un nivel pero por debajo de otro nivel. Aunque se puede regular la expresión del gen en el paso de la transcripción (por ejemplo, mediante la selección de promotores apropiados o elementos promotores a ser utilizados con un transgén dado), es posible regular post-transcripcionalmente la expresión del gen. Dicho control post-transcriptional de la expresión del gen también ofrece la ventaja de permitir el uso de perfiles temporales, espaciales, o inducibles obtenidos mediante el uso de promotores aprop ados o elementos promotores. Un método para el control post-transcriptional de la expresión del gen es controlar la estabilidad del ARN mensajero (ARNm) producido por la transcripción del gen. Incluyendo una secuencia desestabilizante en la región no traducida hacia 3' (UTR 3') de un ARN transcrito que se ha descubierto que desestabiliza el ARNm y reduce la vida media del ARNm en el tabaco (Nicot ana tabacum) y en ARNs animales. Por ejemplo, los genes SAUR (small auxin up ARNs - ARNs de auxina pequeña) de plantas contienen el elemento DST, una secuencia de 43 pares de bases en la región no traducida hacia 3' (UTR 3') altamente conservada entre las especies vegetales, la cual ha sido reportada que confiere inestabilidad a los ARNm de SAUR al menos en plantas de tabaco. Véase, por ejemplo, Newman et al. (1993), Green (1993 , y Gutiérrez et al. (1999), y Feldbrugge et al. (2001 ), los cuales se incorporan como referencia en la presente invención. No se sabía si el terminador SAUR o el elemento DST podría tener efectos similares sobre los ARNs a partir de cosechas de plantas dicotiledóneas o plantas monototiledóneas. Otro motivo conservado del ARN, múltiples copias de AUUUA, se cree que desestabiliza a los ARNms en animales y también se encuentra en pía ntas; se reportó que los repetidos AUUUA desestabilizan a los ARNms en el tabaco mientras que los repetidos AUUAA no lo hacen, indicando la especificidad de secuencia para este motivo y no solamente para el contenido de AU. Véase, por ejemplo, Ohme-Takagi et al. (1993), y Gutiérrez et al. (1999), los cuales se incorporan como referencia en la presente invención. Sin embaigo, no se sabía si el repetido AUUUA podría tener efectos similares en otras plantas dicotiledóneas o en plantas monocotiledóneas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA La presente invención provee un método para la regulación post-transcripcional de la expresión del gen en una planta, tales como plantas de cosecha dicotiledóneas y planta de cosecha monocotiledóneas. Más espec Acámente, la presente invención describe un método de disminución post- transcripcional de la estabilidad del mensajero en una planta, incluyendo la adición de una secuencia desestabilizante a la región no traducida hacia 3' En un aspecto adicional, la presente invención reclama una planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje y que tiene en su gehoma ADN que incluye un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' una o más secuencias desestabilizantes, por medio de la cual el polipéptido se expresa a un nivel más tajo en la planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje en relación con la expresión en la ausencia de una o más secuencias desestabilizantes. En incluso otro aspecto, la presente invención reclama una planta transgénica que tiene en su genoma ADN que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' una o más secuencias desestabilizantes que incluyen la super Dosición de los repetidos ATTTAA, por medio de los cuales dicho polipéptido se expresa a un nivel inferior en dicha planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de dicha una o más secuencias desestabilizantes. En incluso otro aspecto, la presente invención reclama adicionalmente una planta transgénica que tiene en su genoma ADN que incluys un gen que codifica antranilato sintasa y que tiene en su región no traducida hacia 3' una o más secuencias desestabilizantes, por medio de la cual a antranilato sintasa se expresa a un nivel más bajo en la planta transc énica en relación con la expresión en la ausencia de una o más secuencias desestabilizantes. La presente invención también provee métodos para disminuir post-t anscripcionalmente la estabilidad del mensajero de un gen de interés en una planta de cosecha utilizada para alimento o forraje. En la modalidad, el método incluye la adición de una o más secuencias desestabilizantes a la región no traducida hacia 3' del gen de interés en la planta de cosecha utilizada para alimento o forraje, por medio de la cual la estabilidad del mensajero del gen de interés se disminuye post-transcripcionalmente y preferiblemente resulta en la expresión del gen a un nivel más bajo que aquél en donde está ausente la una o más secuencias desestabilizantes. Otras modalidades específicas de la invención se describen en la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. En los ejemplos a continuación se describen los ejemplos no limitantes de construcciones que contienen secuencias desestabilizantes como se utilizan en los experimentos de transformación transitoria descritos en los ejemplos a continuación. Se ilustra un diseño general y se listan los elementos pertinentes de las construcciones. Figura 2. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 2. Diferentes variantes de los terminadores SAUR i (pMON63688) disminuyen efectivamente la expresión del gen en comparación con el terminador NOS (pMON63691) en construcciones utilizando el promotor Lea9 que dirige el gen GUS. Figura 3. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 2. El terminador SAUR (pMON63688, variante 1 ) disminuye efectivamente la expresión del gen en comparación con el terminador NOS (pMON13773) en construcciones que utilizan el promotor 7Salpha' que dirige el gen GUS. Figura 4. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polípéptido como se describe en el ejemplo 4. El elemento 2XDST en combinación con el termirador NOS (pMON63687) pueden disminuir efectivamente la expresión del gi3n en comparación con el terminador NOS solo (pMON58101 ) en construcciones que utilizan el promotor USP que dirige el gen GUS. Figura 5. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 4. El elemento 2XDST en combinación con el terminador NOS (pMON63698) disminuyen efectivamente la expresión del gen en comparación con el terminador NOS solo (pMON13773) en construcciones que utilizan el promotor 7Salpha' que dirige el gen GUS. Figura 6. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se descrbe en el ejemplo 4. El elemento 2XDST en combinación con el terminador NOS (pMON63697) disminuyen efectivamente la expresión del gen en comparación con el terminador NOS solo (pMON63691 ) en construcciones utilizando el promotor Lea9 que dirige el gen GUS.

Figura 7. Un ejemplo no limitante de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 8. Diferentes números de copias de elementos DST en combinación con los terminadores NOS (pMON78113, pMON78116, pMON78117) disminuyen efectivamente la expresión del gen en comparación con e terminador NOS solo pMON64316) en construcciones que utilizan el promotor Perl que dirige el gen GUS. El número de copias de DST se correlacionó de manera negativa con el nivel de la expresión del gen. Figura 8. Ejemplos no limitantes de construcciones que contienen secuencias desestabilizantes y útiles para la generación de plantas transgénicas de la invención. Se ilustra un diseño general y los elementos clave de las construcciones se listan como se describe en el ejemplo 9. La figura 9 ilustra los ejemplos no limitantes de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 9. Los elementos ricos en DST y AU disminuyen de manera efectiva la expresión del gen en un sistema de expresión transitoria en el maíz. El terminador SAUR contenía 1X DST. Se muestra la desviación estándar. Los niveles de expresión mostrados son relativos a los vectores control que contenían el terminator NOS, espaciador 1 , o espaciador 2. Figura 10 ilustra los ejemplos no limitantes de elementos desestabilizantes útiles para disminuir el nivel de expresión de un gen o polipéptido como se describe en el ejemplo 10. Se alcanzaron niveles más media r te Taqman. Para -DST, s1-s4 fueron las plantas a partir de un evento y s5-s7 fueron las plantas a partir de un segundo evento. Para +DST, s8-s9 fueron las plantas a partir de un evento y s1-s15 fueron las plantas a partir de un segundo evento. La figura 11 B muestra el nivel de transcripción relativa en un ncrthem blot. La AS de Agro se utilizó como una sonda. Los resultados Taqman y northern son consistentes entre sí. La parte inferior de al figura 11B muesfra en la cantidad de carga relativa del ARN en el blot.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA BNVENCION I. Plantas transqénicas La presente invención provee una planta transgénica que tiene en s?|? genoma ADN que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante, por medio de la cual el polipéptido se expresa a un nivel más bajo en una semilla de la planta transgéníca en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante. La planta transgénica se puede derivar a partir de cualquier planta de interés monocotiledónea o dicotiledónea, incluyendo, pero no limitada a, plantas de interés comercial o agrícola, tales como plantas de cosecha (especialmente plantas de cosecha utilizadas para alimento de humano o forraje animal), árboles productores de madera o de pulpa, plantas vegetales, plantas frutales, y plantas ornamentales. Los ejemplos no limitantes de plantas de interés incluyen plantas de cosecha de grano tales como trigo, avena , cebada, maíz, centeno, triticale, arroz, mijo, sorgo, quinua, amaranto, y trigo sarraceno; plantas de cosecha de forraje tales como pastos de forraje y forraje del alfalfa; plantas de cosecha de semilla oleosa tales como algodón, cártamo, girasol, frijol de soya, cañóla, semilla de colza, lino, cacahuates, y palma de aceite; árboles de nueces (tales como nuez, almendra anacardo, avellana, nuez, almendra, y los similares); caña de azúcar, coco, palmera de dátil, olivo, remolacha azucarera, té, y café; árboles productores de madera o de pupa; plantas de cosecha de vegetales tales como legumbres (por ejemp o, frijoles, chícharos, lentejas, alfalfa, cacahuate), lechuga, espárragos, alcachofa, apio, zanahoria, rábano, las brassicas (por ejemplo, calabazas, coles, mostazas, y otras brassicas frondosas, brócoli, coliflor, calabacitas de Bruse as, nabo, colinabo), cucurbitáceas comestibles (por ejemplo, pepinos, melones, calabazas de verano, calabazas de invierno), especies allium comestibles (por ejemplo, cebollas, ajo, puerros, echalotes, cebollinos), miembros comestibles de la Solanaceae (por ejemplo, tomates, berenjenas, patatas, pimientos, alquequenjes), y miembros comestibles de la Chenopodiaceae (por ejemplo, remolacha, acelga, espinaca, quinua, amaranto); plantas de cosechas frutales tales como manzana, pera, frutos cítrico!) (por ejemplo, naranja, lima, limón, toronja, y otros), frutas de hueso (por ejemplo, chabacano, durazno, ciruela, nectarina), banana, piña, uva, kiwi, papaya, aguacate, y bayas; y plantas ornamentales que incluyen plantas ornamental que forman flores, árboles ornamentales y arbustos, cubiertas de suelo ornamentales, y céspedes ornamentales. Las plantas dicotiledóneas prefer das incluyen, pero no se limitan a, cañóla, algodón, patata, quinua, amaranto, trigo sarraceno, cártamo, frijol de soya, remolacha azucarera, y girasol, más preferiblemente frijol de soya, cañóla, y algodón. En una moda idad particularmente preferida, la planta transgénica es una planta monocotiledónea transgénica, más preferiblemente una planta de cosecha de monocotiledónea transgénica, tales como, pero no limitadas a, trigo, avena, cebada, maíz, centeno, triticale, arroz, céspedes ornamentales y de forraje, sorgo, mijo, y caña de azúcar, más preferiblemente maíz, trigo, y arroz. Por "gen exógeno" se entiende cualquier gen que se presenta fuera del contexto en el cual se presenta de manera normal en la naturaleza. Por lo tanto, un gen exógeno puede ser un gen no nativo a e introducido como un tra isgén dentro de la planta transgénica de la invención, o puede ser un gen nativo a la planta transgénica de la invención pero localizado en un contexto diferente a aquel en el cual se presenta de manera normal en la naturaleza (por ejemplo, un gen nativo operativamente asociado a un promotor no nativo e introducido como un transgén dentro de la planta). El término "operativamente asociado" cuando se utiliza en referencia a la relación entre las secuencias de ácido nucleico y/o las secuencias de amino ácidos se refiere a la asociación de las secuencias de tal manera que llevan a cabo su función pretendida. Por ejemplo, la asociación operativa de una secuencia promotora a una secuencia nucleotídica de interés refiere a la asociación de la secuencia promotora y la secuencia nucleotídica de interés de tal manera que la secuencia promotora es capaz de dirigir la transcripción de la secuencia nucleotídica de interés y/o la síntesis de un polipéptido codificado por la secuencia nucleotídica de interés. El término también se refiereí a la asociación de las secuencias de aminoácidos de tal manera que se produce esa proteína funcional. El gen exógeno que codifica un polipéptido puede ser cualquier gen exógeno de interés que se transcribe hacia un transcrito de ARN el cual es al nenos en parte traducible hacia un polipéptido, preferiblemente un gen que se transcribe hacia un ARN mensajero (ARNm) que contiene o se puede elaborar para que contenga una región no traducida hacia 3' (UTR 3') en la cual se puede colocar la secuencia desestabilizante. El gen exógeno puede incluir una secuencia que se presenta de manera natural o un derivado u homó ogo de dicha secuencia que se presenta de manera natural. Los derivados u homólogos de las secuencias que se presentan de manera natura l pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones de secuencia, mutaciones puntuales particulares o múltiples, alteraciones en un sitio particular de la enzima de restricción, adición de elementos funcionales, u otros medios de modificación molecular de una secuencia que se presenta de maneía natural. Las técnicas para la obtención de dichos derivados se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las metodologías descritas en Sambrook y Russell, 2001 , incorporado como referencia en la presente nvención. Los ejemplos no limitantes de genes exógenos adecuados incluyen genes que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzirras que participan en la biosíntesis o el catabolismo de las moléculas de interés (tales como aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros carbohidratos, y polímeros biológicos). De manera específica, los ejemp los no limitantes de genes exógenos adecuados incluyen genes que codifican la antranilato sintasa; genes que participan en las rutas de biosíntesis de múltiples pasos, en donde pueden ser de interés para regular el nivel de uno o más intermediarios, tales como los genes que codifican las enzimas para la biosíntesis de polihidroxíalcanoato (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,750,848, incorporada específicamente en la presente invención como referencia); genes que codifican las proteínas para el control del ciclo celular, tales como proteínas con actividad semejante al inhibidor de la cinasa dependiente de ciclina (CDK) (véase, por ejemplo, los genes descritos en WO 05007829, incorporada específicamente en la presente invención como referencia); genes que codifican proteínas que, cuando se expresan en las plantas transgénicas, hacen a las plantas transgénicas resiste¡ntes a las plagas o patógenos (véase, por ejemplo, genes para la colest3rol oxidasa como se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,763,245, incorporada específicamente en la presente invención como referencia); genes que codifican proteínas que codifican un rasgo que se puede seleccionar (tal como asistencia al antibiótico, específicamente si se desea expresar dicho gen a un nivel adecuado para permitir la selección de una célula que porta el gen, pero no tan alto para permitir que las células adyacentes que no portan el gen "escapen" o sobrevivan a la selección); genes en donde la expresión preferiblemente es transitoria (por ejemplo, genes implicados en la resistencia a plaga o a patógeno, especialmente cuando la expresión se induce por plaga o por patógeno); y genes los cuales puede n inducir o restablecer la fertilidad (véase, por ejemplo, los genes barsta r/barnase descritos en la Patente de E.U.A. No. 6,759,575, incorporada específicamente en la presente invención como referencia). La secuencia desestabilizante puede incluir cualquier secuencia que imparte inestabilidad al ARN transcrito del gen exógeno, por ejemplo al disminuir la estabilidad o la vida media de un ARNm transcrito a partir del gen endógeno. En una modalidad preferida, la secuencia desestabilizante es al meno's una seleccionada a partir de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA y una combinación de motivos ATTTA y ATTTAA. Los motivos ATTTA o ATTTAA DNA se transcriben hacia los motivos de ARN AUUUA o AUUUAA. Más prefer blemente, la presencia de la secuencia desestabilizante resulta en la expresión del gen exógeno a un nivel más bajo en la planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante. Se puede utilizar más de una secuencia desestabilízante, o múltiples copias de una o más secuencias desestabilizantes. En los ejemplos no limitantes, una planta transgénica de la invención puede tener en su genoma ADN que incluye un gen exógeno que tiene en su región no traducida hacia 3' al menos un terminador SAUR, o múltiples copias de los elementos DST, o una secuencias que contienen repetidos de ATTTAA. Preferiblemente, al menos 3 copias de los motivos ATTTA o ATTTAA se encuentran en la secuencia repetitiva. Las modalidades no limitantes incluyen secuencias desestabilizantes que incluyen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, e incluso más de 15 copias de los motivos ATTTA o ATTTAA en un repetido supenuesto. Por lo tanto, los ejemplos no limitantes incluyen 3x ATTTA (Al "ATTTATTTA (SEQ ID NO: 27)), 5X ATTTA (Al "ATTTATTTATTTATTTA (SEQ ID NO: 28)), 11x ATTTAA (Al "AATTTAATTT TTTAATTTAATTT TTT TTT TTT TTTAATp AA (S EQ TD NO: 29)), y una combinación 7x ATTTA/ATTTAA (por ejemplo, ATTTATTTATTTAATTTAATTTAATTTATTTAA (SEQ ID NO: 30) y combinaciones similares). Estos ejemplos se proveen para ilustrar la naturaleza superpuesta de los repetidos y no se consideran limitantes de ninguna forma. Las secuencias homologas se pueden identificar, por ejemplo, mediante el uso de las herramientas de comparación conocidas por aquellos expertos en la técnica, tales como, pero no limitadas a, BLAST (Altschul et al. (1997), el cual se incorpora como referencia en la presente invención). Por lo tanto, las secuencias de ADN genómico a partir de especies vegetales de interés, especialmente una planta de cosecha de interés, se pueden investigar para nomólogos de SAUR, homólogos de los terminadores SAUR hacia 3' conocidos, o homólogos de los elementos DST conocidos. Un experto en la técnica se podría dar cuenta de que se podría diseñar una variedad de inicióles utilizando las secuencias SAUR conocidas, las secuencias del termínador SAUR hacia 3' conocidas, o los elementos DST conocidos (por ejemplo, las secuencias provistas en Newman et al. (1993), McCIure et al. (1989), y Yamamoto et al. (1992), y Gil et al. (1994), y las secuencias provistas en la presente invención en SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 10) para amplificar y aislar el ADN para las secuenciación y el ensayo de la capacidad para desestabilizar los transcritos de ARNm utilizando métodos adecuados tales como aquellos provistos en esta descripción, proveyendo así secuencias adicionales SAUR novedosas, secuencias terminadoras SAUR hacia 3' novedosas, o elementos DST novedosos útiles en la presente invención. Además, las modificaciones para las secuencias desestabilizantes conocidas o novedosas se pueden realizar por un experto en la técnica. Las modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a, deleciones de secuencia, mutaciones puntuales particulares o múltiples, alteraciones en un sitio particular de la enzima de restricción, adición de elementos funcionales, repetición de elementos, u otros medios de modificación molecular los cuales pueden dejar sin cambio, o incluso mejorar, la capacidad de la secuencia desestabilizante para desestabilizar los transcritos de ARNm. Las técnicas para la obtención de dichos derivados se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, las metodologías descritas en Sambrook y Russell, 2001 , incorporado como referencia en la presente invención. Las técnicas para mutagenizar o crear deleciones en un segmento de ADN se conocen bien por aquellos expertos en la técnica y se describen en detalle, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. Número 6,583,338, la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad. En una modalidad no limitante de la invención, la planta transc énica es una planta de cosecha dicotiledónea (por ejemplo, frijol de soya) o es una planta de cosecha monocotiledónea (por ejemplo, maíz) en donde se desea proveer un contenido modificado de aminoácidos en la planta de co secha transgénica o semilla de planta de cosecha transgénica, y el gen exógeno es un gen para biosíntesis de un aminoácido (por ejemplo, lisina, triptofano, o metionina); una secuencia desestabilizante o secuencias se puede n utilizar para expresar el gen de la biosíntesis del aminoácido a un nivel más bajo en la planta de cosecha transgénica o semilla en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante, proveyendo así diversas opciones para la composición de aminoácidos de la planta de cosecha transgénica o semilla. La presente invención también provee una planta transgénica que t eñe en su genoma ADN que incluye un promotor no constitutivo operativamente asociado a un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilízante, por medio de la cual el polipéptido se expresa a un nivel más bajo en la planta transcénica en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante.

La planta transgénica se puede derivar a partir de cualquier planta de interés monocotiledónea o dicotiledónea; en algunas modalidades preferidas, la planta transgénica es una planta de cosecha. Anteriormente se proveyó una descripción de las plantas adecuadas para la invención bajo el encabezado "plantas transgénicas I". Los promotores no constitutivos adecuados para uso con las plantéis transgénicas de la invención incluyen promotores especialmente espec íficos, promotores temporalmente específicos, y promotores inducibles. Los promotores especialmente específicos pueden incluir promotores espec íficos de organelo, de célula, o de órgano (por ejemplo, un promotor específico de plastidio, un promotor específico de raíz, o un promotor específico de semilla para la supresión de la expresión del ARN blanco en plasticlios, raíces, o semillas, respectivamente). Los promotores temporalmente específicos pueden incluir promotores que tienden a promover la expresión durante ciertas etapas del desarrollo en un ciclo de crecimiento de la planta, o durante diferentes momentos del día o la noche, o en diferentes temperadas en un año. Los promotores inducibles incluyen promotores inducidos por químicos o mediante condiciones ambientales tales como, pero no limitadas a, estrés biótíco o abiótico (por ejemplo, déficit de agua o sequía, calor, frío, niveles de nutriente o de sal, niveles elevados o bajos de luz, o infección por plagas o patógenos). Un promotor específico de la expresión también puede incluir promotores que son generalmente constitutivamente expresados pero a grados variables o "fuerzas" de expresión, que incluye promotores comúnmente considerados como "promotores fuertes" o como "promotores débiles". Muchos promotores específicos de la expresión funcionales en plantáis y útiles en el método de la invención se conocen en la técnica. Por ejemplo, la Patente de E.U.A. 5,837,848, Patente de E.U.A. 6,437,217, y Patente de E.U.A. 6,426,446 describen promotores específicos de la raíz; la Patente de E.U.A. 6,433,252 describe un promotor de L3 oleosina del maíz; la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2004/0216189 describe un promotor para un gen nuclear vegetal que codifica una aldolasa localizada en plastidio; la Patente de E.U.A. 6,084,089 describe promotores inducibles por frío; la Patente de E.U.A. 6,140,078 describe promotores inducibles por sal; la Patente de E.U.A. 6,294,714 describe promotores inducibles por luz; la Patente de E.U.A. 6,252,138 describe promotores inducibles por patógeno; y la Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2004/0123347 describe promotores inducibles por déficit de agua. Cada una de las patentes y publicaciones que describen promotores y su uso, especialmente en construcciones de ADN recombinante funcionales en plantas, se incorporan específicamente en la presente invención como referencias. Las secuencias de ácido nucleico que son promotores que no se presentan de manera natural o elementos promotores u homólogos de los mismos pero que pueden regular la expresión de un gen también pueden ser útiles para uso con las plantas transgénicas de la invención. Los ejemplos de dichas secuencias reguladoras "independientes del gen" incluyen secuencias de ARN que se presentan de manera natural o secuencias de ARN artificialmente diseñadas que incluyen una región de unión al ligando o aptámero y una región reguladora (la cual puede actuar en cis). Véase, por ejemp lo, Isaacs et al. (2004), Bayer y Smolke (2005), Mandal y Breaker (2004), Davidson y Ellington (2005), Winkler et al. (2002), Sudarsan et al. (2003), y Mandal y Breaker (2004), cada uno de los cuales se incorpora espec íficamente como referencia en la presente invención. Dichos "riboreguladores" se podrían seleccionar o diseñar para especificidad espacial o tem Doral específica, por ejemplo, para regular la traducción del gen exógeno solamente en la presencia (o ausencia) de una concentración dada del ligando apropiado. El gen exógeno que codifica un polipéptido puede ser cualquier gen exógeno de interés que se transcribe hacia un transcrito de ARN el cual es al menos en parte traducible hacia un polipéptido, preferiblemente un gen que se transcribe hacia un ARN mensajero (ARNm) que contiene o se puede elabo 'ar para que contenga una región no traducida hacia 3' (UTR 3') en la cual se puede colocar la secuencia desestabilizante. Anteriormente se descr bieron los ejemplos de genes exógenos adecuados bajo el encabezado 'plantas transgénicas I". La secuencia desestabilizante puede incluir cualquier secue ncia que imparte inestabilidad al ARN transcrito del gen exógeno, por ejemplo al disminuir la estabilidad o la vida media de un ARNm transcrito a partir del gen endógeno. En una modalidad preferida, la secuencia deseátabilizante es al menos una seleccionada a partir de un terminador El gen exógeno que codifica un polipéptido puede ser cualquier gen exc-geno de interés que se transcribe hacía un transcrito de ARN el cual es al menos en parte traducible hacia un polipéptído, preferiblemente un gen que se transcribe hacía un ARN mensajero (ARNm) que contiene o se puede elaborar para que contenga una región no traducida hacia 3' (UTR 3") en la cual se puede colocar la secuencia desestabilizante. Los ejemplos de genes exógepos adecuados se describieron anteriormente bajo el encabezado "plantas transgénicas I". La secuencia desestabilizante puede incluir cualquier secuencia que imparte inestabilidad al ARN transcrito del gen exógeno, por i ejemplj) al disminuir la estabilidad o la vida media de un ARNm transcrito a i partir del gen endógeno. En una modalidad preferida, la secuencia desestiabilizante es al menos una seleccionada a partir de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA y una combir ación de motivos ATTTA y ATTTAA, como también se describieron anteriormente bajo el encabezado "plantas transgénicas I".

II. Repetidos ATTTAA En otro aspecto, la presente invención provee una planta transgénica que tiene en su genoma ADN que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante que incluye la superposición de los repetidos ATTTAA, por medio de la cual dicho polipéptido se expresa a un nivel inferior AA; SE;Q ID NO: 29). En otras modalidades, la superposición de los repetidos ATTT AA se puede encontrar en combinación con los repetidos ATTTA, tal como en las combinaciones anteriormente descritas bajo el encabezado "plantas transgénicas I".

III. Plantas transqénicas con expresión moderada de la antran lato sintasa La presente invención provee adicionalmente una planta transgénica que tiene en su genoma ADN que incluye un gen que codifica antranilato sintasa y que tiene en su región no traducida hacía 3' una secuencia desestabilizante, por medio de la cual la antranilato sintasa se expresa a un nivel más bajo en la planta transgéníca en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante. La planta transgénica se puede derivar a partir de cualesquiera planta**? monocotiledóneas o dicotiledóneas de interés tal como las provistas anteriormente bajo el encabezado "plantas transgénicas I". En algunas modalidades preferidas, la planta transgénica puede ser una planta de maíz, tales como plantas de cosecha en donde se desea incrementar los niveles de triptofano en la planta total o en tejidos vegetales específicos o células. Los ejemplos no limitantes incluyen modalidades en donde la planta transgénica es frijo de soya o maíz. El gene que codifica la antranilato sintasa puede ser cualquier gen que se presenta de manera natural para la secuencia de antranilato, u homólogos de estos genes, tal como se puede identificar a partir de las bases de datos de secuencias medíante el uso de las herramientas de comparación conoc das por aquellos expertos en la técnica, tales como, pero no limitadas a, BLAST (Altschul et al. (1997), el cual se incorpora como referencia en la presente invención). El gene que codifica la antranilato sintasa puede incluir una secuencia derivada basada en una antranilato síntasa que se presenta de manera natural pero con una o más modificaciones tales como deleciones de secuencia, mutaciones puntuales particulares o múltiples, alteraciones en un sitio particular de la enzima de restricción, adición de elementos funcionales, repetición de elementos, u otros medios de modificación molecular. Dichas modificaciones se pueden realizar para mejorar o alterar las propiedades de la antranilato sintasa en la planta transgénica. Un ejemplo no limitante de la modificación incluye la optimización del codón de una antranilato síntasa procarionte para la expresión en una planta transgénica. Preferiblemente el gen para la antranílato sintasa contiene en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante, la cual puede incluir cualquier secuencia que imparte inestabilidad al gene para ARN transe "ito de la antranilato sintasa, por ejemplo al disminuir la estabilidad o la vida media de un ARNm transcrito a partir del gen de la antranilato sintasa. En una modalidad preferida, la secuencia desestabilizante es al menos una seleccionada a partir de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motive ATTTA, un motivo ATTTAA y una combinación de motivos ATTTA y ATTTAA, como también se describieron anteriormente bajo el encabezado Diversos aspectos de la presente invención se dirigen a las plantas transgénicas como se describe en los párrafos precedentes. La presente invención contempla y reclama las plantas transgénicas (en muchas modalidades plantas de cosecha transgénica en particular), tanto directamente regeneradas a partir de células que han sido transformadas con ADN transgénico que incluye un gen exógeno que tiene en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante, así como la progenie de dichas plantas transgénicas, por ejemplo, progenie endogámica y progenie híbrida de plantas transformadas. La preparación de construcciones de ácido nucleico para la transformación de células vegetales y la producción de la planta transgénica hacen uso de las técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las metodologías descritas en Maliga et al, 1995, y Sambrook y Russell, 2001 , los cuales se incorporan específicamente como referencia en la presente invención. Un experto en la técnica podría estar familiarizado con las técnicas para la transformación de las células vegetales para proveer una planta transgenica de la invención. Véase, por ejemplo, métodos de bombardeo por sobre medio y en un ambiente controlado. La práctica de los métodos de transformación y materiales para la elaboración de las plantas transgénicas de esta invención, por ejemplo, diversos medios y células blanco recipientes, transformación de embriones inmaduros, y regeneración subsecuente de plantas transgénicas fértiles, se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,194,636 y 6,232,526, las cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Después de la administración del ADN transgénico a las células vegetales recipientes, las células transformadas se identifican generalmente para oultivo adicional y regeneración vegetal. Para mejorar la capacidad para identif car a los transformantes, uno puede emplear un gen marcador que se puede seleccionar o explorar, en donde la población de las células potencialmente transformadas se puede ensayar mediante la exposición de las cé ulas a un agente o agentes de selección o que se pueden explorar para el raugo del gen marcador deseado. Los ejemplos no limitantes de marcadores que se pueden explorar incluyen un gen que expresa una proteína coloreada o fluorescente tal como una luciferasa o proteína fluorescente verde (GFP), o un gen que expresa un gen de la beta-glucuronidasa o uidA (GUS) para las cuales se conocen diversos sustratos cromcgénicos. Los ejemplos no limitantes de marcadores de selección incluyan aquellos que confieren resistencia a los antibióticos tales como canamicina y paromomicina (nptll), higromícina B (aph IV) y gentamícina (aac3 y aacC4) o resistencia a herbicidas tal como glufosinato (bar o pat) y glifosato (aroA o EPSPS); los ejemplos particularmente útiles de dichos marcadores de selección se ¡lustran en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,550,318, 5,633,435, 5,780 708, y 6,118,047, todas las cuales se incorporan específicamente como referencia en la presente invención. Las plantas transgénicas de la presente invención se pueden modificar adicionalmente o hibridar para proveer derivados de las plantas transe énicas que tienen rasgos apilados, tales como rasgos agronómicamente deseados adicionales, las técnicas para lo cual se conocen por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0106096 y 2002/0112260, y Patentes de E.U.A. 5,034,322, 5,776 760, 6,107,549, y 6,376,754, todas las cuales se incorporan específicamente en la presente invención como referencias. Los ejemplos no limitantes de dichos rasgos incluyen, pero no se limitan a, resistencia o tolera ncia al estrés abiótico tal como sequía o estrés por temperatura, y resistencia a las plagas o patógenos como se ilustra por las Patentes de E.U.A. 5,250,515, 5,880,275, 6,506,599, y 5,986,175, y publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0150017 A1 , todas las cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Las semillas de plantas transe énicas se pueden cosechar a partir de plantas transgénicas fértiles y se puede n utilizar para crecer generaciones de progenie de las plantas transformadas de esta invención que incluyen líneas de plantas híbridas útiles, por ejemplo, para la exploración de plantas que tienen un rasgo agronómico mejorado. Además de la transformación directa de una planta con un ADN recorr binante, las plantas transgénicas se pueden preparar mediante la cruza de una primera planta que tiene un ADN recombinante con una segunda planta que carece del ADN. Por ejemplo, el ADN recombinante se puede introducir dentro de una primera línea vegetal que es capaz de llevar a cabo transformación para producir una planta transgénica la cual se puede cruzar con una segunda línea vegetal para introducir el ADN recombinante dentro de la segunda línea vegetal. Una planta transgénica con ADN recombinante que proveí*, un rasgo agronómico mejorado, por ejemplo, rendimiento mejorado, se puede cruzar con una línea vegetal transgénica que tiene otro ADN recombinante que confiere incluso otro rasgo, por ejemplo, resistencia al herbicida o resistencia a la plaga, para producir plantas progenie que tienen ADN recombinante que confiere ambos rasgos. Típicamente, en dicha cruza para combinar los rasgos la planta transgénica que dona el rasgo adicional es una línea macho y la planta transgéníca que porta los rasgos base es la línea hembra. La progenie de esta cruza se segregará de tal manera que algunas de las plantas portarán el ADN para ambos rasgos parentales y algunos portarán el ADN para un rasgo parental; dichas plantas se pueden identificar por los marcadores asociados con el ADN recombinante parental. Las plantas progenie que portan el ADN para ambos rasgos parentales se pueden retrocruzar en la línea parental hembra múltiples veces, por ejemplo, usualmente de 6 a 8 generaciones, para producir una planta progenie con sustancialmente el mismo genotipo que una línea parental transgénica original pero para el ADN recombinante de la otra línea parental transgénica.

V. Regulación post-transcripcional de la expresión del gen mediante el control de la estabilidad del mensajero La presente invención también provee un método para disminuir post-transcripcionalmente la estabilidad del mensajero de un gen de interés en una p anta de cosecha utilizada para alimento o forraje, que incluye añadir una secuencia desestabilizante a la región no traducida hacía 3' del gen de interés en la planta de cosecha utilizada para alimento o forraje, por medio de la cual la estabilidad del mensajero del gen de interés disminuye post-transcripcionalmente. Preferiblemente, la disminución post-transcripcional de la estabilidad del mensajero resulta en la expresión del gen a un nivel más bajo que cuando la secuencia desestabílizante está ausente. incluyen genes que participan en la biosíntesis de las moléculas de interés, tales como aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, y azúcares y otros carbohidratos. En la modalidad de la invención, el gen de interés está operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgénico. La secuencia desestabilizante puede incluir cualquier secuencia que imparte inestabilidad al ARN transcrito del gen de interés, como se descr bió anteriormente bajo el encabezado "plantas transgénicas I". En una moda idad preferida, la secuencia desestabilizante es al menos una seleccionada a partir de un terminador SAUR hacía 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA, y una combinación de motivos ATTTA y A l I I?A. Los motivos de ADN ATTTA o ATTTAA se transcribieron hacia los motivos AUUUA o AUUUAA ARN. Más preferiblemente, la presencia de la secue ncia desestabilizante resulta en la expresión del gen de interés a un nivel más bajo en la planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de secuencia desestabilizante. Se puede utilizar más de una secue ncia desestabilizante, o múltiples copias de una o más secuencias deseetabilizantes. En los ejemplos no limitantes, una planta transgénica de la invención puede tener en su genoma ADN que incluye un gene de interés que tiene en su región no traducida hacia 3' al menos un terminador SAUR, o múltip les copias de los elementos DST, o cualquier combinación de termiriadores SAUR, elementos DST, o motivos AUUUA o AUUUAA.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se pueden considerar para que constituyan modos prefer dos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica debe apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden realizar muchos cambios en las modalidades específicas los cuales se describen y aún así se obtiene un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las secuencias de ácidos nucleicos se proporcionan en la dirección 5' a 3' a menos que se establezca de otra manera. Las construcciones y vectores descritos en la presente invención se proveen como ejemp os ilustrativos y no se deben considerar como limitantes de ninguna forma EJEMPLO 1 Clonación de ios terminadores SAUR a partñr de Arabidopsis Este ejemplo ¡lustra las secuencias desestabilizantes útiles en la preserjite invención. Más específicamente, este ejemplo describe la clonación de los terminadores SAUR a partir de Arabidopsis. El terminador del gen SAUR-AC1 de Arabidopsis thaliana (Gil et al., 1994), el cual se incorpora como referencia en su totalidad en la presente invención) se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de Arabidopsis (cv. Columbia) utilizando los iniciadores SAURforl , ACCAGCCTTTGTTTCAACAA (SEQ ID NO: 11 ), y SAURrevI , CATAATCAATAAGAAAATAGATGTAC (SEQ ID NO: 12) diseñado de conformidad con la secuencia publicada del gen y abastecido por Invitrogen (Carlsbad, CA). La PCR se llevó a cabo con el sistema de PCR Expand High Fidelity (número de catálogo 1 732 641 , Roche Molecular Biochemicals, Indian apolis, IN). Los componentes primarios de la PCR y las condiciones son como se proporcionan en el cuadro 1.

CUADRO 1 Después de que la reacción se inició mediante la desnaturalización de la muestra a 94 grados Celsius por 1 minuto, la mezcla de reacción se incubó por 20 ciclos que consisten de 94 grados Celsius por 15 segundos, 68 grados Celsius por 30 segundos (disminuyendo 1 grado Celsius por cic lo) y 72 grados Celsius por 3 minutos. La mezcla de reacción se incubó entonces por 11 ciclos que consisten de 94 grados Celsius por 15 segundos, 48 grados Celsius por 30 segundos, 72 grados Celsius por 3 minutos. El proceso se concluyó con un paso de 72 grados Celsius por 10 minutos y la mezcla de reacción se mantuvo a 4 grados Celsius hasta el siguiente experimento. Los productos a partir de la reacción primaria de PCR se purificaron utilizando el equipo de purificación QIAquick PCR (número de catálogo 28104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) y se eluyeron en 30 microlitros de H20. Se llevó a cada una segunda reacción utilizando iniciadores de PCR anidados utilizando 5 microlitros del producto de PCR purificado a partir de la reacción primaria como molde y los iniciadores SAURfor2EcoRI, AAAGMTTCAACTAGTAGGATCCAGTACTATACTAC CATTTCC (SEQ ID NO: 13), y SAURrev2Not, AAAGCGGCCGCCCGGGACCGGACTAACCGCAGTTCA (SEQ ID NO: 14) diseñados de conformidad con la secuencia publicada del gen y abastecidos por Invitrogen (Carlsbad, CA). La PCR se llevó a cabo con el sistema de PCR Expand High Fidelity (número de catálogo 1 732 641 , Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Los componentes de la PCR anidada y las condiciones fueron como se proporcionaron en el cuadro 1 ; la reacción de amplificación se llevó a cabo como se describió anteriormente. El producto del producto de la PCR anidada se limpió utilizando el equipo de purificación QIAquick PCR (número de catálogo 28104, QIAGEN Inc., Valencia, California) y se eluyó en 30 microlitros de ddH20. Una alícuota de 5 microlitros del ADN eluido se digirió con Notl y EcoRl. El producto digerido se separó en un gel de agarosa. La banda de tamaño esperado (-750 pb) se: escindió y se purificó utilizando el equipo de extracción QIAquick Gel (núme ro de catálogo 28704, QIAGEN Inc., Valencia, California). Los fragmentos SAUR putativos se clonaron como terminadores hacia 3' dentro de un plásmido PUC que contenía Lea9 como el promotor y GUS como la secuencia codificante. La construcción resultante (pMON63688) se ilustra en la figura 1. Se secuenciaron múltiples clonas de las construcciones pMON63688 y se identificaron diversas variantes de los terminadores SAUR basándose en la comparación de secuencia (paquete de software Dnastar, DNASTAR, Inc., Madison, WI53715; www.dnastar.com). En un experimento de clonación separado, el terminador NOS se clonó dentro del mismo vector de estructura base con el promotor Lea9 y la secuencia codificante GUS para proveer pMON63691 (figura 1 ), el cual se utilizó como un control en los ensayos transitorios comparando los efectos del terminador SAUR con aquel os del terminador NOS.

Otra construcción, pMON13773 (figura 1 ), se realizó para contener el promotor 7Salpha' que dirige a GUS con el terminador NOS. La variante 1 de SAUR se clonó en pMON13773 para reemplazar el terminador NOS. La construcción novedosa, pMON63692, contenía el promotor 7Salpha' que dirige a GUS con el terminador NOS (figura 1 ).

EJEMPLO 2 Caracterización de los terminadores SAUR en un sistema de transformación transitoria del frijol de soya Este ejemplo ilustra las secuencias desestabilizantes útiles en la preseijite invención y su uso en una planta transgénica modelo. Más específicamente, este ejemplo describe la caracterización de los terminadores SAUR en un sistema de transformación transitoria del frijol de soya. Las semillas a partir de una planta de cosecha dicotiledónea, frijol de soya (Asgrow A3244), se cosecharon 25-28 días después de la floración y se trataron osmóticamente durante toda la noche a 25 grados Celsius en la oscuridad en medio GAMBORG (número de catálogo G5893, Sigma Company, St. Louis, MO) suplementado con 50 milimolar de glutamina, 111 milimolar de maltosa, 125 milimolar de rafinosa, 125 milimolar de manitol y 3 gramos/litro de agua purificada, pH 5.6. Los cotiledones resultantes se separaron y se bombardearon con ADN purificado superenrollado de pMON63691 (terminador NOS) o pMON63688 (terminadores SAUR) utilizando la tecnología de pistola de partículas (Malíga et al, 1995). Como un control interno para normalizar la variación experimental, se incluyó una construcción pMON19425 separada de luciferasa dirigida por e35S (figura 1 ) a una concentración de 1 microgramo/microlitro y en una relación molar 1 :1 con cada una de las construcciones de prueba. Cada placa tuvo seis cotiledones y 5 a 6 replicados por placa se bombardearon por construcción. Los tejidos bombardeados se incubaron por 48 horas a 25 grados Celsius. Las proteínas se extrajeron a partir de seis cotiledones de frijol de soya utilizando 1 mililitro de regulador de pH para extracción que contenía OJ molar de fosfato de potasio (pH 7.8), 10 milimolar de DTT, 1 milimolar de EDTA, 5% de glicerol, e inhibidor de la proteinasa (1 tableta/50 mililitros, número de catálogo 1 697 498, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana). Se utilizó una alícuota de 100 microlitros del extracto de la proteína para un ensayo de luciferasa seguido por un procedimiento de "Steady-Glo" por P Omega (número de catálogo E2510, Promega Corporation Madison, Wl). El regulador de pH para el ensayo GUS se realizó mediante la adición de 8.8 miligramos de MUG (4-metilumbeliferil beta-D-glucurónido, número de catálogo M9130, Sigma, St. Louís, MO) a 10 mililitros del regulador de pH para extracción. Una alícuota de 50 microlitros del extracto de proteína se mezcló con 200 microlitros del regulador de pH para ensayo GUS. El ensayo GUS se llevó a cabo en un lector de placas espectrofotométrico Spectramax Gemini utilizando el Basic Kinetic Protocol de Softmax Pro software con excitación a 355 nanómetros, emisión a 460 nanómetros, y límite a 455 nanómetros (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las lecturas de fluorescencia se registraron durante un periodo de 2 horas con intervalos de 7 minutos y se obtuvo una Vmax de GUS para cada muestra. Cada muestra se ensayó dos veces y el valor promedio se utilizó para el análisis de datos. La actividad GUS se normalizó de conformidad con cada actividad luciferasa de la muestra y la fuerza relativa del promotor se expresó mediante el establecimiento del vector contrcl pMON63691 (figura 1 ) arbitrariamente a 100%. Alternativamente, las proteínas GUS purificadas a partir de una planta transgénica (número de catálogo G8162, Sigma, St. Louis, MO) a concentraciones conocidas se incluyeron en el ensayo para el cálculo de la cantidad absoluta de GUS en las muestras. Los resultados (figura 2) indican que todas las variantes de los terminadores SAUR disminuyeron significativamente la expresión de GUS cuando se compararon con el terminador NOS, un terminador benchmark para la expresión del gen en plantas transgénicas. Otro ensayo transitorio se realizó de manera similar para mostrar que los terminadores SAUR disminuyen efectivamente la expresión del gen cuandp se utiliza 7Salpha' como un promotor para dirigir la expresión de GUS (figura 3).

EJEMPLO 3 Clonación de múltiples copias de los elementos DST dentro de vectores con diversos promotores Este ejemplo ilustra adicionalmente las secuencias desestabilizantes útiles en la presente invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgénico. Más específicamente, este ejemplo descr be la clonación de múltiples copias de los elementos DST dentro de vectores con diversos promotores. El elemento DST en los genes SAUR se identificó como un elemento clave responsable de la desestabilización del ARNm. Para evaluar si el elemento DST trabaja de manera efectiva en conjunción con el cassette de expresión heteróloga en el frijol de soya, dos fragmentos olígonucleótidos de cader a sencilla, 2xDSTfor, AAAGiAATTCGCTAGCAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACATTTTGTA TA ATAAGGAGACTGACATAG (SEQ ID NO: 15) NO: 15), y 2xDSTrev, AAAGGATCCGATGGCCGCACTAGTTATTATACAAAATGTCTCCTCCAATCT AT GTCAGTCTCCTTATTAT (SEQ ID NO: 16) se diseñaron para el ensamblaje de un fragmento de ADN de cadena doble que contenía dos copias de DST, y se abastece por Invitrogen (Carlsbad, CA). La PCR para el ensamblaje del fragmento se llevó a cabo con el sistema para PCR Expand High Fidelity (número de catálogo 1 732 641 , Rochen Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Debido a que los dos fragmentos de ADN de cadena sencilla tienen regiones superpuestas que son comp mentarias entre sí, el ADN molde no fue necesario. La PCR para los componentes para ensamblaje del fragmento y las condiciones fueron como se proporcionaron en el cuadro 1 ; la reacción se llevó a cabo como se descripió en el ejemplo 1. Una alícuota de 3 microlitros de la reacción de PCR se digirió con las enzimas EcoRI y BamHI y se clonó dentro de pMON58101 (figura 1 ) que se linearizó en los sitios entre el gen codificante de GUS y el terminador NOS. Las clonas que contenían 2XDST se identificaron mediante secuenciación y se nombraron pMON63687 (figura 1 ). Se esperaba que la comparación entre pMON58101 y pMON63687 demostrara el efecto de 2XDST sobre la expresión del gen. Se realizaron dos vectores adicionales mediante el reemplazo del promotor USP en pMON63687 con un promotor Lea9 j> un promotor 7Salpha* para generar pMON63697 y pMON63698 (figura 1). pMON63697 se comparó con pMON63691 , un vector control contiene el promctor 7Salpha' que dirige a GUS con el terminador NOS. pMON63698 se comparó con pMON 13773, otro vector control contiene el promotor 7Salpha' que d ¡rige a GUS con el terminador NOS. Las comparaciones utilizaron un ensayo transitorio y se describen en el ejemplo 4. luciferasa "Steady-Glo" y un ensayo de GUS como se describió en el ejemplo 2. La actividad GUS se normalizó de conformidad con cada actividad de luciferasa de la muestra y la fuerza relativa del promotor se expresó mediante el establecimiento del vector control pMON58101 (figura 1 ) arbitrariamente a 100%. Los resultados (figura 4) indicaron que la inclusión de 2XDST disminuyó significativamente la expresión de GUS cuando se comparó con el terminador NOS solo. Se llevaron a cabo otros experimentos para comparar pMON13773 y pMON63698 (figura 5) y para comparar pMON63691 y pMON63697 (figura 6). Los resultados mostraron consistentemente que 2XDST disminuyó efectivamente la expresión del gen en los cotiledones del frijol dé soya. Los datos mostraron colectivamente que 2XDST puede trabajar de mapera efectiva sin importar los promotores utilizados en el experimento.

EJEMPLO 5 Clonación de los vectores Perl que contenían 2XDST, 4XDST o 6XDST Este ejemplo ilustra las secuencias desestabílizantes útiles en la presente invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgénico. Más espec fica mente, este ejemplo describe la clonación de los vectores Perl que contenían 2XDST, 4XDST o 6XDST. Los vectores adicionales se construyeron al seguir los protocolos estándares de clonación molecular (Sambrook y Russell, 2001 , el cual se incorpora en la presente invención como referencia) para evaluar el efecto del número de copias de DST sobre el nivel de la expresión del gen. El vector pMO .42316 (figura 1 ), el vector control, contenía un promotor Perl que dirige la expresión de GUS con un terminador NOS. El promotor Lea9 en pMOÑ63697 se escindió y se reemplazó con el promotor Perl para hacer pMON 78113 el cual tiene 2XDST en combinación con el terminador NOS (figura, 1). Para hacer múltiples copias de DST, se digirió una alícuota de 5 microl tros del producto de PCR a partir del ejemplo 3 con Spel y Nhel. El ADN digerido se separó sobre un gel de agarosa, se extrajo utilizando el equipo de extracción en gel QIAquick (número de catálogo 28704, QIAGEN Inc., Valencia, CA) y se ligó dentro de pMON78113 que fue linearizado con Spel y se trató con fosfatasa alcalina CIP. Las clonas que contenían 4XDST se seleccionaron mediante digestión doble con Spel y Nhel y se denominaron pMON 78116 (figura 1 ). pMON78116 se linearizó de nuevo con Spel, se trató con fosfatasa alcalina CIP y se ligó al fragmento 2XDST anteriormente preparado. Las c onas que contenían 6XDST se seleccionaron mediante digestión doble con Spel y Nhel y se denominaron pMON78117 (figura 1 ).

EJEMPLO 6 Comparación de 2XDST, 4XDST o 6XDST en un sistema transformación transitoria del frijol de soya Este ejemplo ilustra las secuencias desestabilizantes útiles en la presente invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgénico. Más espec Ticamente, este ejemplo describe la comparación de 2XDST, 4XDST y 6XDS J en un sistema de transformación transitoria del frijol de soya. Las semillas a partir de las plantas de frijol de soya (Asgrow A3244) se cosecharon 25-28 días después de la floración y se trataron osmót camente como se describió en el ejemplo 2. Los cotiledones resultantes se seDararon y se bombardearon con ADN purificado superenrollado de pMON42316 (terminador NOS solamente), pMON78113 (2XDST y terminador NOS), pMON78116 (4XDST y terminador NOS) o pMON78117 (6XDST y terminador NOS) utilizando la tecnología de pistola de partículas como se describió en el ejemplo 2. El vector control fue una construcción de luciferasa dirigid a por e35S, pMON19425. Las proteínas se extrajeron y se analizaron con un ensayo de luciferasa "Steady-Glo" y un ensayo de GUS como se describió en el ejemplo 2. La actividad GUS se normalizó de conformidad con cada actividad de luciferasa de la muestra y la fuerza relativa del promotor se expresó mediante el establecimiento del vector control pMON42316 (figura 1 ) arbitrariamente a 100%. Los resultados (figura 7) indicaron que el número de copias de DST correlaciona de manera negativa con el nivel de la expresión del gen.

EJEMPLO 7 Clonación de 1XDST, 3XDST y 5XDST Este ejemplo ilustran las secuencias desestabilizantes útiles en la presente invención. Más específicamente, este ejemplo describe la clonación de 1XDST, 3XDST y 5XDST. Se realizaron vectores adicionales para evaluar adicionalmente CTAGCTAGGAGACTGACATAGATTGGAGGAGACATTTTGTATAATAGGA (SEQ ID NO: 17), y fijación Comp Rev 1XDST, CTAG"CCTATTATACAAAATGTCTCCTCCAATCTATGTCAGTCTCCTAG (SEQ ID NO: 18) se diseñaron para el ensamblaje de un fragmento de ADN de cadena doble que contenía una copia de DST, y se abasteció por Integra'ted DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). La fijación de los dos fragmentos se llevó a cabo en regulador de pH 1XPCR suministrado por el sistema de PCR Expand High Fidelity (número de catálogo 1 732 641 , Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana).

Después de que la reacción se inició mediante la desnaturalización de la muestra a 96 grados Celsius por 10 minutos, la tempeiratura disminuyó a una velocidad de 0.2 grados Celsius/segundo y se pauso por 7 minutos cada uno a 80 grados Celsius, 70 grados Celsius, 60 grados Celsius, 50 grados Celsius, 40 grados Celsius y 30 grados Celsius. El proceso terminó a los 4 grados Celsius y la mezcla se almacenó a los 4 grados Celsius hasta el siguiente experimento. El fragmento fijado 1XDST se purificó entonces utilizando el equipo de purificación QIAquick PCR (número de catálogo 28104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) y se eluyó en 32 microlitros de H20 doblemente destilada. El ADN eluido se trató utilizando un equipo T4 Polynucleotide Kinase (número de catálogo 18004-010, invitrogen, Carlsbad, CA) y se salvó como el inserto 1XDST. Para crear la construcción 1 XDST, pMON78113 se digirió con Spel y Nhel y se trató con fosfatasa alcalina CIP. La estructura base se ligó entonces al inse o 1 XDST para crear pMON78119 (figura 1 ). Para crear las construcciones 3XDST y 5XDST, ?MON78113 y pMON78116 se linearizaron utilizando Spel y se trataron con fosfatasa alcalina CIP. La estructura base se ligó entonces al inserto 1XDST. Las clonas que contenían 3XDST o 5XDST se seleccionaron mediante digestión doble con Spel y Nhel y se denominaron pMON78120 y pMON78121 respectivamente (figura 1 ).

EJEMPLO 8 Com aración de 1XDST, 2XDST, 3XDST5 4XDST y 5XDST en un sistema de transformación transitoria del frijol de soya Este ejemplo ilustra las secuencias desestabilizantes útiles en la presehte invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgéníco. Más específicamente, este ejemplo describe la comparación de 1XDST, 2XDST, 3XDST, 4XDST y 5XDST en un sistema de transformación transitoria del frijol de soya. Las semillas a partir de las plantas de frijol de soya (Asgrow A3244) se cosecharon 25-28 días después de la floración y se trataron osmóticamente como se describió en el ejemplo 2. Los cotiledones resultantes se separaron y se bombardearon con ADN purificado superenrollado de pMON42316 (terminador NOS solamente), pMON78119 (1XDST y terminador NOS), pMON78113 (2XDST y terminador NOS), pMON78120 (3XDST y terminador NOS), pMON78116 (4XDST y terminador NOS) o pMON78121 (5XDST y terminador NOS) utilizando la tecnología de pistola de partículas como se describió en el ejemplo 2. El vector control fue una construcción de luciferasa dirigida por e35S, pMON19425. Las proteínas se extrajeron y se analizaron con un ensayo de luciferasa "Steady-Glo" y un ensayo de GUS como se describió en el ejemplo 2. La actividad GUS se normalizó de conformidad con cada actividad de luciferasa de la muestra y la fuerza relativa del promotor se expresó mediante el establecimiento del vector control pMON42316 (figura 1 ) arbitrariamente a 100%. Los resultados (figura 7) indicaron que el número de copias de DST se correlacionó de manera negativa con el nivel de la expresión del gen. Los resultados también mostraron que 1XDST fue suficiente para disminuir la expresión del gen.

EJEMPLO S fectividad de ¡as secuencias desestabilizantes en una pia cosecha transgénica (frijol de soya) Este ejemplo ilustra las secuencias desestabilizantes útiles en la prese nte invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgéníco. Más específicamente, este ejemplo demuestra la efectividad de las secuencias desestabilizantes en una planta de cosecha transgénica (frijol de soya). Para confirmar adicionalmente la efectividad de DST con un desestabilizante de la secuencia mensajero en frijol de soya transgénico, se construyeron múltiples vectores de transformación por Agrobacterium (figura 8) meidiante los siguientes protocolos estándares de clonación molecular (Sambrook y Russell, 2001 , el cual se incorpora en la presente invención como referencia). Un cassette de expresión que consistía del promotor FMV, el gen codificante CTP2 y CP4 y la UTR hacia 3' E9 se incluyó como un marccidor de selección en todos los vectores. Se utilizó una proteína de fusión de SSU IA CTP de Arabidopsis y antranilato sintasa de Agrobacterium (AS) como un gen codificante para desregular la ruta biosintética del triptofano. El promotor Perl, Lea9, o 7Saipha' se utilizó para dirigir la expresión del gen AS. El terminador NOS se utilizó en combinación con el DST en el extremo 3' del cassette AS. ' Los vectores anteriormente descritos se transfirieron dentro deAgrObacterium tumefaciens, cepa ABl mediante un método de apareamiento triparenteral (Ditta et al. (1980), el cual se incorpora como referencia en la presente invención). Las células bacterianas se prepararon la transformación mediante los métodos bien conocidos en la técnica. Las semillas de frijol de soya comercialmente disponibles (Asgrow A3244) se germinaron durante un período de 10-12 horas. Los explantes de meristemo se escindieron y se colocaron en un recipiente para formación de cicatriz y la cicatriz se formó mediante sonicación. Después de la formación de cicatriz, se añadió el cultivo anteriormente descrito de Agrobacterium y los explantes se incubaron por aproximadamente una hora. Después de la inoculación, el cultivo de Agrobacterium se removió mediante pipetejo y los explantes se colocaron en un co-cultivo por 2-4 días. Los explantes se transfirieron entonces a medio de selección que consistía de Wood/ Plant Médium (WPM) (véase McCown & Lloyd (1981 ), el cual se incorpora como referencia en su totalidad en la presente invención), más 75 micromolar de glifosato y antibióticos para controlar el sobre-crecimiento de Agrobacterium, por 5-7 semanas para permitir la selección y el crecimiento de los brotes transgénicos. Los brotes positivos al fenotipo se cosecharon aprox madamente 5-7 semanas post inoculación y se colocaron dentro de medio selectivo para formación de raíz que comprendía Bean Rooting Media (BRM) con 25 micromolar de glifosato (véase Patente de E.U.A. No. 5,914 451 , la cual se incorpora como referencia en su totalidad en la presente invención) por 2-3 semanas. Los brotes que produjeron raíces se transfirieron al invernadero y se sembraron en suelo. Los brotes que permanecieron sanos durante la selección, pero no produjeron raíces, se transfirieron hacia medio no se ectivo de formación de raíces (por ejemplo, BRM sin glifosato) por dos semanas adicionales. Los tejidos a partir de cualesquiera de los brotes que produjeron raíces sin selección fueron evaluados para la expresión del marcaidor de selección vegetal antes de que fueran transferidos al invernadero y se sembraron en suelo. Las plantas se mantuvieron bajo condiciones estándares de invernadero hasta que se cosechó la semilla R1. I Los niveles de aminoácidos libres se analizaron a partir de cada uno ae los eventos transgénicos utilizando el siguiente procedimiento. Las semillas a partir de cada uno de los eventos transgénicos se fragmentaron individualmente hasta obtener un polvo fino y aproximadamente 50 miligramos del polvo resultante se transfirieron a un tubo de centrífuga pre-pesado. Se registO el peso exacto de la muestra y se añadió 1.0 mililitro de ácido tricloroacético al 5% a cada tubo de la muestra. Las muestras se mezclaron a temperatura ambiente mediante un vórtex y luego se centrifugaron por 15 minutos a 14,000 rpm en un Eppendorf para microcentrífuga (Modelo 5415C, Brinkmann Instrument, Westbury, NY). Una alícuota el sobrenadante se removió y se analizó durante CLAR (Agilent 1100) utilizando el procedure estab ecido en la publicación técnica Agilent "Amíno Acid Analysis Using the Zorbax Eclipse- AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC" (Marzo 17, 2000), el cueil se incorpora como referencia en la presente invención. Debido a que las semillas R1 a partir de cada evento se presentaron una población de semillas segregantes, la semilla con el mayor nivel de triptofano entre las 10 semillas analizadas por evento se eligió como un representante del genotipo homocigoto. También se analizaron 10 semillas no transgénicas seleccionadas al azar de Asgrow A3244. La semilla con el mayor nivel de triptofano a partir de la A3244 no transgénica se eligió como un control negat vo. i EJEMPL0 10 Efectividad del UTR 3' SAUR, 2XDST, 3XDST, 4XDST, 5XDST, y 6XDST en ia transformación transitoria de ia hoja del maíz Este ejemplo ilustra las secuencias desestabilizantes útiles en la presente invención, y su uso con un gen de interés operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transgénico de la invención. Más específicamente, este ejemplo demuestra la efectividad de UTR 3' SAUR, 2XDST, 3XDST, 4XDST, 5XDST, y 6XDST en la transfbrmación transitoria de la hoja del maíz. La expresión del los elementos genét cos que funcionan en las plantas dicotiledóneas no necesariamente también funcionan en las plantas monocotiledóneas. El uso de UTRs 3' SAUR y de los elementos DST para sub-regular la expresión del gen en una planta de cosecha dicotiledónea, frijol de soya, se describió en los ejemplos precedentes de la presente invención. Los mismos elementos fueron evaluados en una monocotiledónea, específicamente en una planta de cosecha monocotiledónea (maíz) para determinar su efectividad en la dismirpución de la expresión del gen. Además de las UTRs 3' SAUR y de los elementos DST, la efectividad de dos arreglos diferentes (motivos AUUUA superpuestos y motivos novedosos AUUUAA superpuestos) de los repetidos superpuestos de un motivo rico en AU se comparó en un sistema de monocotiledónea transitoriamente transformada. En este ejemplo no limitante, se utilizaron 11 copias de los motivos ricos en AU; alternativamente, se podrían utilizar ya sea menoi*. copias (preferiblemente al menos 3) o más copias (más de 1 1 ). Se realizaron cuatro construcciones, dos de las cuales contenían secuencias espadadoras (secuencias al azar de la misma longitud) sirvieron como contrcles. Los oligonucleótidos complementarios sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA) se utilizaron para generar las secuencias control con espaciador y las secuencias de las 11 copias de un motivo rico en AU en los diferentes arreglos. Los iniciadores oligonucleótidos para el arreglo superpuesto AUUUA fueron Estos pares del iniciador oligonucleótido complementario se fijaron juntos en una mezcla de reacción que contenía 1 mícrolitro de cada iniciacor (100 micromolar), 10 microlitros de regulador de pH 10 10X Invitrogen (150 milimolar de NaCI concentración final), y 88 microlítros de agua estéril doblemente destilada. Las condiciones del termociclador fueron 5 minutos a 95 grados Celsius, seguido por 70 ciclos de 95 grados Celsius (disminuyendo 1 grado Celsius por ciclo). Se diseñaron los productos fijados para que tuvieran los sitios Nhel V BamHI en los extremos. Después de la fijación, los productos se diluyeron 1 :50 y se utilizó 1 microlitro para ligarlos en la estructura base de pMON64263, la cual había sido previamente cortada con Nhel y BamHI y purificada en gel. Las construcciones resultantes se denominaron PMON64264, pMON64265, pMON64266, y pMON64267. Se llevaron a cabo los ensayos transitorios en hoja de maíz con las construcciones listadas en el cuadro 2 como se describió en el ejemplo 10. Los datos mostraron que ambos arreglos de 11 copias del motivo rico en AU resultaron una menor expresión (una disminución de aproximadamente 50% en relación con la expresión en la ausencia en un motivo repetido rico en AU) (figura 9).

Los promotores utilizados en las construcciones UTR 3' SAUR y DST ípMON63691 , pMON63688? pMON63697, pMON78121 , pMON78120, pMON78117, pMON781116) que se analizaron en el ensayo transitorio de cotiledón de frijol de soya fueron promotores específicos de la semilla (figura 1). Otros promotores espacialmente específicos, temporalmente específicos, inducibles, o constitutivos también son adecuados. Como las construcciones iniciales para la evaluación en un sistema transitorio de protoplasto de hoja del maíz, los promotores específicos de semilla de estas construcciones fueron reempilazados con el promotor mejorado 35S utilizando técnicas estándares de biología molecular. Las construcciones completadas se muestran en el cuadro 2. Los experimentos de transformación transitoria en protoplasto de hoja de maíz se llevaron a cabo como sigue: los protoplastos se aislaron a partir de hojas de maíz LH200 x H50 ahiladas de 12 días de edad mediante digestión enzimática con 2% de Celulasa RS y 0.3% de Macerozyme R10 (Karlan Research, Santa Rosa, CA). Los protoplastos fueron electroporados (dos veces en 1 milisegundo, 120 volts con 3 pulsos a intervalos de 5 segundos) con 4 picomoles de ADN plasmídico, el cual fue una mezcla igual del ADN experimental y del ADN control interno (luciferasa de luciérnaga, pMON19437). Las electroporaciones se llevaron a cabo por triplicado para cada construcción, y se repitieron en un día diferente (con al menos 24 horas entre los dos días experimentales para minimizar la variación día a día) para un total de seis réplicas. Después de la incubación durante toda la noche, las proteínas se extrajeron mediante la adición de 0.25 volúmenes del regulador de pH para lisis pasiva 5X (Dual-luciferase Repórter Assay System, número de catálogo El 960, Promega, Madison, Wl) a las células transformadas del protoplasto, y 20 microlitros del extracto de proteína se utilizaron para el ensayo de luciferasa siguiendo el protocolo del sistema Dual-luciferase Repórter Assay. La actividad de la luciferasa de luciérnaga (fLUC) sirvió como el con .rol interno. Para la medición de la actividad de GUS, se añadieron 20 microlitros de 1X MUG (número de catálogo M9130, Sigma, St. Louis, MO) a 20 mic rolitros del extracto de proteína y se incubaron a 37 grados Celsius por 0.5 he ras. Después de detener las reacciones mediante la adición de 180 microlitros de 0.2 molar de Na2CO3, se midió la fluorescencia con excitación a 355 néinómetros y emisión a 460 nanómetros utilizando un instrumento Wallac Victor2 (PerkinElmer, Boston, MA). Los resultados (figura 9) demostraron que los elementos DST que resultaron en la expresión del gen a un nivel más bajo en un sistema transitorio en frijol de soya también fueron funcionales en un sistema de planta monocotiledónea. Similar al resultado con la soya, el grado de sub-regulación generalmente correlacionó con el número de copias de DST. I?n este ejemplo particular, más de 3 copias de DST no resultaron en una disminución adicional en los niveles de expresión (figura 9), y el uso de un termin ador SAUR que contiene solamente una copia de DST resultó en la expres ión del gen a un nivel sustancialmente inferior. Se encontró que los elementos DST fueron efectivos para disminuir el nivel de triptofano en frijol de soya transgénico (véase el ejemplo 9). Dos copias (2X) del elemento DST resultaron en una disminución del nivel de triptofano en aproximadamente 30% (figura 10) con relación a los niveles observados en la ausencia de la secuencia DST, con resultados similares observados para dos construcciones "parentales" diferentes (pMON66892 y pMON66891 ). Tanto los datos de la planta transitoriamente transformada como los datos de la planta establemente transformada demostraron que los elementos DST se pueden utilizar para modular la expresión del gen en plantas de cosecha. Todos los materiales y métodos descritos y reclamados en la Referencias Las siguientes referencias, hasta el grado en que proveen procedimientos ejemplares u otros detalles suplementarios a aquellos estab ecidos en la presente invención, se incorporan específicamente en la prese te invención como referencias. Patentes de E.U.A.: Patente de E.U.A. 4,959,317; Patente de E.U.A. 5,527,695; Patente de E.U.A. 5,538,880; Patente de E.U.A. 5,550,318; Patente de E.U.A. 5,591 ,616; Patente de E.U.A. 5,633,435; Patente de E.U.A. 5,750 848; Patente de E.U.A. 5,776,760; Patente de E.U.A. 5,780,708; Patente de E.U.A. 5,880,275; Patente de E.U.A. 5,837,848; Patente de E.U.A. 5,914 451 ; Patente de E.U.A. 5,986,175; Patente de E.U.A. 6,107,549; Patente de E.U.A. 6,118,047; Patente de E.U.A. 6,140,078; Patente de E.U.A. 6,160 208; Patente de E.U.A. 6,194,636; Patente de E.U.A. 6,232,526; Patente de E.U.A. 6,376,754; Patente de E.U.A. 6,399,861 ; Patente de E.U.A. 6,506 599; Patente de E.U.A. 6,583,338; Patente de E.U.A. 6,759,575; Patente de E.U.A. 5,034,322; Patente de E.U.A. 5,250,515; Patente de E.U.A. 5,763)245; Patente de E.U.A. 6,084,089; Patente de E.U.A. 6,252,138; Patente de E.U.A. 6,294,714; Patente de E.U.A. 6,426,446; Patente de E.U.A. 6,433|252; Patente de E.U.A. 6,437,217 Publicación de Patente de E.U.A. 2004/0216189 Publicación de Patente de E.U.A. 2002/0112260 Publicación de Patente de E.U.A. 2003/0106096 Publicación de Patente de E.U.A. 2004/0123347 Publicación de Patente de E.U.A. 2003/0150017 A1 Altschul et al, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997. 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Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una planta transgénica que comprende dentro de su genoma ADN ue comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido y que tiene en su región no traducida hacia 3' al menos una primera secuencia desestabilizante, por medio de la cual dicho polipéptido se expresa a un nivel menor en la semilla de dicha planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de dicha secuencia desestabilizante.

2.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha planta transgénica es una planta de cosecha seleccionada a partir del grupo que consiste de plantas de cosecha de grano, plantas de cosecha de semilla oleosa, plantas de cosecha de forraje, y plantas de cosecha de vegetal.

3.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , ademas porque dicho polipéptido comprende antranilato

4.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 1 , caras erizada además porque dicha secuencia desestabilizante se selecciona a partir del grupo que consiste de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA, y una combinación de motivos ATTTA y ATTTAA.

5.- Una planta transgénica que comprende dentro de su genoma ADN óue comprende un promotor no constitutivo operativamente asociado a un gen exógeno que codifica un polipéptido y que comprende en su región no traducida hacia 3' al menos una primera secuencia desestabilizante, por medio de la cual dicho polipéptido se expresa a un nivel inferior en dicha planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de dicha secuencia desestabilizante.

6.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha planta transgénica es una planta de cosecha.

7.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho promotor no constitutivo se selecciona a partir del grupo que consiste de promotores espacialmente específicos, promotores temporalmente específicos, o promotores inducibles.

8.- La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 5, caracl erizada además porque dicha secuencia desestabilizante se selecciona a partir del grupo que consiste de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA, y una combinación de motivos ATTTA, y ATTTAA.

9.- Una planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje y que comprende dentro de su genoma ADN que comprende un gen exógemo que codifica un polipéptído y que comprende en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante, por medio de la cual dicho polipéptido se expresa a un nivel más bajo en dicha planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje en relación con la expresión en la ausencia de dicha secuencia desestabilizante.

10.- La planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje es una monocotiledónea.

11.- La planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha monocotiledónea es maíz.

12.- La planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje es una dicotiledónea.

13.- La planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha dicotiledónea es frijol de soya. ¡

14.- La planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha secuencia desestabilizante se selecciona a partir del grupo que consiste de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA, y una combinación de motivos ATTTA y ATTTAA.

15.- Una planta transgénica que comprende dentro de su genoma ADN que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido y que comprende en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabilizante que comprende repetidos ATTTAA superpuestos, por medio de la cual dicho polipéptido se expresa a un nivel inferior en dicha planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de dicha secuencia desestabilizante.

16.- Una planta transgénica que comprende dentro de su genorra ADN que comprende un gen que codifica antranilato síntasa y que comprende en su región no traducida hacia 3' una secuencia desestabílizante, por medio de la cual dicha antranilato sintasa se expresa a un nivel más bajo en dic na planta transgénica en relación con la expresión en la ausencia de dicha secuencia desestabilizante.

17.- Un método para disminuir post-transcripcionalmente la estabi idad del mensajero de un gen de interés en una planta de cosecha utilizada para alimento o forraje, que comprende añadir una secuencia deseslabilizante a la región no traducida hacía 3' de dicho gen de interés en dicha Dlanta de cosecha utilizada para alimento o forraje, por medio de la cual la estabilidad del mensajero de dicho gen de interés se disminuye post-transcripcionalmente.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha planta de cosecha transgénica utilizada para alimento o forraje es una monocotíledónea.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha monocotiledónea es maíz.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha planta de cosecha transgénica utilizada para ajimento o forraje es una dicotiledónea.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicha dicotiledónea es frijol de soya.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicha secuencia desestabilizante se selecciona a partir del grupo que consiste de un terminador SAUR hacia 3', un elemento DST, un motivo ATTTA, un motivo ATTTAA, y una combinación de motivos ATTTA y ATTTAA. I

23.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque dicho gen de interés está operativamente asociado a al menos un elemento promotor en un cassette de expresión transqénico.