CN1675366A - 经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了适宜转化非绿色植物细胞的质体转化载体，其中质体载体包含可操作连接的元件——第一侧翼序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列。

Description

经由体细胞胚胎发生的质体遗传工程
关于联邦政府资助的研究的声名
在此申请中报道的研究部分地受到NIH R 01 GM63879资金的资助。
发明领域
本发明领域涉及植物质体遗传工程。更具体的是，本发明涉及通过质体转化来转化非绿色植物细胞，以及随后通过体细胞胚胎发生来再生非绿色植物细胞。
背景技术
因为具有若干有吸引力的有利条件，包括高水平的转基因表达(Daniell等人，2002)、单一转化事件中的多基因改造(DeCosa等人，2001；Ruiz等人，2003；Daniell & Dhingra，2002)、经由母系遗传的转基因限制(Daniell2002)、基因沉默的缺乏(Lee等人，2003；DeCosa等人，2001)、位点特异的转基因整合导致的位置效应(Daniell等人，2002)和多重效应(Daniell等人，2001；Lee等人，2003)，因此质体对于遗传工程而言是理想的。叶绿体遗传工程最适合高表达疫苗抗原和生产有价值的治疗蛋白质。自从我们展示了用于各种生物医学用途的人弹性蛋白衍生聚合物的表达(Guda等人，2000)，我们已将这一方法拓展到表达霍乱、炭疽的疫苗抗原(Daniell等人，2001，Daniell 2003)、单克隆抗体(Daniell等，2001)和人的治疗蛋白质，包括人血清白蛋白(Fernandez等，2003)、爪蟾抗菌肽(DeGray等，2001)、干扰素(Daniell，2003)和胰岛素样生长因子(Daniell，2003)。一些别的实验室已经在转基因叶绿体中表达了人生长激素干扰素-GUS(Human Somatotropin Interferon-GUS)融合蛋白质来提高稳定性(Reddy等人，2003)并在转基因叶绿体中表达了破伤风疫苗抗原(Tregoning等人，2003)。毫无例外，所有这些治疗蛋白质都被表达于转基因烟草叶绿体中，符合各种环境团体针对用于植物来源药物的食品作物倡仪的零容许度(zero-tolerance)。
然而，迫切需要治疗性蛋白质和疫苗抗原的口服递送来大大降低它们的生产、纯化、储存和运输成本，并最小化与静脉给药相关的并发症。因为饮食中胡萝卜是优异的糖、维生素A、C和纤维的来源，胡萝卜(Daucuscarota L.)成为全球范围内人和动物食用的最重要的蔬菜之一。胡萝卜是两年生植物，在两年内完成其生命周期。在第一年植物产生可食的肉质主根。如果将其留在地里，在经过一个寒冷的季节后，植物于第二年开花(Yan，W.& Hunt，L.A Reanalysis of Vernalization Data of Wheat and Carrot，Annals of Botany 84，615-619(1999))。另外，种植的胡萝卜作物的叶绿体基因组严格通过母系遗传传递(Vivek等人1999)。因此，胡萝卜在环境上是安全的，并且通过双重保护阻止了转基因经由花粉和种子的流动，从而符合对食品作物中的转基因流动提出的零容许度倡仪。胡萝卜体细胞胚是单细胞来源的，通过循环的胚胎发生扩增；这提供了一致的细胞培养物来源，这一点是生产治疗蛋白质的必要条件之一(均一单一来源)。使用生物反应器，胡萝卜细胞迅速分裂并产生大量的生物量。培养的胡萝卜细胞是可食的，并可以被直接用于递送精确剂量的疫苗抗原或生物药物。当经由可食胡萝卜进行给药时不需要烹饪，这将保持治疗蛋白质在食用过程中的结构完整性。在培养基中能长期生存的、包裹的胚可以作为人工种子用于低温储藏和有控制的萌发(Tessereau，H.，B.Florin，M.C.Meschine，C.Thierry和V.Petiard，1994)。因此，具有增加的医学或营养价值的转基因胡萝卜能够在改善人或动物的健康方面扮演至关重要的环节。
然而，要改造胡萝卜基因组必须克服几个主要的障碍。迄今为止，仅使用过含有大叶绿体的绿叶作为外植体来转化叶绿体基因组。第一个挑战是向小的前质体引入外源DNA并鉴定在非绿色质体中具有功能的适当的调节序列和选择标记。第二个挑战是经由体细胞胚胎发生再生叶绿体转基因植物并实现同质性(homoplasmy)，这一点不具有当使用叶作为外植体时由器官发生提供的可以进行随后循环选择的好处。由于这些原因，叶绿体遗传工程仅在除烟草之外的一些茄科作物中被完成，如番茄(Ruf等人，2001)和马铃薯(Sidorov等人，1999)，但是后一作物保持不育。即使再生可能从绿叶经由器官发生实现，转化非茄科作物仍然是一挑战。例如，拟南芥属(Arabidopsis)转基因植物是不育的(Sidkar等人，1998)，而在油菜作物中甚至稳定的整合和同质性都不能实现(Bing Kai Hou等人，2003)。
表1显示在叶绿体中表达转基因的发展例表。
表1：叶绿体中的转基因表达
农艺性状 基因 启动子  5’/3’调节元件  参考文献
昆虫抗性 Cry1A(c) Prrn  rbcL/Trps 16  Mc Bride等人1995
除草剂抗性 CP4(碧冬茄) Prrn  ggagg/TpsbA  Daniell等人1998
昆虫抗性 Cry2Aa2 Prrn  ggagg(天然)/TpsbA  Kota等人1999
除草剂抗性 CP4(细菌或人工) Prrn  rbcL或T7基因10/Trps 16  Ye等人2001
昆虫抗性 Cry2Aa2操纵子 Prrn  天然5’UTR/TpsbA  DeCosa等人2001
疾病抗性 MSI-99 Prrn  ggagg/TpsbA  DeGray等人2001
耐盐和耐干旱 tps Prrn  ggagg/TpsbA  Lee等人2003
植物治疗 merAa/merBb Prrn  ggagga，b/TpsbA  Ruiz等人2003
生物药用蛋白质 基因  启动子  5’/3’调节元件 ％tsp表达 参考文献
基于蛋白质的聚合物 EG121  Prrn  T7基因10/TpsbA 没有测试 Guda等人2000
人生长激素 hST  Prrna，PpsbAb  T7基因10a或psbAb/Trps16 7.0％a和1.0％b Staub等人2000
霍乱毒素 ctxB  Prrn  ggagg/TpsbA 4％ Daniell等人2002
破伤风毒素 TetC(细菌和人工 Prrn T7基因10a，atpBb/TrbcL  25％a，10％b Tregoning等人2003
人血清白蛋白 hsa Prrna，PpsbAb ggagga，psbAb/TpsbA  0.02％a，11.1％b Fernandez-San Milan等人
干扰素α5 INFα5 Prrn PpsbA/TpsbA  ND Torres
干扰素α2B INFα2B Prrn PpsbA/TpsbA  19％ Falconer
干扰素γ ifn-g PpsbA PpsbA/TpsbA  6％ Leelavathi和Reddy，2003
单克隆抗体 Prrn ggagg/TpsbA  ND Daniell等人(光合作用)
胰岛素样生长因子 Igf-1 Prrn PpsbA/TpsbA  33％ Ruiz G
炭疽热保护性抗原 Pag Prrn PpsbA/TpsbA  4-5％ Watson
瘟疫疫苗 CaF1～LcrV Prrn PpsbA/TpsbA  4.6％ Singleton
发明概述
本发明一方面描述运用高效率的转化胡萝卜质体的方法，通过体细胞胚胎发生来转化质体的方法。本发明的其它方面还提供能够通过体细胞胚胎发生来转化质体的载体。另一方面还提供转化的质体、植物和植物部分，它们已经通过这里描述的方法和载体，经体细胞胚胎发生被转化。
本申请结合现有技术为改造若干主要作物的质体基因组(其中，通过体细胞胚胎发生介导再生)，提供了必要的指导和教导。谷类作物(小麦、稻、玉米、甘蔗)、豆类(大豆、苜蓿)、油料作物(向日葵、橄榄)、经济作物(棉花、咖啡、茶、橡胶、亚麻、栓皮栎、松树)、蔬菜(茄子、黄瓜、木薯、辣椒、芦笋等)、水果(苹果、樱桃、香蕉、大蕉、瓜类、葡萄、番石榴)、坚果(腰果、胡桃、花生)和树(海枣等)可以通过体细胞胚胎发生进行再生。本发明的另一方面展示使用同样的引物(通用质体引物)构建用于多种不同物种的叶绿体载体。
附图简述
图1(A-B)显示胡萝卜叶绿体转化载体的物理图谱。
图1(A)显示胡萝卜叶绿体转化载体pDD-Dc-gfp/BADH，该载体携带分别处于T7的基因10 5’非翻译区(UTR)/rps 16 3’UTR和PpsbA 5’及3’UTR调节之下表达的gfp和BADH基因。具有PEP和NEP识别位点的16S r-RNA基因的Prrn启动子驱动该盒子的表达。
图1(B)显示携带aadA和BADH基因的胡萝卜叶绿体转化载体pDD-Dc-aadA/BADH。aadA基因的表达处于Shine-Dalgarno序列和psbA3’UTR的调节之下，而BADH的表达受基因10 5’和rps 16 3’UTR调节。显示了用作转基因植物Southern分析探针的AflIII/PvuII消化的约4.9kbDNA片段和用来确证转基因整合进胡萝卜质体的3P/3M和16SF/1M引物的着陆点(landing site)。
图2(A-C)显示用叶绿体载体pDD-Dc-gfp/BADH转化的胡萝卜培养物中GFP的表达；在488纳米蓝色氩气(激光)的激发下，于共聚焦荧光显微镜下可见发出绿色荧光。
图2(A)显示未转化的对照胡萝卜培养物，
图2(B)显示转化的胚性愈伤组织(embryogenic calli)，
图2(C)显示转化的胡萝卜胚性愈伤组织分化成球形体细胞胚和
图2(D)显示分化进入子叶阶段的体细胞胚。
图3(A-D)表示：相对于黄色非转基因胡萝卜细胞培养物可以目视挑选绿色转基因细胞。
图3(A-B)表示：由于表达BADH而变成绿色的转基因胡萝卜细胞培养物(A盘)，而野生型培养物保持黄色(B盘)。当异质性(heteroplasmic)转基因细胞系被置于没有任何选择试剂的培养基中时，可以根据转基因细胞培养物相对于黄色非转基因胡萝卜细胞培养物为绿色的，而区分转基因胡萝卜细胞培养物(C盘和D盘)。
图4(A-C)表示：通过PCR和Southern印迹分析确证转基因(aadA和badh)整合进胡萝卜质体基因组。
图4(A)表示：使用内部引物3P(在侧翼序列上着陆)和3M(在aadA基因上着陆)，在64℃的退火温度下扩增出约1.65kb大小的PCR产物，确证转基因整合进植物细胞系。
图4(B)表示：使用16SF引物(在天然叶绿体基因组上着陆)和1M引物(在aadA基因上着陆)，在64℃的退火温度下扩增出约2.5kb大小的PCR产物，确证转基因的质体特异整合。泳道2代表来自非转基因胡萝卜细胞的DNA，泳道2-9代表来自几个转基因胡萝卜细胞系的DNA。引物对(3P/3M和16SF/1M)的引物着陆位点示于图1B。
图4(C)表示：未被转化和被载体pDD-Dc-aadA/BADH转化的胡萝卜质体基因组的southern印迹分析。用AflIII和PvuII消化胡萝卜基因组DNA(每泳道5μg)并将其转移到硝酸纤维素膜，与放射性标记的4.9kb P32DNA探针(含有2.4kb侧翼序列和2.5kb转基因序列，见图1B)杂交。泳道1，来自未被转化的转基因植物的对照DNA显现出2.4kb大小的条带，而泳道2中来自细胞系1的异质性转基因植物显现出两个条带。通过在液体培养基中反复的传代培养转基因细胞从不同细胞系获得同质性的转基因植物(泳道3-8)。
图5(A-B)表示：在未被转化和被质体载体pDD-Dc-aadA/BADH转化的胡萝卜的蛋白质提取物中分析BADH酶活力(nmol/min/mg/蛋白质)和BADH表达。
图5(A)表示：在甜菜醛存在的情况下，根据NADH的形成，在340nm分析依赖于NAD+的BADH酶的还原作用。在未被转化的细胞悬浮液(U)、胡萝卜根(U)和叶(U)中检测到了非常低的BADH活力。另一方面，在转化的胡萝卜细胞悬浮液(T)和根(T)中记录到相对于叶(T)组织分别约54％和72％的高BADH活力。
图5(B)表示：通过western印迹分析BADH表达。从转化和未被转化的胡萝卜细胞培养物、根和叶组织制备全细胞提取物，从每一样品取50μg的总可溶性蛋白质进行10％SDS-PAGE，将蛋白质转移到Imnuno-blotTM PVDF膜并与多克隆抗-BADH血清(制备于兔子中的抗天然BADH抗血清)杂交。使用与辣根过氧化物酶偶联的二级抗体检测抗原肽。泳道1、2、3含有来自未转化的细胞培养物、根和叶的全胡萝卜提取物，泳道4、5、6含有来自转化的细胞培养物、根和叶的全胡萝卜提取物。与叶(泳道6)相比，转基因的细胞(泳道4)和根(泳道5)表达的BADH蛋白质分别约少50％和25％。
图6(A-C)表示：不同的盐浓度对未被转化和被叶绿体载体pDD-Dc-aadA/BADH转化的胡萝卜细胞悬浮培养物生长的影响。
图6(A)表示未转化的胡萝卜细胞培养物干物质。
图6(B)表示产生于含有100mM NaCl的液体培养基中的转化细胞培养物。
图6(C)表示盐存在情况下对BADH活力的刺激。以悬浮培养物形式将未转化和转化的胡萝卜细胞在含有0、100、200和300mM NaCl的液体培养基中以速度130rpm于摇床上振荡两周。当液体培养基中含有100和200mM NaCl时，在转基因细胞培养物中观察到了提高的BADH活力水平。
图7表示：盐(100-500mM NaCl)对未转化(U)和转化的(T)胡萝卜植物的影响。转基因植物在不同浓度的NaCl下被测试一个月。持续四周隔天使用含有不同浓度NaCl的水灌溉植物。
图8表示质粒pDD-Ta-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc以及来自小麦(Triticum aestivum)的侧翼区域(Ta)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图9表示质粒pDD-So-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc以及来自甘蔗(Saccharum officinarum)的侧翼区域(So)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图10表示质粒pDD-Dc-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自胡萝卜(Daucus carota)的侧翼区域(Dc)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图11表示质粒pDD-Dc-aadA/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/壮观霉素/XL-1 Blue MRF′Tc和来自胡萝卜(Daucus carota)的侧翼区域(Dc)的pDA-29(aadA/BADH表达盒)。
图12表示质粒pDD-Dc-gfp/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1Blue MRF′Tc和来自胡萝卜(Daucus carota)的侧翼区域(Dc)的pDA-30(gfp/BADH表达盒)。
图13表示质粒pDD-Gh-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的侧翼区域(Gh)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图14表示质粒pDD-Gh-aadA/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/壮观霉素/XL-1 Blue MRF′Tc和来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的侧翼区域(Gh)的pDA-29(aadA/BADH表达盒)。
图15表示质粒pDD-Gh-gfp/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的侧翼区域(Gh)的pDA-30(gfp/BADH表达盒)。
图16表示质粒pDD-Zm-aadA/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/壮观霉素XL-1 Blue MRF′Tc和来自玉米(Zea mays)的侧翼区域(Zm)的pDA-29(aadA/BADH表达盒)。
图17表示质粒pDD-Zm-gfp/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和来自玉米(Zea mays)的侧翼区域(Zm)的pDA-30(gfp/BADH表达盒)。
图18表示质粒pDD-Zm-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自玉米(Zea mays)的侧翼区域(Zm)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图19表示质粒pDD-Pv-aphA-6/nptII(柳枝稷)。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自柳枝稷(Panicum virgatum)的侧翼区域(Pv)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图20表示质粒pDD-Pv-aadA/BADH(柳枝稷)。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/壮观霉素XL-1 Blue MRF′Tc和来自柳枝稷(Panicum virgatum)的侧翼区域(Pv)的pDA-29(aadA/BADH表达盒)。
图21表示质粒pDD-Cd-aphA-6/nptII(狗牙根)。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescriptII KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自狗牙根(Cynodon dactylon)的侧翼区域(Cd)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图22表示质粒pDD-Nt-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自烟草(Nicotiana tabacum)的侧翼区域(Nt)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图23表示质粒pDD-Os-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′ Tc和来自稻(Oryza sativa)的侧翼区域(Os)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图24表示质粒pDA-66。更具体地，此质粒描述了psbA 5’UTRBACKBONE VECTOR pUC 19，它是pLD-CtV基本载体(修饰的MCS)的衍生物，具有选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自烟草的侧翼区域。
图25表示质粒pDD-Ta-aadA/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/壮观霉素XL-1 Blue MRF′Tc和来自普通小麦(Triticum aestivum)的侧翼区域(Ta)的pDA-29(aadA/BADH表达盒)。
图26表示质粒pDD-Ta-gfp/BADH。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和来自小麦(Triticum aestivum)的侧翼区域(Ta)的pDA-30(gfp/BADH表达盒)。
图27表示质粒pDD-Hv-aphA-6/nptII。更具体地，此质粒描述了具有载体pBluescript II KS的骨架、选择性标记/宿主细胞：氨苄青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和来自大麦(Hordeum vulgare)的侧翼区域(Hv)的pDA-76(aphA-6/nptII表达盒)。
图28是本文所述具有aphA-6和aphA-2基因的双管质体载体(DoubleBarreled Plastid Vector)的图解示意图，其中，所述两个基因赋予抗氨基糖苷抗性。
图29A和30A说明玉米叶绿体转化载体的构建，其中使用PCR扩增侧翼区域。克隆PCR产物并将表达盒插入trnI/trnA基因之间的转录活性间隔区域。图30A的表达盒具有驱动GFP和BADH表达的Prrn启动子，GFP和BADH的表达分别被(5’)基因10/rpsl6 3’和psbA 5’/3’UTRs调节。31A的表达盒具有驱动aadA和BADH表达的Prrn启动子，BADH基因被(5’)基因10/rpsl6 3’UTR调节。
图29B和30B表示：在大肠杆菌中测试玉米叶绿体转化载体中的基因的功能。为了观察GFP的表达，细胞被铺于LB琼脂(Amp)平板上，并在37℃孵育过夜。如在图30B中所见，当暴露于紫外光时，具有pDD34-ZM-GFP-BADH的细胞显示荧光。为了测试aadA基因表达，具有pDD33-ZM-aadA-BADH质粒的细胞被铺于含有壮观霉素(100mg/ml)的LB琼脂平板上，并在37℃孵育过夜。如在图31B中所见，转化的细胞能在壮观霉素中生长。
图31表示在共聚焦显微镜下研究的玉米胚发生培养物中GFP的表达。图32A是非转基因对照，而图32B-C是转化的玉米胚性愈伤组织。通过将轰击后的愈伤组织转移到含有BA或壮观霉素的愈伤组织诱导培养基中，于轰击后2天开始图30-31中的选择。八周后在荧光立体显微镜和共聚焦显微镜下检测来自不同轰击实验的若干健康生长的愈伤组织的GFP表达。在含有BA或壮观霉素的玉米再生培养基中自体细胞胚进行再生。
图32(A-B)表示在含有壮观霉素或甜菜醛的再生培养基上的玉米植株。图32A展示了能够在指示转基因玉米的构建的选择性试剂中生长的玉米叶绿体转基因植物，而未被转化的玉米植物不能在选择性培养基中生长。
图32B表示使用适当引物通过PCR确证叶绿体转基因植物。泳道1-3为pDD34-ZM-gfp-BADH转化的植物，泳道4-5为pDD33-ZM-aadA-BADH转化的植物。泳道-和+分别表示阴性或阳性对照。从叶组织分离基因组DNA，使用适当的引物对转化和未转化的组织进行PCR。
图33(A-C)表示用叶绿体载体pDD-C-aphA6/aphA2转化的棉花培养物(陆地棉栽培品种Coker310FR)；在补充有50mg/l卡那霉素的培养基MST1(0.1mg/l 2，4-D和0.5mg/l激动素)上进行筛选。
图33(A)表示未被转化的对照棉花愈伤组织。
图33(B)表示转化的原代棉花愈伤组织。
图33(C)表示从转基因原代棉花愈伤组织传代培养的转化的棉花愈伤组织(B盘)。
图34(A-B)表示：通过PCR确证转基因(aphA6和aphA2)整合进了棉花质体基因组。
图34(A)表示：使用内部引物3P(在侧翼序列上着陆)和aphA6-rev(在aphA6基因上着陆)，以64℃为退火温度，扩增出约1.7kb大小的PCR产物，证明转基因整合进棉花愈伤组织。
图34(B)表示：使用引物16SF(在天然叶绿体基因组上着陆)和aphA6-rev(在aphA6基因上着陆)，以64℃为退火温度，产生约2.5kb大小的PCR产物，证明转基因的质体特异性整合。泳道1表示1kb Plus分子标记(梯度)。泳道2代表来自非转基因棉花愈伤组织的DNA，泳道3代表在50mg/l卡那霉素上选择的转基因棉花愈伤组织的DNA。
图35表示aadA/BADH表达盒的序列(SEQ ID No.1)。
图36表示gfp/BADH表达盒的序列(SEQ ID No.2)。
图37表示aphA-6/nptII表达盒的序列(SEQ ID No.3)。
图38为一般性质体转化载体的图解示意图。
发明详述
本发明的一方面提供从植物细胞培养物经由体细胞胚胎发生再生的同质性植物。本发明的另一方面是能够用于非绿色外植体的质体转化载体，其中，所述外植体能导致植物细胞的体细胞胚胎发生。而本发明的另一方面为在植物的非绿色可食部分中进行转基因表达。本发明的另一些方面描述了单子叶植物、豆类、蔬菜、水果作物的转化和在这些植物的非绿色部分中的转基因表达。本发明的另一方面在于使用适于转化植物非绿色部分的质体转化载体来表达异源蛋白质。在其它方面，提供转化质体基因组以便通过体细胞胚胎发生来表达异源蛋白质的方法，以及表达目的蛋白质的转化植物和它们的后代。本发明的再一方面是将外源DNA引入植物小的前质体中，以及鉴定在非绿色质体中行使功能的选择性标记。本发明的再其它方面为：经由体细胞胚胎发生再生叶绿体转基因植物以实现同质性。
本申请的优选方面适用于高等植物的所有质体。这些质体包括存在于水果、蔬菜和花中的色质体；存在于块茎(如马铃薯)中的造粉体；高等植物根中的前质体；存在于植物非绿色部分的白色体和黄化质体(在黑暗中表达)。本申请的各方面也适用于叶绿体的各发育阶段，其中叶绿体不是完全绿色的。
定义
为了更好的理解本公开的内容，提供以下的定义，除非另有说明，否则贯穿整个申请它们都具有相同的含义。
“异源”通常指来自不同的遗传来源。当然本发明设想使用异源和同源的DNA，和适用于在植物质体中表达的操纵子。
“表达盒”在本领域通常被理解为含有必需的调节序列以允许一个或一个以上的克隆基因转录和翻译的克隆载体。
“正确折叠的”应该被理解为意指折叠成正常构象的蛋白质，这种构象与蛋白质作为天然蛋白质表达于其天然宿主细胞中时的折叠方式相一致。
贯穿本申请，当涉及植物时，应当理解这里涉及的各方面延及转化含有质体的所有生物和植物的质体。为了明确，短语“高等植物”通常包括茄科和非茄科植物，例如农作物、水果、花、蔬菜、豆类、医用植物和所有其它本领域技术人员意识到的高等植物。
用于整个后续的说明书和权利要求的“基本上同源”意指与天然人血清白蛋白序列有超过50％，最优选超过80％、甚至更优选超过90％、95％或99％的同源性程度。这里使用的“序列基本一致或基本同源”用于指一个核苷酸序列或氨基酸序列表现出与另一核苷酸或氨基酸序列具有基本相同的结构或功能。在序列基本一致或基本同源的两序列之间任何的结构和功能差异都是微小的；即这些差异不会影响序列在期望的应用中发挥所需的功能。差异可能是由于例如不同物种在密码子使用上的固有差异造成的。如果两个或多个序列之间具有显著的序列重叠或相似性，或者即使序列在长度或结构上不同，但这些不同序列表现出相似的物理特征，则结构差异将被认为是微小的。所述特征包括，如能够仍然表达和正确折叠成蛋白质的天然构象状态以及在规定的条件下杂交，或表现出明确定义的免疫交叉反应性、相似的生物药物活性等。这些特征中的每一种都可以被本领域的技术人员使用已知方法容易地确定。
“非绿色质体”通常指任何非绿色的质体，实例包括存在于水果、蔬菜和花中的色质体；存在于块茎(如马铃薯)中的造粉体；存在于高等植物根中的前质体；白色体和黄化质体(在暗中表达)和不同发育阶段的叶绿体(其中叶绿体不为绿色)。此外，植物和植物细胞的非绿色部分在本领域中已得以充分表征，也是清楚的。
“间隔区域”在本领域被理解为两个基因之间的区域。植物叶绿体基因组含有核苷酸序列高度保守的间隔区域。这些叶绿体基因组间隔区域在核苷酸序列上的高度保守性使间隔区域能够被理想的用于构建可以转化广泛植物物种的叶绿体的载体，而无需针对不同植物或各作物物种构建单独载体。正如本领域清楚的，功能基因的侧翼序列被众所周知的称为“间隔区域”。间隔区域的具体性质被清楚的描述于申请人1998年5月15日提交的、题为“UNIVERSAL CHLOROPLAST INTEGRATION OFEXPRESSION VECTORS，TRANSFORMED PLANTS ANDPRODUCTS THEREOF”的申请09/079,640中。因此，上述申请09/079,640被引入为参考。已熟知在高等植物叶绿体基因组中至少存在60个具有转录活性的间隔区域(Sugita，M.，Sugiura.M.，Regulation of Gene Expressionin Chloroplasts of Higher Plants， Plant Mol.Biol.，32：315-326，1996)。具体的，Sugita等人报道了60个被称为转录单元的转录活性间隔区域，参见该文献表II。因为这些转录活性间隔区域是已知的，故可以在这些鉴定的间隔区(其包含在各种的高等植物叶绿体基因组中)中使用通用载体(如描述于本申请人的美国专利申请No.09/079,640的载体)。运用Sugita等人的教导，可以容易地在质体基因组中定位基因间间隔区。这就使得本领域的技术人员能够使用本申请人的美国专利申请No.09/079,640中教导的方法，向Sugita等人鉴定的间隔区(存在于各种高等植物中)插入含有psbA、psbA的5’非翻译区(UTR)和编码目的蛋白质的基因的通用载体。上述申请和文章被引入作为参考。
选择性标记提供了挑选期望的植物细胞的手段，用于质体转化的载体通常含有能表达选择性标记基因的构建体。标记基因是植物可表达的DNA序列，该序列表达的多肽能抵抗，即削弱或失活选择性物质的天然抑制作用，选择性物质即抗生素、除草剂或醛脱氢酶，如甜菜醛脱氢酶(描述于2001年4月18日提交的本申请人申请No.09/807,722，并在此将该文献整个引入作为参考)。可替代的是，选择性标记基因可以提供另一些可见的反应性应答，即可以在一些物质的存在下使表型或生长模式不同于不表达选择性标记基因的植物或植物细胞，其中所述物质既可以直接应用于植物或植物细胞，也可以存在于植物或植物细胞的生长培养基中。
无论怎样，含有选择性标记基因的植物或植物细胞都将具有可用于鉴定目的的差别表型，即它们可以区别于非转化细胞。此特征性表型允许鉴定含有构建体的细胞、细胞团、组织、器官、植物部分或整个植物。标记物表型的检测使得可以选择具有与标记基因连接的第二基因的细胞。
对这种用于鉴定含有质体构建体的植物细胞的标记，文献中已有使用描述。在以下提供的例子中，细菌aadA基因被作为标记表达。aadA基因的表达赋于壮观霉素和链霉素抗性，因此允许鉴定表达这一标记的植物细胞。aadA基因产物允许叶绿体中含有此选择性标记基因产物的细胞持续生长和变绿。多种其它的启动子区域也可以被用来驱动选择性标记基因表达，包括各种质体启动子和已经被证实可以在植物质体中表现出功能的细菌启动子。
“反向重复区域(Inverted Repeat Regions)”意味着当同源区域存在于质体基因组的反向重复区(称作IRA和IRB)中时，预计每个转化质体具有两个拷贝的转基因。当同源区域存在于质体基因组反向重复区域之外时，预计每个转化质体具有1个拷贝的转基因。
“结构等价”一般应该理解为意指蛋白质保持在天然细胞中表达的天然蛋白质的构象结构。
载体
本申请涉及使用能够转化质体的载体，特别是用于转化质体。这类载体包括质体表达载体(如pUC、pBR322、pBLUESCRIPT、pGEM)和Daniel在美国专利No.5,693,507和美国专利No.5,932,479中鉴定的所有其它载体。也包括侧翼序列定位于叶绿体基因组镶边重复区(embroideredrepent)之外的载体。这些出版物和专利在此被引入作为参考，其引入程度如同具体单独指明每个单独的出版物或专利被引入为参考一样。
通用载体被描述于1999年3月4日出版的WO99/10513和1998年5月15日提交的申请No.09/079,640，两篇所述参考文献被全文引入。
使用了本实验室开发用于叶绿体转化的基础pLD载体(Daniell等人，1998；Daniell等人，2001b；De Cosa等人，2001；Guda等人，2000；Kota等人，1999)。对于不同蛋白质，使用此SD5’序列已经表现出在叶绿体中可以获得高水平的外源蛋白质表达(3-21％的tsp)(Daniell等人，2001b；DeGray等人，2001；Kota等人，1999)。
值得注意的是，这里描述的载体是说明性的例子，可以使用如描述于美国专利申请No.09/079,640中的不同启动子、如描述于美国专利申请No.09/807,722中的不同选择性标记和适用于整合进各种植物质体基因组的不同侧翼序列来构建载体。
转化质体基因组的一般方法
此说明性例子一般性地展示了实践本申请发明所必需的所有步骤。当然，本领域已知的其它合适的方法可以被用来替代或补充这里描述的示例性方法。
植物基因组DNA的分离
研钵和杵、液氮、新鲜的暗绿色叶子。DNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN Inc.)
叶绿体侧翼序列的PCR扩增
PCR反应的材料：基因组DNA(50-100ng/μl)、dNTPs、10xpfu缓冲液、正向引物、反向引物、高压灭菌的蒸馏水和Turbo pfu DNA聚合酶。
载体构建
1.pUC19或pBlueScriptSK(+/-)质粒。
2.PCR扩增的物种特异性叶绿体DNA侧翼序列。
3.在质体中具有功能的启动子、叶绿体基因的5’UTR、选择性标记基因、目的基因和叶绿体3’UTR。
4.限制性酶和缓冲液。
5.T4 DNA聚合酶(除去3’突出端以形成平端和补平5’突出端以形成平端)，或Klenow大片段(补平5’突出端以形成平端)，碱性磷酸酶(对粘性末端去磷酸化)，DNA连接酶(形成磷酸二酯键)，和适当缓冲液。
6.设在不同温度下的水浴或孵育装置。
生物轰击(Biolistics)准备
1.将高压灭菌的Whatman滤纸#1(直径55毫米)置于烤箱中干燥。
2.100％的乙醇。
3.盒装高压灭菌的吸头、包于铝箔中的高压灭菌的Kim Wipes纸巾。
4.储存于-20℃于50％甘油中的无菌金颗粒(见注释1和2)。
5.通过浸入100％乙醇而灭菌的无菌破裂膜(rupture disc)(1100psi)和宏载体(macrocarrier)。
6.高压灭菌的钢的宏载体固定器(macrocarrier holder)和停止屏(stopping screen)。
7.新制2.5mM CaCl2：称取1.84g溶于5mL水并用0.2μm的过滤器过滤除菌。
8.0.1M亚精胺(具有高度吸湿性)：将1M亚精胺储备液稀释10倍并等分成100μl装入1.5mL Eppendrop管，储存于-20℃。每管使用一次后即抛弃。
用于植物组织培养的培养基制备
2.5.1.烟草
1000mL培养基：4.3g MS盐(INVITROGEN Inc.)、H2O(分子生物学级)、100mg/L肌醇、1mg/L硫胺素-HCl、用于芽诱导的3％的蔗糖和用于根诱导的2％的蔗糖、1mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BAP；从1mg/mL储备液中取1ml)、0.1mg/L吲哚-3-乙酸(从1mg/mL储备液中取0.1ml)、用于根诱导的1mg/L吲哚-3-丁酸(从1mg/mL IBA储备液中取1ml)。当高压灭菌的培养基冷到45℃-50℃时，向其加入500mg/L的壮观霉素(从100mg/mL的储备液中取5mL过滤除菌的壮观霉素)。
可食作物
马铃薯
1000mL培养基：4.3g MS盐、维生素B5(在100mL水中溶解1g肌醇、10mg烟酸、10mg吡哆醇-HCl、100mg硫胺素-HCl以制备100x溶液；使用10mL，剩余溶液于4℃储存)、5mg/l玉米素核苷(使用0.5mL 1mg/mL的ZR储备液)、0.1mg/lα-萘乙酸(使用0.1mL 1mg/mL的NAA储备液)、40到500mg/l的壮观霉素。
番茄
1000mL培养基：4.3g MS盐、维生素B5(使用10ml 10x储备液)、0.2mg/L吲哚-3-乙酸(从1mg/mL IAA储备液中取0.2ml)、3mg/L 6-苄基氨基嘌呤(从1mg/mL BAP储备液中取3ml)。300或500mg/l的壮观霉素。
使用1N KOH或1N NaOH将所有植物生长培养基调到pH5.8并在121℃持续20分钟的高压灭菌前加入6g/L的Phytagel(Sigma)。对于1mg/mL的BAP、IAA、IBA、NAA、ZR储备液的制备，分别地：称取10mg粉末，先溶解于1或2滴1N NaOH中，补足到最终体积10mL(所有植物生长调节剂被储存于4℃1-2月)。
转基因植物的分子分析
整合进烟草叶绿体的基因的PCR分析
50μl的PCR反应：1.0μl基因组DNA(50-100ng/μl)、1.5μldNTPs(10mM储存液)、5.0μl(10x PCR缓冲液)、1.5μl正向引物(在天然叶绿体基因组上着陆；10μM储存液)、1.5μl反向引物(在转基因上着陆；10μM储存液)、39.0μl高压灭菌的蒸馏水和0.5μl Taq DNA聚合酶。
同质性的Southern印迹分析
1.脱嘌呤溶液：0.25 N HCl(使用0.4mL 12.1 N的HCl；FisherScientific USA，用蒸馏水补至最终体积500mL)。
2.转移缓冲液：0.4 N NaOH、1M NaCl(称取16g NaOH和58.4gNaCl并溶解于蒸馏水，将体积补到最终1000mL)。
3.20XSSC：3M NaCl、0.3M柠檬酸三钠(称取175.3g NaCl、88.2gNa3C6H5O7·2H2O溶于900mL H2O，用1N HCl调节到pH7.0并用蒸馏水将体积补足到最终1000mL并高压灭菌)。
4.2XSSC：向180mL蒸馏水中加入20mL 20XSSC。
通过Western印迹进行蛋白质分析
1.丙烯酰胺/Bis：来自Fischer(USA)的现成品，储存于4℃。
2.10％SDS：将10g SDS溶解于90mL去离子水，补足体积到100mL，室温储存。
3.分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl(向80mL水中加入27.23g Tris碱，用6 N HCl将pH调至8.8，将体积补到最终150mL。高压灭菌后储存于4℃)。
4.积层胶缓冲液：0.5M Tris-HCl(向60mL水中加入6.0g Tris碱，用6N HCl将pH调至6.8，将体积补到最终100mL。高压灭菌后储存于4℃)。
5.样品缓冲液(SDS还原缓冲液)：在3.55mL水中加入1.25mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8)、2.5mL甘油、2.0mL(10％SDS)、0.2mL(0.5％溴酚蓝)。室温储存。使用前向950μl样品缓冲液中加入50μlβ-巯基乙醇(βME)。
6.10X电泳缓冲液(pH8.3)：于约700mL水中溶解30.3g Tris碱、144.0g甘氨酸和10.0g SDS(如果不溶加入更多的水)。将体积加到1L并储存于4℃。
7.10xPBS：称取80g NaCl、2g KCl、26.8g Na2HPO4·7 H2O(或14.4g Na2HPO4)、2.4g KH2PO4溶解于800mL水中。用HCL将pH调节到7.4并将体积补足到1L。高压灭菌后于室温储存。
8.20％APS：在1mL水中溶解200mg过硫酸铵(每两周新制)。
9.1500mL转移缓冲液：900mL水中加入300mL 10x电泳缓冲液，300mL甲醇、0.15g SDS并将体积调至1L。
植物抽提缓冲液：
                   使用的浓度            终浓度
60μl              5M NaCl               100mM
60μl              0.5M EDTA             10mM
600μl             1M Tris-HCl           200mM
2μl               Tween-20              .05％
30μl              10％SDS               0.1％
3μl               BME                   14mM
1.2mL              1M蔗糖                400mM
1mL                水
60μl              100mM PMSF            2mM
临用前加入PMSF(振荡溶解PMSF晶体)。
PMSF(苯甲基磺酰氟)：于1mL甲醇中振荡溶解17.4mg PMSF粉末，于-20℃储存不超过1个月。
方法：
植物基因组DNA的分离
按照vender的指导，使用DNeasy Plant试剂盒(QIAGEN Inc.)从新鲜绿叶中提取植物基因组DNA。
叶绿体侧翼序列的扩增：
依靠PCR的帮助，从特定植物物种的叶绿体DNA或基因组DNA扩增物种特异的侧翼序列，PCR使用一套根据已知高度保守的烟草叶绿体基因组序列设计的引物。
进行PCR反应的条件：PCR具有3个被重复30到40个循环的主要步骤：(1)在94℃变性：分离双链叶绿体DNA。(2)在54-64℃退火：利用氢键的形成使引物与单链DNA结合并且DNA聚合酶开始复制模板。(3)在72℃延伸：DNA聚合酶在72℃延伸与引物形成强烈氢键的模板。错误匹配的引物不会形成强烈的氢键，因此所有这些温度可以根据DNA序列同源性而变化。与模板互补的碱基在引物的3’端与引物偶联。聚合酶从5’到3’添加dNTPs，以3’到5’的方向阅读模板，加入的碱基与模板互补。
叶绿体转化载体
左和右侧翼是叶绿体基因组中充当稳定整合转基因的同源重组位点的区域。在叶绿体中有效的转录和翻译转基因需要强有力的启动子以及5’UTR和3’UTR。为进行多基因表达，单一启动子可以调节操纵子的转录，并且必须在每个编码序列的上游放置单独的核糖体结合位点(2)(图10)。以下步骤被用于载体构建：
1.用基于烟草叶绿体基因组的已知序列设计的引物扩增质体的侧翼序列(叶绿体的16S-23S区之间)。
2.将含有叶绿体基因组侧翼序列的PCR产物插入pUC 19质粒，pUC质粒事先被限制酶PvuII消化(以消除该多克隆位点)，用碱性磷酸酶(CIP)于50℃处理5分钟进行去磷酸化(以阻止克隆载体的重新环化)。于68℃处理10分钟以失活CIP酶。
将叶绿体转化盒子(在T4 DNA聚合酶或Klenow填补的帮助下成为平端)克隆进在间隔区中唯一的PvuII位点处消化的克隆载体中，此间隔区在迄今检测的所有高等植物中都是保守的。
经由粒子枪将外源基因递送入叶绿体
这是向质体递送转基因的最成功和简单的技术，其被称为生物轰击PDS-1000/He粒子递送系统(Biolistic PDS-1000/He Particle DeliverySystem(18，19))。这一技术已被证明可以成功地在广泛的植物物种中向目的组织递送外源DNA，并且已在烟草(2)、拟南芥(20)、马铃薯(21)、番茄(25)的叶绿体基因组中实现了转基因的整合，在小麦(22)、胡萝卜、万寿菊和辣椒(23)中实现了瞬时表达(见注释5)。
金颗粒悬浮液的制备。
1.在1mL 100％的乙醇中悬浮50-60mg金颗粒并涡旋两分钟。
2.以最大速度约10,000xg离心3分钟(使用台式微量离心机)。
3.弃上清。
4.加入1mL新制70％的乙醇并涡旋1分钟。
5.室温孵育15分钟并间隙振荡。
6.10,000xg离心两分钟。
7.弃上清，加入1ml无菌蒸馏水，涡旋1分钟，室温放置1分钟，并10,000xg离心两分钟。
8.用水重复3次上述洗涤过程(步骤7)。
9.将金沉淀重悬浮于1ml 50％的甘油中，于-20℃冰箱中储存储备液。在用于5个样品的金颗粒上沉淀叶绿体载体。
1.涡旋1分钟后，取50μl金颗粒放入1.5mL试管中。
2.加入10μl DNA(约1μg/μl质粒DNA)，并涡旋混合物30秒。
3.加入50μl 2.5M的CaCl2并涡旋混合物30秒。
4.加入20μl 0.1M的亚精胺并在4℃对混合物涡旋20分钟。洗涤包被在金颗粒上的叶绿体载体
1.加入200μl 100％的乙醇并涡旋30秒。
2.3000xg离心40秒。
3.倒掉乙醇上清。
4.重复5次乙醇洗涤。
5.在最后一步仔细倒掉乙醇并加入35-40μl乙醇(100％)。
宏载体的制备
1.通过在100％的乙醇中浸泡15分钟来灭菌宏载体，空气干燥后在塑料盖的帮助下插入无菌钢环固定器。
2.涡旋金-质粒DNA悬浮液，吸取8-10μl放于宏载体的中心并空气干燥。
用于轰击样品的基因枪的设置
1.用100％乙醇以精细纸巾擦拭枪室和固定器(不要用酒精擦拭门)。
2.打开真空泵。
3.打开氦气罐的阀门(氦压力调节器)(逆时针)。
4.使用调节柄调节压力表阀(可调阀)，使高于期望的破裂膜压力约200到250psi(顺时针)。
5.打开基因枪。
6.将破裂膜(通过在100％的乙醇中浸泡5分钟而灭菌)置入破裂膜支承盖(rupture disc-retaining cap)，并紧紧拧在气体加速管上。
7.在宏载体发射装置(macrocarrier launch assembly)中放入停止屏，在停止屏上方放置宏载体，以金颗粒(带有叶绿体载体)面朝下对着屏。在此装置上拧上宏载体罩(macrocarrier coverlid)，并插入枪室(gunchamber)。
8.将待轰击的完整叶子或外植体置于滤纸(Whatman No.1)(浸于不含抗生素的培养基中)上。将样品板置于靶板架(target plate shelf)上，插入枪室并关闭轰击室门。
9.按压Vac开关以在真空压力表显示器中建立压力(达到28英寸汞柱)。在控制点关掉同一开关并按下Fire开关直到听到破裂膜的爆破声。
10.按下Vent开关释放真空并打开枪室取走样品。
11.通过关闭氦气汽缸上的主阀(氦压力调节器)来关闭系统。基因枪室中形成一定的真空，不停地打开和关闭Fire开关，直到两压力表显示零读数。释放真空压力并关掉基因枪和真空泵。
12.在培养室于黑暗中(即用铝箔覆盖)对被轰击的样品板孵育两天，并在第三天将外植体切成适当的小块置于选择性培养基上。
植物组织培养和叶绿体转化
烟草叶绿体转化
已建立了一种用于烟草栽培品种Petit Havana的高效率可重复方案(Daniell，H.(1997)Methods in Mol.Biol.Recombinant gene expressionprotocols.62，463-489)。
1.用叶绿体载体轰击4周龄暗绿色烟草叶的背轴面(背面)并在无选择的培养基上对叶子黑暗孵育两天。
2.在第三天将轰击的叶子外植体切成小方块(5mm)并将外植体以背轴面朝向培养基的方式置于含有MS盐、1mg/l硫胺素HCl、100mg/l肌醇、3％蔗糖、1mg/l BAP和0.1mg/1 IAA连同作为选择性试剂的500mg/l壮观霉素的选择性培养基上。
3.在转化的3到5周后应当出现转基因芽。将芽叶再次切成小的方形外植体(2mm)，在新鲜培养基上接受第二轮选择以实现同质性。
4.转基因芽在含有MS盐、1mg/l硫胺素HCl、100mg/l肌醇、2％蔗糖和1mg/l IBA连同500mg/l壮观霉素的生根培养基上进行再生(通过PCR确证转基因的整合)。
5.在高湿度条件下将转基因植物转移到盆中并将它们移入温室或生长室以进一步生长和表征。
可食作物的质体转化
Daniell的小组提出了使用一种植物物种的叶绿体DNA可以转化另一物种(具有未知序列)的通用载体概念(8)。使用这一概念，番茄和马铃薯叶绿体基因组按如下描述被转化。
马铃薯叶绿体转化
使用烟草叶绿体载体，经由生物轰击技术转化马铃薯栽培品种FL1607的叶组织，使用选择性aadA基因标记和可见的绿色荧光蛋白质(GFP)报告基因(21)回收稳定的转基因植物。
1.轰击马铃薯叶(3-4周龄)并在无选择性的培养基上于暗处孵育两天。
2.第三天将叶子切成小方块(5mm)并置于含有维生素B5、5mg/1 ZR、0.1 NAA和3％蔗糖的MS培养基上。在散射光线下每隔两周进行传代培养之后，逐渐增加壮观霉素选择压力(从40到400mg/l)。
3.在含有维生素B5、0.01mg/L NAA、0.1mg/L GA3、2％蔗糖和40-400mg/l壮观霉素的MS培养基上从转基因马铃薯愈伤组织再生芽。
4.将转基因芽转移至含有维生素B5、2％蔗糖和40-400mg/l壮观霉素的基础MS培养基上进行根诱导。将转基因小植株转移到生长室。
番茄叶绿体转化
使用烟草叶绿体载体，利用非常低强度的光照产生具有转基因质体的番茄(Lycopersicon esculentum cv.IAC Santa Clara)植物(25)。
1.轰击四周龄番茄叶，并在无选择性的培养基上于暗处孵育两天。
2.将轰击的叶子切成小块并置于含有0.2mg/L IAA、3mg/L BAP、3％蔗糖和300mg/L壮观霉素的芽诱导培养基上。
3.在不进行芽诱导的情况下持续3到4月后选择具壮观霉素抗性的原代愈伤组织。
4.在将转基因愈伤组织转移到含有0.2mg/L IAA、2mg/L ZR、2％蔗糖和300mg/L壮观霉素的芽诱导培养基上后约4周再生芽，然后在无激素的培养基上生根。将再生转基因植物转移到温室中。
转基因植物的分子分析
转基因芽的PCR筛选。
此方法已经被用于区分突变体、核和叶绿体转基因植物。通过与临近整合位点的天然叶绿体基因组退火的一个引物和与aadA基因退火的另一个引物(26)，在叶绿体转化体中应产生适当大小的PCR产物。因为在核转基因植物和突变植物中不能得到此PCR产物，因此排除了核整合或突变体的可能性。
1)使用DNeasy Plant试剂盒(QIAGEN Inc.)根据生产商的使用说明从转基因叶组织抽提基因组DNA。在转基因组织量较少时，可以适当减少缓冲液体积。
2)使用Taq DNA聚合酶(QIAGEN Inc.)按照与上文描述的扩增侧翼序列时同样的条件，通过适当的引物进行PCR反应。
同质性的Southern印迹分析
在Southern印迹分析中，相比于含有转基因盒和侧翼区域的转基因叶绿体，适当限制酶消化的野生型烟草质体基因组应当产生较小的片段(仅有侧翼区)。此外，当只观察到转基因片段时才实现了转基因植物的同质性。
将DNA转移到膜上
1.用适当限制酶消化转基因样品的基因组DNA(约2到10μg)(包括野生型作为对照)并将消化的DNA在每100ml含有5μl EtBr(取自10mg/mL储备液)的0.8％琼脂糖凝胶中以40V电泳4小时。
2.将凝胶在0.25N的HCl(脱嘌呤溶液)中浸泡15分钟并在蒸馏水中洗两次，5分钟。
3.将凝胶在转移缓冲液中漫泡20分钟以变性DNA。
4.使用转移缓冲液将DNA从凝胶过夜转移至尼龙膜(先在水中预漫泡，再在转移缓冲液中浸泡5分钟)。
5.第二天，使用2xSSC缓冲液洗膜两次，每次5分钟并在滤纸上空气干燥5分钟。在适当(C3)设置下使用GS GeneLinker UV Chamber(Bio-Rad)使DNA与膜交联。
探针的制备
1.用适当的限制酶消化任何质粒(含有叶绿体基因组的侧翼序列)。
2.在95℃对45μl侧翼DNA片段(50-250ng)变性5分钟，然后在冰上放置2-3分钟。
3.向Ready-To-Go DNA标记小珠(-dCTP)试管(AmershamBiosciences，USA)加入变性的探针并通过轻弹试管进行温和的混合。
4.向探针混合物加入5μl放射性α32P(dCTP；Amersham Biosciences，USA)并在37℃孵育1小时，使用ProbeQuant G-50 Micro柱(AmershamPharmacia Biotech Inc.USA)过滤探针。
预杂交和杂交。
将印迹(DNA转移面朝向溶液)放入杂交瓶并加入10mL Quik-Hyb(Stratagene，USA)。
在68℃孵育1小时。向标记探针加入100μl超声处理的鲑精(10mg/mL贮存液；Stratagene，USA)，在94℃加热5分钟并加入含有膜和Quik-Hyb溶液的瓶子。于68℃孵育1小时。
洗涤和放射自显影。
1.弃掉含有探针的Quik-Hyb溶液，并在室温于50mL(2xSSC缓冲液和0.1％的SDS)中洗涤膜两次，15分钟。
2.在60℃于50mL(0.1xSSC缓冲液和0.1％的SDS)中洗涤膜两次，15分钟。
3.将洗后的膜包裹于Saran Wrap中并在暗处使印迹暴光x感光胶片，置于-70℃直到准备显影。
通过Western印迹确定转基因表达
植物蛋白质的提取
1.在液氮中碾磨100mg的叶子并在冰上向样品中加入200μl提取缓冲液。
2.向一等份植物提取物加入适当体积的新制2x样品上样缓冲液(取自含有50μlβ-巯基乙醇和950μl样品上样缓冲液的储备液)。
3.煮沸样品及上样染料4分钟并在10,000xg离心两分钟，然后立即向凝胶中上样20μl。
电泳凝胶
凝胶上样并在100V电泳半小时，然后150V电泳1小时，直到与目的蛋白质相应的标志带位于中部。
蛋白质向膜的转移。
使用Mini Transfer Blot Module以30V过夜或65V两小时或100V 1小时从凝胶向膜转移蛋白质。如果需要的话，可以将膜包裹在Saran Wrap中在-20℃储存几天。
膜封闭
1.转移后用水漂洗膜并将膜在PTM(100mL 1xPBS，50μL 0.05％Tween 20和3g干奶(3％))中于室温孵育1小时。
2.加入15ml适当稀释的初级抗体并在室温孵育两小时。用1xPBS洗涤膜两次，每次五分钟。
3.加入20毫升适当稀释的二级抗体。在摇床中于室温孵育1.5小时。
4.用PT(100ml 1xPBS+50μl Tween 20)清洗两次，15分钟，最后用1x PBS清洗10分钟。
印迹对X感光胶片曝光
1.在1.5mL试管中混合每种化学发光溶液(Luminol Enhancer和稳定的过氧化物)各750μl并加到膜上，彻底覆盖。
2.去掉额外的溶液，并用印迹对X胶片进行适当持续时间的暴光，显影胶片。
种子灭菌
1.在具有1mL 70％乙醇的微量离心管中将少量的种子涡旋1分钟。短暂的离心后弃乙醇。
2.向试管中加入1mL消毒液(1.5％Bleach和0.1％Tween 20)并间歇地涡旋15分钟。短暂的离心后弃溶液。
3.使用无菌蒸馏水洗涤种子3次。
4.在含有补加500μg/mL壮观霉素的RMOP基础培养基的平板上(以确定转基因叶绿体植物的母系遗传)，用无菌蒸溜水喷洒种子。
结果评估
叶绿体转基因植物中的母系遗传
整合进叶绿体基因组的转基因是母系遗传的。当转基因的烟草种子在含有500μg/mL壮观霉素的RMOP基础培养基上萌发时，这一点便显而易见。选择性试剂对转基因幼苗不应有有害影响，而对未转化幼苗将会有影响。
CTB-GM1-神经节苷脂结合ELISA分析。
1.用单唾液酰神经节苷脂-GM1(3.0μg/mL的重碳酸盐缓冲液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)溶液)包被微量滴定板(96孔ELISA板)，并用BSA(3.0μg/mL的重碳酸盐缓冲液溶液)包被一些孔作为对照。
2.在4℃过夜孵育平板。
3.在37℃用0.01M磷酸缓冲盐水(PBS)中的1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭小孔两小时。
4.用PBST缓冲液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤小孔3次。
5.加入于PBS中的来自转化和未转化植物的可溶性蛋白质和细菌CTB，孵育平板。
6.加入初级抗体(兔抗霍乱血清，以1∶8000稀释于含有0.5％BSA的0.01 M PBST中)并在37℃孵育平板两小时。
7.用PBST缓冲液洗涤小孔3次。
8.加入1∶50000稀释的二级抗体(溶于含有0.5％BSA的0.01 M PBST中的小鼠抗兔IgG-碱性磷酸酶缀合物)并在37℃对平板孵育两小时。
9.用Sigma Fast pNPP底物显影平板。通过加入3M NaOH终止反应并在405nm读取平板的吸收值。
巨噬细胞裂解试验如下：
1.从100mg转基因叶子中粗提取分离蛋白质，蛋白质的抽提使用200μl含有CHAPS去污剂(4％CHAPS、10mM EDTA、100mM NaCl、200mM Tris-HCl、pH8.0、400mM蔗糖、14mMβ-巯基乙醇、2mMPMSF)或不含CHAPS去污剂的提取缓冲液。
2.以10,000xg离心样品5分钟，上清和匀浆物都被用于分析。
3.将巨噬细胞RAW 264.7(生长到50％汇合)铺于96孔板，在120μlDulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；来自Invitrogen life technologies)中孵育。
4.从孔中吸走培养基并加入100μl含有250ng/mL叶粗提蛋白质的培养基。
5.在对照平板中只加入不含叶子组分的DMEM来测试植物材料和缓冲液的毒性。
6.在另一平板中，取40μl植物样品稀释液加入RAW 264.7细胞，其中植物样品连续两倍稀释以致最高行具有1∶14稀释的植物提取物。
7.5小时后向含有细胞的每孔加入20μl的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物；Sigma)以评估细胞死亡。
8.在37℃孵育平板5小时。用针和注射器除去培养基。向每孔加入200μl DMSO并用吸管吹吸以溶解晶体。转移到平板读数器上并测量550nm吸收。
在上清和匀浆物组分中都发现了活性PA。然而，当使用具有CHAPS去污剂的抽提缓冲液时，最大巨噬细胞裂解活力出现在上清。
作为可食疫苗的霍乱毒素(CTB)抗原
叶绿体转基因植物是理想的疫苗生产者。大肠杆菌肠毒素的热不稳定毒素B亚基(LTB)，或霍乱弧菌的霍乱毒素(CTB)被认为是疫苗抗原的潜在候选者。通过将未修饰的天然CTB基因整合进叶绿体基因组，已在转基因叶绿体中表现出高水平的CTB聚积(Daniell，H.，等人(2001).J.Mol.Biol.311，1001-1009.)。本新方法不仅允许天然CTB基因的高水平表达而且允许此多聚体蛋白质在叶绿体中正确装配，这一点是必需的，因为对于许多疫苗抗原的功能而言，四级结构是关键环节。CTB在转基因植物中的表达水平为3.5％至4.1％tsp，并且植物提取物中装配的5聚体聚集物与纯化的细菌抗原以相似方式发生结合，由此证明了蛋白质的功能性，并且结合试验证明叶绿体合成的CTB和细菌的CTB都与肠膜GM1-神经节苷脂受体结合，从而确证了转基因叶绿体中CTB5聚体的正确折叠和二硫键形成(图11)。
此外，本发明考虑了经由质体表达的可食疫苗的例子，如CTB(如上文描述)、炭疽热、瘟疫和其它已知并描述于现有技术中的疫苗，包括描述于12/26/02提交的PCT/US02/41503中的疫苗。前述申请被完全引入作为参考。本发明的此方面进一步考虑表达其它治疗蛋白质，如干扰素、IGF-1、胰岛素，它们将被表达于非绿色植物细胞中以便用于口服给药。这类治疗蛋白质的一个示例性描述可见于要求美国临时申请60/393,439、60/393,428、60/393,451、60/393,649和60/393,438(其中描述了治疗蛋白质在植物质体中的表达)的优先权的PCT申请。
疫苗的口服给药和不使用抗生素筛选标记进行的转基因植物选择。
来自菠菜的甜菜醛脱氢酶(BADH)基因被用作转化烟草叶绿体基因组的筛选标记(Daniell，H.等人，(2001)Curr.Genet.39，109-116)。在含有甜菜醛(BA)的培养基上挑选转基因植物。携带BADH活性的转基因叶绿体将有毒的BA转变成有益的甜菜碱(GB)。用包含aadA和BADH基因的构建体轰击的烟草叶在芽再生效率方面表现出非常强烈的差异。与壮观霉素相比，使用BA选择，转化和再生效率高出25％，并且在BA上植物繁殖更为迅速。叶绿体转基因植物在不同的发育阶段表现出比未转化的对照高出15到18倍的BADH活力。高BADH表达水平和由此导致的甜菜碱积聚不会导致任何多效性，转基因植物形态正常并且与未转化的对照植物一样结籽。在转基因叶绿体中生产人治疗蛋白质。
人血清白蛋白(HSA)蛋白质。
人血清白蛋白(HSA)占血液总蛋白质的60％并被广泛用于多种人类治疗。已产生了表达HSA的叶绿体转基因植物(Fernandez-San Millan等人，(2003)Plant Bitechrzol.J.1，71-79)。HSA在叶绿体转基因植物中的表达水平达到了11.1％tsp。在转基因叶绿体中HSA包涵体的形成对于蛋白质的纯化是有利的。通过离心沉淀包涵体，使用一个离心步骤即能够容易的将包涵体与存在于可溶组分中的大多数细胞蛋白质分开。通过离心进行包涵体纯化可以不需要昂贵的亲和柱或层析技术。
HSA的纯化
1.使用含有0.2M NaCl、25mM Tris-HCl(pH7.4)、2mM PMSF和0.1％Triton X-100的提取缓冲液溶解来自转化组织的HSA包涵体。
2.以10,000xg离心。用含有6M Gu-HCl、0.1M βME和0.25mMTris-HCl(pH7.4)的缓冲液悬浮沉淀。
3.用含有100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)和1mM EDTA的缓冲液将植物提取物稀释100倍。
4.通过37％的聚乙二醇处理，沉淀浓缩HSA蛋白质。
5.按照供应商的使用说明(Bio-Rad，USA)，通过SDS-PAGE凝胶分离蛋白质组分并用银试剂染色凝胶。
电子显微镜和免疫金标记.
1.将转化和未转化的叶子切成1-3mm的方块。
2.在0.1M、pH7.4的二甲胂酸缓冲液(2.5％戊二醛、2％多聚甲醛和5mM CaCl2)中于真空下固定15分钟，并在4℃下固定12小时。
3.固定后在0.1M二甲胂酸缓冲液(pH7.4)中漂洗样品两次。
4.通过梯度乙醇系列(直到95％)对固定的样品脱水，然后于60℃在LRW树酯中包埋24小时。
5.使用Leica Ultracut T超薄切片机切出超薄切片，并将切片收集到镍网上。
6.将切片在用PBS缓冲液制备的0.05M甘氨酸中孵育15分钟以失活残余的醛基。
7.将镍网放在封闭溶液(含有2％脱脂干牛奶的PBS)滴上并孵育30分钟。
8.在山羊抗人白蛋白多克隆抗体(使用封闭液进行1∶1000到1∶10,000的稀释)中孵育切片1小时。
9.用封闭液洗涤切片6次，每次5分钟。
10.在用封闭液1∶40稀释的、与10nm金缀合的、兔抗山羊IgG二级抗体中孵育切片两小时。
11.用封闭液洗涤切片6次(每次5分钟)并用PBS洗涤3次(每次5分钟)，在用PBS稀释的2％戊二醛中固定切片5分钟。
12.将固定的切片在PBS中洗涤3次(每次5分钟)，然后在蒸馏水中洗涤5次，每次两分钟。
13.然后使用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对切片染色并使用透射电子显微镜于60kv下检测样品。
注释
1.悬浮在50％甘油中的金颗粒可以在-20℃储存几个月。避免反复冻融亚精胺储存液；溶解后使用一次并丢弃剩余的溶液。使用过滤除菌的新制CaCl2溶液。不要高压灭菌。
2.DNA在金上的沉淀效率以及DNA-金颗粒在宏载体上的铺开非常重要。为了经由生物轰击技术获得高的转化效率，当酒精挥发后应在宏载体盘上出现厚的金颗粒膜。稀疏或稀薄的金沉淀将降低转化效率。
3.通常，表达盒两侧各1000bp的侧翼区足以促进转基因的稳定整合。
4.为获得质体中高水平的转基因表达，必须使用5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)调节信号(13)。转基因在植物叶绿体中的表达依赖于功能启动子、稳定的mRNA、有效的核糖体结合位点；有效的翻译由5’和3’非翻译区(UTR)决定。可以从烟草叶绿体基因组中扩增叶绿体转化元件Prrn、psbA5’UTR、3’UTR。
5.在暗处孵育两天后，应当将接受轰击的叶子切成小方块(5-7mm)进行第一轮选择，再生的转基因芽应当切成小方块(2-4mm)进行第二轮选择。
6.植物生长室的温度应该为约26-28℃，以适宜烟草、马铃薯以及番茄组织培养物的生长。在马铃薯和番茄中最初的转基因芽诱导需要漫射的光线。然而，更高的光强度对于烟草是无害的。
7.与烟草相比，马铃薯和番茄栽培品种的转化效率非常低。
8.如果用于其它植物物种，烟草叶绿体载体会产生低的转化频率。例如，当碧冬茄叶绿体侧翼序列被用于转化烟草叶绿体基因组(DeGray，G.等人，(2001)，Plant Physiol.127，852-862.)时，导致了非常低的转化效率。
在漫射光线的条件下，高度再生的番茄栽培品种(Microtom)芽出现提早开花，阻止了转基因植物的进一步生长。因此，当第一个芽诱导期后，应当将芽移到正常的光线条件下。
示例性实施例1：经由胡萝卜转化的体细胞胚胎发生
经由体细胞胚胎发生，表现出高水平盐耐受性(达到500mM NaCl)的同质性转基因胡萝卜植物从胡萝卜细胞培养物中迅速再生。胡萝卜叶绿体基因组是严格母系遗传的并且植物在第一年不结籽，从而彻底的阻止转基因外流。使用生物反应器，胡萝卜细胞可以迅速扩增并产生巨大的生物量。体细胞胚来源于单细胞；在培养基中能长期生存的、包裹的胚可以用作人工种子用于低温储藏和有控制的萌发；这些特征为从植物制造药物蛋白质和它们的口服给药提供了理想的生产系统。BADH表达细胞通过它们的绿色提供了目视筛选手段，将它们与未转化的黄色细胞区别开来。由此，第一次在非烟草作物中经由叶绿体基因组改造了有用的性状。这是利用非绿色外植体和体细胞胚胎发生第一次实现的质体转化，从而开启了转化单子叶植物、豆科植物、蔬菜、水果作物和在非绿色可食部分表达转基因的大门。
此实施例提供了使用非绿色组织作为外植体、经由体细胞胚胎发生、稳定高效质体转化胡萝卜的第一个报导。有用的植物性状(盐耐受性)第一次在非茄科作物中经由叶绿体基因组表达。迄今为止，只有烟草叶绿体基因组经改造而被赋予了除草剂抗性(Daniell等人，1998)、昆虫抗性(McBride等人，1995；Kota等人，1999；DeCosa等人，2001)、疾病抗性(DeGray等人，2001)、抗旱性(Lee等人，2003)和有毒金属的植物救治手段(Ruiz等人，2003)。另外，BADH酶的表达有利于从未转基因的黄色细胞中通过目视挑选转基因的绿色细胞。作为一种世界范围内消耗的主要作物，此报导应当是使用非绿色组织作为外植体，并通过体细胞胚胎发生进行再生来遗传改造高等植物物种的质体基因组的模型。
结果和讨论
胡萝卜质体转化载体的构建
胡萝卜叶绿体载体使表达盒定向于叶绿体基因组的16S/trnI-trnA/23S区，以便经同源重组进行整合。整合的位点与我们实验室早先报道的通用叶绿体转化载体(pLD)(Daniell等人，1998；Guda等人，2000)相似，但是本表达盒两侧的侧翼序列的大小被加倍了，以提高同源重组的效率。结果，侧翼序列被增加到接近4kb。叶绿体转化载体pDD-Dc-gfp/BADH(图1A)是胡萝卜特异载体，其携带由基因10 5’UTR/rpsl6 3’UTR调节的gfp基因(便于在绿色和非绿色组织中表达并通过GFP荧光筛选转化体)和处于psbA 5’和3’UTRs的控制之下表达的badh基因(便于在绿色组织中表达，由光线调节)。除了基因10 5’UTR来自T7噬菌体基因10外，所有5’和3’调节元件都是通过PCR从烟草基因组DNA中扩增的。在此表达盒中两个转基因的转录都由全长Prrn 16S rRNA启动子驱动，该启动子含有用于核编码的和质体编码的RNA聚合酶的调节元件，因此有利于在绿色和非绿色组织中转录。叶绿体转化载体pDD-Dc-aadA/BADH(图1B)带有aadA和badh基因，它们的表达分别处于RBS(核糖体结合位点)/3’psbA UTR和基因10 5’UTR/rpsl6 3’UTR调节元件调节之下由全长16S rRNA启动子驱动。
值得进一步注意的是描述于美国专利申请No.09/079,640的通用载体可以被用来按本申请所描述的方式转化质体基因组。
胡萝卜质体的转化和植物的再生
如所描述的(Daniell，1997；Kumar和Daniell，2003)，用胡萝卜叶绿体载体pDD-Dc-gfp/BADH和pDD-Dc-aadA/BADH轰击从胡萝卜(Daucuscarota L.cv.Half long)茎节段诱导的细的黄色细胞悬浮培养物。用pDD-Dc-gfp/BADH载体转化的胡萝卜培养物产生表达GFP的愈伤组织和体细胞胚，它们在20mM的甜菜醛(BA)的选择下于共聚焦显微镜下被观察到(图2A-C)。虽然表达GFP的体细胞胚能够在BA的选择下迅速再生是显而易见的，但是对于此载体的使用仍然有两个主要的限制因素。BA非常昂贵($2000-$3000/gm)，因此可以进行的实验数量受到了限制，同时badh基因由psbA启动子和UTR元件调节，这便处于发育和光调节之下。不幸的是，培养的胡萝卜细胞是非绿色细胞并且处于发育的早期阶段，从而最小化了badh的表达。因此，更多的努力集中在使用其它叶绿体载体来转化胡萝卜细胞。使用叶绿体载体pDD-Dc-aadA/BADH，在含有不同浓度的壮观霉素(150-450mg/L)的固体培养基上(MSB+3mg/L 2，4-D，1mg/L激动素)于2-3个月内从5个轰击获得了7个独立的转基因细胞系。进一步将转基因愈伤组织转移到350-mg/L的壮观霉素中孵育1个月并使用500-mg/L的壮观霉素进行增殖。在100lx光强度、26±2℃的温度下孵育所有的转基因细胞培养物。用加入3-mg/L 2，4-D和1mg/L激动素连同选择性试剂的MSB培养基作为诱导和增殖转基因细胞培养物的生长培养基。为了扩增转基因培养物，每隔2-3周将它们在固体培养基上传代培养一次，并以130rpm在液体培养基(MSB+0.1mg/L 2，4-D)中漫射光(50lx)下培养。没有2，4-D的培养基(MSB+0.2mg/L激动素)被用作将胚性愈伤组织转变为小植株的植物-再生-培养基。保持在基础MSB培养基(含500mg/L的壮观霉素)上的转基因植物被转移到盆装土壤中，以诱导成熟的主根系统并用于进一步的特征描述。
转基因胡萝卜细胞的可见筛选。在转基因和非转基因的体外细胞培养研究中，有趣的是注意到可以基于颜色来区分胡萝卜细胞。携带badh转基因的转基因胡萝卜细胞始终是绿色，而非转基因细胞则是黄色(见图3A-B)。为了验证明亮的转基因绿色细胞的确是转基因细胞，将具有异质性(heteroplasmy)(部分转化的质体)的胡萝卜细胞培养物置于不具选择性的生长培养基上并允许分离；在3-4周内，目视绿色和黄色细胞分离(图3C-D)。转基因绿色细胞被证实为阳性的转基因整合，而黄色细胞被发现是未转化的。此外，当将细胞暴露于不同的NaCl浓度时，未转化细胞的分裂可以受到抑制。当使用直接重复(Iamtham和Day，2002)从转化的叶绿体基因组中排除掉选择性抗生素标记基因后，此可见的选择系统对于从未转化的细胞中区别转化的细胞是重要的。研究BADH酶在增加转基因叶绿体的叶绿素生物合成或稳定性方面的作用将是有意义的。
转基因整合进胡萝卜质体的确证。
胡萝卜叶绿体载体pDD-Dc-aadA/BADH通过同源重组将aadA和badh基因整合进质体基因组的16S-23S-间隔区。使用内部引物组3P(在质体的trnI区上着陆)和3M(在aadA基因上着陆)，通过PCR产生1.6kb的PCR产物，确证转基因整合进胡萝卜细胞系(图4A)。这就排除了可能通过壮观霉素筛选获得的、由叶绿体16S rRNA基因突变导致的突变体。为了区别核和叶绿体转基因细胞系(图4B)，使用在整合位点上游200bp的天然叶绿体基因组上着陆的16S-F引物和在aadA基因上着陆的1M引物，产生2.5kb大小的PCR产物。因为在核转基因植物中不能获得这一PCR产物，因此排除了核整合的可能性。因此，PCR分析允许迅速的筛选大量假定的转基因系并消除突变体和核转基因系。
转基因胡萝卜质体中同质性的确定。
将PCR确定的转基因胡萝卜细胞系在液体培养基中进行一周一次的反复传代培养，以在选择性试剂存在的情况下进行几轮筛选。使用未转化的和从不同转基因细胞系发育而成的转化的胡萝卜植物，分离总基因组DNA，AflII和PvuII消化后进行Southern印迹分析(图4C)。AflIII限制位点在转化和未转化的胡萝卜质体中存在于16S-rRNA区(左侧翼)中，并且在未转化质体的trnI和trnA侧翼区之间以及在badh转基因的中部区域具有唯一的PvuII位点，由此允许在未转化和转基因系中都切出预知大小的片段。为了确定异质性或同质性，用AflIII和PvuII消化的胡萝卜植物基因组DNA与4.9kb放射性DNA探针杂交。此探针片段分离自用AflIII和PvuII消化的叶绿体载体pDD-Dc-aadA/BADH；此片段包括2.4Kb的trnl侧翼序列和2.5kb的叶绿体载体转基因序列(图1B)。在具有选择性试剂(350mg/L壮观霉素)的液体培养基中传代培养两次后形成的转基因植物表现出异质性(图4C，泳道2)，而在加入高浓度的选择性试剂(500mg/L壮观霉素)的液体培养基中传代培养8-10次后，由细胞系形成的转基因植物表现出同质性(图4C，泳道3-8)。
胡萝卜细胞、根和芽中的BADH酶活力。
如描述(Daniell等人，2001)，在来自未转化和转化的胡萝卜细胞培养物、主根(胡萝卜)和叶子的粗提物中分析了BADH酶活力。使用50μg经G-25柱脱盐的来自各样品的蛋白质粗提物，通过评估BADH酶活力，在细胞以及胡萝卜植物的不同部分观察到了badh转基因表达。BADH酶在甜菜醛存在的情况下将NAD+转变成NADH，因此通过NAD+还原导致的340nm吸收增加来测定反应速率。与未转化的胡萝卜组织相比，来自转基因质体(细胞、主根和叶)的粗提物表现出提高的BADH活力水平(图5A)。在胡萝卜叶子、主根和悬浮培养的转基因细胞中观察到的更高的BADH活力，证明全长的16S启动子Prrn和基因10UTR非常适合在各种组织中表达转基因。因为预计这些调节元件在所有组织中具有一致的功能，我们推测观察到的BADH活力差异可能是由于质体基因组拷贝数的差异引起。已知在不同组织中质体基因组拷贝数变化显著，在根中只观察到了叶子中的5％(Sasaki等人，1990)。而在胡萝卜主根中观察到的高BADH酶活力(叶子的75％)可能是由于存在大量的色质体；根据它们的橙色或紫色，而不是通常在植物中观察到的仅含有5％质体拷贝的无色根而言，这是显而易见的。
在胡萝卜细胞、根和芽中表达的BADH蛋白质
为了进一步确证在细胞、主根和叶中的BADH活力结果，使用从转化和未转化的胡萝卜组织中制备的粗提物进行Western印迹分析，将来自每一样品的组分(50μg蛋白质)进行10％的SDS-PAGE。转移到硝酸纤维素膜的蛋白质与多克隆抗-BADH血清(在兔子中引起的抗天然BADH抗血清，由Dr.Elisa Soto赠与；Figueroa-Soto等人，1999)杂交，使用与辣根过氧化物酶偶联的二级抗体检测抗原肽。在未转化的胡萝卜组织(细胞、主根和叶)中没有检测到badh的表达(泳道1-3)。而在转基因样品中(图5B)，叶(泳道6)和主根(泳道7)中观察到了比胡萝卜细胞悬浮培养物(泳道4)更高的表达。BADH蛋白质在胡萝卜根和叶组织中的积聚与在转基因根和芽中获得的BADH酶活力结果平行。
胡萝卜细胞悬浮培养物的盐耐受性和BADH活力
为了测试盐协迫是否影响BADH活力，在不同盐浓度(0-500mM NaCl)下对胡萝卜细胞悬浮培养物进行了实验。在胡萝卜细胞上进行了两周的研究，表明转化细胞能够比未转化细胞在具有更高浓度NaCl的液体培养基中维持和增殖(图6A-B)。在含有100ml培养基的500mL锥形瓶中，胡萝卜培养物产生约11.82g转化和未转化的细胞(1475％)，而当存在100mMNaCl时，两周后获得了8.75g转基因细胞(1096％)和1.29g未转化的细胞(161％)(使用的原初培养物每烧瓶含0.8g，见图6A-B)。
此外，当转基因胡萝卜细胞培养物暴露于100到300mM NaCl时，刺激了BADH酶活力。在100和200mM NaCl中见到显著的最大BADH活力(图6C)，而这种增加在未转化细胞中是不显著的。这表明尽管在非绿色细胞或根中质体基因组拷贝数低，但全长的Prrn启动子和基因10 5’UTR有利于在所有组织中有效地转录和翻译，而且与发育阶段无关。
盐对胡萝卜植物的影响
在不同的盐浓度(100-500mM NaCl)下测试转移到盆装土壤中的转化和未转化胡萝卜植物。携带badh转基因的转基因植物在多达400mM的NaCl中旺盛生长(图7)。而未转化的植物在超过200mM NaCl的盆中两周后死亡。
本发明的一方面描述转化质体的方法，该方法通过体细胞胚胎发生，使用高效率的胡萝卜质体转化法进行。本发明在其它方面提供能够通过体细胞胚胎发生转化质体的载体。而在另一方面提供通过这里描述的方法和载体，经体细胞胚胎发生转化的质体、植物和植物部分。本申请结合现有技术的知识为改造若干主要作物的质体基因组(其中，通过体细胞胚胎发生介导再生)提供了必要的指导和说明。谷类作物(小麦、稻、玉米、甘蔗)、豆类(大豆、苜蓿)、油料作物(向日葵、橄榄)、经济作物(棉花、咖啡、茶、橡胶、亚麻、栓皮栎、松树)、蔬菜(茄子、黄瓜、木薯、智利辣椒、芦笋等)、水果(苹果、樱桃、香蕉、大蕉、瓜类、葡萄、番石榴)、坚果(腰果、胡桃、花生)和树(海枣等)可以通过体细胞胚胎发生再生。
之前报导了通过轰击大量的叶外植体进行的叶绿体转化，但几乎未获得转基因。例如，在马铃薯中在200个轰击中，在长期组织培养之后仅获得两个转基因芽(Sidorov，1999)。作者描述番茄质体的转化进行了几乎两年(Ruf等人，2001)。相比，本发明在8-10周内，从5个轰击中确证了7个转基因稳定整合的转基因胡萝卜细胞系，并且通过8-10周在液体培养基中重复的传代培养，实现了细胞培养物的同质性。在一个月之内从同质性细胞系中产生了胡萝卜转基因植物(即可盆栽)。对于质体基因组中的转基因整合，在胡萝卜中获得的如此高频率的转化可能是由于几个原因所致。使用来自相同物种(即胡萝卜(Daucus carota L.cv.halflong)天然叶绿体基因组)的长侧翼序列用于同源重组。相比，在番茄和马铃薯中用于质体转化的叶绿体载体含有来自烟草叶绿体基因组的侧翼序列。相似的，当碧冬茄叶绿体侧翼序列被用于转化烟草叶绿体基因组时，也导致了非常低的转化效率(DeGray等人，2001)。因此，为了推进这一研究领域，应该对有用作物的叶绿体基因组进行测序。当不能在Genbank中获得叶绿体DNA序列时(如胡萝卜的例子)，获得用于同源重组的侧翼序列是非常具有挑战性的。
在本研究中另一个重要的观察结果是在培养的胡萝卜细胞前质体中高水平的转基因表达。Sidorov等人报道了在马铃薯块茎的造粉体中GFP的积聚相对于叶子少50倍。与之形成强烈对比，我们报导在细胞中观察到相对于叶子而言53％的BADH活力。这是在前质体中表达转基因的首次报导，尽管已有报导色质体可以积聚适当数量的外源基因产物(Ruf等人，2001)。调节badh基因翻译的异源基因10 5’UTR事实上不是启动子。已知叶绿体psbA 3’UTR能够稳定转录物并且转录终止作用弱(具有30％的终止效率)。然而，如果需要在前质体中得到更高的表达水平(如玉米种子或根的线虫抗性)，可能期望在基因10 5’UTR上游插入启动子以增强转录。
为了在胡萝卜系统中实现同质性，需要几个循环的选择(8-10)以及高选择压力。在液体培养物中，胡萝卜细胞的所有表面直接暴露于生长培养基。这意味着高选择压力，这种压力可以阻断未转化质体的生长。相对于含有2，4-D的固体培养基，液体培养基中的胡萝卜细胞增殖迅速。一旦2，4-D从胡萝卜细胞中清除，胡萝卜细胞迅速转变成成熟体细胞胚，并大量形成小植株。为实现同质性，另一需要是可获得用于整合进每个细胞数以千计的质体基因组中的模板。我们在先前已经证实利用含有完全的叶绿体复制起点的叶绿体侧翼序列可以在叶绿体中提供大量的模板(Daniell等人，1990)并帮助实现同质性，即便是在首轮筛选中(Guda等人，2000)。在胡萝卜叶绿体载体中包含叶绿体复制起点(推测此ori在其它植物物种中存在于相同的位点)应该有助于在少数细胞分裂循环中实现同质性。
胡萝卜细胞具有通过体细胞胚迅速繁殖的巨大潜力，在暴露于用于将其转变成植物的成熟培养基之前其会产生次生体细胞胚(循环胚发生)，并且此培养物可以在体外培养中维持几年。在胡萝卜栽培品种US-Harumakigosun中，在适宜生长培养基中保持5年的胡萝卜胚性愈伤组织通过液体细胞培养(使用旋转生物反应器)持继245天连续产生了大量的植物(4×107小植株/L-培养基/天)，而且生产力没有任何下降(Nagamori等人，1999)。体细胞胚的另一优点是它们可以被用作人工种子。人造或人工种子已经被定义为包裹于藻酸钠小珠或基质中用于商业植物繁殖的体细胞胚。例如，包裹于藻酸-gellan胶(脱水至15％RH，并在潮湿的空气中重新水合至90％RH)的胡萝卜体细胞胚在土壤中达到73％的萌发率(Timbert等，1996)，固定化细胞比非固定化细胞获得了高出1.5倍的再生频率(Nagamori等人，1999)。利用人工种子技术可以长时间低温保存胡萝卜和其它植物物种中的期望原种基因型(Tessereau等人，1994)，并且一旦需要，这些繁殖体可以被用于在温室或田间同步种植植物。而为了最小化治疗蛋白质的异质性，高度需要单一的生产源。
甜菜碱(GB)是所有活的生物体正常产生的化合物，并且研究提示许多高等植物、细菌、海洋生物和哺乳动物物种在缺水或盐协迫下会积聚GB。在植物、细菌和哺乳动物肾组织中，GB作为渗透压保护剂起作用。在猪肾中，BADH定位于皮质和内部的髓质，它专门定位于围绕暴露于尿液和高盐化合物的小管的细胞上(Figueroa-Soto等人，1999)。甜菜碱是在大鼠肾脏内部的髓质中鉴定到的主要相容性有机渗压剂之一，它有助于肾脏细胞在暴露于高渗和致死水平的尿液时存活并正常运作。
这些事实表明在人或动物消耗的食物中BADH酶的存在或GB的聚积是有利的。在植物中，由于灌溉实践和不断增加的对淡水供给的需要，盐协迫对于农作物植物的生长和产量是持续并不断增长的有害因素；因此，耐盐农作物植物工程一直是一个长期被深入研究的科题(Apse MP和Blumwald E，2002)。降低这一协迫导致的损害的有效机制之一是通过基因工程在植物中积聚高细胞内水平的渗透压保护剂化合物(如甜菜碱)(Rontein等人，2002)。
实验方案
质体转化载体的构建。
按照厂商方案，使用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagenen Inc.)从叶子中分离胡萝卜基因组，并从胡萝卜基因组中扩增作为胡萝卜侧翼序列的DNA片段。利用从烟草叶绿体基因组序列产生的引物，使用Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen Inc.)扩增此侧翼序列片段。扩增的片段为叶绿体基因组的16S/trnI-trnA/23S区，约4.2kb大小。用T4多核苷酸激酶(Promega)处理PCR扩增的DNA片段并克隆进PvuII消化的、用虾碱性磷酸酶(Promega)去磷酸化的pBluescript II KS。激酶和去磷酸化反应分别根据厂商的使用说明来完成。基于从烟草叶绿体基因组(登录号NC 001879)中获得的信息，使用PCR扩增叶绿体启动子和调节序列。通过向胡萝卜叶绿体DNA侧翼序列的PvuII位点插入代表gfp/BADH表达盒的平末端ClaI-SacI片段从而构建胡萝卜特异的叶绿体转化载体pDD-Dc-gfp/BADH(图1A)。sm-gfp基因来自TAIR。相似的，通过向胡萝卜叶绿体DNA侧翼序列的PvuII位点(去磷酸化后)插入代表aadA/BADH表达盒的平末端ApaI片段，构建胡萝卜叶绿体转化载体pDD-Dc-aadA/BADH(图1B)。根据标准的分子生物学方案进行细菌和DNA操作。
注意，可以使用的潜在载体是如提交于2002年12月26日的美国专利申请No.PCT/us02/41503中描述的双管质体载体(double barrel plastidvector)。此申请被全文引入作为参考，但是为了简便的目的，我们包括了描述此叶绿体双管载体的特殊段落。下文提供的描述将有助于理解本申请图9-28所表示的质粒。
迄今为止只在少数茄科作物中实现了叶绿体转化。在向其它作物拓展这一技术时存在若干挑战。迄今只有使用叶作为外植体时的绿色叶绿体被转化。然而，对于许多作物(包括单子叶作物)而言，用作外植体的是培养的非绿色细胞或其它非绿色植物部分。这些非绿色组织含有前质体而不是叶绿体，这两者中的基因表达和基因调节系统十分不同。在转化过程中，转化的前质体应该发育成成熟的叶绿体并且转化的细胞应该能在发育的所有阶段历经选择过程而存活。因此，最主要的挑战是赋于叶绿体在不同的发育阶段于光暗中经历选择并存活的能力。这是绝对关键的，因为在一个植物细胞中只有一个或两个叶绿体被转化，这些质体应该具有在选择压力中生存、增殖并建立自己的能力，而所有其它未转化的质体在选择过程中被消灭。双管质体载体通过使用编码两种不同的、但能够解除相同选择标记(或具有相同谱型的选择标记)毒性的酶的基因，并使这些基因处于在前质体和成熟叶绿体中均具有功能的调节信号驱动之下，而实现了这一点。
这里描述的质体载体是若干这种非限制性例子中的一个。叶绿体侧翼序列含有适当的编码序列和间隔区(转基因盒插入其中)。质体基因组中的任何间隔序列都可以用作转基因整合的靶点，包括转录的和转录沉默的间隔区。aphA-6和aphA-2(nptII)基因都编码属于氨基糖苷磷酸转移酶家族的酶，但是它们起源于不同的原核生物。因为叶绿体基因组的原核性质，这些基因无需密码子的优化就能理想的用于转基因叶绿体。原核起源的基因已在转基因叶绿体中以非常高的水平表达(达到总可溶蛋白质的47％，DeCosa等人，2001)。两种酶具有相似的催化活力，但是aphA-6基因产物具有扩展的解毒卡那霉素的能力，并且提供了更广泛的氨基糖苷解毒谱(包括丁胺卡那霉素)。选择卡那霉素作选择性标记的优势是不存在它的天然抗性，不像在许多单子叶植物中以及在选择过程中16S rRNA基因的自发点突变中观察到的壮观霉素抗性。此外，卡拉霉素并不在人类临床中作为抗生素使用，并且含有卡拉霉素抗性核转基因的若干作物已经被FDA批准用于人消费以及在市场上流通(如风味番茄)。
如图36所示，在此非限制性的例子中，所有的转基因都由质体Prrn启动子调节；这一16SrRNA启动子在天然叶绿体基因组中驱动整个rRNA操纵子并含有核编码的和质体编码的RNA聚合酶的结合位点。因此，此启动子能够在前质体和叶绿体(绿色和非绿色，在亮处和暗处)中行使功能。aphA-6基因还被基因10 5’UTR进一步调节，该5’UTR能够在非绿色组织的前质体中于暗处实现有效的翻译(见图32和2中玉米和胡萝卜非绿色细胞前质体中由16S rRNA启动子和基因10UTR调节的GFP表达)。rps 16 3’UTR被用于稳定aphA-6基因转录物。在另一方面，aphA-2(nptll)基因被psb启动子5’和3’UTR调节，该启动子是光调节的，当处于光照下时，在叶绿体中高度有效(见A.Fernandez-San Millan，A.Mingeo-Castel，M.Miller和H.Daniell，2003，A chloroplast transgenic approach tohyperexpress和purify Human Serum Albumin，a protein highlysusceptible to proteolytic degradation.Plant Biotechnology Journal，出版中；也见于WO 01/72959)。
因此，受前质体和叶绿体中光和暗调节信号驱动的aphA-6和aphA-2基因的组合，昼夜不间断地保护转化的质体/叶绿体免于选择性试剂的损害。具有适当调节信号的目的基因(基因X)被插在双管选择系统的下游或上游。因为可以在间隔区域中插入多个基因(DeCosa等人，2001，Daniell&Dhingra，2002)，插入的转基因数量并不会为操纵子的转录、转录加工和翻译带来困难(WO 01/64024)。在此实施例的一种变通方案中，使用适当的侧翼序列并经两载体的共转化，将与不同转基因偶联的aphA-6和aphA-2基因插入同一叶绿体基因组的不同间隔区。
植物材料的转化和转基因植物的再生
在含有MS盐(Murashige和Skoog，1962)、维生素B5(Gamborg等人，1968)、2％蔗糖和0.8％琼脂的培养基中于植物组织培养试管中长出无菌胡萝卜植物(Daucus carota L.cv.Half long)。将下胚轴切成0.5mm的节段并置于含有3％蔗糖、0.1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、pH5.7的50mlMSB液体培养基中。在26±2℃、120rpm下连续振荡3周后，在100μM筛子上收集离散的细胞，离心细胞(150xg 10分钟)并在新鲜培养基中重悬浮。对迅速生长的均质黄色细胞进行每周传代培养。将通过100μM筛子过滤的细的胡萝卜细胞悬浮培养物均匀的涂布于补加3mg/L 2，4-D和1mg/L激动素的MSB固体培养基上，并用胡萝卜特异的质体载体轰击(图1A-B)。轰击的愈伤组织在暗处孵育两天后，于含有3mg/L 2，4-D和1mg/L激动素和不同浓度甜菜醛(10，15，20和25mM BA)及壮观霉素150、250、350和450mg/L)的MSB培养基上筛选。在16/8h光/暗周期中、以50-100 1x光强度和温度26±2℃孵育培养物。使用加入选择性试剂的固体和液体培养基扩增转基因培养物。将通过体细胞胚胎发生(在含有0.2mg/L的MSB培养基上)产生的转基因植物移植到盆装土壤中。盆在第一周被罩以塑料袋以保持高湿度，并以浓度逐渐降低的MS盐进行第一周的灌溉，在第二周则灌溉自来水。
DNA提取、PCR和Southern印迹分析。使用Plant Dneasy试剂盒(Quiagen Inc.USA)分离总基因组DNA以进行转基因胡萝卜的PCR和Southern印迹分析。使用10x PCR缓冲液及Taq DNA聚合酶和引物对3P/3M(分别在侧翼序列/aadA基因上着陆)和16SF/1M(分别在天然叶绿体基因组/aadA基因上着陆)进行PCR，PCR反应条件是：将50ng DNA模板在94℃变性5分钟，进行25个PCR循环(94℃1分钟、64℃1分钟、72℃3分钟)，最后72℃延伸10分钟。
为进行Southern印迹分析，用PvuII和AflIII消化植物DNA并将其转移到尼龙膜上与4.9 kb探针杂交，探针是通过用PvuII和AflIII消化pDD-Dc-aadA/badh载体并用ProbeQuant G-50柱(Amersham，USA)标记上32P而产生的。使用Stratagene Quick-HYB杂交缓冲液并按照供应商的使用说明(Stratagene，USA)将印迹与探针杂交。
BADH酶活力和免疫印迹分析。如描述的(Daniell等，2001)进行了BADH(甜菜醛脱氢酶)的提取和活力分析。将1g胡萝卜组织置于两毫升含有50mM Hepes-KOH(pH8.0)、1mM EDTA、20mM偏亚硫酸氢钠、10mM硼酸钠、5mM抗坏血酸和5mM DTT的缓冲液中研磨。在4℃以10000xg将粗提物离心10分钟并使用Sephadex G-25柱(AmershamPharmacia biotech，USA)对上清脱盐。在向1mL试验缓冲液(50mMHepes-KOH，pH8.0；1mM EDTA、5mM DTT、1mM NAD+)中于25℃加入1mM BA起始反应后1分钟和10分钟，用分光光度法于340nm测量被BADH还原的NAD+。
为进行免疫印迹分析，使用2x Laemmli缓冲液从100mg胡萝卜组织中分离总可溶蛋白质。将混合物煮沸5分钟并在10000xg离心5分钟。将含有50μg总可溶蛋白质的上清(用Bradford试验定量)上样到10％SDS-PAGE凝胶上并转移到印迹膜上。使在兔子中抗BADH产生的多克隆抗BADH血清(由Dr.Elisa Soto提供)与膜杂交。使用与辣根过氧化物酶偶联的二级抗体，通过Lumi-PhosTM WB化学发光试剂(Pierce，USA)检测杂交的肽。
转基因植物盐耐受性的分析。在0、100、200、300、400和500mM NaCl中分别分析转移到盆中土壤的具有相同形态发生生长阶段和高度的转基因和非转基因胡萝卜植物，以评价盐耐受性。将植物保持在生长室中，并用具有不同盐浓度水平的盐水每日灌溉持续1个月。
说明性实施例2：棉花转化
材料和方法
植物材料和转化：通过在70％的乙醇中浸泡两分钟，再用含有约4％可利用的氯的次氯酸钠溶液处理8分钟，然后用0.1％的氯化汞溶液(w/v)处理5分钟，从而对脱绒的棉花(Gossypium hirsutum L.cv.Coker310FR)种子灭菌。表面灭菌及用无菌水洗涤种子4-5次后，种子保持在无菌水中4-5小时以软化种皮。在将种子置于含有一半浓度的MS盐(Murashige和Skoog，1962)和维生素B5(Gamborg等1968)及1.5％蔗糖的1/2 MSB培养基之上前，完全除去种皮。将5日龄幼苗的下胚轴外植体(4-6mm长)垂直置于MST1培养基(含有MS盐、维生素B5、0.1mg/l 2，4-D、0.5mg/l激动素和3％葡萄糖)上，以诱导愈伤组织。使用基于氦的生物轰击粒子枪(Bio-Rad)，用包被叶绿体载体的金颗粒轰击均一分散的胚前愈伤组织。棉花愈伤组织的转化使用如下参数优化：0.6μm的金颗粒宏载体、27英寸Hg柱室真空、1550psi氦压、6mm的破裂膜与宏载体间隙、6mm的宏载体飞行距离、6cm靶距离和10μl包被在金颗粒上的叶绿体载体。轰击后的培养物在暗处孵育24小时，之后被转移到补加有50mg/l卡那霉素的MST1选择培养基上并于16/8 h光/暗周期、750lux光强度和28±2℃的温度条件下孵育。在补加50mg/l卡那霉素的MSTI培养基上扩增转基因胚发生培养物(图34)并通过PCR确证转基因aphA-6基因整合进培养物(图35)。
说明性实施例3：表达盒的构建
材料和方法
侧翼序列的扩增和克隆：按照厂商方案，使用Qiagen植物提取试剂盒从叶子中分离植物基因组DNA，并从基因组DNA中扩增代表侧翼序列的DNA片段。利用引物ADLF-5’gtgtcagtgtcggcccagcagag 3’和ADLR-5’aacaggggtcaaggtcggccag 3’，使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Inc.)扩增侧翼序列片段。扩增的片段为叶绿体基因组的16S/trnI-trnA/23S区，大小约为4.2kb。用T4多核苷酸激酶(Promega)处理PCR扩增的DNA片段，并克隆进PvuII消化的、用虾碱性磷酸酶(Promega)去磷酸化的pBluescript II KS。激酶和去磷酸化反应分别根据厂商的使用说明来完成。携带胡萝卜特异的侧翼区的克隆被命名为pDA-35。
表达盒的构建：pDA-29是克隆进pBluescript II KS的叶绿体特异的表达盒，它携带提供壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因和将有毒的甜菜醛分解代谢成甜菜碱的badh基因。前一个基因的表达由16S Prrn启动子驱动，处于Shine-Dalgarno序列(在5’端)和psbA 3’UTR(在3’端)的调节下。badh基因的表达由异源的T7基因10 5’UTR和rpsl6 3’UTR调节。aadA基因来自pLD-CtV(Daniell等人，1998)，badh基因来自pLD-BADH(Daniell等人，2001)。另一个叶绿体表达盒pDA-30携带编码可溶的、修饰的绿色荧光蛋白质(来自TAIR)的sm-gfp基因和badh基因。sm-gfp的表达由16S Prrn启动子驱动，并被异源的T7基因10 5’UTR和rpsl63’UTR调节。badh基因的表达被psbA启动子/5’UTR和3’UTR调节。基于从烟草叶绿体基因组中所获得的信息(Shinozaki等人，1987)，使用PCR扩增启动子和调节序列。
叶绿体转化载体的构建：叶绿体转化载体pDD-XX-aadA/badh是携带侧翼序列和pDA-29表达盒的pDA载体衍生物。来自pDA-29的表达盒以ApaI片段的形式获得，使用klenow DNA聚合酶(NEB)按照厂商的使用说明，产生平末端，并克隆进PvuII消化并去磷酸化的pDA-35中。另一物种特异的叶绿体转化载体pDD-XX-gfp/badh携带胡萝卜侧翼序列和pDA-30表达盒。来自pDA-30的表达盒以ClaI/SacI片段的形式获得，处理成平末端后克隆进PvuII消化并去磷酸化的pDA-35中。
细菌和DNA操作按照标准的分子生物学操作方案进行。
说明性实施例4：玉米转化
为了遗传改造玉米叶绿体基因组，使用特异的PCR引物扩增玉米特异的序列(trnI和trnA)(玉米叶绿体基因组中其位于目的整合位点侧翼)并经亚克隆而成为甜菜醛脱氢酶(BADH)选择性标记及绿色荧光蛋白质(GFP)报告基因表达盒的侧翼。愈伤组织培养由无菌切下的未成熟合子胚(1-2mm长)(产生于Hill(F1)玉米植物自花授粉的穗上)起始。穗在含有2.6％的次氯酸钠(使用商业漂白剂制备)、1％Tween 20(聚氧乙烯失水山梨醇醚单月桂酸酯)的溶液中不停振荡下浸泡20分钟进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗4次。然后将胚置于含有N6盐和维生素(463.0mg/l(NH4)2SO4、2830.0mg/l KNO3、400mg/l KH2PO4、166.0mg/lCaCl2、185mg/l MgSO4.7H2O、37.3mg/l Na2-EDTA、27.85mg/lFeSO4·7H2O、1.6mg/l H3BO3、4.4mg/l MnSO4·H2O、·8，KI、1.5mg/lZnSO4·7H2O)、2％蔗糖和1.0mg/l 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)的愈伤组织诱导培养基CI-1上，使圆的盾侧(scutellar side)暴露于外，扁平的胚芽-胚根轴侧(plumule-radicle axis side)与培养基接触。愈伤组织培养物在25-28℃保持于暗处并且每隔两周进行传代培养。
胚性愈伤组织的微粒轰击
用DNA(pDA34-ZM-gfp-BADH和pDA33-ZM-aadA-BADH)包裹微粒并使用生物轰击装置PDS1000/He(Bio-Rad)进行轰击。
在轰击之前挑选胚性愈伤组织，转移到无菌滤纸(Watman No.l)上，并置于标准培养皿(100×15mm)中的新鲜培养基表面。然后按如下用质粒DNA包被金颗粒(0.6μm)：50μl清洗后的金颗粒与10μl DNA(1μg/μl)、50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M的亚精胺混合并涡旋振荡。在3000rpm将颗粒离心几秒，然后倒掉乙醇。用乙醇洗涤5次，然后将沉淀重新悬浮于30μl的100％的乙醇中并置于冰上直到用于轰击(在两小时内使用包被的颗粒)。使用PDS1000/He(Bio Rad)生物轰击装置，将靶样品在部分真空(28英寸汞柱)下于样品室上样(level 2)，进行轰击。
使用1100psi破裂膜，用玉米叶绿体转化载体轰击愈伤组织培养物。轰击之后将外植体转移到新鲜的培养基，用微孔胶带(micropore tape)密封平板并在25-28℃于暗处孵育。
选择
轰击后2天开始选择。轰击的愈伤组织被转移到含有5-20mM BA(甜菜醛)或25-100mg/l链霉素的愈伤组织诱导培养基中。也使用50-150mMNaCl结合BA进行筛选，以保持渗透压。
再生
在轰击之后6到8周，通过将愈伤组织转移到含有Ms盐和维生素并补加入1.0mg/l NAA(α-萘乙酸)、2％蔗糖、2g/l肌醇和.3％phytagel的R1培养基(pH5.8)上，开始再生。将再生的植物转移到含有1/2MS盐和维生素、3％蔗糖和.3％phytagel的R2(pH5.8)上。将再生的植物保持在光照下(16/8hr的光周期)。
芽的扩增
玉米种子的表面灭菌和萌发
玉米种子在含有2.6％的次氯酸钠(使用商业漂白剂制备)、.1％Tween20的溶液中连续振荡20分钟进行表面灭菌，然后在无菌蒸馏水中漂洗4次。种子于暗处于MS培养基(pH5.8)上生长、。从3日龄的幼苗上无菌切下节片(nodal section)，节片在幼苗上呈现清楚的划分并代表第7节。当被切下后，横截的节片是1.3到1.5mm长。
节片的粒子轰击
在轰击前，20-30个节片被置于每一培养皿的中心，以向顶端(acropitilaend)朝上。使用1100、1300和1550psi的破裂膜，用玉米叶绿体转化载体进行轰击。
多芽的诱导和选择
将节片外植体以向顶端向上放置于由MS盐和维生素、1.0mg/l 6BA(6-苯基氨基嘌呤)、3％蔗糖和5g/l phytagel组成的pH5.8的芽扩增培养基SM1上，在25℃持续光照。培养2到4周后开始从原来的芽尖产生芽尖团块。轰击后2天，将转化的节片转移到含有5-20mM BA或50-100mg/l链霉素选择性试剂的芽扩增培养基。通过在含有5-20mM BA或25-100mg/l链霉素的选择性芽扩增培养基上筛选、分裂和传代培养绿色团块，由此每隔两周进行相继的传代培养。
再生
通过将多芽团块转移到含有MS盐、维生素、5mg/l IBA和3％蔗糖的pH5.8的再生培养基M1上，使之再生。将芽尖团块转移到含有1/2 MS盐和维生素、3％蔗糖和3g/l phytagel的M2培养基(pH5.8)上使形成的芽再生。值得进一步注意的是，所有的再生培养基被补加有5-20mM BA或25-100mg/l链霉素作为选择性试剂。
为了在改造玉米叶绿体基因组时不使用抗生素抗性基因，用含有绿色荧光蛋白质(GFP)和甜菜醛脱氢酶(BADH)基因作为选择性或筛选性标记的叶绿体表达载体轰击玉米愈伤组织。为了比较甜菜醛(BA)选择和链霉素，构建了含有aadA和BADH基因的另一个叶绿体表达载体。在BA选择中比在链霉素选择中，推定的转基因事件数量高。使用激光扫描共聚焦显微镜检测BA上筛选的转基因玉米组织。在整个的玉米体细胞胚上观察到GFP荧光。玉米叶绿体的转化提供了一个生产可食疫苗和可口服给药的生物药物的合适途径。
玉米叶绿体转化载体
玉米叶绿体转化载体有利于转基因整合进玉米叶绿体基因组的反向重复区(IR)。载体pLD-Corn-BADH含有由组成型16SrRNA启动子驱动并受来自碧冬茄质体基因组的psbA基因3’UTR区调节的嵌合aadA基因和BADH基因。在此构建体中，aadA和BADH都具有叶绿体优选的核糖体结合位点——GGAGG。另一用于玉米叶绿体转化的载体pLD-corn-UTR-BADH具有驱动此双顺反子(dicistron)表达的组成型16SrRNA启动子，但是BADH处于此启动子和psbA基因5’UTR和psbA基因3’UTR的调节之下，以增强表达。因为需要在玉米种子的色质体中表达外源蛋白质，所以需要将目的基因置于不受细胞控制的调节序列的控制之下。在本文中，候选调节序列的合适例子是T7基因10前导序列和cry2Aa2 UTR。T7基因10前导序列被用于在转基因色质体中表达外源蛋白质。cry2Aa2 UTR已经被本发明人证实能够与绿色组织中的psbA UTR同样有效地使外源蛋白质在色质体中积累。因此，对于其它载体，选择性标记使用处于psbA启动子和5’UTR调节下的BADH基因，因为psbA是在绿色组织中被最有效地翻译的叶绿体基因之一。当使用绿色组织或非绿色胚性愈伤组织向玉米叶绿体基因组引入转基因时，优选分别使用光调节的psbA启动子/UTR或16SrRNA启动子/基因10UTR。
以下列出的例子(其中本申请人说明了玉米、棉花和胡萝卜的体细胞胚胎发生)清楚地说明基于本申请的描述和这里包含的实施例，多种植物均可以进行转化。以下列出的多个示范性参考文献说明了在多种植物中通过体细胞胚胎发生进行的植物转化方法学，其进一步支持了可以在多种植物中进行植物转化以在这些植物中实现胚胎发生。以下参考文献示例了经由胚发生的作物再生和/或经由核基因组的作物/植物转化。作为结果，本领域的技术人员可以使用以下示范性参考文献中描述的体细胞胚胎发生方案，结合本说明书中描述的叶绿体载体来实现经由非绿色植物细胞的质体转化。换句话说，本领域的技术人员将认识到以下方案可应用于本说明书中描述的内容。以下列出的参考文献(被全文引入本申请)描述经由体细胞胚胎发生的植物转化。
作物：
玉米：
J.F.Petolino，N.L.Hopkins，B.D.Kosegi，M.Skokut，遗传转化和杂交：颈须介导的玉米胚性愈伤组织转化。19：781-786(2000)。
大豆：
H.N.Trick，J.J.Finer，超声波协助的土壤杆菌介导的对大豆[Glycinemax(L.)Merrill]胚发生悬浮培养组织的转化。Plant Cell Reports 17：482-488(1998)。
小麦：
A.Pellegrineschi，R.M.Brito，L.Velazquez，L.M.Noguera，W.Pfeiffer，S.McLean，D.Hoisington.适度热和干旱协迫预处理对三种硬质小麦品种外植体以及生物轰击转化频率的影响。Plant Cell Rep 20：955-960(2002)。
大麦：
M.Manoharan，L.S.Dahleen，通过愈伤组织的粒子轰击对商业大麦(Hordeum vulgare L.)品种Conlon的遗传转化
Plant Cell Rep 21：76-80(2002)。
Meyeong-Je C.，Wen J.和Lemaux P.G，通过提高再生能力转化顽固的大麦品种和降低的白化病。Plant Science 138：229-244。
稻：
Sung-Ho Lee，Nigel W.Blackhall，J.Brian Power，Edward C.Cocking，David Tepfer和Michael R.Davey，用来自发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri TL-DNA的rolA基因遗传和形态学转化稻，Plant Science，161：917-925(2001)。
向日葵：
S.Weber，W.Friedt，N.Landes，J.Molinier，C.Himber，P.Rousselin，G.Hahne，R.Horn.提高的农杆菌介导的向日葵(Helianthus annuus L.)转化：离析酶和超声作用的评估。Plant Cell Rep 21：475-482(2003).
棉花：
B.Chaudhary，S.Kumar，K.V.S.K.Prasad，G.S.Oinam，P.K.Burma，D.Pental，减缓脱水导致从转化的棉花(Gossypium hirsutum L.cv.Coker310 FR)体细胞胚高频率地收获芽。Plant Ceu Rep.21：955-960(2003)。
甘蔗：
Gil A.Enriquez-Obregon，Roberto I.Vazquez-Padron，Dmitri L.Prieto-Samsonov，Gustavo A.De la Riva，Guillermo Selman-Housein，通过农杆菌介导的转化获得除草剂抗性的甘蔗(Saccharum officinarum L.)植物。Planta 206：20-27(1998)。
甜菜：
S.Kifle，M.Shao，C.Jung，D.Cai，用于研究甜菜(Beta vulgaris L.)发根中基因表达的改进的转化方案。Plant Cell Reports 18：514-519(1999)。
香蕉：
T.R.Ganapathi，N.S.Higgs，P.J.Balint-Kurti，C.J.Arntzen，G.D.May，J.M.Van Eck，农杆菌介导的香蕉品种Rasthali(AAB)的胚发生细胞培养物的转化。Plant Cell Reports 20：157-162(2001)。
木薯：
P.Zhang，G.Legris，P.Coulin，J.Puonti-Kaerlas，经由粒子轰击产生稳定转化的木薯植物。Plant Cell Reports 19：939-945(2000)。
燕麦：
H.F.Kaeppler，G.K.Menon，R.W.Skadsen，A.M.Nuutila，A.R.Carlson，经由目视选择表达绿色荧光蛋白质的细胞获得转基因燕麦植物。Plant Cell Reports 19：661-666(2000)。
Meyeong-Je C.，Wen J.和Lemaux P.G，经由微粒轰击种子来源的高度再生性培养物获得燕麦的高频率转化。Plant Science 148：9-17(1999)。
药用植物：
使用农杆菌转化的组织选择Medicago种间体细胞杂种，PlantScience，69卷，1990第二期，189-198页。
M.R.Thomas，L.B.Johnson和F.F.White
成熟紫杉的遗传转化：遗传控制抗癌药物——紫杉醇的体外生产的方法。Plant Science，95卷，1994第二期，187-196页。Kyung-Hwan Han，PaulFleming，Kevin Walker，Matthew Loper，W.Scott Chilton，Ursula Mocek，Milton P.Gordon和Heinz G.Floss。
Giri，A.，Banerjee，S.，Ahuja，P.S.和Giri，C.C.，1997，使用发根农杆菌在Aconitum heterophyllum Wall中产生发根。In Vitro Cellular andDevelopmental Biology Plant 33 4，pp.293-296。
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豆类、蔬菜和水果：
从菜豆(Phaseolus polyanthus Greenman)(一年生豆类)愈伤组织再生能育植物。Annals of Botany，88卷，2001年9月第3期371-377页。MukundZambre，Pascal Geerts，Alain Maquet，Marc Van Montagu，Willy Dillen和Geert Angenon
转基因葡萄(Vitis vinifera)中在三种组成型启动子和增强衍生物控制下表达双功能绿色荧光蛋白质融合标记物。Plant Science，160卷，2001年4月第5期，877-887页。Zhijian Li，Subramanian Jayasankar和D.J.Gray
农杆菌介导的葡萄体细胞胚的遗传转化和表达葡萄铬黄花叶线虫传多面体病毒(GCMV)衣壳蛋白质的转基因植物的再生，Plant Science，102卷，1994第2期，161-170页。O.Le Gall，L.Torregrosa，Y.Danglot，T.Candresse和A.Bouquet
转化罗马甜瓜(Cucumis melo L.var.cantalupensis)的可靠系统导致大量的二倍体再生体，Scientia Horticulturae，84卷，2000年4月28日第1-2期，91-99页。Monique Guis，Mohamed Ben Amor，Alain Latché，Jean-Claude Pech和Jean-Paul Roustan
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从稳定转化的胚性愈伤组织再生转基因花生植物，Plant Science，93卷，1993第1-2期，185-194页。Peggy Ozias-Akins，Jennifer A.Schnall，William F.Anderson，Chong Singsit，Thomas E.Clemente，Michael J.Adang和Arthur K.Weissinger
经由微粒轰击转化黄瓜组织：鉴定含有功能和非功能的转基因的植物。Gene，118卷，1992年9月10日第2期，255-260页。Paula P.Chee和Jerry L.Slightom
H.Tsukazaki，Y.Kuginuki，R.Aida，T.Suzuki.农杆菌介导的甘蓝双单倍体系的转化。Plant Cell Rep(2002)21：257-262
花：
玫瑰(Rosa hybridaL.)的生物轰击转化，Annals of Botany，81卷，1998年1月10日第1期，109-114页。R.MARCHANT，J.B.POWER，J.A.LUCAS和M.R.DAVEY
通过农杆菌介导的胚性愈伤组织转化产生转基因百合科观赏植物Agapanthus praecox ssp.orientalis(Leighton)Leighton，Plant Science，161卷，2001年6月第1期，89-97页。Sakae Suzuki，Kanyaratt Supaibulwatana，Masahiro Mii和Masaru Nakano
菊花的体细胞胚胎发生以及农杆菌介导的转化，Plant Science，97卷，1994第1期95-101页。Daniela Pavingerová，Josef Dostal，Rena Bi sková和Vojtch Benetka
树：
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L.H.Zhu等人，使用rolB基因转化苹果根状茎M.9/29以及它对生根和生长的影响。Plant Sci.160(2001)，pp.433-439。
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甘薯：
利用根癌农杆菌转化甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)以及再生表达豇豆胰蛋白酶抑制剂和雪花莲凝集素的植物，Plant Science，107卷，1995年6月1日第2期，215-227页。C.A.Newell，J.M.Lowe，A.Merryweather，L.M.Rooke和W.D.O.Hamilton
亚麻：
来自农杆菌介导的转化的转基因亚麻植物：嵌合再生体的发生和转基因植物的遗传，Plant Science，91卷，1993第2期，139-148页。Jin-ZhuoDong和Alan McHughen
咖啡：
T.Hatanaka，Y.E.Choi，T.Kusano，H.Sano，由根癌农杆菌介导转化从胚性愈伤组织得到Coffea canephora咖啡转基因植物。19：106-110(1999)。
橡胶：
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Mondal，Bhattacharya，Ahuja，Chand，通过农杆菌介导转化体细胞胚获得的转基因茶[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze cv.Kangra Jat]植物。Plant Cell Reports 20：712-720(2001)。
可可：
moxalactam作为反筛选抗生素用于农杆菌介导的转化以及它对Theobroma cacao体细胞胚胎发生的积极作用，Plant Science，164卷，2003年4月第4期，607-615页。Gabriela Antunez de Mayolo，Siela N.Maximova，Sharon Pishak和Mark J.Guiltinan
此处和本申请全文包含的所有参考文献，以及在参考文献部分列出的所有参考文献被本申请全文引入作为参考。
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Claims (39)

1.适于转化非绿色植物细胞的质体转化载体，所述质体载体包含可操作连接的成分——第一侧翼序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列。
2.权利要求1的载体，其还包含在所述质体转化载体中具有功能的调节序列。
3.权利要求2的载体，其中所述调节序列包含在所述质体基因组中生效的启动子。
4.权利要求3的载体，其中所述启动子是Prrn 16S rRNA。
5.权利要求4的载体，其中所述调节序列包含psbA 5’和psbA 3’元件。
6.权利要求2的载体，其中所述调节序列还包含能增强编码外源基因的所述DNA序列转录和翻译的5’UTR。
7.权利要求2的载体，其中所述调节序列还包含能赋予编码外源基因的所述DNA序列转录稳定性的3’非翻译区(UTR)。
8.权利要求2的载体，其中所述调节序列还包含基因10 5’UTR。
9.权利要求8的载体，其中所述调节序列还包含基因10 5’UTR/rps 163’UTR。
10.权利要求1的载体，其中所述第一侧翼序列是16S/trnI，所述第二侧翼序列是trnA/23S。
11.权利要求1的载体，其中所述第一侧翼序列约4kb。
12.权利要求1的载体，其中所述第二侧翼序列约4kb。
13.权利要求1的载体，其中载体是用于稳定整合进高等植物物种质体基因组的元件，并且其中所述第一和第二侧翼DNA序列与所述质体基因组的间隔区中的序列基本同源，且所述侧翼序列在所述高等植物物种的质体基因组中是保守的。
14.权利要求13的载体，其中所述间隔区是转录活性间隔区。
15.权利要求6的载体，其中所述5’UTR是psbA的5’UTR。
16.权利要求7的载体，其中所述3’UTR是psbA的3’UTR。
17.权利要求1的载体，其还包含编码选择性标记的DNA序列。
18.权利要求17的载体，其中所述选择性标记为非抗生素选择性标记。
19.权利要求18的载体，其中所述非抗生素选择性标记是甜菜醛脱氢酶(BADH)。
20.权利要求17的载体，其中编码所述选择性标记的所述DNA序列编码抗生素抗性选择性标记。
21.权利要求20的载体，其中所述抗生素抗性选择性标记是aadA。
22.用权利要求1的载体稳定转化的植物。
23.权利要求22的植物的后代。
24.权利要求22的植物的种子。
25.权利要求22的植物的非绿色部分，其包含具有编码目的多肽的异源DNA序列的质体基因组。
26.权利要求22的植物，其中所述植物还包含至少一个用权利要求1的载体转化的前质体。
27.用权利要求1的载体转化的体细胞胚。
28.包含非绿色质体的非绿色植物细胞，其中非绿色质体包含表达盒，其中所述表达盒含有可操作连接的成分——在所述非绿色质体中具有功能的启动子、编码目的多肽的异源DNA序列、至少一个额外的编码赋予可选择性状的多肽的结构基因或其功能部分、转录终止区和位于所述表达盒侧翼以利于通过同源重组将所述表达盒稳定整合进所述质体的基因组的质体DNA侧翼序列，其中所述异源DNA序列的转录由所述启动子调节。
29.权利要求28的非绿色植物细胞，所述细胞能够通过体细胞胚胎发生再生。
30.转基因非绿色植物细胞，所述细胞具有用权利要求1的质体转化载体转化的质体基因组，其中所述转基因非绿色植物细胞通过体细胞胚胎发生再生。
31.通过体细胞胚胎发生转化质体的方法，所述方法包括步骤：将权利要求1的载体整合进植物质体的质体基因组中。
32.使用非绿色外植体实现质体转化的方法，其中通过体细胞胚胎发生再生植物，包括步骤。
33.含有质体的植物细胞，所述质体包括表达盒，该表达盒含有可操作连接的成分——编码目的多肽的异源DNA序列、编码选择性标记的DNA序列、和位于所述表达盒侧翼以利于通过同源重组将所述表达盒稳定整合进叶绿体基因组的质体DNA序列，其中所述植物细胞通过体细胞胚胎发生再生。
34.能够通过体细胞胚胎发生再生的非绿色植物细胞，其中所述非绿色植物细胞包含编码目的多肽的异源DNA序列，其中编码所述目的多肽的所述异源DNA序列整合在所述非绿色植物细胞所含的质体中。
35.能够转化非绿色植物细胞的质体转化载体，所述质体载体包含可操作连接的成分——第一侧翼序列、在质体中生效的启动子、编码在质体中生效的选择性标记的DNA序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列。
36.适于转化质体的质体转化载体，其中所述待转化的质体在非绿色植物细胞中，并且其中所述质体转化载体包含可操作连接的成分——第一侧翼序列、在所述质体中具有功能的调节序列、编码目的多肽的异源DNA序列和第二侧翼序列。
37.在非绿色植物细胞中产生目的多肽的方法，其中所述目的多肽由异源DNA序列编码，所述方法包括步骤：将根据权利要求1的质体转化载体整合进植物细胞的质体基因组；和生长所述植物细胞以表达所述目的多肽。
38.目视筛选转基因植物的方法，包括步骤：使用根据权利要求的载体转化非绿色植物细胞以表达外源甜菜醛脱氢酶(badh)基因。
39.适于转化非绿色植物细胞的质体转化载体，所述质体载体包含可操作连接的成分——第一侧翼序列、在质体中具有功能的调节序列、编码外源基因的DNA序列和第二侧翼序列。
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