JP2005532069A - 体細胞胚形成を介した色素体遺伝子操作 - Google Patents
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- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
Description
本願において報告される研究は、一部、NIH R 01 GM63879からの資金提供によって支援された。
本発明の領域は、植物色素体の遺伝子操作に関する。より具体的には、本発明は、色素体形質転換を通した非緑色植物細胞の形質転換、及びその後の体細胞胚形成を通した非緑色植物細胞の再生に関する。
色素体は、高レベルの導入遺伝子発現(Daniellら、2002)、単一の形質転換イベントにおける多遺伝子の操作(DeCosaら、2001;Ruizら、2003;Daniell&Dhingra、2002)、母性遺伝を介した導入遺伝子封じ込め(Daniell 2002)、遺伝子サイレンシングの欠如(Leeら、2003;DeCosaら、2001)、部位特異的導入遺伝子組み込みによる位置効果(Daniellら、2002)、及び多面発現効果(Daniellら、2001;Leeら、2003)を含む多数の魅力的な利点を示すため、遺伝子操作にとって理想的である。葉緑体遺伝子操作は、ワクチン抗原の超発現(hyper-expression)及び貴重な治療用タンパク質の作製に最も適している。本発明者らは、様々な生物医学的適用のためのヒト・エラスチン由来ポリマーの発現を証明して以来(Gudaら、2000)、コレラ、炭疽のワクチン抗原(Daniellら、2001、Daniell 2003)、モノクローナル抗体(Daniellら、2001)、並びにヒト血清アルブミン(Fernandezら、2003)、マガイニン(DeGrayら、2001)、インターフェロン(Daniell 2003)、及びインスリン様増殖因子(Daniell、2003)を含むヒト治療用タンパク質を発現させるためにこのアプローチを拡張してきた。他のいくつかの研究室が、トランスジェニック葉緑体において、安定性を改良するためのヒト成長ホルモン・インターフェロン-GUS融合タンパク質(Reddyら、2003)及び破傷風ワクチン抗原(Tregoningら、2003)を発現させている。これらの治療用タンパク質は、全て例外なく、様々な環境グループにより主張されている植物由来薬剤のための食用作物のゼロ・トレランス(zero-tolerance)を満たすトランスジェニック・タバコ葉緑体において発現させられている。
本発明の一つの局面は、体細胞胚形成を通したニンジン色素体形質転換のための高度に効率的な方法を使用した色素体を形質転換する方法を記載する。さらに、本発明のその他の局面は、体細胞胚形成を通した色素体形質転換が可能なベクターを提供する。さらに、もう一つの局面は、本明細書に記載された方法及びベクターを通して体細胞胚形成を通して形質転換された、形質転換された色素体、植物、及び植物部分を提供する。本願は、当技術分野の知識と協同して、再生が体細胞胚形成を通して媒介される、いくつかの主要な作物の色素体ゲノムを操作するための必要な案内及び指示を提供する。禾穀類(コムギ、イネ、トウモロコシ、サトウキビ)、マメ科植物(ダイズ、アルファルファ)、油料作物(ヒマワリ、オリーブ)、換金作物(ワタ、コーヒー、チャ、ゴム、アマ、コルクガシ、マツ)、野菜(ナス、キュウリ、キャッサバ、トウガラシ、アスパラガス等)、果実(リンゴ、サクラ、バナナ、プランテーン、メロン、ブドウ、グアバ)、堅果(カシュー、クルミ、ピーナッツ)、及び樹木(ナツメヤシ等)が、体細胞胚形成を通して再生される。本発明のもう一つの局面は、同一プライマー(ユニバーサル色素体プライマー)を使用した、多様な異なる種のための葉緑体ベクターの構築物を示す。
本発明の一つの局面において、体細胞胚形成を介して植物細胞細胞培養物から再生させられたホモプラスミックな植物が提供される。本発明のもう一つの局面は、植物細胞の体細胞胚形成をもたらすことができる、非緑色外植片において使用され得る色素体形質転換ベクターである。本発明のさらにもう一つの局面は、非緑色可食植物部分における導入遺伝子発現を提供する。本発明の局面は、さらに、単子葉植物、マメ科植物、野菜、果実作物の形質転換、及びこれらの植物の非緑色植物部分における導入遺伝子発現を記載する。本発明のもう一つの局面は、非緑色植物部分を形質転換するのに適している色素体形質転換ベクターを使用した異種タンパク質の発現を提供する。その他の局面において、異種タンパク質を体細胞胚形成を介して発現させるため色素体ゲノムを形質転換する方法、目的のタンパク質を発現する形質転換された植物及びそれらの子孫が、提供される。本発明のさらにもう一つの局面は、植物の小さな原色素体への外来DNAの導入、及び非緑色色素体において機能する選抜マーカーの同定である。本発明のさらに他の局面は、ホモプラスミーを達成するため体細胞胚形成を介して再生させられた葉緑体トランスジェニック植物を提供する。
本開示をよりよく理解するため、特記しない限り、本願の全体にわたってそれらの意味を保持すべき以下の定義が、本願を適切な情況に置くために適用される。
本願は、特に色素体形質転換のための、色素体形質転換が可能なベクターの使用を企図する。そのようなベクターには、米国特許第5,693,507号及び米国特許第5,932,479号においてダニエル(Daniel)により同定されたpUC、pBR322、pBLUESCRIPT、pGEM、及びその他全てのような色素体発現ベクターが含まれる。隣接配列が葉緑体ゲノムの装飾された反復配列(embroidered repeat)の外部に位置しているベクターも含まれる。これらの出版物及び特許は、個々の出版物又は特許が各々特別かつ個々に参照として組み入れられると示されるように、参照として本明細書に組み入れられる。
この例示的な例は、本出願人らの発明を実施するために必要な工程の全てを一般に示す。当然、当技術分野において既知であるその他の適当な方法が、代用されるか、又は本明細書に記載された例の方法論を補足するために使用されてもよい。
乳鉢及び乳棒、液体窒素、新鮮な濃緑色の葉。DNeasyプラント・ミニ・キット(DNeasy Plant Mini Kit)(QIAGEN Inc.)。
PCR反応のための材料:ゲノムDNA(50〜100ng/μl)、dNTP、10×pfu緩衝液、フォワードプライマー、リバースプライマー、オートクレーブ処理済み蒸留H2O、及びターボ(Turbo)pfu DNAポリメラーゼ。
1.プラスミドpUC19又はpBlueScript SK(+/-)。
2.種特異的なPCR増幅された葉緑体隣接配列DNA。
3.色素体において機能性のプロモーター、葉緑体遺伝子の5'UTR、選抜可能マーカー遺伝子、目的の遺伝子、及び葉緑体3'UTR。
4.制限酵素及び緩衝液。
5.平滑末端を形成させるための3'突出部を除去するためのT4 DNAポリメラーゼ、及び平滑末端を形成させるための5'突出部のフィルイン(fill-in)、又はクレノウ・ラージ断片(平滑末端を形成させるための5'突出部のフィルイン)、付着末端の脱リン酸のためのアルカリホスファターゼ、ホスホジエステル結合を形成させるためのDNAリガーゼ、及び適当な緩衝液。
6.異なる温度に設定された水浴又はインキュベーター。
1.オーブンで乾燥させたオートクレーブ処理済みワットマン(Whatman)ろ紙#1(直径55mm)。
2.100%エタノール。
3.ボックス内のオートクレーブ処理されたチップ、アルミホイルに包まれたオートクレーブ処理済みキムワイプ(kimwipes tissues)。
4.50%グリセロール中、-20℃で保管された無菌金粒子(注1及び2参照)。
5.100%エタノールへの浸漬により滅菌された無菌のラプチャー・ディスク(rupture discs)(1100psi)及びマクロキャリアー(macrocarriers)。
6.オートクレーブ処理済みのスチール・マクロキャリアー・ホルダー及びストッピング・スクリーン。
7.新鮮に調製された2.5mM CaCl2:1.84gを計量し、5mL H2Oに溶解させ、0.2μmフィルターで濾過滅菌する。
8.0.1Mスペルミジン(高度に吸湿性):1Mスペルミジン・ストックを10×に希釈し、1.5mLエッペンドルフ・チューブに100μLずつ分注し、-20℃で保管する。単回使用後に各チューブを廃棄する。
2.5.1.タバコ
1000ml用の培地:4.3g MS塩(INVITROGEN INC.)、H2O(分子生物学等級)、100mg/Lミオイノシトール、lmg/LチアミンHCl、シュート誘導のための3%ショ糖及び根誘導のための2%ショ糖、1mg/L 6-ベンジル・アミノプリン(BAP;1mg/mLストックから1mLを使用)、0.1mg/Lインドール-3-酢酸(1mg/mL IAAストックから0.1mLを使用)、根誘導のための1mg/Lインドール-3-酪酸(lmg/mL IBAストックから1mLを使用)。オートクレーブ処理された培地に、それが45℃〜50℃に冷却された時点で、500mg/Lスペクチノマイシンを添加する(100mg/mLストックから5mLの濾過滅菌されたスペクチノマイシンを使用)。
ジャガイモ
1000mL用の培地:4.3g MS塩、B5ビタミン(1gミオイノシトール、10mgニコチン酸、10mgピリドキシンHCl、100mgチアミンHClを溶解させることにより100mL H2Oで100×溶液を作成;10mLを使用し、残りの溶液は4℃で保管)、5mg/lゼアチン・リボシド(1mg/mL ZRストックから0.5mLを使用)、0.1mg/l α-ナフタレン酢酸(1mg/mL NAAストックから0.1mLを使用)、40〜500mg/Lスペクチノマイシン。
1000mL用の培地:4.3g MS塩、B5ビタミン(lO×ストックから10mL)、0.2mg/lインドール-3-酢酸(1mg/mL IAAストックから0.2mLを使用)、3mg/l 6-ベンジルアミノプリン(1mg/mL BAPストックから3mLを使用)。300又は500mg/Lスペクチノマイシン。
タバコ葉緑体への遺伝子組み込みに関するPCR分析
50μL用のPCR反応:1.0μlゲノムDNA(50〜100ng/μl)、1.5μl dNTP(ストック10mM)、5.0μl(10×PCR緩衝液)、1.5μlフォワードプライマー(ネイティブ葉緑体ゲノム上に対合(land);ストック10μM)、1.5μlリバースプライマー(導入遺伝子上に対合;ストック10μM)、39.0μlオートクレーブ処理済み蒸留H2O、及び0.5μl Taq DNAポリメラーゼ。
1.脱プリン溶液:0.25N HCl(12.1N HCl;Fisher Scientific USAから0.4mL HClを使用、蒸留H2Oで最終容量500mLにする)。
2.トランスファー緩衝液:0.4N NaOH、1M NaCl(16g NaOH及び58.4g NaClを計量し、蒸留H2Oに溶解させ最終容量を1000mLにする)。
3.20×SSC:3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリウム三ナトリウム塩(sodium citrate trisodium salt)(175.3g NaCl、88.2g Na3C6H507・2H2O 900mL H2Oを計量し、1N HClを使用してpH7.0に調整し、蒸留H2Oで最終容量を1000mLにし、オートクレーブ処理する)。
4.2×SSC:180mLの蒸留H2Oに20mLの20×SSCを添加する。
1.アクリルアミド/ビス:4℃で保管されたFischer(USA)からの既製品。
2.10%SDS:10g SDSを90mL脱イオン水に溶解させ、容量を100mLにし、室温で保管する。
3.分離用ゲル緩衝液:1.5MトリスHCl(80mLの水に27.23gのトリス塩基を添加し、6N HClでpH8.8に調整し、最終容量を150mLにする。オートクレーブ処理後4℃で保管する)。
4.濃縮用ゲル緩衝液:0.5MトリスHCl(60mLの水に6.0gのトリス塩基を添加する。6N HClでpH6.8に調整する。容量を100mLにする。オートクレーブ処理後4℃で保管する)。
5.試料緩衝液(SDS還元緩衝液):3.55mLの水に、1.25mL 0.5MトリスHCl(pH6.8)、2.5mLグリセロール、0.2mL(10%SDS)、2.0mL(0.5%ブロモフェノール・ブルー)を添加する。室温で保管する。使用前に950μLの試料緩衝液に50μLのβ-メルカプトエタノール(βME)を添加する。
6.10×ランニング緩衝液(pH8.3):30.3gトリス塩基、144.0gグリシン、及び10.0g SDSを〜700mLの水に溶解させる(溶解しない場合にはさらに水を添加する)。容量を1Lにし、4℃で保管する。
7.10×PBS:80g NaCl、2g KC1、26.8g Na2HP04・7H2O(又は14.4g Na2HP04)、2.4g KH2PO4を800mLの水中に計量する。HClでpHを7.4に調整し、容量を1Lにする。オートクレーブ処理後、室温で保管する。
8.20%APS:1mLの水に200mgの過硫酸アンモニウムを溶解させる(2週間毎に新鮮なものを作成)。
9.1500mL用のトランスファー緩衝液:900mLの水に300mL 10×ランニング緩衝液、300mLメタノール、0.15g SDSを添加し、容量を1Lにする。
植物からのゲノムDNAの単離
供給元の指示に従い、DNeasyプラント(Plant)キット(QIAGEN Inc.)を使用して、新鮮な緑色の葉からゲノムDNAを抽出する。
特定の植物種の葉緑体DNA又はゲノムDNAからの種特異的隣接配列は、タバコ葉緑体ゲノムの既知の高度に保存された配列を使用して設計されたプライマー・セットを使用したPCRの補助により増幅される。
左及び右の隣接部は、導入遺伝子の安定的組み込みのための相同的組み換え部位として役立つ葉緑体ゲノム内の領域である。強力なプロモーター並びに5'UTR及び3'UTRが、葉緑体における導入遺伝子の効率的な転写及び翻訳に必要である。多重遺伝子発現に関しては、単一のプロモーターがオペロンの転写を制御してもよく、個々のリボソーム結合部位は各コーディング配列の上流に操作されなければならない(2)(図10)。以下の工程がベクター構築において使用される:
1.タバコ葉緑体ゲノムの既知の配列(葉緑体の16S〜23S領域)に基づき設計されたプライマーによる色素体の隣接配列の増幅。
2.(マルチプル・クローニング部位を排除するため)PvuII制限酵素で消化され、(クローニング・ベクターの再環状化を防止するため)50℃で5分間アルカリホスファターゼ(CIP)の補助により脱リンされたpUC19プラスミドへと葉緑体ゲノムの隣接配列を含有しているPCR産物を挿入する。68℃で10分間CIP酵素を不活化する。
これは、導入遺伝子を色素体へ送達するための最も成功している単純な技術であり、バイオリスティック(Biolistic)PDS-1000/He微粒子送達システム(Particle Delivery System)(18、19)と呼ばれている。この技術は、多様な植物種において外来DNAの標的組織への送達に成功していることが立証されており、導入遺伝子の組み込みは、タバコ(2)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)(20)、ジャガイモ(21)、トマト(25)の葉緑体ゲノムにおいて達成されており、コムギ(22)、ニンジン、キンセンカ、及びアカトウガラシ(23)においては一過性の発現が達成されている(注5参照)。
1.1mLの100%エタノールに50〜60mgの金粒子を懸濁させ、2分間ボルテックス処理する。
2.(卓上微量遠心分離機を使用して)最大速度〜10,000×gで3分間スピンする。
3.上清を廃棄する。
4.lmlの新鮮な70%エタノールを添加し、1分間ボルテックス処理する。
5.室温で15分間インキュベートし、断続的に振とうする。
6.10,000×gで2分間スピンする。
7.上清を廃棄し、1mlの無菌蒸留H2Oを添加し、l分間ボルテックス処理し、室温で1分間放置し、10,000×gで2分間スピンする。
8.上記のH2Oでの洗浄過程(工程7)を3回繰り返す。
9.金ペレットを1mLの50%グリセロールに再懸濁させ、ストックを-20℃のフリーザーで保管する。
1.1分間のボルテックス処理後、1.5mLチューブに50μlの金粒子をとる。
2.10μlのDNA(約1μg/μlプラスミドDNA)を添加し、30秒間混合物をボルテックス処理する。
3.50μlの2.5M CaCl2を添加し、30秒間混合物をボルテックス処理する。
4.20μlの0.1Mスペルミジンを添加し、4℃で20分間混合物をボルテックス処理する。
1.200μlの100%エタノールを添加し、30秒間ボルテックス処理する。
2.3000×gで40秒間スピンする。
3.エタノール上清を流し出す。
4.エタノール洗浄を5回繰り返す。
5.最後の工程において、エタノールを注意深く流し出し、35〜40μlのエタノール(100%)を添加する。
1.100%エタノールへの15分間の浸漬によりマクロキャリアーを滅菌し、空気乾燥させた後、プラスチック・キャップの補助により無菌のスチール・リング・ホルダーにそれらを挿入する。
2.金-プラスミドDNA懸濁物をボルテックス処理し、マクロキャリアーの中心に8〜10μlをピペットで移し、空気乾燥させる。
1.微細なティッシュペーパーを使用して、100%エタノールでガン・チャンバー及びホルダーを拭く(ドアはアルコールで拭かない)。
2.真空ポンプを作動させる。
3.ヘリウム・ガス・タンクのバルブ(ヘリウム圧力制御装置)を作動させる(左回り)。
4.調整ハンドルを使用して、所望のラプチャー・ディスク圧力より〜200から250psi高くゲージ・バルブ(アジャスタブル・バルブ)を調節する(右回り)。
5.遺伝子銃を作動させる。
6.(5分間の100%エタノールへの浸漬により滅菌された)ラプチャー・ディスクをラプチャーディスク保持キャップに置き、ガス加速チューブへときつくねじ込む。
7.マクロキャリアー・ランチ・アセンブリーにストッピング・スクリーンを置き、その上に、葉緑体ベクターを含む金粒子を含むマクロキャリアーをスクリーンに対して下向きに置く。マクロキャリアー・カバーリッドでアセンブリーをねじ留め、ガン・チャンバーへ挿入する。
8.抗生物質を含有していない培地に浸されたろ紙(ワットマンNo.1)の上に打ち込むべき完全な葉又は外植片を置く。ターゲット・プレート・シェルフの上に試料プレートを置き、ガン・チャンバーへ挿入し、ボンバーメント・チャンバー・ドアを閉じる。
9.真空計ディスプレイに圧力(最大28インチHg)を構築するためVacスイッチを押す。同じスイッチをホールド・ポイントに下げ、破裂したディスクの爆発音が聞こえるまで、ファイヤー(Fire)スイッチを押す。
10.真空を放出させるためベント(Vent)スイッチを押し、試料を除去するためチャンバーを開ける。
11.ヘリウム・ガス・シリンダー上のメイン・バルブ(ヘリウム圧力制御装置)を閉じることにより、システムをシャット・ダウンする。遺伝子銃チャンバー内にある程度の真空を作出し、両方の圧力計がゼロ読み取りを示すまで時々ファイヤー・スイッチを使用して維持する。真空圧を放出させ、遺伝子銃及び真空ポンプを切る。
12.打ち込まれた試料プレートを、暗所で(即ち、アルミホイルで覆い)培養室で2日間インキュベートし、3日目に外植片を適当な切片へと切り、選抜培地上に置く。
タバコ葉緑体形質転換
タバコ(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana)のための高度に効率的かつ再現可能なプロトコルが確立されている(Daniell,H.(1997)Methods in Mol.Biol.Recombinant gene expression protocols.62,463-489)。
1.4週齢濃緑色タバコ葉の背軸側(下側)に葉緑体ベクターを打ち込み、無選抜培地で2日間暗所で葉をインキュベートする。
2.3日目に、打ち込まれた葉外植片を小さな正方形切片(5mm)へと切り、選抜剤としての500mg/lスペクチノマイシンと共にMS塩、lmg/lチアミンHCl、100mg/lミオイノシトール、3%ショ糖、lmg/l BAP、及び0.1mg/l IAAを含有している選抜培地に背軸面を向けて外植片を置く。
3.トランスジェニック・シュートが、形質転換の3〜5週間後に出現するはずである。シュート葉を再び小さな正方形の外植片(2mm)に切り、ホモプラスミーを達成するため、新鮮な培地上での2回目の選抜に供する。
4.500mg/lスペクチノマイシンと共に、MS塩、lmg/lチアミンHCl、100mg/lミオイノシトール、2%ショ糖、及びlmg/l IBAを含有している発根培地上で(導入遺伝子組み込みに関してPCRにより確認された)トランスジェニック・シュートを再生させる。
5.高湿度下のポットへトランスジェニック植物を移し、さらなる生長及び特徴決定のため、温室又はグロース・チャンバーにそれらを移動させる。
ある植物種からの葉緑体DNAを(未知の配列の)もう一つの種を形質転換するために使用するためのユニバーサル・ベクターの概念は、ダニエル(Daniell)のグループによって開発された(8)。この概念を使用して、下記のようにして、トマト及びジャガイモの両方の葉緑体ゲノムが形質転換された。
タバコ葉緑体ベクターを使用して、ジャガイモ栽培品種FL1607の葉組織が、バイオリスティックを介して形質転換され、安定的なトランスジェニック植物が、選抜aadA遺伝子マーカー及び視覚的な緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子を使用して回収された(21)。
1.ジャガイモ葉(3〜4週齢)に打ち込みをし、無選抜培地上で2日間暗所でインキュベートする。
2.3日目、小さな正方形切片(5mm)へと葉を切り取り、B5ビタミン、5mg/l ZR、0.1 NAA、及び3%ショ糖を含有しているMS培地上に置く。散光下での2週間毎の継代培養の後、スペクチノマイシン選抜圧を徐々に増加させる(40〜400mg/l)。
3.B5ビタミン、O.O1mg/L NAA、O.1mg/L GA3、2%ショ糖、及び40〜400mg/lスペクチノマイシンを含有しているMS培地上でトランスジェニック・ジャガイモ・カルスからシュートを再生させる。
4.根誘導のため、B5ビタミン、2%ショ糖、及び40〜400mg/lスペクチノマイシンを含有している基本MS培地にトランスジェニック・シュートを移す。トランスジェニック小植物をグロース・チャンバーに移す。
タバコ葉緑体ベクターを使用して、極めて低い光度を使用して、トランスジェニック色素体を有するトマト(Lycopersicon esculentum cv.IAC Santa Clara)植物が生成させられた(25)。
1.4週齢のトマト葉に打ち込みをし、無選抜培地上で2日間暗所でインキュベートする。
2.打ち込まれた葉を小さな切片へと切り取り、0.2mg/L IAA、3mg/L BAP、3%ショ糖、及び300mg/Lスペクチノマイシンを含有しているシュート誘導培地上に置く。
3.シュート誘導のない3〜4ヶ月の期間の後、スペクチノマイシン耐性初代カルスを選抜する。
4.0.2mg/L IAA、2mg/L ZR、2%ショ糖、及び300mg/Lスペクチノマイシンを含有しているシュート誘導培地にトランスジェニック・カルスを移した後、約4週間以内にシュートを再生させ、次いで無ホルモン培地上で発根させる。再生したトランスジェニック植物を温室に移す。
トランスジェニック・シュートのPCRスクリーニング
この方法は、変異体と核トランスジェニック植物と葉緑体トランスジェニック植物とを区別するために使用されている。組み込み点に隣接してネイティブ葉緑体ゲノム上に一つのプライマーを対合させ、aadA遺伝子上に第二のプライマーを対合させることにより(26。適当なサイズのPCR産物が、葉緑体形質転換体において生成するはずである。このPCR産物は、核トランスジェニック植物又は変異体では入手され得ないため、核組み込み又は変異体の可能性が排除されるはずである。
1)供給元の指示に従うことによりDNeasyプラント・キット(QIAGEN Inc.)を使用して、トランスジェニック葉組織からゲノムDNAを抽出する。より少量のトランスジェニック組織の場合には、緩衝液の容量を適当に減少させてもよい。
2)隣接配列の増幅のための前記と同じ条件に従い、適当なプライマーを使用して、Taq DNAポリメラーゼ(QIAGEN Inc.)を用いてPCR反応を実行する。
サザンブロット分析において、適当な制限酵素で消化されたタバコ色素体ゲノムは、隣接領域のみならず導入遺伝子カセットも含んでいるトランスジェニック葉緑体と比較して、より小さな断片(隣接領域のみ)を、野生型植物においては産生するはずである。さらに、トランスジェニック植物におけるホモプラスミーは、トランスジェニック断片のみが観察される場合に達成される。
1.(対照として野生型を含む)トランスジェニック試料から適当な制限酵素によりゲノムDNA(〜2から10μg)を消化し、40Vで4時間100mLで5μL EtBr(10mg/mLストックから)を含有している0.8%アガロース・ゲル上で消化されたDNAを泳動させる。
2.15分間0.25N HCl(脱プリン溶液)にゲルを浸し、2回蒸留H2Oで5分間ゲルを濯ぐ。
3.DNAを変性させるため、20分間トランスファー緩衝液にゲルを浸す。
4.トランスファー緩衝液を使用して、一晩、ゲルからナイロン膜(まず水に予め浸し、次いで5分間トランスファー緩衝液に浸す)へDNAをトランスファーする。
5.翌日、各5分間2×SSC緩衝液で2回膜を濯ぎ、ろ紙上で5分間空気乾燥させる。適当な(C3)設定でGSジーンリンカー(GeneLinker)UVチャンバー(Chamber)(Bio-Rad)を使用して、トランスファーDNAを膜に架橋する。
1.適当な制限酵素で(葉緑体ゲノムの隣接配列を含有している)プラスミドを消化する。
2.95℃で5分間45μL隣接DNA断片(50〜250ng)を変性させ、次いで、2〜3分間氷上に置く。
3.レディ・ツー・ゴー(Ready-To-Go)DNAラベリング・ビーズ(Labeling Beads)(-dCTP)チューブ(Amersham Biosciences,USA)に変性プローブを添加し、チューブを弾くことにより穏やかに混合する。
4.5μLの放射性α32P(dCTP;Amersham Biosciences,USA)をプローブ混合物に添加し、37℃で1時間インキュベートし、プローブクアント(ProbeQuant)G-50マイクロカラム(Micro Columns)(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)を使用してプローブをろ過する。
(DNAトランスファー側を溶液に向けて)ブロットをハイブリダイゼーション・ボトルに置き、10mLのクイック・ハイブ(Quik-Hyb)(Stratagene,USA)を添加する。
1.プローブを含むクイック・ハイブ(Quik-Hyb)溶液を廃棄し、室温で15分間50mL(2×SSC緩衝液及び0.1%SDS)で2回膜を洗浄する。
2.60℃で15分間、50mL(0.1×SSC緩衝液及び0.1%SDS)で2回膜を洗浄する。
3.サラン・ラップで洗浄膜を包み、暗所でブロットをx線フィルムに曝し、現像の準備が整うまで-70℃で放置する。
植物タンパク質の抽出
1.液体窒素中で100mgの葉を破砕し、氷上で200μLの抽出緩衝液を試料に添加する。
2.適当な容量の新鮮に調製された2×試料ローディング緩衝液を、分注された植物抽出物に添加する(50μL β-メルカプトエタノール及び950μL試料ローディング緩衝液を含有しているストックから)。
3.ローディング色素と共に4分間試料を煮沸し、10,000×gで2分間遠心分離し、次いで、直ちに20μLの試料をゲルにロードする。
試料をゲルにロードし、タンパク質に対応するマーカー・バンドが中央にくるまで、100Vで30分間、次いで、150Vで1時間泳動させる。
30Vで一晩又は65Vで2時間又は100Vで1時間、ミニ・トランスファー・ブロット・モジュール(Mini Transfer Blot Module)を使用してゲルから膜へとタンパク質をトランスファーする。サラン・ラップで包まれた膜は、必要であれば、-20℃で数日間保管され得る。
1.トランスファーの後、水で膜を濯ぎ、PTM(100mL 1×PBS、50μL 0.05%トゥイーン20、及び3g粉乳(3%))中、室温で1時間膜をインキュベートする。
2.15mLのため適当な希釈率で一次抗体を添加し、室温で2時間インキュベートする。各5分間1×PBSで2回膜を洗浄する。
3.20mLのため適切な希釈率で二次抗体を添加する。シェーカー上で室温で1.5時間インキュベートする。
4.PT(100ml 1×PBS+50μLトゥイーン20)で15分間、最後に1×PBSで10分間、2回洗浄する。
1.1.5mLチューブで750μLの各化学発光溶液(Luminol Enhancer and Stable Peroxide)を混合し、膜に添加し、完全にカバーする。
2.余分な溶液を拭き取り、適当な期間、ブロットをx線フィルムに曝し、フィルムを現像する。
1.1mL 70%エタノールを含む微量遠心分離チューブで少量の種子を1分間ボルテックス処理する。短時間のスピンの後、エタノールを廃棄する。
2.チューブに1mLの殺菌溶液(1.5%漂白剤及び0.1%トゥイーン20)を添加し、15分間断続的にボルテックス処理する。短時間のスピンの後、溶液を廃棄する。
3.無菌蒸留水で3回種子を洗浄する。
4.トランスジェニック葉緑体植物における母性遺伝を決定するため、500μg/mLスペクチノマイシンが補足されたRMOP基本培地を含有しているプレートに、滅菌水を用いて種子をスプレーする。
葉緑体トランスジェニック植物における母性遺伝
葉緑体ゲノムへ組み込まれた導入遺伝子は母性遺伝する。タバコのトランスジェニック種子を、500μg/mLスペクチノマイシンを含有しているRMOP基本培地上で発芽させた場合、これは明白である。トランスジェニック実生においては選抜剤の有害効果は存在しないはずであるが、形質転換されていない実生は影響を受けるであろう。
1.モノシアロガングリオシド-GM1{重炭酸緩衝液(15mM Na2C03、35mM NaHCO3、pH9.6)中3.0μg/mL}でマイクロタイター・プレート(96穴ELISAプレート)をコーティングし、対照として、2〜3ウェルをBSA(重炭酸緩衝液中3.0ug/mL)でコーティングする。
2.4℃で一晩プレートをインキュベートする。
3.1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含む0.01Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により37℃で2時間ウェルをブロッキングする。
4.PBST緩衝液(0.05%トゥイーン20を含有しているPBS)で3回ウェルを洗浄する。
5.PBS中の形質転換植物及び非形質転換植物からの可溶性タンパク質並びに細菌CTBを添加することにより、プレートをインキュベートする。
6.一次抗体(0.5%BSAを含有している0.01M PBSTで1:8000希釈されたウサギ抗コレラ血清)を添加し、37℃で2時間プレートをインキュベートする。
7.PBST緩衝液で3回ウェルを洗浄する。
8.1:50,000希釈された二次抗体(マウス抗ウサギIgG-アルカリホスファターゼ・コンジュゲートを含む0.5%BSA含有0.01M PBST)を添加し、37℃で2時間プレートをインキュベートする。
9.シグマ・ファースト(Sigma Fast)pNPP基質でプレートを現像する。3M NaOHを添加することにより、反応を中止させ、405nmでプレート吸光度を読み取る。
1.CHAPS界面活性剤を含有している抽出緩衝液(4%CHAPS、10mM EDTA、100mM NaCl、200mMトリスHCl、pH8.0、400mMショ糖、14mM β-メルカプトエタノール、2mM PMSF)及びCHAPS界面活性剤を含まないもの200μLを使用して、100mgのトランスジェニック葉から粗抽出物タンパク質を単離する。
2.10,000×gで5分間試料をスピンし、上清及びホモジネートの両方をアッセイに使用する。
3.120μLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Invitrogen life technologies製)中でインキュベートされた(50%コンフルエンスに増殖した)マクロファージ細胞RAW264.7を96穴プレートへ播種する。
4.ウェルから培地を吸引し、250ng/mLのタンパク質を含有している100μLの培地を粗葉抽出物に添加する。
5.対照プレートには、植物材料及び緩衝液の毒性を試験するため、葉画分を含まないDMEMのみを添加する。
6.もう一つのプレートにおいては、最上列が1:14希釈率の植物抽出物を有するよう、2倍段階希釈された植物試料からの40μLの希釈物をRAW 264.7細胞へ添加する。
7.細胞死を査定するため、5時間後、(1×PBSに溶解させ濾過滅菌したストック5mg/ml MTTから)20□LのMTT 3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド;Sigma)を、細胞を含有している各ウェルに添加する。
8.37℃で5時間プレートをインキュベートする。針及び注射器を用いて培地を除去する。各ウェルに200□LのDMSOを添加し、結晶を溶解させるためピペットを上下させる。プレート・リーダーに移し、550nmで吸光度を測定する。
葉緑体トランスジェニック植物は、ワクチンの作製にとって理想的である。熱に対して不安定な大腸菌エンテロトキシンの毒素Bサブユニット(LTB)、又はビブリオ・コレレ(Vibrio cholerae)のコレラ毒素(CTB)は、ワクチン抗原のための可能性のある候補と見なされている。未修飾ネイティブCTB遺伝子の葉緑体ゲノムへの組み込みは、トランスジェニック葉緑体における高レベルのCTB蓄積を証明した(Daniell,H.ら(2001).J.Mol.Biol.311,1001-1009)。この新たなアプローチは、ネイティブCTB遺伝子の高レベルの発現を可能にするのみならず、多くのワクチン抗原の機能にとって重大な四次構造の役割のため不可欠である多量体タンパク質の葉緑体における適切な組み立てをも可能にした。トランスジェニック植物におけるCTBの発現レベルは、3.5%〜4.1%tspであり、タンパク質の機能性は、精製細菌抗原に類似している植物抽出物中の組み立てられたペンタマーの結合凝集体により証明され、結合アッセイは、葉緑体によって合成されたCTB及び細菌CTBの両方が、腸膜GM1-ガングリオシド受容体に結合することを確認し、このことから、トランスジェニック葉緑体におけるCTBペンタマーの正確な折り畳み及びジスルフィド結合形成が確認された(図11)。
ホウレンソウ由来のベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(BADH)遺伝子は、タバコの葉緑体ゲノムを形質転換するため、選抜可能なマーカーとして使用されている(Daniell,H.ら、(2001)Curr.Genet.39,109-116)。トランスジェニック植物は、ベタイン・アルデヒド(BA)を含有している培地上で選抜された。BADH活性を保持しているトランスジェニック葉緑体は、毒性BAを有益なグリシン・ベタイン(GB)へと変換する。aadA遺伝子及びBADH遺伝子の両方を含有している構築物を打ち込まれたタバコ葉は、シュート再生効率の極めて劇的な違いを示した。形質転換及び再生はBA選抜の方が25%効率的であり、植物繁殖はスペクチノマイシンと比較してBAの方が迅速であった。葉緑体トランスジェニック植物は、種々の発達段階において、非形質転換対照より15〜18倍高いBADH活性を示した。高いBADHレベルの発現、及びその結果としてのグリシン・ベタインの蓄積は、多面発現効果をもたらさず、トランスジェニック植物は、形態学的に正常であり、非形質転換対照植物と同様に種子を与えた。
ヒト血清アルブミン(HSA)タンパク質。
ヒト血清アルブミン(HSA)は、血中の全タンパク質の60%を占め、多数のヒト治療において広範に使用されている。HSAを発現する葉緑体トランスジェニック植物は、生成させられている(Fernandez-San Millanら、(2003)Plant Bitechnol.J.1,71-79)。葉緑体トランスジェニック植物におけるHSA発現のレベルは、最大11.1%tspまで達成された。トランスジェニック葉緑体におけるHSA封入体の形成は、タンパク質の精製に有利であった。封入体は、遠心分離により沈殿し、単一の遠心分離工程により可溶性画分に存在する細胞タンパク質の大部分から容易に分離された。遠心分離による封入体の精製は、高価なアフィニティー・カラム又はクロマトグラフィ技術の必要を排除し得る。
1.0.2M NaCl、25mMトリスHCl(pH7.4)、2mM PMSF、及び0.1%トリトンX-100を含有している抽出緩衝液を使用して、形質転換された組織からのHSA封入体を可溶性にする。
2.10,000×gでスピンする。6M Gu-HCl、0.1M βME、及び0.25mMトリスHCl(pH7.4)を含有している緩衝液にペレットを懸濁させる。
3.100mM NaCl、50mMトリスHCl(pH8.5)、及び1mM EDTAを含有している緩衝液で植物抽出物を100倍に希釈する。
4.37%のポリエチレングリコール処理を使用した沈殿によりHSAタンパク質を濃縮する。
5.SDS-PAGEゲルの泳動によりタンパク質画分を分離し、供給元の指示に従い(Bio-Rad,USA)、銀試薬でゲルを染色する。
1.形質転換葉及び非形質転換葉を1〜3mmの正方形に切る。
2.真空で15分間及び4℃で12時間、0.1Mカコジル酸緩衝液pH7.4(2.5%グルタルアルデヒド、2%パラホルムアルデヒド、及び5mM CaCl2)でそれらを固定する。
3.固定の後、0.1Mカコジル酸緩衝液(pH7.4)で2回試料を濯ぐ。
4.95%までの段階的なエタノール系列を通して固定試料を脱水し、次いで、60℃で24時間LRW樹脂へと移植する。
5.ライカ・ウルトラカット(Leica Ultracut)Tウルトラミクロトームを使用して、極めて薄い切片を切り、切片をニッケル・グリッドへ収集する。
6.残余のアルデヒド基を不活化するため、PBS緩衝液で調製された0.05Mグリシンの中で15分間切片をインキュベートする。
7.グリッドをブロッキング溶液(2%脱脂粉乳を含有しているPBS)の液滴の上に置き、30分間インキュベートする。
8.ヤギ抗ヒト・アルブミン・ポリクローナル抗体(ブロッキング溶液中1:1000〜1:10,000の希釈率範囲)で1時間切片をインキュベートする。
9.ブロッキング溶液で6×各5分間切片を洗浄する。
10.ブロッキング溶液で1:40希釈された10nm金とのウサギ抗ヤギIgG二次抗体コンジュゲートと共に2時間切片をインキュベートする。
11.切片をブロッキング溶液で6×5分間、PBSで3×5分間洗浄し、PBSで希釈された2%グルタルアルデヒドで5分間切片を固定する。
12.固定された切片をPBSで3×各5分間、次いで蒸留水で5×各2分間洗浄する。
13.酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を使用して切片を染色し、60kvの透過型電子顕微鏡下で試料を調査する。
1.50%グリセロールに懸濁した金粒子は、-20℃で数ヶ月間保管され得る。スペルミジン・ストックの再凍結及び解凍は回避する;解凍後に一度使用し、残りの溶液は廃棄する。新鮮に調製されたCaCl2溶液を濾過滅菌後に使用する。オートクレーブ処理しない。
2.金へのDNAの沈殿効率及びマクロキャリアーへのDNA-金粒子混合物の展開は、極めて重要である。バイオリスティックを介した高い形質転換効率のためは、アルコール蒸発後に、金粒子の厚いフィルムがマクロキャリアー・ディスク上に出現するべきである。散在した又は不十分な金の沈殿は、形質転換効率を減少させる。
3.一般に、発現カセットの各側の1000bp隣接配列領域が、導入遺伝子の安定的な組み込みを促進するのに適切である。
4.5'非翻訳領域(5'UTR)及び3'非翻訳領域(3'UTR)制御シグナルの使用は、色素体におけるより高レベルの導入遺伝子発現にとって必要である(13)。植物葉緑体における導入遺伝子の発現は、機能性プロモーター、安定なmRNA、効率的なリボソーム結合部位に依存し;効率的な翻訳は5'及び3'の非翻訳領域(UTR)によって決定される。葉緑体形質転換エレメントPrrn、psbA5'UTR、3'UTRは、タバコ葉緑体ゲノムから増幅され得る。
5.2日間の暗所インキュベーションの後の打ち込まれた葉が、1回目の選抜のため小さな正方形切片(5〜7mm)へと切除されるべきであり、再生したトランスジェニック・シュートが、2回目の選抜のため小さな正方形切片(2〜4mm)へと切除されるべきである。
6.タバコ、ジャガイモ、及びトマトの組織培養物の適当な増殖のための植物グロース・チャンバーの温度は、約26〜28℃であるべきである。ジャガイモ及びトマトにおける初期のトランスジェニック・シュート誘導は、散光を必要とする。しかしながら、より高い強度はタバコには有害ではない。
7.形質転換効率は、タバコと比較して、ジャガイモ及びトマト両方の栽培品種で極めて不十分である。
8.タバコ葉緑体ベクターは、他の植物種に使用された場合には、低い形質転換頻度を与える。例えば、ペチュニア葉緑体隣接配列が、タバコ葉緑体ゲノムを形質転換するために使用され(DeGray,G.ら、(2001),Plant Physiol.127,852-862)、それは極めて低い形質転換効率をもたらした。
高レベルの耐塩性(最大500mM NaCl)を示すホモプラスミックなトランスジェニック・ニンジン植物が、体細胞胚形成を介して、ニンジン細胞培養物から急速に再生した。ニンジン葉緑体ゲノムは、厳密に母性遺伝し、植物は、1年目には種子を産生しないため、導入遺伝子流出の完全な封じ込めを提示する。ニンジン細胞は急速に繁殖し、大きなバイオマスがバイオリアクターを使用して作製され;体細胞胚は単細胞に由来し;培養培地上で長期間生存可能であり、封入された胚は、凍結保存及び調節された発芽のための人工種子として使用される;これらの特色は、植物において作成された薬学的タンパク質のための理想的な作製系及びそれらの経口送達を提供する。BADH発現細胞は、それらを非形質転換黄色細胞から区別する、緑色による視覚的な選抜を提供する。有用な形質が、初めて、非タバコ作物において葉緑体ゲノムを介して操作された。これは、非緑色外植片及び体細胞胚形成を使用して達成された最初の色素体形質転換であり、非緑色可食部分における単子葉植物、マメ科植物、野菜、果実作物の形質転換、及び導入遺伝子発現への扉を開くものである。
ニンジン色素体形質転換ベクターの構築
ニンジン葉緑体ベクターは、相同的組み換えを介した組み込みのため、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域へと発現カセットをターゲティングする。この組み込みの部位は、当研究室から以前に報告されたユニバーサル葉緑体形質転換ベクター(pLD)に類似しているが(Daniellら、1998;Gudaら、2000)、発現カセットの片側の隣接配列のサイズが、相同的組み換えの効率を増強するため2倍にされた。結果として、隣接配列は、〜4kbに増加した。葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-gfp/BADH(図1A)は、(緑色組織及び非緑色組織における発現を促進し、GFP蛍光により形質転換体をスクリーニングするための)遺伝子10 5'UTR/rps16 3'UTRにより制御されたgfp遺伝子、並びに(光により制御される緑色組織における発現を促進するための)psbA 5'及び3'UTRの下で発現されるbadh遺伝子を保有しているニンジン特異的ベクターである。ファージT7遺伝子10に由来する遺伝子10 5'UTRを除き、全ての5'及び3'制御エレメントが、タバコ・ゲノムDNAからPCR増幅された。このカセット中の両導入遺伝子の転写は、核によりコードされたRNAポリメラーゼ及び色素体によりコードされたRNAポリメラーゼの両方のための制御エレメントを含有しており、そのため、緑色組織においても非緑色組織においても転写を促進する全長Prrn 16S rRNAプロモーターによって駆動される。葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-aadA/BADH(図1B)は、それぞれRBS(リボソーム結合部位)/3'psbA UTR及び遺伝子10 5'UTR/rpsl6 3'UTR制御エレメントの制御下で全長16S rRNAプロモーターにより発現が駆動されるaadA遺伝子及びbadh遺伝子を保有している。
ニンジン(Daucus carota L.cv.Half long)の茎セグメントから誘導された黄色の微細な細胞懸濁培養物に、記載されたようにして(Daniell、1997;Kumar及びDaniell、2003)、ニンジン葉緑体ベクターpDD-Dc-gfp/BADH及びpDD-Dc-aadA/BADHを打ち込んだ。pDD-Dc-gfp/BADHベクターで形質転換されたニンジン培養物は、20mMベタイン・アルデヒド(BA)で選抜された場合、共焦点顕微鏡下で観察されるGFPを発現しているカルス及び体細胞胚を産生した(図2A〜C)。GFPを発現している体細胞胚がBA選抜で急速に再生し得ることは全く明白ではあったが、このベクターを使用するためには二つの主要な制限が存在した。BAは非常に高価であり($2000〜$3000/gm)、このことが、実施され得る実験の数を制限し、badh遺伝子は、発達及び光による制御下にあるpsbAプロモーター及びUTRエレメントにより制御されていた。不運にも、培養されたニンジン細胞は、発達の初期段階においては非緑色であり、従ってbadh発現は最小限に抑えられていた。従って、もう一つの葉緑体ベクターを使用して、ニンジン細胞を形質転換するべく、さらなる努力がなされた。葉緑体ベクターpDD-Dc-aadA/BADHを使用して、異なる濃度(150〜450mg/L)のスペクチノマイシンを含有している固形培地(MSB+3mg/L 2,4-D、1mg/Lカイネチン)における5回の打ち込みから、2〜3ヶ月以内に7個の独立のトランスジェニック細胞系が回収された。さらに、トランスジェニック・カルスを1ヶ月間350mg/Lスペクチノマイシンに移し、500mg/Lスペクチノマイシンを使用して繁殖させた。全てのトランスジェニック細胞培養物を、26±2℃の温度で100lxの光度下でインキュベートした。トランスジェニック細胞培養物を誘導し繁殖させるため、選抜剤と共に3mg/L 2,4-D及び1mg/Lカイネチンが補足されたMSB培地を、増殖培地として使用した。トランスジェニック培養物を繁殖させるため、それらを2〜3週間毎に固形培地上で継代培養し、散光(50lx)の下で130rpmで液体培地(MSB+0.1mg/L 2,4-D)において増殖させた。2,4-Dを含まない培地(MSB+0.2mg/Lカイネチン)は、胚原性カルスを小植物へと変換するための植物再生培地として使用された。(500mg/Lスペクチノマイシンを含有している)基本MSB培地で維持されたトランスジェニック植物を、成熟主根系を誘導するためにポット内の土壌に移し、さらなる特徴決定に使用した。
トランスジェニック・ニンジン及び非トランスジェニック・ニンジンのインビトロ細胞培養研究において、ニンジン細胞が色に基づき区別され得ることに注意することは興味深かった。badh導入遺伝子を保持しているトランスジェニック・ニンジン細胞は常に緑色であり、非トランスジェニック細胞は黄色であった(図3A〜B参照)。トランスジェニック明緑色細胞が真にトランスジェニックであることを試験するため、ヘテロプラスミックな(部分的に形質転換された色素体)ニンジン細胞培養物を選抜なしの増殖培地上に置き、分離させたところ;3〜4週間以内に緑色細胞及び黄色細胞が視覚的に分離された(図3C〜D)。トランスジェニック緑色細胞は導入遺伝子組み込み陽性であることが確認され、黄色細胞は形質転換されていないことが見出された。さらに、細胞を異なる濃度のNaClに曝した場合には、非形質転換細胞の分裂の抑制が可能であった。この可視の選抜系は、直列反復配列(direct repeats)(Iamtham及びDay、2002)を使用した選抜可能抗生物質マーカー遺伝子を排除しつつ、非形質転換細胞から形質転換細胞を区別するために重要であろう。トランスジェニック葉緑体における葉緑素の生合成又は安定性の増強におけるBADH酵素の役割を検討することは、興味深いであろう。
ニンジン葉緑体ベクターpDD-Dc-aadA/BADHは、相同的組み換えにより、色素体ゲノムの16S-23Sスペーサー領域へaadA遺伝子及びbadh遺伝子を組み込む。ニンジン細胞系への導入遺伝子組み込みは、1.6kbのPCR産物を産生する内部プライマー・セット(色素体のtrnI領域に対合する)3P及び(aadA遺伝子に対合する)3Mを使用したPCRにより確認された(図4A)。これは、葉緑体16S rRNA遺伝子の変異により引き起こされた、スペクチノマイシン選抜で入手され得る変異体を排除する。核トランスジェニック細胞系と葉緑体トランスジェニック細胞系とを区別するため(図4B)、16S-Fプライマーをネイティブ葉緑体ゲノム上の組み込み部位の200bp上流に対合させ、1MプライマーをaadA遺伝子に対合させた;これにより、2.5kbサイズのPCR産物が生成した。このPCR産物は核トランスジェニック植物においては入手され得ないため、核組み込みの可能性は排除された。このように、PCR分析は、多数の推定トランスジェニック系の迅速なスクリーニングを可能にし、変異体又は核トランスジェニック系を排除する。
PCRにより確認されたトランスジェニック・ニンジン細胞系を、選抜剤の存在下での数回の選抜のため液体培地で1週間毎に繰り返し継代培養した。異なるトランスジェニック細胞系から発達した、AflIII及びPvuIIで消化された非形質転換ニンジン植物及び形質転換ニンジン植物から単離された全ゲノムDNAを使用して、サザンブロット分析を実施した(図4C)。形質転換ニンジン色素体及び非形質転換ニンジン色素体の両方における16S-rRNA領域(左隣)におけるAflIII制限部位の存在、及び非形質転換色素体のtrnI隣接領域とtrnA隣接領域との間、及びbadh導入遺伝子の中央領域における非反復PvuII部位の存在により、非形質転換系及びトランスジェニック系の両方における予測されたサイズの断片の切り出しが可能であった。ヘテロプラスミー又はホモプラスミーを確認するため、AflIII及びPvuIIで消化されたニンジン植物のゲノムDNAに、4.9kbの放射性DNAプローブをハイブリダイズさせた。このプローブ断片は、AflIII及びPvuIIで消化することにより、葉緑体ベクターpDD-DC-aadA/BADHから単離された;この断片は、葉緑体ベクターの2.4kbのtrnI隣接配列及び2.5kbの導入遺伝子配列を含んでいる(図1B)。選抜剤(350mg/Lスペクチノマイシン)上での液体培地での2回の継代培養の後発達したトランスジェニック植物は、ヘテロプラスミーを示し(図4C、レーン2)、高濃度の選抜剤(500mg/Lスペクチノマイシン)が補足された液体培地での8〜10回の継代培養の後、細胞系から発達した植物は、ホモプラスミーを示した(図4C、レーン3〜8)。
記載されたようにして(Daniellら、2001)、形質転換されていない及び形質転換されたニンジン細胞培養物、主根(ニンジン)、及び葉からの粗抽出物において、BADH酵素活性をアッセイした。BADH酵素活性を査定することにより、G-25カラムを使用して脱塩された各試料からのタンパク質の粗抽出物50μgを使用して、ニンジン植物の細胞及び異なる部分においてbadh導入遺伝子の発現を観察した。ベタイン・アルデヒドの存在下で、BADH酵素は、NAD+をNADHに変換し、その反応速度はNAD+の還元による340nmにおける吸光度の増加により測定された。トランスジェニック色素体(細胞、主根、及び葉)からの粗抽出物は、ニンジンの非形質転換組織と比較して上昇したレベルのBADH活性を示す(図5A)。より高いBADH活性が、ニンジン植物の葉、主根、及び懸濁培養物中のトランスジェニック細胞に観察され、このことから、全長16SプロモーターPrrn及び遺伝子10 UTRが、様々な組織において導入遺伝子を発現させるのに高度に適していることが確認された。これらの制御エレメントは、全ての組織において均一に機能すると予想されるため、本発明者らは、観察されたBADH活性の違いは、色素体ゲノムのコピー数の変動によるものであるかもしれないと推定する。異なる組織においては色素体ゲノムのコピー数が有意に異なり、葉と比較して根に観察されるのは5%のみであることが既知である(Sasakiら、1990)。しかしながら、ニンジン主根において観察された高いBADH酵素活性(葉の75%)は、存在する多数の有色体によるのかもしれず;このことは、色素体コピーのわずか5%しか含有していない植物において通常観察される根が無色ではなく、橙色又は紫色であることから明白であった。
細胞、主根、及び葉におけるBADH活性の結果をさらに確認するため、形質転換ニンジン組織及び非形質転換ニンジン組織から調製された粗抽出物を使用してウェスタンブロット分析を実施し、各試料からの画分(50μgタンパク質)を10%SDS-PAGEに供した。ニトロセルロース膜にトランスファーされたタンパク質に、ネイティブBADHに対してウサギにおいて作製されたポリクローナル抗BADH血清(Elisa Soto博士の好意により提供された;Figueroa-Sotoら、1999)をハイブリダイズさせ、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ連結二次抗体を使用して抗原性ペプチドを検出した。badh発現は、非形質転換ニンジン組織(細胞、主根、及び葉;レーン1〜3)には検出されなかった。しかしながら、トランスジェニック試料(図5B)においては、ニンジン細胞懸濁培養物(レーン4)と比較してより高度の発現が、葉(レーン6)及び主根(レーン7)に観察された。ニンジン根及び葉組織におけるBADHタンパク質蓄積は、トランスジェニックの根及びシュートにおけるBADH酵素活性で得られた結果と平行であった。
塩ストレスがBADH活性に影響を与えるか否かを試験するため、ニンジン細胞懸濁培養物で異なる塩濃度(0〜500mM NaCl)の下で実験を実施した。ニンジン細胞において2週間実施された研究は、非形質転換細胞より高い液体培地中のNaCl濃度で、形質転換細胞が持続され増殖し得ることを示した(図6A〜B)。100mlの培地を含有している500mL三角フラスコを使用して、ニンジン培養物は、形質転換及び非形質転換の両方で11.82gの細胞を産生したが、100mM NaClの存在下においては、2週間後に8.75gのトランスジェニック細胞(1096%)及び1.29gの非形質転換細胞(161%)が得られた(使用された初期培養物が、フラスコ1個当たり0.8gを含有していた場合、図6A〜B参照)。さらに、100〜300mM NaClに曝された場合、BADH酵素活性はトランスジェニック・ニンジン細胞培養物において刺激された。最大の顕著なBADH活性は、100及び200mM NaClで見られ(図6C)、そのような増加は非形質転換細胞においては有意でなかった。これは、非緑色の細胞又は根における色素体ゲノムの低いコピー数にもかかわらず、発達段階に関係なく、全長Prrnプロモーター及び遺伝子10 5'UTRが全ての組織において効率的な転写及び翻訳を促進することを示している。
異なる塩濃度(100〜500mM NaCl)を、ポット内の土壌に移された形質転換ニンジン植物及び非形質転換ニンジン植物において試験した。badh導入遺伝子を保持しているトランスジェニック植物は、最大400mM NaClでよく生長したが(図7)、非形質転換植物は、200mM NaCl超では2週間後にポット内で生存することができなかった。
色素体形質転換ベクターの構築
製造業者のプロトコルに従い、DNeasyプラント・ミニ・キット(Qiagen Inc.)を使用して、葉から単離されたニンジン・ゲノムDNAから、ニンジン隣接配列を表わすDNA断片を増幅した。その隣接配列断片を、プラチナ(Platinum)Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen Inc.)を使用して、タバコ葉緑体遺伝子配列から生成させたプライマーを用いて増幅した。増幅された断片は、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域を表し、サイズは〜4.2kbである。PCR増幅されたDNA断片を、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ(Promega)で処理し、シュリンプ・アルカリホスファターゼ(Shrimp Alakaline phosophatase)(Promega)で脱リン酸されたPvuIIで消化されたpBluescript II KSへとクローニングした。キナーゼ反応及び脱リン酸反応は、製造業者の指示の通りに実施した。葉緑体プロモーター及び制御配列は、タバコ葉緑体ゲノムに関して入手可能な情報に基づくPCRを使用して増幅した(アクセッション番号NC_001879)。ニンジン特異的葉緑体形質転換ベクターpDD-Dc-gfp/BADH(図1A)は、gfp/BADH発現カセットを表す平滑末端化されたClaI-SacI断片を、ニンジン葉緑体DNA隣接配列のPvuII部位へと挿入することにより構築した。sm-gfp遺伝子はTAIRから得られた。同様に、ニンジン葉緑体形質転換ベクターpDD-DC-aadA/BADH(図1B)は、脱リン酸の後に、aadA/BADH発現カセットを表す平滑末端化されたApaI断片を、ニンジン葉緑体DNA隣接配列のPvuII部位へと挿入することにより構築した。細菌及びDNAの取り扱いは、標準的な分子生物学プロトコルの通りに実施した。
MS塩(Murashige及びSkoog、1962)、B5ビタミン(Gamborgら、1968)、2%ショ糖、及び0.8%寒天を含む培地を含有している植物組織培養チューブで、無菌のニンジン植物(Daucus carota L.cv.Half long)を育てた。胚軸を0.5mmセグメントに切り、3%ショ糖、0.1mg/l 2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)pH5.7を含有している50mlのMSB液体培地中に置いた。26±2℃及び120rpmでの3週間の連続的な振とうの後、遊離した細胞を、100μMメッシュで収集し、遠心分離し(10分間150×g)、新鮮な培地に再懸濁させた。急速に増殖する同種の黄色細胞を、毎週継代培養した。100μMメッシュでろ過されたニンジンの微細な細胞懸濁培養物を、3mg/L 2,4-D及び1mg/Lカイネチンが補足されたMSB固形培地に均一に広げ、ニンジン特異的色素体ベクター(図1A〜B)を打ち込んだ。暗所で2日間インキュベートされた打ち込まれたカルスを、3mg/L 2,4-D、1mg/Lカイネチン、及び異なる濃度のベタイン・アルデヒド(10、15、20、及び25mM BA)及びスペクチノマイシン(150、250、350、及び450mg/L)を含有しているMSB培地上で選抜した。培養物を、50〜100lxの光度及び26±2℃の温度で16/8時間の昼/夜周期でインキュベートした。トランスジェニック培養物を、選抜剤が補足された固体培地及び液体培地の両方を使用して繁殖させた。(0.2mg/Lを含有しているMSB培地上で)体細胞胚形成を通して作製されたトランスジェニック植物を、ポット内の土壌に移した。1週間目は高湿度を維持するためポットをプラスチックの袋で覆い、1週間目は漸進的に減少する濃度のMS塩を潅注し、その後、2週間目には水道水を潅注した。
全ゲノムDNAを、トランスジェニック・ニンジンのPCR及びサザンブロット分析のため、植物DNeasyキット(Quiagen Inc.USA)を使用して単離した。PCR反応は、lO×PCR緩衝液及びプライマー対3P/3M(隣接配列上に対合/aadA遺伝子上に対合)及び16SF/1M(ネイティブ葉緑体ゲノム/aadA遺伝子上に対合)と共にTaq DNAポリメラーゼを使用して、5分間94℃で50ngのDNAテンプレートを変性させ、25 PCRサイクル(94℃で1分間、64℃でl分間、72℃で3分間)、72℃で10分間の最終伸張を実行することにより実施された。
記載されたようにして(Daniellら、2001)、抽出及びBADH(ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ)活性に関するアッセイを実施した。1gのニンジン組織を、50mMヘペス-KOH(pH8.0)、1mM EDTA、20mM二亜硫酸ナトリウム、10mMホウ酸ナトリウム、5mMアスコルビン酸、及び5mM DTTを含有している2mLの緩衝液中で破砕した。粗抽出物を、10分間4℃で10,000×gで遠心分離し、上清をセファデックス(Sephadex)G-25カラム(Amersham Pharmacia biotech,USA)を使用して脱塩した。反応を開始するために25℃で1mM BAが添加されたアッセイ緩衝液(50mMヘペス-KOH、pH8.0;1mM EDTA、5mM DTT、1mM NAD+)において、1分後及び10分後に、340nmで分光光度的にBADHによるNAD+還元を測定した。
それぞれ0、100、200、300、400、及び500mM NaClを含有しているポット内の土壌に移された同じ形態形成生長相及び高さのトランスジェニック・ニンジン植物及び非トランスジェニック・ニンジン植物を、耐塩性に関して分析した。植物はグロース・チャンバーで維持し、1ヶ月間、異なるレベルの塩を含有している食塩水を毎日潅注した。
材料及び方法
植物材料及び形質転換
繊維が除去されたワタ(Gossypium hirsutum L.cv.Coker310FR)種子を、2分間70%エタノールへ浸漬することにより滅菌した後、〜4%の有効塩素を含有している次亜塩素酸ナトリウム溶液により8分間処理し、次いで0.1%塩化第二水銀溶液(w/v)により5分間処理した。表面滅菌及び4〜5回の滅菌水での洗浄の後、種皮を柔らかくするため種子を4〜5時間滅菌水中に維持し、それを完全に除去した後、種子を、1.5%ショ糖と共に半分の強度のMS塩(Murashige及びSkoog、1962)及びB5ビタミン(Gamborgら、1968)を含有している1/2 MSB培地上に置いた。5日齢の実生の胚軸外植片(4〜6mm長)を、カルスの誘導のため、(MS塩、B5ビタミン、0.1mg/l 2,4-D、0.5mg/lカイネチン、及び3%グルコースを含有している)MST1培地上に垂直に置いた。均一に分布した胚形成前(pro-embryognic)のカルスに、ヘリウムに基づくバイオリスティック微粒子銃(Bio-Rad)を使用して、葉緑体ベクターでコーティングされた金粒子を打ち込んだ。ワタ・カルスの形質転換は、以下のパラメータを使用して最適化された:0.6μm金粒子マクロキャリアー;27in.Hgチャンバー真空;1550psiヘリウム圧;6mmラプチャー・ディスク・マクロキャリアー・ギャップ;6mmマクロキャリアー飛距離、6cm標的距離、及び10μl金粒子上にコーティングされた葉緑体ベクター。打ち込み後の培養物を、24時間暗所でインキュベートし、その後、50mg/lカナマイシンが補足された選抜培地MST1に移し、750luxの光度及び28±2℃の温度で16/8時間の昼/夜周期でインキュベートした。トランスジェニック胚原性培養物を、50mg/lカナマイシンが補足されたMST1培地上で繁殖させ(図34)、培養物における導入遺伝子aphA-6遺伝子の組み込みをPCRにより確認した(図35)。
材料及び方法
隣接配列の増幅及びクローニング
製造業者のプロトコルに従い、キアゲン(Qiagen)植物抽出キットを使用して、隣接配列を表すDNA断片を、葉から単離された植物ゲノムDNAから増幅した。隣接配列断片を、プラチナ(Platinum)Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen Inc.)を使用して、プライマーADLF-5' gtgtcagtgtcggcccagcagag 3'及びADLR-5' aacaggggtcaaggtcggccag 3'により増幅した。増幅された断片は、葉緑体ゲノムの16S/trnI-trnA/23S領域を表し、サイズは〜4.2kbである。PCR増幅されたDNA断片を、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ(Promega)で処理し、シュリンプ・アルカリホスファターゼ(Shrimp Alakaline phosophatase)(Promega)で脱リン酸されたPvuIIで消化されたpBluescript II KSへとクローニングした。キナーゼ反応及び脱リン酸反応は、製造業者の指示の通りに実施した。ニンジン特異的隣接領域を保有しているクローンを、pDA-35と名付けた。
pDA-29は、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を賦与するaadA遺伝子、並びに毒性ベタイン・アルデヒドのグリシン・ベタインへの分解を代謝するbadh遺伝子を保持している、pBluescript II KSへとクローニングされた葉緑体特異的発現カセットである。第一の遺伝子の発現は、5'末のシャイン・ダルガーノ配列及び3'末のpsbA 3'UTRの制御の下で16S Prnnプロモーターにより駆動される。badh遺伝子の発現は、異種T7遺伝子10 5'UTR及びrpsl6 3'UTRにより制御される。aadA遺伝子はpLD-CtV(Daniellら、1998)由来であり、BALLA遺伝子はpLD-BADH(Daniellら、2001)由来であった。第二の葉緑体発現カセットpDA-30は、可溶性の修飾された緑色蛍光タンパク質(TAIRより入手)をコードするsm-gfp遺伝子及びbadh遺伝子を保持している。sm-gfpの発現は、16S Prrnプロモーターにより駆動され、異種T7遺伝子10 5'UTR及びrpsl6 3'UTRにより制御される。badh遺伝子の発現は、psbAプロモーター/5'UTR及び3'UTRにより制御される。プロモーター及び制御配列は、タバコ葉緑体ゲノムに関して入手可能な情報(Shinozakiら、1987)に基づくPCRを使用して増幅された。
葉緑体形質転換ベクターpDD-XX-aadA/badhは、pDA-29発現カセットと共に隣接配列を保有しているpDAベクターの誘導体である。pDA-29からの発現カセットは、ApaI断片として得られ、製造業者の指示の通りにクレノウDNAポリメラーゼ(NEB)を使用して平滑末端化され、PvuIIで消化され脱リン酸されたpDA-35へとクローニングされた。他の種特異的葉緑体形質転換ベクターpDD-XX-gfp/badhは、ニンジン隣接配列及びpDA-30発現カセットを保有している。pDA-30からの発現カセットは、ClaI/SacI断片として導出され、平滑末端化され、PvuIIで消化され脱リン酸されたpDA-35へとクローニングされた。細菌及びDNAの取り扱いは、標準的な分子生物学プロトコルの通りに実施された。
トウモロコシ葉緑体ゲノムの遺伝子操作のため、トウモロコシ葉緑体ゲノム内のターゲティングされた組み込み部位に隣接するトウモロコシ特異的配列(trnI及びtrnA)を、特異的なPCRプライマーで増幅し、ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(BADH)選抜可能マーカー及び緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子発現カセットに隣接するようサブクローニングした。
微小発射体(micro projectiles)をDNA(pDA34-ZM-gfp-BADH及びpDA33-ZM-aadA-BADH)でコーティングし、打ち込みをバイオリスティック装置PDS1000/HE(Bio-Rad)で実施した。
選抜は打ち込みの2日後に開始した。打ち込まれたカルスを、5〜20mM BA(ベタイン・アルデヒド)又は25〜100mg/lストレプトマイシンを含有しているカルス誘導培地に移した。浸透圧を維持するため、BAと組み合わせられた50〜150mMNaClを使用した選抜も実施した。
再生は、1.0mg/l NAA(α-ナフタレン酢酸)、2%ショ糖、2g/lミオイノシトール、及び.3%フィタゲル、pH5.8が補足されたMs塩及びビタミンを含有している培地Rlにカルスを移すことにより、打ち込みの6〜8週間後に開始した。再生した植物を、1/2のMS塩及びビタミン、3%ショ糖、及び.3%フィタゲル、pH5.8を含有しているR2に移した。再生した植物を、明所で維持した(16/8時間光周期)。
トウモロコシ種子の表面滅菌及び発芽
トウモロコシ種子を、継続的な振とうの下、20分間、.1%トゥイーン20を含有している2.6%次亜塩素酸ナトリウム(市販の漂白剤から調製)を含有した溶液で表面滅菌し、次いで、無菌蒸留水で4回濯いだ。種子を、暗所でpH5.8のMS培地上で生長させた。3日齢の実生から無菌的に節切片を切除した。節切片は、発芽した実生上に透明な区分として出現し、7番目の節を表す。切除した場合、節の横断面は1.3〜1.5mmの長さである。
打ち込みの前に、20〜30個の節切片を、アクロピチラ末端(acropitila end)を上にして、各ペトリ・プレートの中心に置いた。打ち込みは、1100、1300、及び1550psiのラプチャー・ディスクを使用して、メイズ葉緑体ベクターにより実施された。
節切片外植片を、125℃で連続光の下、Ms塩及びビタミン、1.0mg/l 6BA(6-ベンジルアミノプリン)、3%ショ糖、及び5g/lフィタゲルpH5.8から構成されたシュート繁殖培地SM1上に求頂末端(acropital end)を上にして置いた。最初のシュート先端からのシュート先端クランプの開始が、培養の2〜4週間後に起こった。打ち込みの2日後、形質転換された節切片を、5〜20mM BA又は50〜100mg/lストレプトマイシン選抜剤を含有しているシュート繁殖培地に移した。その後の2週間隔での継代培養は、5〜20mM BA又は25〜100mg/lストレプトマイシンを含有している選抜シュート繁殖培地で緑色クランプを選抜し、分割し、継代培養することにより実施された。
MS塩及びビタミン、5mg/l IBA及び3%ショ糖、pH5.8を含有している再生培地M1に移すことにより、複数のシュート・クランプを再生させた。1/2のMS塩及びビタミン、3%ショ糖及び3g/lフィタゲル、pH5.8を含有しているM2培地にシュート先端クランプを移すことにより、発達したシュートを再生させた。さらに、全ての再生培地に、選抜剤としての5〜20mM BA又は25〜100mg/lストレプトマイシンが補足されることに注意すべきである。
トウモロコシ葉緑体形質転換ベクターは、トウモロコシ葉緑体ゲノムの逆方向反復(IR)領域への導入遺伝子の組み込みを促進する。ベクターpLD-Corn-BADHは、構成性16S rRNAプロモーターにより駆動され、ペチュニア色素体ゲノムからのpsbA遺伝子の3'UTR領域により制御されるキメラのaadA遺伝子及びBADH遺伝子を含有している。この構築物において、aadA及びBADHはいずれも葉緑体にとって好ましいリボソーム結合部位、GGAGGを保有している。トウモロコシ葉緑体形質転換のため使用されたもう一つのベクターpLD-Corn-UTR-BADHは、ジシストロン(dicistron)の発現を駆動する構成性16S rRNAプロモーターを有しているが、BADHは、増強された発現のため、プロモーター及びpsbA遺伝子の5'UTR及びpsbA遺伝子の3'UTRの制御下にある。トウモロコシ種子の有色体における外来タンパク質の発現が望まれるため、目的の遺伝子は、細胞性調節がない制御配列の調節下にある必要がある。この情況において、適当な候補制御配列の例は、T7遺伝子10-リーダー配列及びcry2Aa2 UTRである。T7遺伝子10-リーダー配列は、トランスジェニック有色体において外来タンパク質を発現させるために使用される。cry2Aa2 UTRは、緑色組織においてpsbA UTRと同程度の効率で同程度の量の外来タンパク質を有色体に蓄積させることが本発明者により示されている。従って、psbAが緑色組織における最も効率的に翻訳される葉緑体遺伝子のうちの一つであるため、付加的なベクターのための選抜可能マーカーは、psbAプロモーター及び5'UTRの制御下にあるBADH遺伝子を使用する。緑色組織又は非緑色胚原性カルスが導入遺伝子をトウモロコシ葉緑体ゲノムへ導入するために使用される場合には、それぞれ光制御されるpsbAプロモーター/UTR又は16S rRNAプロモーター/遺伝子10 UTRを使用することが好ましい。
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「アグロバクテリウムにより媒介された形質転換のための対抗選抜抗生物質としてのモキサラクタム(Moxalactam)、及びテオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)体細胞胚形成に対するその正の効果(Moxalactam as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis)」Plant Science,Volume 164,Issue 4,April 2003、607〜615頁 Gabriela Antunez de Mayolo、Siela N.Maximova、Sharon Pishak、及びMark J.Guiltinan
Claims (39)
- 機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター
- 色素体形質転換ベクターにおいて機能性である制御配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
- 制御配列が色素体ゲノムにおいて作用するプロモーターを含む、請求項2記載のベクター。
- プロモーターがPrrn 16S rRNAである、請求項3記載のベクター。
- 制御配列がpsbA 5'エレメント及びpsbA 3'エレメントを含む、請求項4記載のベクター。
- 制御配列が、外来遺伝子をコードするDNA配列の転写及び翻訳の増強を提供することができる5'UTRをさらに含む、請求項2記載のベクター。
- 制御配列が、外来遺伝子をコードするDNA配列に転写物安定性を賦与することができる3'非翻訳領域(UTR)をさらに含む、請求項2記載のベクター。
- 制御配列が遺伝子10 5'UTRをさらに含む、請求項2記載のベクター。
- 制御配列が遺伝子10 5'UTR/rps 16 3'UTRをさらに含む、請求項8記載のベクター。
- 第一の隣接配列が16S/trnIであり、かつ第二の隣接配列がtrnA/23Sである、請求項1記載のベクター。
- 第一の隣接配列が約4kbである、請求項1記載のベクター。
- 第二の隣接配列が約4kbである、請求項1記載のベクター。
- 高等植物種の色素体ゲノムへの安定的組み込みのための成分であり、第一及び第二の隣接DNA配列が、該色素体ゲノムのスペーサー領域内の配列に実質的に相同であり、かつ該隣接配列が、該高等植物種の色素体ゲノムにおいて保存されている、請求項1記載のベクター。
- スペーサー領域が、転写的に活性なスペーサー領域である、請求項13記載のベクター。
- 5'UTRがpsbAの5'UTRである、請求項6記載のベクター。
- 3'UTRがpsbAの3'UTRである、請求項7記載のベクター。
- 選抜可能マーカーをコードするDNA配列をさらに含む、請求項1記載のベクター。
- 選抜可能マーカーが、抗生物質なしの選抜可能マーカーである、請求項17記載のベクター。
- 抗生物質なしの選抜可能マーカーが、ベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(BADH)である、請求項18記載のベクター。
- 選抜可能マーカーをコードするDNA配列が、抗生物質耐性選抜可能マーカーをコードする、請求項17記載のベクター。
- 抗生物質耐性選抜可能マーカーがaadAである、請求項20記載のベクター。
- 請求項1記載のベクターによって安定的に形質転換された植物。
- 請求項22記載の植物の子孫。
- 請求項22記載の植物の種子。
- 目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列を有する色素体ゲノムを含む、請求項22記載の植物の非緑色部分。
- 請求項1記載のベクターで形質転換された少なくとも一つの原色素体をさらに含む、請求項22記載の植物。
- 請求項1記載のベクターによって形質転換された体細胞胚。
- 機能的に接続された成分として、非緑色色素体において機能性のプロモーターと、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、選抜可能な形質を賦与するポリペプチドをコードする少なくとも一つの付加的な構造遺伝子又はその機能性部分とを含む発現カセットを含む非緑色色素体を含有する非緑色植物細胞であって、該異種DNA配列の転写が、該プロモーターと、転写終結領域と、相同的組み換えによる該色素体のゲノムへの発現カセットの安定的組み込みを促進する該発現カセットに隣接する色素体DNA隣接配列とによって制御される、非緑色植物細胞。
- 体細胞胚形成を通して再生することができる、請求項28記載の非緑色植物細胞。
- 請求項1記載の色素体形質転換ベクターで形質転換された色素体ゲノムを有するトランスジェニック非緑色植物細胞であって、体細胞胚形成を通して再生されるトランスジェニック非緑色植物細胞。
- 請求項1記載のベクターを植物色素体の色素体ゲノムへ組み込む工程を含む、体細胞胚形成を通して色素体を形質転換する方法。
- 工程を含む体細胞胚形成を通して植物が再生される、非緑色外植片を使用して色素体形質転換を達成する方法。
- 機能的に接続された成分として、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、選抜可能マーカーをコードするDNA配列と、相同的組み換えによる葉緑体ゲノムへの発現カセットの安定的組み込みを促進する発現カセットに隣接する色素体DNA配列とを含む発現カセットを含む色素体を含有する植物細胞であって、体細胞胚形成を通して再生される植物細胞。
- 目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列を含み、体細胞胚形成を通して再生することができる非緑色植物細胞であって、該目的のポリペプチドをコードする該異種DNA配列が、該非緑色植物細胞に含有されている色素体に組み込まれている、非緑色植物細胞。
- 機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において作用するプロモーターと、色素体において作用する選抜可能マーカーをコードするDNA配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換することができる色素体形質転換ベクター。
- 機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において機能性である制御配列と、目的のポリペプチドをコードする異種DNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞内にある色素体を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター。
- 請求項1記載の色素体形質転換ベクターを植物細胞の色素体ゲノムへ組み込む工程;及び
目的のポリペプチドを発現させるため該植物細胞を増殖させる工程
を含む、異種DNA配列によりコードされる目的のポリペプチドを非緑色植物細胞において作製する方法。 - 外因性のベタイン・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ(badh)遺伝子を発現するよう請求項1記載のベクターを介して非緑色植物細胞を形質転換する工程を含む、トランスジェニック植物を視覚的に選抜する方法。
- 機能的に連結された成分として、第一の隣接配列と、色素体において機能性である制御配列と、外来遺伝子をコードするDNA配列と、第二の隣接配列とを含む、非緑色植物細胞を形質転換するのに適した色素体形質転換ベクター。
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