CN104936437A - 使用线性dna载体的质体转化 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供使用线性DNA载体进行质体转化的方法和具有基本上不降解的质体DNA的植物组织。还提供可用于本文提供的方法的线性DNA载体，通过本文提供的方法得到的转质体植物或植物部分，和所述转质体植物或植物部分的后代。

Description

使用线性DNA载体的质体转化

相关申请的交叉参考

依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2012年10月24日提交的美国临时申请号61/718,095的利益，其内容通过引用完全结合在本文中。

序列表

本申请包含序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII格式提交，并且通过引用完全结合在本文中。所述ASCII副本在2013年3月12日产生，命名为034186-077150-PCT_SL.txt，并且大小为20,932字节。

政府利益声明

本发明是在美国农业部授予的合同号为2008-39211-19557的政府支持下进行的。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本公开内容涉及质体转化的方法，使用该方法产生的转质体植物(transplastomic plant)和植物部分，以及所述转质体植物和植物部分的后代。

相关领域描述

与核转化相比，质体转化具有多种优点。其允许高的转基因表达水平，在单次转化事件中的多基因改造，和通过母体遗传的转基因遏制(transgene containment)。另外，由于有毒转基因产物的亚细胞区室化(subcellular compartmentalization)，质体转化缺少多效效应。此外，这种技术避免与核转基因表达相关的其他问题，诸如由于转基因整合位点导致的基因沉默和位置影响。尽管存在它的优点，质体转化局限于特定的双子叶植物。已经证明单子叶植物，如玉蜀黍(maize)，小麦，和水稻，不受该技术影响。

概述

本文所述的方法和组合物涉及在任意植物中提供高效的质体转化的载体和转化流程。在一些实施方案中，所述植物可以是曾经不受质体转化影响的单子叶植物。

在一方面中，本公开内容提供质体转化的方法，所述方法包括：向植物组织的质体中引入线性DNA载体，其中(i)所述质体包含基本上不降解的质体DNA，(ii)所述线性DNA载体包含：(1)质体DNA靶向序列，和(2)目的转基因。

在某些实施方案中，所述植物是谷物农作物。

所述目的转基因可以选自由下述组成的组：编码治疗性或预防性多肽的基因，提供或增强除草剂抗性、昆虫抗性、真菌抗性、细菌抗性和胁迫耐受性的基因，以及提高氮固定、矿物质营养、植物产量、淀粉累积、脂肪酸累积、蛋白累积和光合作用的基因。

在某些实施方案中，所述线性DNA载体还包括编码选择标记的基因，诸如提供针对壮观霉素、链霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦或双丙氨膦(bialaphos)抗性的基因，提供甘露糖代谢机制的基因或编码荧光蛋白的基因。

在某些实施方案中，所述质体DNA靶向序列包含质体染色体DNA分子的末端序列。例如，所述质体末端序列与SEQ ID NO：1，8，15，21，29，35，41或47的一部分至少90％相同，所述部分至少30个核苷酸长。

在某些实施方案中，所述质体末端序列包含：当所述植物组织是玉蜀黍组织时，包含SEQ ID NO：2，9，16，22，27，28，30，36，42，48，53，54，55，56或57的至少30个连续的核苷酸，当所述植物组织是小麦组织时，包含SEQ ID NO：3，10，17，23，31，37，43或49的至少30个连续的核苷酸，当所述植物组织是水稻组织时，包含SEQ ID NO：4，5，11，12，18，19，24，25，32，33，38，39，44，45，50或51的至少30个连续的核苷酸，当所述植物组织是烟草组织时，包含SEQ ID NO：6，13，20，26，34，40或52的至少30个连续的核苷酸，或当所述植物组织是苔类植物组织时，包含SEQ ID NO：7或46的至少30个连续的核苷酸。

在一些实施方案中，所述线性DNA载体包含在5′端或3′端的单链突出端，可以或可以不共价连接所述线性DNA载体的两条DNA链的单链环，或不是与5′端或3′端共价连接的核苷酸的分子。

在一些实施方案中，所述植物组织是非绿色组织，诸如成熟胚的一部分，暗处生长的幼苗的一部分，种子或种子的一部分。

在某些实施方案中，所述质体是前质体、黄化质体或其他非绿色质体。

在某些实施方案中，通过用由所述线性DNA载体包被的微粒生物弹道轰击植物组织进行步骤(a)。

在某些实施方案中，质体转化的方法还包括(b)避光培养来自步骤(a)的植物组织。

在一些实施方案中，质体转化的方法还包括(c)由步骤(a)或步骤(b)的植物组织再生转质体植物。

在某些实施方案中，所述转质体植物是同质的。

在另一方面中，本公开内容提供由本文公开的方法得到的转质体植物或植物部分。

在相关的方面中，本公开内容提供由本文公开的方法得到的转质体植物的植物或或植物部分的后代。

在另一方面中，本文公开内容提供用于植物中质体转化的线性DNA载体，所述载体包含：(1)质体DNA靶向序列，其包含质体末端序列(plastidterminal sequence)，(2)表达盒，其包含：(a)任选地，在要转化的植物的质体中有活性的启动子，(b)用于接纳目的转基因的DNA插入位点，(c)任选地，一个或多个选择标记，(d)任选地，编码在要转化的植物的质体中有活性的转录终止区的DNA序列。

在某些实施方案中，所述线性DNA载体还包括在DNA插入位点插入的目的转基因。

附图简述

图1A-1F图示苔类植物质体转化载体和转基因整合。图1A图示载体pCS31的示意图。图1B图示通过SacI消化线性化的载体LpCS31的示意图。图1C图示通过NotI/SacII消化线性化的载体TCpCS31的示意图。aadA/RBS片段产生阳性转化体。图1D图示通过同源重组整合到质体基因组中的示意图。图1E图示通过末端连接整合的示意图。图1F图示通过链侵入(strand invasion)整合的示意图。LBS：左边界序列，RBS：右边界序列，aadA：具有PEP启动子、5′-UTR和3′-UTR的转基因，P1，P4-P6：侧翼连接边界序列的PCR引物，P2，P3：在转基因盒内的PCR引物，aL，aR：用于aadA转基因的PCR引物。

图2A-2C图示用于烟草质体转化的载体。图2A图示环形载体pPRV111A的示意图，所述载体包含烟草ptDNA LBS和RBS，侧翼连接烟草psbA启动子/psbA 5′-UTR和psbA 3′-UTR的用于壮观霉素选择的aadA基因。具有限制性位点的多接头位于LBS与启动子区之间。转基因盒是登记号U12812。箭头表示16S rRNA和trnV基因的位置。图2B图示通过EcoRV消化pPRV111A产生的线性载体LpPRV111A的示意图。图2C图示通过SacI消化pPRV111A产生的线性载体TCpPRV111A的示意图。

图3A-3G图示用于玉蜀黍质体转化的载体。图3A和3C图示环形载体pZMCP150和pZMCP152的示意图，所述载体包含玉蜀黍ptDNALBS和RBS以及侧翼连接玉蜀黍16S rRNA启动子/psbA 5′-UTR和psbA3′-UTR的gfp基因。箭头表示16S rRNA、ORF85和trnV基因以及PCR引物的位置。在RBS中，End5分别对应IRb、pZMCP150和pZMCP152的5′和3′端。图3B和3D图示通过PstI/PvuII/SfiI消化产生的线性载体TCpZMCP150和TCpZMCP152的示意图。包括PvuII酶以减少线性载体片段重新环化的机会。通过限制性消化产生另外三种线性载体：图3E图示TC2pZMCP152的示意图，其包括具有End5的完整的LBS和最小的RBS(27bp)区；图3F图示TC3pZMCP152的示意图，其包括完整的RBS和最小的LBS(172bp)，没有End5；图3G图示TC4pZMCP152的示意图，其包括完整的LBS和RBS区，但是末端序列由来自克隆质粒的113和205bp构成。

图4A-4B图示用质体转化载体轰击的玉蜀黍胚组织的图像。对来源于用环形载体pZMCP150粒子轰击后的成熟胚的单片愈伤组织成像：对于每对图像，白光在左侧，GFP在右侧。在4A和4B中都可以看到植物细胞壁的自体荧光。图4A图示质体中没有GFP表达的组织区域。图4B图示质体中具有GFP表达的组织区域。

图5A-5D图示用质体转化载体轰击的玉蜀黍胚组织的图像。对来源于粒子轰击后的成熟胚的单片愈伤组织成像：对于每对图像，白光在左侧，GFP在右侧。图5A图示没有DNA的组织，图5B图示具有线性载体TCpZMCP150的组织，图5C图示具有环形载体pZMCP152的组织，图5D图示具有线性载体TCpZMCP152的组织。用GFP滤光片可以观察到植物细胞壁的自体荧光。

图6A-6B图示SEQ ID NOS：1-14；一部分玉蜀黍End5(SEQ ID NOS：2和9)与来自小麦(SEQ ID NOS：3和10)、水稻(SEQ ID NOS：4，5，11和12)、烟草(SEQ ID NOS：6和13)和苔类植物(SEQ ID NO：7和14)的ptDNA的ptDNA序列比对。共有序列以SEQ ID NOS：1和8显示。在五个测序的质体基因组中评估线性ptDNA的末端序列的同源性，该末端序列本图中和在图3中指定为End5，在表6中指定为End1/5，所述五个测序的质体基因组为：小麦(Ta，小麦(Triticum aestivum)，NC_02782)，水稻(Osj，日本水稻(Oryza sativa japonica)，X15901；Osi，印度水稻(Oryza sativaindica)，AY522329)，烟草(Nt，烟草(Nicotiana tabacum)，NC_00189)，和苔类植物(Mp，地钱(Marchantia polymorpha)，X04665)。完整End1/5序列比对跨越对应玉蜀黍质体基因组X86563的nt 94920：96198(图11)的1278bp区域。数据最佳适配位于IRb中nt 96976±60和IRa中127767±60的末端(见表6)。图6A图示End5序列的5′端120bp(nt 94976至nt 95095)与其他植物ptDNAs的比较。图6B图示End5序列的3′端120bp(nt 94857至nt 94976)与其他植物ptDNAs的比较。点表示每种植物中相同的核苷酸(A/G/C/T)，大写字母表示高度同源性区域内的碱基改变，小写字母表示在高度同源区域外的非同源性。

图7A-7B图示SEQ ID NOS：15-26；一部分玉蜀黍End2(SEQ ID NOS：16和22)与图6中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比对。图7A图示End2序列的5′端120bp(nt 94143至nt 94262)与其他植物ptDNAs的比较。图7B图示End2序列的3′端120bp(nt 94924至nt 94143)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp没有发现相似的序列。

图8A-8B图示SEQ ID NOS：27和28；一部分玉蜀黍End3的5′末端序列(SEQ ID NO：27和28)与图6中相同的植物ptDNAs进行比较，尽管对于其他五种ptDNA序列中的任一种都没有发现相似的序列。图8A图示End3序列5′端120bp(nt 87402至nt 87521)。图8B图示End3序列3′端120bp(nt 87283至nt 87402)。

图9A-9B.SEQ ID NOS：29-40；一部分玉蜀黍End4(SEQ ID NO：30和36)与图6A-6B中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比对。图9A图示End4序列的5′端120bp(nt 84555至nt 84674)与其他植物ptDNAs的比较。图9B图示End4序列的3′端120bp(nt 84436至nt 84555)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp没有发现相似的序列。

图10A-10B图示SEQ ID NOS：41-52；一部分玉蜀黍End6(SEQ IDNOS：42和48)与图6A-6B中相同的植物ptDNAs的ptDNA序列比对。图10A图示End6序列的5′端120bp(nt 93863至nt 93982)与其他植物ptDNAs的比较。对于Nt没有发现相似的序列。图10B图示End6序列的3′端120bp(nt 93744至nt 93863)与其他植物ptDNAs的比较。对于Mp没有发现相似的序列。

图11图示SEQ ID NO：53；完整的End1/5序列是利用测序数据由ClustalW比对确定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为“真正的末端”。

图12图示SEQ ID NO：54；完整的End2序列是利用测序数据由ClustalW比对确定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为“真正的末端”。

图13图示SEQ ID NO：55；完整的End3序列是利用测序数据由ClustalW比对确定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为“真正的末端”。

图14图示SEQ ID NO：56；完整的End4序列是利用测序数据由ClustalW比对确定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为“真正的末端”。

图15图示SEQ ID NO：57；完整的End6序列是利用测序数据由ClustalW比对确定的。将在所有个体测序输出中发现最大重叠程度的第一个核苷酸指定为“真正的末端”。

详述

本公开内容提供质体转化的方法，用于所述方法的线性DNA载体，通过所述方法得到的转质体植物或植物部分，以及这些植物和植物部分的后代。

标准的质体转化方法使用环形载体，使用在光照下生长的绿色植物组织通过同源重组发生转基因向质体基因组中的整合。仅在某些双子叶物种中观察到使用所述方法成功获得了质体转化，而在谷类植物(单子叶植物)，如玉蜀黍(maize)、小麦和水稻中没有成功。

本公开内容的方法使用线性DNA载体和包含基本上不降解的质体DNA的植物组织(例如，非绿色组织)的新型组合。所述方法允许在谷类植物中成功的质体转化，并且与使用环形DNA载体和/或绿色植物组织的那些方法相比，提供更高的质体转化率。本文提供的方法可以产生同质的转质体植物。

在一个方面中，本公开内容提供质体转化的方法，所述方法包括将线性DNA载体引入到植物组织的质体中。引入所述线性DNA载体的质体包含基本上不降解的质体DNA，并且所述线性DNA载体包含质体DNA靶向序列和目的转基因。

传统上，质体转化通过将环形DNA载体上携带的转基因通过双重相互重组(交换转基因的上游和下游)插入到固有的质体DNA(假定专门存在于环形DNA分子中)中而实现。还相信在质体中重组是极常见的，并且其负责形成环形染色体DNA的两种等摩尔的异构体(Palmer，Nature(自然)301：92-3，1983)。不受理论限制，本发明人假设，使用线性DNA载体替代环形DNA载体，可能通过末端介导的转基因掺入(如末端结合和链侵入)获得更高的质体转化率(参见实施例1，图1和表3)。本发明人进一步假设，由于大部分质体DNA实际上是线性的，传统的环形转化载体与固有的质体染色体不相似，而不会被识别为“天然的”染色体。相比之下，按照内源性线性ptDNA建模的线性DNA载体可以通过比环形载体更有效的内源性ptDNA复制机制整合到质体基因组中。

在本文所述的一些实施方案中，线性DNA分子可以允许转基因转移到质体中。用于本文中时，“线性DNA载体”是指这样的DNA载体：当以双链形式存在时，所述载体具有两条链，每条链具有彼此不连接的5′和3′端。在本文所述的任一方面的一些实施方案中，所述DNA载体可以是非环形DNA载体。用于本文中时，“环形DNA载体”是指这样的DNA载体：当以双链形式存在时，所述载体具有两条链，其中每条链是连续的环，没有物理上可辨认的5′或3′端。在一些实施方案中，“环形DNA载体”可以包括带切口的环形DNA载体，例如，具有第一条未断裂的环形链和具有彼此不连接的5′和3′端的第二条链的环形DNA载体。以非限制性举例的方式，线性DNA载体可以包括，其中每条链具有游离的5′和3′端的双链的DNA分子；其中一条链的3′端与第二条链的5′端连接的双链DNA分子(例如，形成单链的发夹分子)；和本文下文中所述的其他形式。在一些实施方案中，可以通过使用一种或多种限制酶将环形DNA载体线性化而得到线性DNA载体。在某些实施方案中，线性DNA载体包含在宿主细胞(例如，细菌和酵母)中起作用的复制起点。在某些其他实施方案中，线性DNA载体不包含任何在宿主细胞中起作用的复制起点。

在某些实施方案中，可用于质体转化的线性DNA载体包含质体DNA-靶向序列，以促进所述线性DNA载体或其部分整合到质体DNA中。在一些实施方案中，所述质体-靶向序列可以位于转基因序列的一侧。在一些实施方案中，质体-靶向序列可以位于转基因序列的两侧。

所述质体DNA-靶向序列可以是与目的质体基因组中的序列充分相似的序列，以允许所述质体DNA-靶向序列与所述质体基因组之间的同源重组。线性DNA载体中可以包含任意与目的质体基因组中的序列充分相似的序列。示例性的质体DNA-靶向序列包括在实施例中所提供的左边界序列(LBS)和右边界序列(RBS)。其他优选的DNA-靶向序列是包括本发明人确定的End序列的全部或部分的序列，包括表6和图6-15中所述的那些和由侧翼连接转基因的质体表达控制区(如启动子和终止子)而没有另外的LBS/RBS序列组成的那些。在某些实施方案中，线性DNA载体包含两种不同的质体DNA-靶向序列：在也存在于线性DNA载体中的目的转基因每一侧有一种。在一些实施方案中，两个质体DNA-靶向序列的存在允许通过双重相互同源重组整合转基因，而在DNA载体末端存在质体DNA-靶向序列允许所述载体DNA向所述质体基因组中的末端介导的掺入。

不希望受到理论限制，本发明人假设，在质体DNA复制过程中，质体末端序列对于基因组扩增可能是重要的，通过使用包含与这些末端的至少一部分基本上相同或同源的靶向序列的载体可以实现有效的质体转化。因此，在某些实施方案中，所述质体DNA-靶向序列包含与质体末端序列的一部分相同或同源的质体末端序列。“质体末端序列”是指邻近天然存在的线性质体染色体的末端(在5′端下游或3′端上游)的至少约1000bp长的区域(例如，至少约100bp长，至少约200bp长，至少约300bp长，至少约400bp长，至少约500bp长，至少约600bp长，至少约700bp长，至少约800bp长，至少约900bp长，或多至约1000bp长，或者，例如100-1000bp长)(序列按实施例3所述确定)。质体DNA的“5′末端序列”是指邻近位于5′质体DNA末端下游的质体DNA末端的区域。质体DNA的“3′末端序列”是指邻近位于3′质体DNA末端上游的质体DNA末端的区域。

本领域技术人员容易确定质体末端序列，例如，本领域中已知多种物种的质体DNA序列。多种植物物种的质体DNA序列可从数据库中公共获得，例如，在叶绿体DB中，其在万维网http：//chloroplast.cbio.psu.edu/organism.cgi上免费可得。质体DNA序列通常以“环形图谱”图示，长单拷贝(LSC)区的第一个核苷酸邻近反向重复(IRa)之一的最后一个核苷酸并且与之连接。核苷酸编号1(nt＝1)指定为LSC(或其对缺少反向重复的质体DNA序列的等价体)的第一个核苷酸然而，质体DNA序列编号为第一和最后一个的核苷酸并不对应于线性质体DNA分子的真正的末端。确定给定的物种或品种的质体末端序列需要制备结构上完好的质体DNA，并且从末端测序，例如，在本文的实施例3中所述。

在一些实施方案中，质体末端序列还可以包括与本文公开的任一种质体末端序列同源的序列。可以找到任意给定的核酸序列的同源物，例如通过使用BLAST程序，例如通过检索关于同源序列的序列的免费可用的数据库，或通过查询这些数据库关于显示同源物的注释。这样的数据库可见于，例如，在万维网http：//ncbi.nlm.nih.gov/上。在一些实施方案中，质体末端序列、质体-靶向序列或质体终端序列的同源物是与本文所述的具有至少25bp的长度的序列部分具有至少85％同一性的序列，例如，与具有至少25bp的长度的序列部分具有85％以上的同一性，90％以上的同一性，或95％以上的同一性。

用于本文时，术语“质体末端序列”是指与质体末端序列长度至少约25bp的部分至少85％相同的序列。

在一些实施方案中，质体末端序列与质体末端序列长度为25-50、50-100、100-150或150-200个核苷酸的部分相同。在某些实施方案中，质体末端序列与质体末端序列长度至少为25、30、35、40、45或50个核苷酸的部分相同。

在某些实施方案中，质体末端序列与质体末端序列的一部分至少85％-90％，90％-95％或95％-99％相同，所述部分长度可以是25-50，50-100，100-150或150-200个核苷酸。在一些实施方案中，质体末端序列与质体末端序列的一部分至少85％-90％，90％-95％或95％-99％相同，所述部分长度可以是至少25，30，35，40，45或50个核苷酸。

示例性的质体末端序列的部分包括SEQ ID NOS：2-6(参见图6)。另外的示例性的天然存在的质体末端序列的部分包括SEQ ID NOS：16-20和22-26(图7)，27和28(图8)，30-34和36-40(图9)，和42-46与48-52(图10)。其他示例性的质体末端序列可以包括图11-15中给出的完整的质体末端序列的任意部分。“质体末端序列”可以广义定义为通过实施例3所述的步骤鉴定的序列。“真正的末端”狭义上定义为对于特定的末端(如表6中提供的Ends 1/5，2-4和6)在所有个体测序输出中发现最大的序列重叠程度处的第一个核苷酸。

在某些实施方案中，质体末端序列包含SEQ ID NO：1，2，3，4，5，6或7的部分，所述部分长度为至少30个核苷酸。另外示例性的质体末端序列包含SEQ ID NO：8-52的部分，所述部分长度为至少30个核苷酸。

当比较多核苷酸序列时，如果当出于最大的对应性比对两个序列时这两个序列中每一个的核苷酸序列是相同的，则认为这两个序列是“相同的”。本文所述的两个核苷酸序列之间(例如，质体末端序列与天然存在的质体末端序列)的同一性百分数按照Mac Vector利用与参照比对和ClustalW比对(MacVector，Inc，http：//www.macvector.com；Larkin等，Bioinformatics(生物信息学)23：2947-2948，2007；http：//www.clustal.org/)确定

在某些实施方案中，线性DNA载体可以包含质体末端序列以及与目的质体染色体的一部分同源的至少一个其他质体靶向序列。在一些实施方案中，所述线性DNA载体可以包含质体末端序列和与目的质体染色体的部分同源的两个以上另外的质体靶向序列。

除了质体DNA靶向序列，线性DNA载体可以包含目的转基因。目的转基因包含编码有工业价值的酶、生物材料、治疗性或预防性多肽、抗体、抗生素、疫苗抗原的那些，提供或增强除草剂抗性、昆虫抗性、真菌抗性、细菌抗性、干旱抗性、盐抗性、寒冷和霜冻抗性的基因，以及增强下述的基因：氮固定，矿物质营养，植物产量，淀粉累积，脂肪酸累积，蛋白累积，植物修复能力(phytoremediative ability)，提高的活力、颜色或美观吸引力，健康和营养特征，存储特征，重金属抗性，耐水性，甜度，味道，质地，减少的磷酸含量，发芽率，微营养物摄入，淀粉组成，和光合作用(Bock，Curr Opin Biotechnol(现代生物技术观点)18：100-6，2007；Bock和Warzecha，Trends Biotechnol(生物技术趋势)28：246-52，2010；Daniell等，Vaccine(疫苗)23：1779-83，2005；Daniell等，Trends Plant Sci(植物科学趋势)14：669-79，2009；Grevich和Daniell，Crit.Rev.Plant Sci.24：83-108，2005；Maliga，Annu Rev Plant Biol(植物生物学年度综述)55：289-313，2004；Verma和Daniell，Plant Physiol(植物生理学)145：1129-43，2007)。示例性的转基因包括cry，nif，tetC和xynA。在某些实施方案中，目的转基因是选择标记基因。

在某些实施方案中，转基因是来源于与该转基因所引入的植物物种不同的物种(例如，另一种植物物种或不同的生物体)的基因。在其他实施方案中，转基因是来源于与该转基因所引入的相同的植物物种的基因，但是在组成和/或基因组基因座上已经基本上由其天然形式进行了修饰。在一些实施方案中，转基因是来源于与该转基因所引入的相同的植物物种的基因，但是不天然存在于质体中。在某些实施方案中，转基因是外部产生的，如含有基因的反义版本的DNA序列。所有这些类型的转基因可以称为“异源”基因。

所述转基因可以位于在DNA插入位点的线性DNA载体的表达盒中。所述表达盒可以包含与下游序列(例如，转基因)可操作地连接的启动子序列，转录终止序列，和/或编码选择标记的基因(或者，如果所述转基因本身是选择标记，则是编码第二选择标记的基因)。术语“可操作地连接”用在本文中是指启动子和/或转录终止序列与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列起始并且调节与所述第二序列相对应的核苷酸序列的转录，所述转录终止序列终止编码所述第二序列的核酸的转录。通常，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且，对连接两个蛋白编码序列所必需的，是连续的且在相同的阅读框中。所述启动子序列(和/或转录终止序列)可以是宿主生物体和/或转基因所天然的、类似的、外源的或异源的。另外地，所述启动子可以是天然序列或备选地是合成序列。

所述启动子可以是在要转化的植物物种的质体中有活性的任意启动子。示例性的启动子包括叶绿体特异性的核糖体RNA操纵子启动子rrn(16S rRNA)，PEP启动子，psbA启动子(Staub等，EMBO J 12：601-6，1993)，rbcL启动子，trnV启动子，rps16启动子，以及编码D1类囊体膜蛋白的基因的启动子。在实施例中提供了某些示例性的启动子。

所述转录终止序列可以是在要转化的植物物种中有活性的任意转录终止序列。示例性的转录终止序列包括psbA终止序列和rrn，rbcL，trnV，和rps16的终止序列。在实施例中提供了某些示例性的终止子。

用于本文时，“在要转化的植物物种的质体中有活性”表示所涉及的功能单位(例如，启动子或终止序列)在所述植物物种的质体中可以表现出可检测水平的活性(例如，当所述功能单位与转基因和植物物种的质体中的其他需要的功能单位可操作性连接时，在至少一组条件下可以检测到可检测水平的表达产物(例如，RNA或多肽表达产物)，和/或，在终止子的情形中，在至少一组条件下可以检测到可检测水平的所述转基因的转录物的正确终止的拷贝)。如果功能单位在一种或多种类型的质体，例如，一种类型的质体，两种类型的质体，或更多种类型的质体，多至并且包括所有类型的质体中是有活性的，则所述功能单位可能在所述植物物种的质体中是有活性的。如果功能单位在至少一个发育阶段(例如，在成熟的植物中，在幼苗中)的一种或多种类型的质体中有活性，则所述功能单位可能在所述植物物种的质体中是有活性的。如果功能单位在至少一个组织中的一种或多种类型的质体中有活性，则所述功能单位可能在所述植物物种的质体中是有活性的。

在线性DNA载体中还可以包括另外的不翻译区(UTR)序列，所述不翻译区序列与转基因的编码序列和/或编码选择标记的基因融合。在实施例中提供了示例性的UTR序列。表达盒中还可以包括另外的用于表达蛋白的元件，如转录和翻译增强子，核糖体结合位点等。

选择标记可以包括，但不限于，编码赋予壮观霉素、链霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦、双丙氨膦、庆大霉素或甘露糖抗性的多肽的基因。在一些实施方案中，编码选择标记的基因可以是赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA。

备选地，可以使用可显现的标记，诸如荧光蛋白。示例性的可显现标记包括绿色荧光蛋白(GFP)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)，荧光素酶(LUX)。可以通过用适当的光源照射推定的转化体并且选择表现出荧光的转化体而可视性地进行选择。

在一些实施方案中，所述选择标记可以是可去除的和/或可切除的选择标记(例如，“清理基因”技术("clean gene″technology))，例如，其可以侧翼连接LoxP位点，以使在存在Cre重组酶的条件下，将其从宿主核酸序列中切除。本领域中还已知其他的重组酶系统，例如，Flp-Frt。制备和使用可去除的和/或可切除的选择标记的方法在本领域中是已知的，例如，参见Day和Goldschmidt-Clermont.Plant Biotechnology(植物生物技术)2011 9：540-533；其通过引用完全结合在本文中。

线性ptDNA分子的体内形式可以包括端粒(末端)结构。这种端粒结构可以由平端、5′突出端或3′突出端构成。此外，末端可以具有结构修饰，包括可以形成或可以不形成连接两条DNA链的共价键的单链环，或与5′端或3′端共价连接的分子，如蛋白、肽、或氨基酸。修饰线性DNA载体以使其具有与体内ptDNA相似的端粒结构可以提高质体转化效率。

所述线性DNA载体还可以在5′端、3′端或5′端和3′端两端具有单链突出端。备选地，所述线性DNA载体在5′端或3′端不包含任何单链突出端。

在一些实施方案中，所述线性DNA载体可以具有单链环，所述单链环可以或可以不共价连接所述线性DNA载体的两条DNA链。

在一些其他的实施方案中，所述线性DNA可以具有与5′端或3′端共价连接的不是核苷酸的分子(例如，蛋白、肽或氨基酸)。

可以向其中引入包含目的转基因的线性DNA载体的质体包括包含基本上不降解的质体DNA的任意质体。示例性的质体包括黄化质体，前质体，色质体，白色体，造粉体，油质体，和叶绿体，它们包含基本上不降解的质体DNA。质体的类型和鉴定它们的方法在本领域中是已知的；例如，参见Wise.Advances in Photosynthesis and Respiration(光合作用和呼吸作用进展)2006 23：3-26；其通过引用完全结合在本文中。在一些实施方案中，所述质体是非绿色质体，例如，其不是叶绿体。

分开质体中存在的基因组DNA序列的完整的一套序列称为“单位基因组”。在任意给定的质体中可能存在多个拷贝的单位基因组。在一些实施方案中，在同一核酸分子内可能存在单位基因组的任意给定部分的多个拷贝，多至包含完整的单位基因组。因此，质体中给定的不降解的核酸分子的长度可以是x bp，2x bp，3x bp等。长度为x bp的核酸分子可以称为“单位基因组尺寸的”，而“多基因组尺寸的”分子长度可以是2x bp，3x bp，4x bp，5x bp等。质体的发育和/或暴露于光可以诱导所述质体DNA的降解，以使给定的核酸分子长度为yx bp，其中y不是整数。在一些实施方案中，如果多于25％的质体DNA是单位基因组和多基因组尺寸的，则所述质体包含基本上不降解的质体DNA。在某些实施方案中，多于30％-90％，如多于30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，70％，80％或90％的质体DNA是单位基因组和多基因组尺寸的。在一些实施方案中，包含基本上不降解的质体DNA的质体可以是非绿色组织包含的质体。用在本文中时，“非绿色”细胞或组织是包含少于20％(例如，20％以下，10％以下，5％以下，2％以下或1％以下)的在绿色的光合作用细胞或组织(例如，绿叶)中存在的叶绿体和/或叶绿素的细胞或组织。

包含基本上不降解的质体DNA的任意组织可以用于质体转化。所述组织包括非绿色组织，如暗处生长的幼苗的茎秆和叶，不成熟的和成熟的胚，种子，暗处生长的胚形成的愈伤组织，原生质体，根，块茎，以及它们的部分。成熟的胚是由一个或两个子叶、胚根和下胚轴组成的充分发育的种子的部分。不成熟的胚是发育中的种子(典型地在传粉后11-14天收获的种子)的部分。

使用非绿色组织，特别是来自谷物的那些，用于质体转化比使用绿色组织有利。不希望受到理论限制，本发明人假设之前尝试转化谷物中的质体的失败至少部分是由于某些绿色质体(例如，玉蜀黍绿色质体)中的DNA是高度降解的。本发明人进一步假设，之前的失败还可能由包含绿色质体的细胞已经由其分生细胞中的前体分化并且不能将质体DNA传到其后代细胞中的事实导致。因此，在某些实施方案中，进行质体转化的组织是非分化状态的非绿色组织。在一些实施方案中，组织中的大部分质体是前质体，例如，至少50％的质体是前质体，至少60％的质体是前质体，至少70％的质体是前质体，至少80％的质体是前质体，或至少90％的质体是前质体。

适合用本文公开的方法进行质体转化的植物包括双子叶植物和单子叶植物。在一些实施方案中，所述植物是农作物植物(例如，培育的植物，包括种植主要用于人类消耗的农作物，如谷物农作物)、蔬菜、水果、种子农作物和产油植物。谷物农作物是由于其谷粒的可食用成分而培育的禾本科植物(单子叶禾本科(Poaceae)成员)，其谷粒由胚乳、胚原基和麸组成。适于质体转化的谷物农作物包括玉蜀黍(maize)，小麦(wheat)，水稻(rice)，大麦(barley)，高粱(sorghum)，粟(millet)，燕麦(oats)，黑小麦(triticale)，裸麦(rye)，乔麦(buckwheat)，fonio，和(谷粒样)奎奴亚藜(quinoa)。适于质体转化的另外的示例性植物包括烟草(tobacco)，莴苣(lettuce)，棉花(cotton)，大豆(soybean)，番茄(tomato)，和拟南芥(Arabidopsis)。考虑另外的植物和/或农作物适合按照本文所述的方法和组合物进行质体转化。这些另外的植物和/或农作物可以包括，但不限于：被子植物和裸子植物，如金合欢属(acacia)，紫花苜蓿(alfalfa)，苹果属(apple)，杏树(apricot)，洋蓟(artichoke)，灰树(ash tree)，天门冬属(asparagus)，鳄梨(avocado)，芭蕉属(banana)，豆类(beans)，甜菜(beet)，桦树(birch)，山毛榉(beech)，黑莓(blackberry)，蓝莓(blueberry)，花椰菜(broccoli)，球芽甘蓝(brussels sprouts)，卷心菜(cabbage)，芸苔(canola)，香瓜(cantaloupe)，胡萝卜(carrot)，木薯(cassava)，花椰菜(cauliflower)，芹菜(celery)，栗树(chestnut)，樱桃(cherry)，大白菜(Chinese cabbage)，柑桔属(citrus)，克莱门氏小柑橘(Clementine)，苜蓿(clover)，咖啡树(coffee)，玉米(corn)，棉花(cotton)，豇豆(cowpea)，黄瓜(cucumber)，茄子(eggplant)，榆树(elm)，菊苣(endive)，桉树(eucalyptus)，茴香(fennel)，无花果(figs)，冷杉(fir)，老鹳草属(geranium)，葡萄(grape)，葡萄柚(grapefruit)，野(groundnuts)，酸浆属植物(ground cherry)，山核桃(hickory)，羽衣甘蓝(kale)，奇异果(kiwifruit)，苤蓝(kohlrabi)，落叶松属植物(larch)，韭葱(leek)，柠檬(lemon)，酸橙(lime)，洋槐(locust)，铁线蕨(maidenhair)，芒果(mango)，枫树(maple)，甜瓜(melon)，蘑菇(mushroom)，芥菜(mustard)，油桃(nectarine)，坚果类(nuts)，橡树(oak)，秋葵(okra)，洋葱(onion)，柑桔(orange)，观赏植物或花或树，木瓜树(papaya)，棕榈(palm)，欧芹(parsley)，欧洲防风草(parsnip)，豌豆(pea)，桃树(peach)，花生(peanut)，梨树(pear)，peat，胡椒属植物(pepper)，柿树(persimmon)，木豆(pigeon pea)，菠萝(pineapple)，车前草(plantain)，李属植物(plum)，石榴(pomegranate)，白杨(poplar)，马铃薯(potato)，南瓜(pumpkin)，榅桲(quince)，菊苣(radicchio)，萝卜(radish)，油菜籽(rapeseed)，悬钩子(raspberry)，柳树(sallow)，菠菜(spinach)，南瓜小果(squash)，草莓(strawberry)，糖萝卜(sugarbeet)，甘蔗(sugarcane)，向日葵(sunflower)，甘薯(sweet potato)，甜玉米(sweetcorn)，红橘(tangerine)，茶树(tea)，树木(trees)，冷季型草坪草(turfgrasses)，芜菁(turnips)，藤本植物(vine)，胡桃(walnut)，水田芥(watercress)，西瓜(watermelon)，山药(yams)，紫杉(yew)，西葫芦(zucchini)，雪松(cedar)，柏树(cypress)，松树(pine)，美洲杉(sequoia)，云杉(spruce)，培养的苔类植物和相关的苔藓类植物的细胞，以及培养的藻类。所述植物可以来自选自由下述组成的组的属：葱属(Allium)，金鱼草属(Antirrhinum)，天门冬属(Asparagus)，颠茄属(Atropa)，燕麦属(Avena)，甜菜属(Beta)，芸苔属(Brassica)，雀麦属(Bromus)，布洛华丽茄属(Browailia)，辣椒属(Capsicum)，藜属(Chenopodium)，菊苣属(Cichorium)，柑桔属(Citrus)，香瓜属(Cucumis)，南瓜属(Cucurbita)，曼陀罗属(Datura)，胡萝卜属(Daucus)，菊属(Dendranthema)，毛地黄属(Digitalis)，草莓属(Fragaria)，老鹳草属(Geranium)，大豆属(Glycine)，棉属(Gossypium)，向日葵属(Helianthus)，萱草属(Hemerocallis)，大麦属(Hordeum)，天仙子属(Hyoscyamus)，核桃属(Juglans)，伽蓝菜属(Kalanchoe)，莴苣属(Lactuca)，亚麻属(Linum)，黑麦草属(Lolium)，百脉根属(Lotus)，苹果属(Malus)，木薯属(Manihot)，苜蓿属(Medicago)，烟草属(Nicotiana)，驴食豆属(Onobrychis)，稻属(Oryza)，稷属(Panicum)，天竺葵属(Pelargonium)，狼尾草属(Pennisetum)，碧冬茄属(Petunia)，牵牛属(Pharbitis)，菜豆属(Phaseolus)，豌豆属(Pisum)，杨属(Populus)，毛茛属(Ranunculus)，萝卜属(Raphanus)，蔷薇属(Rosa)，蛾蝶花(Salpiglossis)，黑麦属(Secale)，千里光属(Senecio)，Sinapus，茄属(Solanum)，车轴草属(Trifolium)，胡卢巴属(Trigonella)，小麦属(Triticum)，豇豆属(Vigna)，葡萄属(Vitis)，玉蜀黍属(Zea)，云杉属(Picea)，松属(Pinus)，和黄杉属(Pseudotsuga)。

向植物组织的质体中引入线性DNA载体可以通过本领域已知的任何技术进行。示例性的技术包括电穿孔、粒子枪转化、聚乙二醇转化和晶须(whiskers)技术(参见美国申请公布号2010/0218277；其通过引用完全结合在本文中)。在优选的实施方案中，通过用包被有线性DNA载体的微粒生物弹道轰击植物组织而将所述线性DNA载体引入到植物组织的质体中。

质体转化后，具有引入到其质体中的转基因(例如，具有整合到其质体DNA中的转基因)的细胞可以通过本领域已知的多种技术进行检测，所述技术诸如杂交，电泳，测序和/或PCR。在某些实施方案中，具有引入到其质体中的转基因的细胞可以通过选择标记进行选择，所述选择标记的基因与所述转基因一起也被引入。例如，如果aadA与转基因一起引入，可以用链霉素或壮观霉素筛选含有aadA与转基因的细胞。在实施例中提供了某些用于检测含有结合到其质体DNA中的转基因的细胞的示例性的方法。

在某些实施方案中，质体转化处理后(例如，用线性DNA载体包被的生物弹道轰击)，将处理的植物组织进一步避光和/或不经受任何选择剂(例如，链霉素或壮观霉素)培养3-21天。延迟将组织暴露于选择压力防止选择剂杀死多个或大部分潜在可转化的细胞，并且增加转化率。使用非绿色组织并且延迟将其暴露于光(某些选择剂，如链霉素或壮观霉素的选择需要光)还防止某些质体DNA(例如，玉蜀黍质体DNA)在暴露于光时快速降解。

在相关的方面中，本公开内容通过通过本文提供的方法得到的转质体植物或植物组织。“转质体”植物或植物组织是指具有引入到至少其部分质体中的异源基因(例如，转基因)的植物或植物组织。在优选的实施方案中，所述转质体植物或植物组织是同质的。“同质的”转质体植物或植物组织仅包含携带掺入的转基因作为其DNA的一部分的质体，并且不含有其DNA不携带转基因的质体(即，其DNA仅包含野生型质体DNA的质体)。

由于植物细胞包含大量拷贝数的制剂基因组，因此，有效的选择标记和选择方案对于选择同质的转化体是重要的。可以使用本领域已知的选择策略。所述策略的实例包括使用选择标记，诸如使用用于壮观霉素/链霉素抗生素抗性的aadA(Svab等.，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)87：8526-30，1990；Verma Maliga和Bock，Plant Physiol(植物生理学)155：1501-10，2011)，用于除草剂抗性的bar(White等，NucleicAcids Res(核酸研究)18：1062，1989；Nakamura等，Biosci BiotechnolBiochem(生物科学生物技术生物化学)74：1315-9，2010)，和/或用于代谢选择的pmi(Wright等，Plant Cell Rep(植物细胞报告)20：429-36，2001)。在这一阶段，如果选择标记(例如，基于aadA或bar基因的那些)需要，可以将转化体从暗处转移到有光处。

在其质体中包含目的转基因的转化体可以用于再生转质体植物。可以使用本领域已知的用于再生转基因或转质体植物的任意方法。示例性的方法包括用体细胞胚胎发生(somatic embrogenesis)和幼苗分生组织再生玉蜀黍(Santos等，Plant Sci Letters(植物科学通信)33：309-315，1984；Zhong等，Planta 187：483-489，1992；Al-Abed等，Planta 223：1355-60，2006；Huang和Wei，Plant Cell Rep(植物细胞报告)22：793-800，2004；Li等，TheorAppl Genet(应用遗传学理论)108：671687，2004；Ahmadabadi等，Transgenic Res(转基因研究)16：437448，2007)。

在另一个相关方面中，本公开内容还提供转质体植物或植物组织的后代。在某些实施方案中，所述后代是同质的。

在另一方面中，本公开内容提供包含下述的线性DNA载体：(1)质体DNA靶向序列，其包含质体末端序列，(2)表达盒，其包含：(a)任选地，在要转化的植物的质体中有活性的启动子，(b)用于接纳目的转基因的DNA插入位点，(c)任选地，一个或多个选择标记，(d)任选地，编码在要转化的植物的质体中有活性的转录终止区的DNA序列。在某些实施方案中，所述线性DNA载体不具有插入到DNA插入位点的目的转基因。所述载体促进不同的转基因的质体转化。在某些实施方案中，具体的目的转基因已经插入在DNA插入位点处。线性DNA载体的不同成分在上文联系本文提供的质体转化的方法进行了描述。所述线性DNA载体可以通过使包含上述多种成分并且也能够在宿主细胞(例如，细菌或酵母细胞)中自我复制的环形DNA载体线性化而得到。

用于本文时，术语“表达盒”是指当引入到植物宿主细胞(例如，宿主细胞质体)中时能够赋予基因产物表达的核酸分子。

用于本文时，术语“植物”是指植物界(Plantae)中多种光合的、真核的、多细胞生物体中的任一种，其特征性产生胚，包含叶绿体，并且具有纤维素细胞壁。植物的部分，即，“植物组织”可以按照本文所述的方法进行处理。按照本发明，“植物组织”还包括植物细胞。植物细胞包括混悬培养物、愈伤组织(callus)、胚、分生组织区、愈伤组织(callus tissue)、叶片、根、芽(shoots)、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物组织可以是在不同的成熟阶段的，并且可以生长在液体或固体培养基中，或者生长在盆、温室或野外中的土壤或适当的介质中。植物组织还指所述植物、种子、后代、有性或无性产生的繁殖体的任意的克隆，和任意这些的后代，如插枝(cuttings)或种子。

除了实施的实施例或另外指示之外，所有表示本文所用的成分量或反应条件的数字应该理解为在所与情形中由术语“约”进行修饰。术语“约”在与百分数结合使用时可以意指±1％。

用于本文时，术语“包括”或“包含”联系组合物、方法和其各自的成分使用，所述成分是所述方法或组合物必需的，但是包括未指明的元素，不管该元素是必需的还是不是必需的。

术语“由……组成”是指本文所述的组合物、方法及其各自的成分，其排除在实施方案的描述中没有引用的任何元素。

用于本文时，术语“基本上由……组成”是指给定的实施方案所需要的那些元素。该术语允许存在实质上不影响该实施方案基本的和新颖的或功能性特征的元素。

单数术语“一个(‘a，’‘an，’)”和“这个(‘the’)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚指明。类似地，词语“或者”意欲包括“和”，除非上下文另外清楚指明。尽管在实施或检验本公开内容时可以使用与本文所述的那些相似或等价的方法和材料，但是，适当的方法和材料记述在下文中。缩写“e.g.(例如)”来源于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用来表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.(例如)”与术语“for example(例如)”同义。

细胞生物学和分子生物学中常规术语的定义可见于The Encyclopediaof Molecular Biology(分子生物学百科全书)，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin，Genes X(基因X)，由Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10：0763766321)；Kendrew等(编)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference(分子生物学和生物技术：综合案头参考书)，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)和Current Protocols in ProteinSciences(现代蛋白质科学流程)2009，Wiley Intersciences，Coligan等，编。

除非另外阐明，本发明使用标准方法进行，例如，在Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，USA(2001)；和Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(1995)中所述的标准方法；它们通过引用完全结合在本文中。

其他术语在本文中在本发明各个方面的描述中进行定义。

所有的专利和其他公布；包括参考文献，授权的专利，公开的专利申请，和待审的专利申请；在贯穿该申请中引用的通过引用明确结合在本文中，用于描述和公开的目的，例如，所述公布中所述的可以联系本文所述的技术使用的方法。这些公布仅提供其在本申请的申请日之前的公开内容。在这一点上，没有内容应该解释为承认本发明人没有资格利用在先的发明或出于任何其他原因将所述公开内容提前。关于日期的所有声明或关于这些文件的内容的陈述是基于本申请人可获得的信息，并且不组成关于所述日期的正确性或这些文件的内容的任何承认

本公开内容的实施方案的描述不意欲是穷尽的或将该公开内容限制为所公开的精确形式。尽管出于举例说明的目的在本文中描述了公开内容的具体的实施方案和实施例，但是，多种等价的修改在本公开内容的范围内是可行的，相关领域的技术人员应该认识到这些。例如，尽管方法步骤或功能以给定的顺序描述，但是备选实施方案可以以不同的顺序发挥功能，或者可以基本上同时发挥功能。本文提供的公开内容的教导可以适当地用于其他步骤或方法。可以组合本文所述的各种实施方案，以提供另外的实施方案。如果需要，可以修饰本公开内容的多个方面，以利用上述参考文献和申请的组合物、功能和观念来提供本公开内容的其他实施方案。按照详述，可以对本公开内容进行这些和其他的改变。所有这样的改进旨在包含在后附权利要求书的范围内。

任意前述实施方案的具体的元素可以组合或替换其他实施方案中的元素。此外，尽管与本公开内容的某些实施方案相关的优点已经在这些实施方案的上下文中进行了描述，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且不是所有的实施方案都需要必然表现出此类优点以落入本公开内容的范围内。

通过下述实施例进一步举例说明本文所述的技术，其绝不应该解释为进一步的限制。在这些实验中的结果显示使用线性DNA载体和非绿色组织在苔类植物、烟草、玉蜀黍、小麦和水稻中的成功的质体转化。

本文所述的技术的一些实施方案可以按照任意下述编号的段落定义：

1.质体转化的方法，其包括：(a)向植物组织的质体中引入线性DNA载体，其中

(i)所述质体包含基本上不降解的质体DNA，

(ii)所述线性DNA载体包含：

(1)质体DNA靶向序列，和

(2)目的转基因。

2.段1的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

3.段1-2中任一项的方法，其中所述植物是苔类植物或相关物种的植物。

4.段1-3中任一项的方法，其中所述目的转基因选自由下述组成的组：编码治疗性或预防性多肽的基因，提供或增强除草剂抗性、昆虫抗性、真菌抗性、细菌抗性和胁迫耐受性的基因，以及提高氮固定、矿物质营养、植物产量、淀粉累积、脂肪酸累积、蛋白累积和光合作用的基因。

5.段1-4中任一项的方法，其中所述线性DNA载体进一步包含编码选择标记的基因。

6.段5的方法，其中所述选择标记是提供针对壮观霉素、链霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦或双丙氨膦抗性的基因。

7.段5的方法，其中所述选择标记是提供甘露糖代谢的基因。

8.段5的方法，其中所述选择标记是编码荧光蛋白的基因。

9.段1-8中任一项的方法，其中所述质体DNA靶向序列包含质体染色体DNA分子的末端序列(terminal sequence)。

10.段9的方法，其中所述质体末端序列与SEQ ID NO：1，8，15，21，29，35，41或47的一部分至少90％相同，所述部分长度为至少30个核苷酸。

11.段9的方法，其中所述质体末端序列包含下述：

当所述植物组织是玉蜀黍组织时，包含SEQ ID NO：2，9，16，22，27，28，30，36，42，48，53，54，55，56或57的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是小麦组织时，包含SEQ ID NO：3，10，17，23，31，37，43或49的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是水稻组织时，包含SEQ ID NO：4，5，11，12，18，19，24，25，32，33，38，39，44，45，50或51的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是烟草组织时，包含SEQ ID NO：6，13，20，26，34，40或52的至少30个连续的核苷酸，或

当所述植物组织是苔类植物组织时，包含SEQ ID NO：7或46的至少30个连续的核苷酸。

12.段1-11中任一项的方法，其中所述线性DNA载体包含在5′端或3′端的单链突出端，可以或可以不与所述线性DNA载体的两条DNA链共价连接的单链环，或不是与5′端或3′端共价连接的核苷酸的分子。

13.段1-12中任一项的方法，其中所述植物组织是非绿色组织。

14.段13的方法，其中所述非绿色组织是成熟胚的一部分、暗处生长的幼苗的一部分、种子或种子的一部分。

15.段1-14中任一项的方法，其中所述质体是前质体、黄化质体或其他非绿色质体。

16.段1-15中任一项的方法，其中通过用由所述线性DNA载体包被的微粒生物弹道轰击植物组织进行步骤(a)。

17.段1-16中任一项的方法，其还包括(b)避光培养来自步骤(a)的植物组织。

18.段1-17中任一项的方法，其还包括(c)由步骤(a)或步骤(b)的植物组织再生转质体植物。

19.段18的方法，其中所述转质体植物是同质的。

20.通过段1-19中任一项的方法得到的转质体植物或植物部分。

21.段20的植物或植物部分的后代。

22.用于植物中质体转化的线性DNA载体，所述载体包含：

(1)质体DNA靶向序列，其包含质体末端序列，和

(2)表达盒，其包含：

(a)任选地，在要转化的植物的质体中有活性的启动子，

(b)用于接纳目的转基因的DNA插入位点，

(c)任选地，一个或多个选择标记，和

(d)任选地，编码在要转化的植物的质体中有活性的转录终止区的DNA序列。

23.段22的线性DNA载体，其还包括在DNA插入位点插入的目的转基因。

实施例

实施例1

苔类植物中的质体转化

环形质体转化载体，即pCS31，与其线性化形式用于转化苔类植物质体。pCS31包含标准的大肠杆菌(E.coli)质粒(pBluescript II SK+)，与所述质体基因组的区域同源的右和左边界序列(分别为RBS和LBS)，和转基因(aadA)(图1A)(Chiyoda等，Transgenic Res(转基因研究)16：41-9，2007)。质体DNA(ptDNA)区域对应于IRb的核苷酸(nt)83，881-85，894和IRa的116，226-118，239(GenBank登记号X04465)，并且包含trnI和trnA基因。限制性消化产生线性化形式(LpCS31)，其一个末端位于RBS或LBS(图IB)或者恰好是转基因盒(TCpCS31)，所述转基因盒包含一个或两个边界序列和所述转基因(图1C)。对于大部分的苔类植物细胞实验，使用仅包含RBS加转基因的TCpCS31载体。LpCS31和TCpCS31二者中RBS的末端是在预测与Zm End1/5相似的苔类植物ptDNA序列的～3000bp(表6和7)。

将苔类植物细胞悬浮培养物在1M51C培养基中生长并且每两周传代培养(参见，Oldenburg和Bendich，J Mol Biol(分子生物学杂志)310：549-62，2001；Oldenburg和Bendich，J Mol Biol(分子生物学杂志)276：745-58，1998)。为了质体转化，将细胞无菌过滤到42.5-mm Whatman培养皿上并且放置在1M51C琼脂平板上。然后，将细胞用由环形或线性化载体(0.5-1μg DNA)包被的0.6μm金微载体轰击。48小时的复苏期后，将细胞/培养皿在荧光下放置在壮观霉素选择平板上(1M51C+500μg/mL壮观霉素)3-4周。一些集落从一级(1°)选择平板上转移到包含壮观霉素的新鲜平板上进行二级(2°)选择筛选。对于2°选择，选出单个集落或2-5个集落，重悬在液体1M51C培养基中，并且涂布到选择平板上。

由在壮观霉素选择培养基上的绿色集落的数目来评估用苔类植物的转化效率(表1)，并且通过PCR和与aadA基因的点印迹杂交来评估转基因的存在(表2)。与环形载体相比，使用线性化的载体得到更高的转化效率(通常3-10倍，但是在一个情形中为200倍；表1)。

使用环形载体进行转基因整合的常规方法是通过所述载体与ptDNA内的同源区域(LBS和RBS)之间的同源重组(HR)进行(图ID)。相比之下，线性载体可以通过HR，EJ(末端结合；图IE)，或SI(链侵入；图IF)整合。在线性转基因盒(TCpCS31)的情形中，整合将是通过EJ或SI进行的，而不是通过HR，原因在于其仅包含一个与ptDNA同源的区域(RBS)(图1)。用引物P3/P6得到的PCR扩增产物表示通过链侵入得到的阳性转化体，但是，如果整合是通过EJ进行的，则不是。另一方面，aadA引物aL/aR将报道所有阳性转化体，而与机制无关。因此，使用P3/P6引物(与aadA引物相比，用TCpCS31有较低的数量，表2)的PCR数据暗示通过EJ整合，而不是SI整合。对于主要的TCpCS31，相对于aadA阳性转化体的总数，21％的整合是通过SI进行的，79％是通过EJ进行的(分别为4/19和15/19)。表3显示了使用线性DNA载体进行转基因整合的机制。

实施例2

烟草中的质体转化

烟草中的质体转化用幼小的刚展开的叶片和较老的完全展开的叶片使用壮观霉素选择(aadA基因)和病毒标记gfp进行。使用aadA载体，阳性转化体评分为1，在叶节上由一些愈伤组织样的生长。这样的组织是浅黄色的或绿色的，通常有毛状体从组织中伸出。选择培养基包含应该允许芽生长的激素(除了壮观霉素选择之外)；然而，没有得到芽。使用幼叶的质体转化比用较老的叶子号4至6倍(表4)。使用线性gfp载体也发现在质体中具有GFP表达的阳性转化体(图像未显示)。

烟草(Nicotiana tabacum)Petite Havana在连续光照下在控制温度的房间中在RM无菌生长。采集不同龄的叶片，并且在将背轴侧放置到RMOP平板上之前测量。然后用由环形或线性化pPRV111A(图2)或pPRV131B载体包被的0.7μm钨微载体轰击(Lutz等，Plant Physiol(植物生理学)145：1201-10，2007)。将叶片放置过夜，并且次日切成5x5mm的切片，并放置在含有500mg/L壮观霉素的RMOP选择平板上，背轴侧在培养基上。所用的RMOP琼脂已经由促使生长技术浓度改变为包含0.5mg/L NAA和0.5mg/L BAP。三至四周后，为叶片切片的再生评分(表4)。使用addA/壮观霉素选择烟草，具有选择“逃逸物(escapes)”不是不常见的(Svab和Maliga，Proc Natl Acad Sci USA(美国国家科学院学报)90：913-7，1993)，如由具有无DNA叶节的愈伤组织的存在所示的(表4)。还用显微镜检查已经用赋予GFP表达的pPRV131B轰击的叶片的GFP荧光(图像未显示)。将PCR引物aadA R1/L1加入到总组织DNA(ttDNA)中，并且在琼脂糖凝胶上以条带显现扩增的产物(表5)。

使用线性载体的质体转化效率略高于环形载体。对于TCpPRV111A，EcoRV/SacI消化不完全(琼脂糖凝胶分析，数据未显示)，产生LpPRV111A(图2B)和TCpPRV111A(图2C)二者，但是没有环形载体。使用TCpPRV111A得到比使用LpPRV111A略高的转化，这表明由仅一个ptDNA-靶向区域(RBS)加标记基因(aadA)组成的载体可以比具有RBS和LBS二者的载体更好地整合到质体基因组中。此外，由于苔类植物质体转化表明通过EJ比通过HR得到更好的整合，因此，对于TCpPRV111A较高的烟草转化体数目可能是由于EJ导致的。TCpPRV111A中RBS的末端是在预测与Zm End1/5类似的烟草ptDNA序列的～1500bp(表6和7)。

实施例3

在玉蜀黍、小麦和水稻中的质体转化

构建包含ptDNA末端序列和标记转基因(gfp)的用于玉蜀黍的质体转化载体(图3)。所用的方法和在玉蜀黍质体基因组内的末端序列的位置记述在下文中。非绿色玉蜀黍组织(成熟的胚和暗处生长的幼苗的茎秆)以及小麦和水稻组织(完整的或裂开暴露胚的种子)用于使用环形和线性化的载体通过粒子轰击进行质体转化。在轰击后数天，评价愈伤组织和发育中的芽组织的gfp表达，并且收集组织样品用于总组织DNA(ttDNA)制备、PCR和印迹杂交分析。

1.确定玉蜀黍ptDNA的末端序列。

在玉蜀黍中，质体基因组的尺寸为140,387bp(Maier等，J Mol Biol(分子生物学杂志)251：614-28，1995)。质体染色体DNA分子作为单位基因组尺寸的线性异构体(单体和多联体)和多基因组、分支的复合分子的集合存在(Oldenburg和Bendich，J Mol Biol(分子生物学杂志)335：953-70，2004)。玉蜀黍以及大部分(而不是全部)植物中的质体基因组具有四个确定的区域：大的单拷贝区(LSC)，小的单拷贝区(SSC)和两个反向重复区(IRs；IRa和IRb)。对于测序的质体基因组，第一个核苷酸(nt＝1)定义为不具有IRs的基因组中LSC或其等价物的起点。末端序列是与Ends(nts)相邻的区域(5′下游或3′上游)，如下文所述。

使用三种方法确定用于玉蜀黍ptDNA的末端序列：(1)单位点或两位点限制性消化，然后脉冲场凝胶电泳(PFGE)和印迹杂交，(2)与克隆质粒末端连接，然后对ptDNA插入物PCR扩增并测序，(3)与克隆质粒末端连接，然后是亚克隆到大肠杆菌中，质粒选择/制备和测序。

使用第一种方法，通过限制性酶消化和印迹杂交鉴定三个用于玉蜀黍ptDNA的离散的末端(Oldenburg和Bendich，J Mol Biol(分子生物学杂志)335：953-70，2004)。使用相同的方法，还已经鉴定了用于蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(Shaver等，Plant Physiol(植物生理学)146：1064-74，2008)和烟草(Scharff和Koop，Plant Mol Biol(植物分子生物学)62：611-21，2006)的ptDNA的末端。这种方法表明在玉蜀黍IRb中的末端大约位于nts 78,000，88,000和100,000，标准偏差为±5,000bp(末端也在IRa中)。

对于其他方法，将线性化的质粒，如pBluescript，连接到通过标准方法制备的玉蜀黍ptDNA的末端(Oldenburg和Bendich，J Mol Biol(分子生物学杂志)335：953-70，2004)。通过PFGE将凝胶内质粒-连接的-ptDNA分开，并且将充分结合的级分(多基因组、分支的线性形式)和限定单体级分从凝胶上切下。下一步是用限制酶(如BamHI)消化该质粒-连接的-ptDNA，以产生在质粒多接头和ptDNA中相容的末端，然后连接所述相容的末端。然后，使用通用引物(M13正向和反向)利用两种方法测序与质粒相邻的末端。第一种是使用M13引物的PCR，以扩增包含末端区域的ptDNA插入物。利用琼脂糖凝胶电泳来分开PCR产物，然后切下DNA条带并测序。第二种方法是用质粒-ptDNA进行大肠杆菌转化，选择克隆，质粒小量制备，并且对具有包含末端序列的ptDNA插入物的质粒进行测序。这些方法使用来自几种不同玉蜀黍ptDNA制备物的ptDNA进行并且在分支的线性(充分结合的)和线性的单体分子上进行。利用这两种方法确定五种末端序列的位置(表6和图11-15)。End3的末端是在nt 87,402，并且可能对应于之前通过限制性消化和印迹杂交鉴定的末端(nt 88,000)。End1/5用来构建用于玉蜀黍、小麦和水稻质体转化的载体(见下；图3)。

对于苔类植物和烟草，评估质体基因组和转化载体与玉蜀黍ptDNA末端的序列相似性(表6和7)。对于所有的玉蜀黍末端存在序列同源性，在烟草中对于五种玉蜀黍末端中的三种以及对于苔类植物与五种中的两种具有近乎精确的末端序列(＞90％的同一性)(尽管这些中的一种是在LSC中而不是在IRs中)。如更详细地显示地，在小麦、水稻和烟草的ptDNAs中存在与玉蜀黍ptDNA End1/5的实质上的序列同源性，在苔类植物ptDNA中具有较短的同源性区域(约40bp)(图6)。有趣地，用于苔类植物和烟草质体转化的线性化载体的末端接近推定的末端序列，所述推定的末端序列是通过与玉蜀黍末端进行比较而确定的(表6和7)。

2.用于玉蜀黍、小麦和水稻的质体转化的载体构建。构建并检测两种载体用于玉蜀黍、小麦和水稻中的质体转化(图3，A-D)。载体由插入到克隆质粒pBluescript II KS+中的LBS和RBS区域、标记转基因和表达控制区构成(表8)。用这三种区域中的每一种单独地和与独特的限制性位点构建质粒，以允许模块组装和多重质体转化载体的检测。另外，优化密码子用于在玉蜀黍质体中表达。质粒pZMCP120包含标记转基因gfp(pzmcpGFP)，其侧翼连接用于psbA的16S rRNA启动子+5′-UTR(分别为：IRb中nts 94976：95095和LSC中1151：1311)和psbA的3′-UTR(LSC中nts 1：88)的玉蜀黍ptDNA表达调控序列(pZmPrrnpsbA53)。质粒pZMCP112包含对应于IRb的nts 94976：96740的LBS1/RBS1序列，并且在End5的5′下游处(pZMCP112)。对于质体转化载体pZMCP150，调节/标记序列插入在pZMCP112的SalI限制性位点处。质粒pZMCP113包含对应于IRb的nts 93476：94976的LBS2/RBS2序列，并且在End5的3′上游处。对于质体转化载体pZMCP152，，调节/标记序列插入在pZMCP113的SalI限制性位点处。

还通过限制性消化产生四种另外的线性在载体，并且检测在玉蜀黍、小麦和水稻中的质体转化(图3，E-G)。TC2pZMCP152包含具有End5和最小RBS(27bp的区域)的完整的LBS(图3E)。T3pZMCP152包含完整的RBS和最小的LBS(172bp)，没有End5(图3F)。TC4pZMCP152包含完整的LBS和RBS区域，但是末端序列包含来自克隆质粒的113和205bp(图3G)，由此模糊或“封闭”ptDNA的“真正的末端”。

3.用于载体递送、玉蜀黍、小麦和水稻组织培养和质体转化的方法。将种子(玉米(Zea mays)自交种B73，小麦(Triticum aestivum)品种中国春小麦，或日本水稻(Oryza sativajaponica)品种M104)在20％漂白剂(+1滴吐温20)中消毒30分钟，然后用无菌水润洗几次。将种子浸泡2-5天，并且切下玉蜀黍胚。将完整的胚或3-4mm的玉蜀黍片放置在含有1mg/L 2，4-D和0.5mg/L BAP的N6琼脂板的中央并且放置在暗处。对于小麦和水稻，将完好的或裂开露出胚的整个种子放置在N6平板上。在放置完好的胚后一天或在放置胚片后3-10天(此时已经发育愈伤组织和/或芽)，使用由环形或线性化载体包被的0.3或0.4μm的金微载体进行粒子轰击。

对于暗处生长的玉蜀黍的幼苗，将种子放置在含有MS琼脂的Magenta盒中，并且在暗处生长1-3周。将茎秆(从基底分生组织节到第一片叶片的舌叶，L1)切成3-4mm的切片，并且放置在含有1mg/L 2，4-D和0.5mg/L BAP的N6琼脂板上，并在暗处保持约1周。然后，用具有环形或线性载体的0.3μm的金微载体进行生物弹道学。将平板和茎秆组织保持在暗处，并且辨别愈伤组织、茎、和芽组织的生长。

4.质体转化结果。关于GFP表达评估玉蜀黍组织的质体转化。通过手持激光器(ex 405nm)和配有SYBR绿色滤光器(em 520nm)的解剖显微镜通过目测评估初始GFP表达。在生物弹道学后3天内，在一些平板上辨别出具有推定的GFP-质体细胞的扇形叶片。一般地，在生物弹道学后5-10天进行GFP表达的检查(表9和10)，并在平板的底部上标记阳性组织的位置。选择单片的组织(通过激光器对GFP阳性的和阴性的两种)通过荧光显微镜检查。在用环形和线性载体转化的玉蜀黍组织中观察到具有GFP-质体的细胞(表10，图4和5)。为了进一步评估转化效率，将来自每个转化平板的一些组织片进行处理得到ttDNA，并且通过用gfp-特异性引物进行的PCR扩增和与DIG-gfp探针的点印记杂交进行评价(表9)。

对于具有“真正的末端”的线性载体(图3D)和其中末端序列被“非真正的末端”“封闭”的线性载体(在这种情形中，为克隆质粒的一部分)(图3G)评估质体转化的效率。从载体转化的玉蜀黍组织制备原生质体，并且通过荧光显微镜评估GFP表达(表11)。与环形和“非真正的末端”的线性载体相比，使用具有“真正的末端”的线性载体得到约2倍更高的转化效率。转基因的整合可以通过对“真正的末端”、“非真正的末端”线性的和环形的载体的双重相互性同源重组进行。然而，所述“真正的末端”的线性载体还能够通过末端结合或链侵入进行整合。

如上文关于玉蜀黍所述，通过小麦ttDNA的GFP荧光成像和DIG-gfp点印迹杂交(表12)显示小麦和水稻(表12)的阳性转化。

表1苔类植物细胞的质体转化

^a总轰击数：用于粒子轰击的具有苔类植物细胞的平板数。

^b1°选择后的阳性转化体数：给出来自所有平板的绿色集落的平均数和单个平板的范围。

^c转化效率：给出来自所有平板的每克细胞的绿色集落的平均数(转化体数目/～0.2-0.3g细胞)和单个平板的范围。

表2苔类植物质体转基因整合的PCR和印迹杂交评估

^a用于来自推定的转化体的总组织DNA的PCR扩增的引物组(见图1)。

^b来自推定的苔类植物转化体的总组织DNA与aadA基因探针的点印迹杂交。

^c所用的载体。来自一级(1°)和二级(2°)选择的转化体。

^dPCR扩增或aadA杂交为阳性的转化体数目/所检测的绿色集落的数目。

^e阳性转化体的百分数。

表3使用TCpCS31(aadA-RBS)进行苔类植物质体转化的PCR产物和基因整合的机制

^a用于扩增来自由苔类植物组织制备的总组织DNA(ttDNA)的转基因区域的PCR引物组。引物LWT-P5和-P6对应于侧翼连接整合的转基因(在其外侧)的野生型ptDNA序列。

^b用PCR引物组扩增的ptDNA内的转基因区域。

^cHR：同源重组；EJ：末端结合；SI：链侵入。注意：转基因的HR整合需要LBS和RBS二者。因此，由于不包含LBS区域，TCpCS31不通过这种机制整合。相比之下，对于包含LBS和RBS二者的环形pCS31和线性化的pCS31，的确发生通过HR的转基因整合。

表4烟草的质体转化

载体a	酶b	叶龄c	叶节数d	愈伤组织数e	％愈伤组织f
						无DNA		幼小的	194	26	13
无DNA		老的	238	44	18
						pPRV111A		幼小的	225	44	20
pPRV111A		老的	234	30	13
						LpPRV111A	EcoRV	幼小的	135	44	33
LpPRV111A	EcoRV	老的	113	21	19
						TCpPRV111A	EcoRV/SacI	幼小的	29	15	52
TCpPRV111A	EcoRV/SacI	老的	48	36	53

^a来自七次实验的总数据：用由不用DNA包被的、用环形载体pPRV111A或线性化载体LpPRV111A(四次实验)和TCpPRV111A(三次实验)包被的钨粒子进行的粒子轰击。

^b用于pPRV111A线性化的限制性酶。EcoRV消化是完全的，并且产生单个线性条带LpPRV111A。EcoRV/SacI消化对于EcoRV是完全的，但是对于SacI仅是部分的，由此产生对应于LpPRV111A、TCpPRV111A和残余的pUC119的三个条带。

^c用于轰击的叶片的叶龄。

^d叶节总数。

^e具有愈伤组织生长的切片数目。

^f具有愈伤组织生长的叶节百分数。

表5利用针对aadA转基因的PCR的烟草质体转化的效率

^a来自单次实验的数据：用由不用DNA包被的、用环形载体pPRV111A或线性化载体LpPRV111A(用EcoRV/SacI限制性消化pPRV111A)包被的钨粒子进行生物弹道轰击。

^b总组织DNA(ttDNA)由在选择培养基上3-4周后的叶片制备。

使用aadA引物具有PCR产物的ttDNA样品数/所检测的总ttDNA样品。

^cPCR产物量的相对定量(目测)：-没有产物；+/-极弱的DNA条带；+至+++逐渐增加的DNA量。

表6玉蜀黍ptDNA的末端序列和通过与玉蜀黍ptDNA末端序列比对确定的推定的烟草和苔类植物ptDNA末端

^a针对玉蜀黍ptDNA鉴定的末端。对PCR产物和质粒独立地进行序列比较以鉴定玉蜀黍质体基因组内末端的位置，然后，如果发现相似的末端位置，作为组合的组。由此，End1(用PCR产物确定的)和End5(用质粒确定的)通过与玉蜀黍ptDNA序列的ClustalW比对鉴定为相同的末端序列。

^b通过测序PCR产物或具有ptDNA插入物的质粒确定的末端。测序反应使用M13引物。

^c确定每个末端的测序的PCR产物和/或质粒的数目(#Seq′ed)。末端测序总共使用五种不同的ptDNA制备物。

^d烟草和苔类植物质体基因组上的末端序列的位置：LSC，长的单拷贝区；SSC，短的单拷贝区；IRb，反向重复b；IRa，反向重复a。

^e核苷酸区域对应于玉蜀黍ptDNA序列登记号X86563。

^f与玉蜀黍ptDNA测序的末端相比，烟草和苔类植物ptDNAs推定的末端的区域。核苷酸区域分别对应于序列登记号NC_001879和X04465。用MacVector进行比较。通过“与参照(Zm末端序列的120bp)比对”确定的无(None)预测＞90％的同一性。对于“ClustalW比对”，存在烟草ptDNA针对ZmEnd3的68％的同一性(ID)和针对ZmEnd6的84％的ID，对于苔类植物针对ZmEnd2的69％的ID，针对ZmEnd3的78％的ID和针对ZmEnd4的63％的ID。

表7烟草和苔类植物ptDNA末端序列的位置

^a烟草和苔类植物质体基因组上末端序列的区域：LSC，长的单拷贝区；SSC，短的单拷贝区；IRb，反向重复b；IRa，反向重复a。

^b末端序列在烟草质体基因组上的核苷酸(nt)。

^c通过限制性消化确定的末端序列(±5000bp)(Scharff和Koop 2006PlantMol Biol(植物分子生物学)62：611-621；Scharff和Koop 2007Plant J(植物学杂志)50：782-794)。

^d如果切割产生两个片段，即，克隆的质粒+LBS-转基因-RBS，针对线性化的载体LpPRV111A和LpPRV131B的准确的末端核苷酸。

^e对于载体TCpPRV111A-SacI，末端在V-End7-LBS，并且在预测与ZmEnd1/5同源的烟草末端的1504bp(表6)。

^f对于载体LpPRV111A-EcoRV，末端在V-End8-RBS，并且在预测与ZmEnd2同源的烟草末端的307bp(表6)。

^g如果切割产生两个片段，即，克隆的质粒+LBS-转基因-RBS，针对线性化的载体LpCS31的准确的末端核苷酸。

^h对于载体LpCS31-SacI和TCpCS31-NotI/SacII，末端在V-End1-RBS，并且在预测与ZmEnd1/5同源的苔类植物末端的2952bp。在V-End1-LBS的末端是在预测与ZmEnd1/5同源的苔类植物末端的1950bp(表6)。

表8质粒/载体

表9具有用手持激光器成像的GFP荧光和与gfp探针的点印迹杂交的玉蜀黍组织

^a用于对每个平板进行轰击的载体。

^b来自3-4次生物弹道学实验的数据，例外的是对于TC2pZMCP152和TC3pZMCP152的单次实验。每个平板包含12-17个成熟的胚。

^c来自单次生物弹道学实验的数据。每个平板包含14-17个来自暗处生长的幼苗的茎秆。nd：没有进行实验。

^d具有GFP扇形叶片的(胚或茎秆)个数/组织片数的总数。用解剖显微镜进行目测。

^e具有GFP荧光的愈伤组织/芽扇形叶片的百分数。

^f来自单次生物弹道学实验的数据。由生物弹道学后的几片组织制备ttDNA，点样到N⁺尼龙膜上，并且与DIG-gfp探针杂交。给出对gfp杂交阳性的数目/ttDNA样品总数。

表10具有GFP-质体的玉蜀黍细胞

^a单生物弹道学实验。每个平板包含12-17片成熟的胚。

^b用于轰击每个平板的载体。

^c从每个平板选择单片(T13和T19除外)玉蜀黍组织并且显微镜检查在质体中具有GFP表达的细胞。将所述组织涂抹到显微镜载玻片上。显微镜检查后，将该组织从载玻片上刮下用于制备ttDNA和PCR分析。

^d用手持激光器和解剖显微镜评估每个平板上所有的胚片的GFP表达(表8)。使用这种方法，从每个平板上选择用于通过表面荧光显微镜分析GFP-质体的单片组织是阳性的(+)或阴性的(-)。

^e在质体中具有GFP表达的细胞的百分数。

表11具有GFP-质体的玉蜀黍原生质体

^a用于对每个平板进行轰击的载体。pZMCP152是环形载体。对于线性载体TC1pZMCP152，End5的3′端在LBS区露出。对于线性载体TC4pZMCP152，End5的3′端被在LBS区的克隆质粒的片段“封闭”。

^b由单个平板的转化的玉蜀黍组织制备原生质体，然后，用荧光显微镜检查质体中GFP的表达。先用白光鉴定个体原生质体，然后用GFP-滤光器评估具有(#GFP)和不具有(#无GFP)GFP信号的原生质体。

表12与gfp探针点印迹杂交的小麦组织和具有用手持激光器成像的GFP表达的水稻组织

^a用于轰击每个平板的载体。

^b对小麦进行两次生物弹道学实验，总共有三个平板的种子用每种载体轰击，两个没有DNA。每个平板包含20粒小麦种子，其中在生物弹道学之后从每个平板随机选取4-8棵幼苗用于通过印迹杂交进行分析。从生物弹道学之后的幼苗制备ttDNA，点样到N⁺尼龙膜上，并与DIG-gfp探针杂交。给出关于gfp-杂交阳性的数目/ttDNA样品总数。nd：没有进行。

^c进行单次生物弹道学实验。每个平板包含18粒裂成两片的水稻种子。通过手持激光器和解剖显微镜观察确定具有GFP表达的组织片数/种子的总数。

在本文提供的描述中，本文提供的任何范围包括该范围内的所有值。还应该注意，术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用(即，意指备选项中的一个、两个或其任意的组合)，除非内容上另外清楚地指明。此外，当用在本说明书中和附上的权利要求书中时，单数形式“一个(‘a，’‘an，’)”和“这个(‘the’)”包括复数指代，除非内容上清楚地另外指明。

上述各个实施方案可以组合，以提供另外的实施方案。本说明书中引用的和/或申请数据表中列出的所有的美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公布都通过引用完全结合在本文中。如果需要，实施方案的多个方面可以进行修改，以利用多个专利、申请和公布的概念来提供另外的实施方案。

根据上文的详细描述，可以对实施方案进行这些和其他的改变。通常，在下述权利要求书中，所用的术语不应该解释为将权利要求限制为本说明书和权利要求书中公开的具体的实施方案，而是应该解释为包括所有可能的实施方案以及所述权利要求所赋予的等价物的全范围。因此，权利要求书不受本公开内容的限制。

Claims (23)

1.质体转化的方法，其包括：(a)向植物组织的质体中引入线性DNA载体，其中

(i)所述质体包含基本上不降解的质体DNA，和

(ii)所述线性DNA载体包含：

(1)质体DNA靶向序列，和

(2)目的转基因。

2.权利要求1的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述植物是苔类植物或相关物种。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述目的转基因选自由下述组成的组：编码治疗性或预防性多肽的基因，提供或增强除草剂抗性、昆虫抗性、真菌抗性、细菌抗性和胁迫耐受性的基因，以及提高氮固定、矿物质营养、植物产量、淀粉累积、脂肪酸累积、蛋白累积和光合作用的基因。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述线性DNA载体进一步包含编码选择标记的基因。

6.权利要求5的方法，其中所述选择标记是提供针对壮观霉素、链霉素、卡那霉素、潮霉素、氯霉素、草甘膦或双丙氨膦抗性的基因。

7.权利要求5的方法，其中所述选择标记是提供甘露糖代谢的基因。

8.权利要求5的方法，其中所述选择标记是编码荧光蛋白的基因。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述质体DNA靶向序列包含质体染色体DNA分子的末端序列。

10.权利要求9的方法，其中质体末端序列与SEQ ID NO：1，8，15，21，29，35，41或47的一部分至少90％相同，所述部分长度为至少30个核苷酸。

11.权利要求9的方法，其中所述质体末端序列：

当所述植物组织是玉蜀黍组织时，包含SEQ ID NO：2，9，16，22，27，28，30，36，42，48，53，54，55，56或57的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是小麦组织时，包含SEQ ID NO：3，10，17，23，31，37，43或49的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是水稻组织时，包含SEQ ID NO：4，5，11，12，18，19，24，25，32，33，38，39，44，45，50或51的至少30个连续的核苷酸，

当所述植物组织是烟草组织时，包含SEQ ID NO：6，13，20，26，34，40或52的至少30个连续的核苷酸，或

当所述植物组织是苔类植物组织时，包含SEQ ID NO：7或46的至少30个连续的核苷酸。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述线性DNA载体包含在5′端或3′端的单链突出端，可以或可以不与所述线性DNA载体的两条DNA链共价连接的单链环，或不是与5′端或3′端共价连接的核苷酸的分子。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述植物组织是非绿色组织。

14.权利要求13的方法，其中所述非绿色组织是成熟胚的一部分、暗处生长的幼苗的一部分、种子或种子的一部分。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述质体是前质体、黄化质体或其他非绿色质体。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中通过用由所述线性DNA载体包被的微粒生物弹道轰击植物组织进行步骤(a)。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其还包括(b)避光培养来自步骤(a)的植物组织。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其还包括(c)由步骤(a)或步骤(b)的植物组织再生转质体植物。

19.权利要求18的方法，其中所述转质体植物是同质的。

20.通过权利要求1-19中任一项的方法得到的转质体植物或植物部分。

21.权利要求20的植物或植物部分的后代。

22.用于植物中质体转化的线性DNA载体，所述载体包含：

(1)质体DNA靶向序列，其包含质体末端序列，和

(2)表达盒，其包含：

(a)任选地，在要转化的植物的质体中有活性的启动子，

(b)用于接纳目的转基因的DNA插入位点，

(c)任选地，一个或多个选择标记，和

(d)任选地，编码在要转化的植物的质体中有活性的转录终止区的DNA序列。

23.权利要求22的线性DNA载体，其还包括在DNA插入位点插入的目的转基因。