ES2244073T5 - Vectores universales de integracion y de expresion de cloroplastos, y plantas transformadas. - Google Patents
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Abstract
Un vector universal de integración y de expresión, competente para transformar de forma estable el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y secuencias de control situadas en dirección 5'' desde el extremo 5'' y en dirección 3'' desde el extremo 3'' de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente activa entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana.
Description
Vectores universales de integración y de
expresión de cloroplastos, y plantas transformadas.
Esta solicitud se refiere al campo de la
ingeniería genética de genomas de plantas, particularmente la
ingeniería genética del genoma de plastidios de plantas, tales como
cloroplastos, y a la transformación estable del genoma de
cloroplastos de cualquier especie vegetal.
Esta solicitud se refiere en particular a un
vector universal de expresión de integración de cloroplastos que es
competente para transformar cualquier planta con uno o más genes de
interés. La solicitud de patente previa, Serie nº 08/591.407,
muestra células vegetales transformadas mediante un casete de
expresión que comprende una secuencia de ADN exógena que se integra
establemente (se enlaza covalentemente) en el genoma del cloroplasto
de la célula de una planta diana. Las secuencias de ADN
"establemente" integradas son aquellas que se heredan a través
de la replicación del genoma por las células u organismos
descendientes. Esta estabilidad se muestra mediante la capacidad
para establecer estirpes celulares permanentes, clones, o plantas
transgénicas que comprenden una población que contiene el ADN
exógeno.
Igualmente, la patente U.S. 5.693.507 (1997), de
Daniell y McFadden, describe tal integración estable por medio de
un casete de expresión que comprende una secuencia de ADN exógeno
que codifica un rasgo deseado, y las plantas transformadas.
El carácter atractivo de la transformación del
genoma de cloroplastos sobre la transformación del genoma nuclear
es atribuible a los serios riesgos que resultan de ésta última. Una
preocupación habitual es el escape de genes extraños a través de la
dispersión del polen desde las plantas transgénicas de la cosecha
hasta sus parientes herbáceos. Se ha demostrado que el polen
transgénico repartirá genes extraños (transgénicos) a otras plantas
sexualmente compatibles (detectado mediante el predominio del gen
marcador en la prole cosechada a partir de plantas no transgénicas
que se hicieron crecer en el área circundante). Por ejemplo, se ha
observado a distancias variables, en diferentes direcciones, la
dispersión de polen desde una parcela de ensayo central, que
contiene plantas de algodón transgénicas, hasta las plantas no
transgénicas circundantes (Lewellyn y Fitt, 1996); (Umbeck, P.F.
et al., 1991). Además, las frecuencias de genes marcadores en
girasoles salvajes fue, por término medio, alrededor de 28 hasta
38%; en fresas salvajes, que crecen a 50 metros de un campo de
fresas, más del 50% de las plantas salvajes contenían genes
marcadores procedentes de fresas cultivadas (King, J., 1996).
El escape de genes extraños a través del polen
es especialmente una preocupación medioambiental seria, en el caso
de genes con resistencia a herbicidas, debido a las tasas elevadas
de flujo de genes desde las cosechas hasta sus parientes salvajes.
La preocupación es que el escape de genes desde las cosechas
transgénicas hasta sus parientes herbáceos creará malas hierbas
poderosas. En el arroz (Oryza sativa), se ha observado el
flujo de genes desde variedades cultivadas hasta los parientes
salvajes, en O. perrennis (Barrett, 1983) y en el arroz rojo
(O. sativa; Langevin et al., 1990). En el sur de los
Estados Unidos de América, el arroz rojo se ha convertido en una
mala hierba importante debido a que los herbicidas que lo exterminan
también exterminan al arroz cultivado. Se pagan menores precios por
el arroz cultivado contaminado con arroz rojo. Algunos
investigadores han introducido el gen bar que confiere
resistencia a glufosinato (Liberty), en el arroz cultivado, para
combatir esta mala hierba (Oard et al., 1996; Sankula et
al., 1996). Sin embargo, debido a la compatibilidad sexual, la
introducción de un gen expresado en el núcleo permitirá la
transmisión de ese rasgo de resistencia al arroz rojo, vía el
polen.
De forma similar, se cruzó colza transgénica,
genéticamente manipulada por ingeniería para la resistencia a
herbicidas, con un pariente de tipo mala hierba, Brassica
campestris (mostaza salvaje), y confirió resistencia a
herbicidas incluso en la primera generación del retrocruzamiento en
las condiciones de campo (Mikkelson, T. R., et al.,
1996).
La herencia materna de los genes introducidos
evita el escape de genes a través del polen. Una solución a este
problema son los genes extraños manipulados por ingeniería genética
a través de genomas de cloroplastos (que se heredan de forma
materna para la mayoría de las cosechas). También, las enzimas o
proteínas diana para la mayoría de los herbicidas (por ejemplo,
fotosíntesis o rutas biosintéticas de aminoácidos/ácidos grasos) se
encuentran en compartimientos dentro del cloroplasto. Otra ventaja
importante de la transformación de cloroplastos es el mayor nivel
de expresión de genes extraños debido a un número de copias muy
elevado (5000-10.000) de genomas de cloroplastos en
las células vegetales. Debido a que la maquinaria transcripcional y
de traducción del cloroplasto tiene naturaleza procariota, los
genes de origen bacteriano resistentes a herbicidas se pueden
expresar a niveles extraordinariamente elevados en cloroplastos.
Las investigaciones tempranas sobre la
transformación de cloroplastos se centraron en el desarrollo de
sistemas de orgánulos usando cloroplastos capaces de una
transcripción y una traducción eficaces y prolongadas (Daniell y
Rebeiz, 1982; Daniell et al., 1983) y de la expresión de
genes extraños en cloroplastos aislados (Daniell y McFadden, 1987).
Estos experimentos se realizaron con la premisa de que fue posible
introducir cloroplastos intactos aislados en protoplastos, y
regenerar plantas transgénicas (Carlson, 1973). El descubrimiento
del arma génica como dispositivo de transformación abrió la
posibilidad de la transformación directa de plastidios en plantas
(Daniell, 1993). Usando el arma génica, se logró la expresión
transitoria de genes extraños en plastidios de dicotiledóneas
(Daniell et al., 1990; Ye et al., 1990), de
monocotiledóneas (Daniell et al., 1991), la expresión
prolongada de genes foráneos usando vectores de expresión de
cloroplastos que se replican autónomamente (Daniell et al.,
1990), y la integración estable de un marcador seleccionado en el
genoma del cloroplasto del tabaco (Svab y Maliga, 1993). Se
obtuvieron plantas de tabaco, resistentes a ciertos insectos,
integrando el gen cryIAc en el genoma del cloroplasto
del tabaco (McBride et al., 1995; Patente U.S. 5.451.513).
La transformación estable de plastidios de plantas superiores se ha
logrado hasta ahora sólo en el tabaco.
Hasta la fecha, la integración estable de un gen
extraño en el genoma de cloroplastos de una planta superior sólo se
ha dado a conocer en el tabaco. Esto se logró con un vector que fue
específico para el tabaco y que se derivó a partir del genoma de
cloroplastos del tabaco, esto es, el vector contenía una secuencia
homóloga solamente con el genoma de cloroplastos del tabaco y que
no se conservó de forma elevada en los genomas de cloroplastos de
otras plantas. Tal vector es inadecuado para transformar de forma
estable especies de plantas distintas del tabaco. El único
documento publicado de la expresión de genes extraños en una especie
vegetal distinta del tabaco es aquel que trata de la expresión de
hojas y embriones de trigo (Daniell et al., 1991), pero no
se logró la integración estable. Nunca se ha dado a conocer la
integración estable de un gen extraño en el genoma de cloroplastos
de una planta monocotiledónea. Al menos en cereales
(monocotiledóneas), los protocolos de transformación/regeneración
desarrollados previamente pueden no ser susceptibles a la
transformación de plastidios debido a las ineficacias inherentes en
esos sistemas. También, las selecciones secuenciales/en serie
(selecciones repetidas), consideradas importantes para lograr la
homoplasmia (Daniell, 1997), pueden no ser factibles usando
aquellos sistemas de regeneración empleados. El desarrollo reciente
de protocolos de transformación/regeneración únicos de maíz
(Rudraswamy, 1997) y de arroz (sin publicar) tiene el
potencial
de mostrar eficacias sustancialmente mayores, y permite más de una ronda de selección durante la regeneración.
de mostrar eficacias sustancialmente mayores, y permite más de una ronda de selección durante la regeneración.
Maliga et al., en la patente U.S.
5.451.513, y Svab et al., 1990, proponen una transformación
del genoma de plastidios del tabaco mediante una técnica de
selección no letal que emplea ADN de plastidio que codifica un
fenotipo seleccionable no letal. Según Maliga et al., una
selección no letal es absolutamente esencial para obtener líneas
transplastgénicas.
A diferencia de la técnica de Maliga et
al., el método de la invención proporciona una selección que es
letal para todas las plantas no transformadas, salvo para el
tabaco. Sólo las plantas transformadas sobreviven y continúan
creciendo. Esta selección letal tiene lugar con virtualmente todos
los antibióticos, incluyendo espectinomicina y estreptomicina en un
medio que contiene el antibiótico en una concentración de
500-1.000 \mug/ml. Maliga et al.
demostraron que condiciones similares eran no letales para el
tabaco. Además, a diferencia de la técnica de Maliga et al.,
según la invención, la transformación hasta la homoplasmia se puede
lograr incluso en la primera ronda de selección.
En la Solicitud de Patente Europea nº 0 251 654,
Cannon et al. describe la transformación de cloroplastos del
tabaco mediada por transposones, por ejemplo, usando el transposón
bacteriano Tn5. El vector que contiene el transposón se dirige a
una región cromosómica conocida por ser una región
"transcripcionalmente silenciosa", a fin de conservar la
integridad transcripcional de los genes nativos. Se ha identificado
que tal región transcripcionalmente silenciosa está localizada
entre dos promotores divergentes conocidos de genes de cloroplastos,
por ejemplo los promotores para los genes para la subunidad grande
de cloroplastos de la ribulosa bisfosfato carboxilasa (RbcL, "LS
RuBisCo") y para \beta-ATPasa (atpB). Estos
promotores transcriben los genes en direcciones opuestas, lejos de
la región silenciosa del cromosoma. No se proporciona, en el vector
de expresión de Cannon et al., ningún terminador de la
transcripción; se sabe que tales regiones terminadoras son
absolutamente esenciales para la expresión génica en plastidios.
Finalmente, Cannon et al. no demuestra que se logre la
transformación estable de cloroplastos.
La invención descrita aquí tiene varias
características distintivas con respecto a Cannon et al. La
invención enseña la transformación estable transmisible a la prole.
La integración no está dirigida a una región transcripcionalmente
inactiva del cromosoma de cloroplastos. La invención integra un
casete (que contiene un terminador de la transcripción, como se
describe posteriormente en lo sucesivo) en una región
transcripcionalmente activa del genoma de cloroplastos. Los
promotores controlan la expresión de uno o más genes. A diferencia
de Cannon et al., ningún transposón está implicado en la
transformación del cloroplasto según la invención.
En NATO Asi Series, Daniell et al., 1994,
da a conocer la resistencia a insectos, obtenida mediante ingeniería
genética, vía genomas de cloroplastos que muestran la expresión de
la proteína CryIIA en plantas, para controlar insectos. McBride
et al., 1995, y la patente U.S. 5.545.818 (1996), confirman
lo expuesto por Daniell et al., y muestran la expresión de
la proteína CRYIAc de Bacillus thuringiensis en plastidios de
plantas. Los vectores dados a conocer por McBride están diseñados
para introducir el constructo sólo en el genoma de cloroplastos del
tabaco.
Es evidente, a partir del estado de la técnica,
que existe una necesidad importante de un vector de integración y
de expresión de cloroplastos para transformar, preferiblemente de
forma estable, los genomas de cloroplastos de muchas especies
diferentes de plantas. Tal "vector universal" permitiría la
transformación del genoma de cloroplastos de una planta diana
seleccionada, con una secuencia que codifica ADN heterólogo
(extraño), y eliminaría la necesidad de construir vectores cada uno
de los cuales es específicamente adecuado para transformar el
genoma de cloroplastos de la especie vegetal particular que se va a
transformar.
Hasta donde alcanza el conocimiento del
inventor, aún no se ha resuelto el problema para construir tal
vector universal, competente para transformar plantas
diferentes.
Aunque la secuencia nucleotídica de regiones
codificantes del genoma, incluyendo el genoma de cloroplastos, a
menudo se conserva entre especies, las secuencias que flanquean a
genes funcionales, es decir, las regiones espaciadoras entre
regiones codificantes, por el contrario, típicamente no se
conservan. El dogma aceptado para la falta de conservación, y de
este modo para el bajo grado de homología entre especies de las
regiones espaciadoras, es que las regiones espaciadoras típicamente
no realizan funciones esenciales. Por lo tanto, hay poca, si la
hay, presión selectiva para conservar la secuencia de regiones
espaciadoras entre especies. La secuencia de las regiones
espaciadoras se puede alterar sin efectos indeseables.
Stummann et al., 1988, describe que el
orden de genes del operón de ARN ribosómico del genoma de
cloroplastos es el mismo entre diferentes especies de plantas,
incluyendo el tabaco, el maíz, y una hepática, Marchantia, y
que las secuencias codificantes de este operón son muy homólogas.
Stummann también describe que la homología del operón entre
especies es menor que la homología de las regiones codificantes
génicas entre especies. Esto es consistente con la falta de
conservación de las regiones espaciadoras; y sugiere que la
homología de regiones espaciadoras entre especies, en el operón de
ARN ribosómico, es relativamente baja.
La invención, contrariamente al dogma de falta
de conservación de las regiones espaciadoras, usa regiones
espaciadoras, que se conservan enormemente entre diferentes plantas,
para construir vectores competentes para transformar una variedad
de plantas.
La invención proporciona vectores universales de
integración y de expresión de cloroplastos, que son competentes
para transformar e integrar de forma estable genes de interés en el
genoma de cloroplastos de múltiples especies de plantas. Se
proporcionan plantas transformadas y su prole. Se transforman
plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, las cuales nunca han
sido transformadas hasta ahora. Las plantas transformadas con un gen
sintético expresan polímeros a base de proteínas (PBP)
biodegradables valiosos. Las plantas transformadas producen
moléculas muy valiosas. Se proporciona resistencia a las cosechas
agrícolas frente a la mayoría de las clases de herbicidas químicos.
La resistencia a herbicidas se usa como un marcador seleccionable
letal para la transformación de los cloroplastos. Las plantas
transformadas son capaces de expresar, además del rasgo
seleccionado, un rasgo no seleccionado secundario deseable. Se
proporciona a las plantas transformadas resistencia frente a
insectos, tanto contra insectos que son susceptibles a toxinas Bt
como contra insectos que han desarrollado una resistencia a toxinas
de Bt.
Se ha descubierto, contrariamente a la creencia
convencional, que el genoma de cloroplastos (ct) de plantas
contiene regiones espaciadoras con secuencias nucleotídicas muy
conservadas. La naturaleza muy conservada de las secuencias
nucleotídicas de estas regiones espaciadoras del genoma de
cloroplastos hace a tales regiones espaciadoras, según se ha
descubierto, ideales para la construcción de vectores para
transformar cloroplastos de especies vegetales ampliamente
variables, todo esto sin la necesidad de construir vectores
individuales para plantas diferentes o para especies de cosechas
individuales, lo que requeriría primero una determinación de la
secuencia de ADN de cada uno de los genomas de los cloroplastos.
Este hallazgo tiene numerosas consecuencias útiles, e importantes
aplicaciones prácticas.
La invención tiene varias realizaciones útiles.
La invención proporciona un vector universal de integración y de
expresión, en lo sucesivo denominado como "UV", y su uso para
la expresión de al menos un fenotipo en una variedad de plantas
diferentes.
\newpage
El vector universal de integración y de
expresión de la invención comprende un casete de expresión
(posteriormente descrito más abajo) que comprende los elementos
genéticos necesarios para transformar transitoria o preferiblemente
de forma estable los plastidios, por ejemplo el genoma de
cloroplastos de una célula vegetal diana, con un ADN extraño
(heterólogo) que codifica una molécula de interés, como un fenotipo
para ser expresado por la planta, o una molécula no vegetal de
valor elevado, como un péptido (o polipéptido) biológicamente
activo. El vector universal está construido con una región
transcripcionalmente activa de un genoma de cloroplastos que se
conserva enormemente en un amplio intervalo de genomas de
cloroplastos de plantas superiores. Preferiblemente, esa región es
la región espaciadora 2, la región espaciadora intergénica entre la
región de ARN^{Ile}-t y la región de
ARN^{Ala}-t. Tal región se denomina a menudo aquí
como una región "espaciadora" debido a que, en el genoma de
cloroplastos, es intergénica entre varios genes en el operón de ARNr
que es transcrito mediante un promotor. Cuando se construye en el
vector universal, tal región se denomina generalmente aquí como un
"borde" o preferiblemente como una "secuencia de flanqueo"
o "secuencias de flanqueo". Esto es debido a que, en el vector
universal, los elementos genéticos operablemente unidos para
transformar establemente el plastidio de la planta diana están
flanqueados a cada lado por una secuencia, es decir, un fragmento,
de la región espaciadora. Las secuencias de flanqueo en el vector y
las secuencias espaciadoras en el genoma de cloroplastos tienen
suficiente homología entre sí para sufrir una recombinación
homóloga. El vector universal se inserta en el espaciador de una
región transcripcionalmente activa, en el genoma de los
cloroplastos. Generalmente, la región espaciadora está situada en
la región repetida invertida del genoma de los cloroplastos. El
resto del constructo, es decir, distinto de las secuencias de
flanqueo y distinto del casete de expresión, generalmente se
denomina aquí como el "vector" que comprende secuencias
bacterianas, como los vectores de clonación plasmídicos pUC,
pBR322, pGEM o pBlueScript.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector universal comprende un casete de
expresión que está flanqueado a cada lado por una secuencia de
flanqueo. En la patente U.S. 5.693.507 (1997) se describe un casete
de expresión adecuado para uso en la invención. Ese casete
comprende, unidos operablemente, una región de iniciación
transcripcional, funcional en el cloroplasto de la planta, al menos
una secuencia de ADN heterólogo que codifica una molécula diana de
interés, por ejemplo un gen (o una fracción funcional del mismo)
que codifica un compuesto biológicamente activo, y secuencias de
control situadas en dirección 5' desde el extremo 5' y en dirección
3' desde el extremo 3', y una región de terminación de la
transcripción, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el genoma del cloroplasto de una planta diana.
Preferiblemente, el casete de expresión está flanqueado por
secuencias de ADN de la planta, como secuencias de ADN del
cloroplasto, a fin de facilitar la integración estable del vector
de expresión en el genoma del cloroplasto. En la construcción del
casete de expresión, la secuencia de ADN comprende uno o más sitios
de clonación para la integración del gen o de los genes de
interés.
Las secuencias espaciadoras que se han
identificado en plastidios de plantas superiores se conservan
ubícuamente entre una gran variedad de plantas. Se encontró que
estas secuencias eran ideales para construir los vectores
universales de la invención, los cuales son, como resultado,
competentes para transformar el genoma de los cloroplastos de una
gran variedad (o multiplicidad) de plantas diana mediante
recombinación homóloga. De este modo, es irrelevante a partir de
qué espaciador individual de una planta particular se construya el
vector universal.
Como es sabido, generalmente será aconsejable
tener al menos una secuencia nucleotídica heteróloga adicional que
codifique un fenotipo seleccionable, tal como un gen que proporcione
resistencia a antibióticos, o una porción funcional del mismo, que
sirva como marcador asociado con el casete de expresión o con el
vector universal de integración y de expresión. Esto facilita la
identificación de las células vegetales en las que se ha integrado
establemente el gen extraño. Los genes marcadores son conocidos en
la bibliografía, por ejemplo \beta-lactamasa,
genes resistentes a herbicidas, tales como el gen psbA
mutante o EPSPS-aroA, el gen cat que codifica la
cloranfenicol acetotransferasa, y el gen uidA que codifica la
\beta-glucuronidasa (gus), y otros.
Se reconoce que el tabaco es único en no ser
susceptible al efecto letal de estreptomicina y espectinomicina.
Aunque las hojas de tabaco carecen de la pigmentación cuando se
exponen a un medio con tal antibiótico, es observable el
crecimiento continuado. Sin embargo, esta propiedad del tabaco es
burlada fácilmente. Hay numerosos antibióticos disponibles que son
letales para el tabaco, como la higromicina. Otro enfoque es
seleccionar un gen que exprese un marcador visible, como un color,
fluorescencia, etc., como el gen informador mGFP, que codifica una
proteína fluorescente verde.
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La invención proporciona un método de
transformación que puede producir homoplasmia (integración de genes
extraños en todos los genomas de los cloroplastos de la célula
vegetal) después de una primera ronda de selección, sin la
necesidad de un proceso de selección adicional. El método para
transformar una planta usa el vector universal construido con
secuencias de flanqueo procedentes de una especie vegetal distinta
de la especie de la planta diana a transformar. Como alternativa,
el vector puede contener secuencias de flanqueo que proceden de la
misma especie vegetal de la planta diana, incluyendo las procedentes
del tabaco.
La invención proporciona además un método para
construir el vector universal de integración y de expresión de
cloroplastos. Para ello, se determina una porción espaciadora del
genoma de cloroplastos de cualquier planta, de forma que sea
altamente homóloga con más de una especie de plantas. A partir del
genoma de los cloroplastos identificado se obtiene (o se sintetiza)
una secuencia nucleotídica que corresponde a la región espaciadora,
y se incorpora en un vector adecuado, tal como mediante subclonación
en un plásmido. La región espaciadora se coloca como secuencias de
flanqueo del casete de expresión, que comprende los elementos
genéticos necesarios para la transformación del plastidio y la
expresión del gen o genes extraños.
Se puede usar cualquier método de transformación
del cloroplasto. Para la transformación con el vector universal, es
adecuado cualquier gen (o porción funcional del mismo) que se pueda
utilizar para transformar un cloroplasto vegetal y codificar un
péptido deseado para conferir el rasgo deseado a la planta
diana.
La invención proporciona además plantas en las
que el genoma del cloroplasto se ha transformado establemente, esto
es, permanentemente, con el vector universal de la invención,
incluyendo su descendencia.
La invención incluye plantas monocotiledóneas,
como cereales, o células vegetales, tales como maíz, arroz, cebada,
avena, trigo y hierbas, y su descendencia en la que el genoma de los
cloroplastos se ha transformado establemente con el vector
universal derivado de la misma especie o de una especie diferente de
la planta transformada. La invención proporciona plantas
dicotiledóneas y monocotiledóneas, transformadas establemente tras
una única ronda de selección, debido a homoplasmia obtenible con el
vector universal que comprende un origen de replicación
(ori) del cloroplasto. La invención también proporciona
plantas establemente transformadas de especies diferentes,
incluyendo variedades de la misma especie, géneros, familias,
órdenes, y divisiones de plantas.
Según la invención, una planta en la que el
genoma de los cloroplastos se ha transformado establemente con uno
o más genes extraños de interés incluye plantas maduras y su
descendencia, como plantones y embriones. El término "planta",
en este contexto, también incluye porciones de plantas, tales como
explantes como esquejes, cultivos de tejidos, suspensiones de
células, y callos.
De este modo, la invención incluye las plantas
multicelulares transformadas establemente, su descendencia, la
semilla, y los plastidios transformados, por ejemplo el cloroplasto,
etc., y el método para regenerar las plantas transformadas.
En esta memoria descriptiva y en las
reivindicaciones, cuando se hace referencia a diferentes
"especies", el término "especie" se refiere no sólo a la
"especie" sino a variedades dentro de una especie, géneros,
familias, orden y divisiones del reino vegetal. De este modo, se
entiende que un vector universal, que se puede usar para
transformar plantas de diferentes especies, es capaz de transformar
plantas de diferentes variedades dentro de una especie, diferentes
géneros, diferentes familias, diferentes órdenes, y diferentes
divisiones. El término "planta" (o "plantas") pretende
ser genérico como se usa aquí.
Otra realización de la invención que usa el
vector universal de integración y de expresión proporciona plantas
transformadas con un gen biopolímero sintético que codifica
polímeros a base de proteínas (PBP) biodegradables.
Estos polímeros tienen propiedades importantes
de importancia práctica, según se discute en lo sucesivo.
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El descubrimiento fascinante de que la
transformación con un gen sintético que no necesita tener un análogo
natural en la planta o en el animal, para producir PBP, es
factible, ha demostrado la amplia aplicabilidad del vector en aún
otro campo del esfuerzo humano: la producción de moléculas
biológicamente activas, como productos farmacéuticos, en plantas, a
partir de cualquier gen o fracción funcional del mismo, sintético o
natural.
Una realización adicional de la invención es,
por lo tanto, el uso de plantas transformadas como biorreactores
(como factorías) para productos biofarmacéuticos. Hay al menos dos
capacidades a menudo necesarias para la producción de proteínas de
valor farmacéutico, no posibles en sistemas procariotas. Las
plantas, a diferencia de las bacterias, son capaces de producir la
proteína extraña en una conformación activa biológica. También, las
plantas a menudo son más tolerantes a la alteración de sus rutas
biosintéticas. De este modo, las plantas se pueden transformar con
un gen no funcional en (o extraño a) las plantas, que puede ser
sintético o no, que puede ser normalmente funcional (competente) en
animales (mamíferos), en ovíparos, en peces u otras especies.
La invención proporciona además plantas
transformadas que comprenden un gen provisto de un casete de
expresión, preferiblemente de un vector universal, que codifica una
variedad de productos deseados, especialmente moléculas
biológicamente activas como péptidos (polipéptidos), proteínas,
insulina, seroalbúmina humana (HSA), y otras moléculas descritas
adicionalmente en lo sucesivo. Se deja o se provoca que las plantas
crezcan, y los productos se aíslan de la cosecha transformada, como
tabaco, maíz, etc., y, si es deseable, se cosechan primero y, si es
necesario, se purifican.
Otra realización importante de la invención
proporciona plantas transgénicas resistentes a herbicidas en las
que se integra, preferiblemente de forma estable, un transgén
extraño, que confiere resistencia a uno o más herbicidas, en el
genoma de cloroplastos por medio del vector universal. Son de
particular importancia las plantas transformadas que muestran
resistencia a glifosato y de este modo son resistentes a
"ROUNDUP^{TM}", un herbicida comercialmente disponible de
Monsanto Company. El vector universal proporciona un medio eficaz
para transformar el genoma de cloroplastos de cualquier planta, y
para conferir resistencia (o tolerancia) a cualquiera de los
productos químicos herbicidas.
Un aspecto diferente de la invención proporciona
un método para transformar una planta mediante un casete de
expresión, preferiblemente mediante el vector universal, para
provocar que produzca un rasgo (o fenotipo) no buscado (secundario
u otro). [Véase, por ejemplo, Penazloza, V., et al. (1995),
quien da a conocer que la expresión mediante el gen de higromicina
\beta-fosfotransferasa confiere resistencia al
herbicida glifosato].
En otro aspecto de la invención, la tolerancia a
los herbicidas se usa como un gen marcador para la transformación
de cloroplastos.
Una realización adicional de la invención
proporciona resistencia a los insectos. Con la creciente
preocupación por el uso de plaguicidas químicos, se ha apoyado
ampliamente el uso de formulaciones de Bacillus thuringiensis
(Bt). El Bacillus thuringiensis proporciona muchos tipos de
inclusiones cristalinas que son tóxicas para los insectos. Las
proteínas que comprenden estas inclusiones se han categorizado
basándose en la clase de hospedante insecticida, y en la homología
de las proteínas. Las toxinas CRYI y CRYII tienen actividad
insecticida frente a lepidópteros, o lepidópteros y dípteros,
respectivamente. Las protoxinas CRYI tienen un tamaño de
130-135 kDa que se escinden enzimáticamente en
proteínas de 65 kDa para la actividad insecticida. La protoxina
CRYII tiene un tamaño de 65 kDa, con una proteína con una masa
molecular de 60-62 kDa para la actividad
insecticida. Muchas plagas de insectos comercialmente importantes
(especialmente en la familia Pyralidae) son susceptibles a la
toxina CryIIA, incluyendo el barrenador europeo del maíz,
Ostrinia nubilalis, el barrenador menor del tallo del maíz,
Elasmopalpus lignosellus, el barrenador de la vaina de la
judía de vaca, Maruca testulalis, el cogollero del tabaco,
Heliothis virescens, el gusano de cuerno del tabaco,
Manduca sexta, y la lagarta peluda, Lymantria dispar,
Daniell et al. 1994.
Sin embargo, las formulaciones de Bt no han sido
tan eficaces como se anticipó, principalmente debido a su
susceptibilidad a la radiación UV, al recubrimiento inadecuado, y al
alcance caro y limitado de los hospedantes. Por lo tanto, es
tentador el suministro de toxinas de Bt vía plantas transgénicas con
Bt.
Se ha producido el control aceptable de insectos
con el algodón nuclearmente transgénico con Bt frente al cogollero
del tabaco, Heliothis virescens, pero estas plantas no
expresan suficiente toxina de Bt para controlar al gusano del
capullo del algodón, Helicoverpa zea. Adicionalmente, estos
genes de Bt se pueden cruzar con especies vegetales relacionadas,
vía el polen. Para evitar estas preocupaciones, se ha evaluado la
transformación y la expresión de cloroplastos según la invención
debido a las siguientes razones. 1) Las células vegetales que
contienen cloroplastos pueden contener hasta 10.000 copias de genes
por célula, 2) los cloroplastos pueden leer el ADN bacteriano
intacto, incluyendo operones, y 3) los genomas de los cloroplastos
se heredan de forma materna y, por lo tanto, se elimina
drásticamente el escape de genes extraños vía el polen, debido a
que el ADN de los cloroplastos se degrada generalmente en el
polen.
Se escogió la CRY2A debido a que la CRY2A es
relativamente no homóloga con CRYIA y, por lo tanto, sólo muestra
una ligera resistencia cruzada frente a algunas poblaciones de H.
virescens resistentes a CRYIA. Debido a que la CRY2A está
"naturalmente truncada", se pueden lograr niveles elevados de
expresión sin sacrificar la región 3'.
En consecuencia, se ha proporcionado resistencia
al genoma de cloroplasto del tabaco, transformado con un vector
universal de la invención, frente a insectos normalmente
susceptibles a toxinas de Bt, y también frente a insectos que han
desarrollado resistencia o menor susceptibilidad a las toxinas de
Bt. Los insectos que jamás habían sido exterminados mediante
cualquier toxina CRY mostraron una mortalidad del 100% en el tabaco
transformado.
Por lo tanto, la expresión de cry2A, en
una planta, sería una herramienta valiosa para controlar múltiples
plagas de insectos a la vez que se supera el desarrollo de
resistencia a Bt. Otras proteínas insecticidas, tales como
colesterol oxidasa, que exterminan al picudo del algodonero mediante
un mecanismo diferente, se expresan en niveles elevados en los
cloroplastos.
En lo sucesivo, serán manifiestas otras
realizaciones de la invención.
La Figura 1 muestra un mapa del genoma del
cloroplasto del tabaco. Las líneas gruesas en el mapa genómico
representan las regiones repetidas invertidas del genoma del
cloroplasto. Las flechas etiquetadas "UV" representan las
secuencias de inserción para la realización preferida del vector
universal de integración y de expresión (UV); la flecha etiquetada
"TV" representa la secuencia de inserción para el vector del
tabaco (TV).
La Figura 2A muestra el vector del cloroplasto
del tabaco (TV), pZS-RD-EPSPS, para
la expresión de la resistencia a herbicidas (ejemplo
comparativo).
La Figura 2B muestra el vector universal de
expresión y de integración de cloroplastos (UV),
pSBL-RD-EPSPS, para la expresión de
resistencia a herbicidas.
La Figura 3A muestra el vector universal de
integración y de expresión de cloroplastos,
pSBL-CG-EG121, para la expresión de
biopolímeros.
La Figura 3B muestra el vector de integración y
de expresión del tabaco,
pZS-CG-EG121, para la expresión de
biopolímeros (ejemplo comparativo).
La Figura 4A-4E muestra la
homología de secuencias de las regiones espaciadoras entre el tabaco
y otras especies de cosechas. Se muestra mediante flechas un sitio
para la inserción de genes extraños. En dirección 5' del sitio para
la inserción de genes extraños, se muestra el sitio de un origen de
la replicación (ori).
La Figura 4F-4G muestra la
alineación de secuencias de la región espaciadora (64 pb) del ADNr
16S-23S de varias especies de cosechas con la
secuencia del cloroplasto del tabaco, en la que (+) representa a la
hebra positiva y (-) a la hebra negativa, respectivamente.
Las Figuras 5A-C muestran la
construcción del borde del vector pSBL-CT.
Las Figuras 6A-C muestran la
construcción del casete del gen marcador seleccionable del vector
pSBL-CtV1, casete el cual contiene un promotor
(Prrn) de ARNr 16S de cloroplasto, el gen aadA, y una región
no traducida 3' del gen psbA del cloroplasto.
Las Figuras 7A-7D muestran los
vectores pSBL-CtV2, pSBL-CtV3,
pSBL-CtVH, pSBL-CtVHF,
respectivamente.
La Figura 8A-B muestra los
vectores pSBL-CtVHBt y pSBL-CtVHBtR,
respectivamente.
La Figura 9 muestra las plantas de tabaco
transformadas y no transformadas que crecen en presencia de
espectinomicina, indicando la selección no letal en el medio (500
\mug/ml). Nótese el crecimiento de las hojas transformadas
(blanqueadas) y no transformadas (verdes).
Las Figuras 10A-10G muestran la
transformación y regeneración de plastidios de maíz.
La Figura 11 muestra la transformación de
plastidios de maíz. Las plantas de maíz transformadas crecen
normalmente (brote del centro), mientras que las plantas no
transformadas mueren en el medio letal, confirmando la selección
letal mediante el antibiótico (1000 \mug/ml de
espectinomicina).
Las Figuras 12A-12F muestran la
transformación y regeneración de plastidios de arroz.
Las Figuras 13A y 13B muestran el análisis
mediante PCR de ADN aislado de las hojas de transformantes de
arroz.
La Figura 14 muestra la transformación de
plastidios de cacahuete. Las plantas de cacahuete transformadas
crecen normalmente (en el centro y en la parte izquierda de la
placa), mientras que las plantas no transformadas mueren en el
medio letal (500 \mug/ml de espectinomicina).
La Figura 15 muestra la transformación de
plastidios de haba de soja. Dos plantas transformadas muestran
brotes, y las otras plantas mueren en el medio letal, confirmando
la selección letal mediante el antibiótico (500 \mug/ml de
espectinomicina).
La Figura 16 muestra la transformación de
embriones de boniato en el medio de selección letal (500 \mug/ml
de espectinomicina).
La Figura 17 muestra la transformación de
células de uva. Las células del cultivo transformadas se pusieron
verdes, mientras que las células no transformadas mueren en el medio
de selección letal (500 \mug/ml de espectinomicina).
\newpage
La Figura 18 muestra la expresión de biopolímero
a base de proteína (PBP) mediante los vectores de integración y de
expresión de cloroplasto, en E. coli.
La Figura 19 muestra el análisis de
transferencia Southern realizado con los transformantes procedentes
de plantas transgénicas con PBP, usando el vector del tabaco (TV)
(ejemplo comparativo). Las sondas procedían de secuencias de borde
de cloroplastos (A) o procedían de secuencias génicas polímeras
(EG121) (B).
La Figura 20 muestra el análisis de
transferencia Southern realizado con los transformantes preferentes
de plantas transgénicas productoras de PBP, usando el vector
universal (UV). Las sondas procedían de las secuencias del borde de
los cloroplastos (A), o procedían del gen aadA (B).
La Figura 21A muestra los niveles de transcrito
del gen extraño analizados mediante transferencia northern usando
ARN total aislado de los transformantes de los cloroplastos, del
control, y de una planta de tabaco transgénica nuclear que expresa
de forma elevada el gen del biopolímero sintético (EG121).
La Figura 21B muestra el aumento de las líneas
4-7 de la Figura 21A.
La Figura 22 muestra el análisis de
transferencia Western de proteína polímera purificada procedente de
plantas transgénicas.
La Figura 23A muestra la mayor velocidad de
crecimiento de E. coli que contiene el vector del tabaco con
el gen de EPSPS (ejemplo comparativo).
La Figura 23B muestra la mayor velocidad de
crecimiento de E. coli que contiene el vector universal con
el gen de EPSPS.
Las Figuras 24A-24B muestran la
integración de genes extraños en el genoma de plastidios mediante
PCR usando los cebadores rbcL y aadA (A), o los
cebadores 16SRNA y aadA (B).
Las Figuras 25A-25C muestran la
integración del gen aroA en el cloroplasto mediante análisis de
Southern, y la elevada generación de homoplasmia usando la sonda de
EPSPS (A) o la sonda rcbL-orf512. El sitio de
integración se muestra en (C).
Las Figuras 26A y 26B muestran la generación de
semillas recogidas a partir de plantas de tabaco del control y de
plantas de tabaco transformadas, respectivamente, en presencia de
los marcadores seleccionables.
Las Figuras 27A y 27B muestran plantas de tabaco
transgénicas y del control pulverizadas con glifosato.
Las Figuras 28A y 28B muestran la
susceptibilidad del tabaco (control) y resistencia (transformadas) a
insectos.
La Figura 29 muestra la proteína total (análisis
de transferencia Western) aislada a partir de plantas de tabaco del
control y de plantas de tabaco transgénicas.
En lo sucesivo se describen con mayor detalle
realizaciones preferidas de la invención.
El vector universal de integración y de
expresión de la invención es competente para transformar de forma
estable cloroplastos de diversas plantas diana diferentes. Se pueden
proporcionar en el casete secuencias codificantes de ADN heterólogo
para codificar un fenotipo, tal como resistencia a herbicidas,
resistencia a insectos, u otros rasgos. El vector comprende además
una secuencia de flanqueo a cada lado de la secuencia codificante
de ADN, que es homóloga a una secuencia espaciadora del genoma del
cloroplasto, secuencia espaciadora la cual se conserva en los
genomas de los cloroplastos de plantas diferentes. De esta manera,
se facilita la integración estable del gen heterólogo en el genoma
del cloroplasto de la planta diana a través de la recombinación
homóloga de las secuencias del borde de flanqueo con secuencias
espaciadoras complementarias, en el genoma del cloroplasto. El
vector universal es competente para transformar cualquier especie
vegetal.
Se ha encontrado que la región espaciadora de
trnI y trnA se conservan enormemente en una gran
variedad de especies vegetales, desde cianobacterias hasta plantas
superiores, tales como monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los genes
trnI y trnA flanquean a cada lado una región
espaciadora, denominada como región espaciadora 2 o región "espa
2" (Figura 4F-4G). Las regiones en un lado u otro
de la región espaciadora tienen igualmente una homología casi
perfecta con las regiones correspondientes entre especies de plantas
desde cianobacterias hasta plantas superiores, excepto que las
plantas superiores contienen dos intrones en los genes trnI
y trnA. Unas secuencias del borde más largas tienden a
favorecer una integración más eficaz del ADN extraño. Por lo tanto,
aunque no es esencial, la homología entre especies de los genes
trnI y trnA, además de la homología de la región
espaciadora, contribuye a la eficacia de la transformación y de la
integración (Figura 4A-4E).
Si se incorporan en el vector secuencias del
borde más largas, que incluyan porciones no homólogas, la porción
no homóloga de la secuencia "formará un bucle" y "se
cortará" en el proceso de recombinación, y no se integrará en el
genoma del cloroplasto diana.
Se pueden construir diferentes vectores
universales con la región espaciadora. Por ejemplo, se pueden
constituir secuencias de flanqueo más cortas o más largas, con
parte o con todos los genes trnA y trnI adyacentes a
"espa 2".
Un vector universal preferido comprende las
secuencias de flanqueo y un casete de expresión que comprende los
siguientes elementos genéticos para proporcionar la transcripción y
la traducción de la secuencia codificante de ADN, organizado en el
siguiente orden (desde el extremo 5' hasta el extremo 3'): una parte
5' de la secuencia de flanqueo, un promotor funcional en el
cloroplasto, una secuencia de ADN con un sitio o sitios de clonación
apropiados para la inserción de una o más secuencias codificantes
para el fenotipo deseado o la molécula de interés, y para un
marcador seleccionable, un terminador de la transcripción y una
parte 3' de la secuencia de flanqueo. Se puede cambiar el orden de
las secuencias de ADN que codifican el fenotipo deseado y el
marcador seleccionable. Se pueden proporcionar secuencias de ADN
vegetal de flanqueo adicionales para promover la integración
estable. Preferiblemente, la secuencia de flanqueo comprende un
origen de replicación (ori).
En una ilustración particular, la región
espaciadora muy conservada reside en la repetición invertida del
genoma del cloroplasto. Sin embargo, la localización particular del
espaciador en el genoma del cloroplasto no es tan importante como
su elevada homología con la región espaciadora de plantas
diferentes.
Además, como se puede observar en las Figuras
4F-4G, la secuencia espaciadora 2 (o espa 2), que
tiene una longitud de 64 pb, es demasiado corta para incluir el
genoma ori del cloroplasto, que se encuentra en dirección 5'
de ese espaciador. Si se desea incluir el ori, se
seleccionará una secuencia espaciadora más larga, que englobe al
ori, que incluirá la secuencia espaciadora y una secuencia
adicional en las secuencias de flanqueo. Esto proporcionará un
molde más largo para la recombinación homóloga en el genoma del
cloroplasto del receptor, y promoverá la homoplasmia.
Otro vector preferido es aquel en el que las
secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la región
espaciadora 2, una porción o toda la región espaciadora intergénica
entre los genes ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma del
cloroplasto (Figura 4A-4E). Además, las secuencias
de flanqueo pueden incluir parte o todos los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala}, respectivamente. De forma opcional, las secuencias de
flanqueo comprenden, cada una, parte o todas las secuencias génicas
de ARNr 16S y/o 23S.
Un vector universal preferido comprende una
secuencia de ADN que comprende la secuencia de la región espaciadora
2 entre los genes trnI y trnA altamente conservados,
entre los genes de ARNr 16S-23S del genoma del
cloroplasto. Preferiblemente, esta región comprende parte o toda la
secuencia de ADN (Figura 4F-4G) de los genes
trnI y trnA. Esa región se corta por escisión a partir
de una planta seleccionada, como el tabaco, y se subclona en el
plásmido habitualmente disponible, como pUC19, por ejemplo en el
sitio de PvuII. En el plásmido se inserta el casete de expresión
que contiene un gen marcador seleccionable, un promotor de ARNr 16S
del cloroplasto, un gen que codifica una enzima que confiere una
resistencia a un antibiótico, como el gen aadA que codifica
aminoglicósido-3'-adenil-transferasa,
que confiere resistencia a estreptomicina/espectinomicina, y una
región no traducida 3' del gen psbA del cloroplasto.
Específicamente, cuando se construyó un vector
universal con el plásmido
pSBL-Ct-bor (Figura 5), se insertó
en el plásmido un casete de gen marcador seleccionable que contiene
un promotor de ARNr 16S del cloroplasto, el gen aadA que
codifica
aminoglicósido-3'-adenil-transferasa,
que confiere resistencia a estreptomicina/espectinomicina, o un gen
de resistencia a herbicidas, y una región no traducida 3' del gen
psbA del cloroplasto (Figura 6). Este casete de gen marcador
seleccionable se insertó entonces en el borde universal, en dos
orientaciones diferentes. En el vector pSBL-CtV1,
el casete del gen marcador seleccionable se insertó en el gen
trnI (Figura 6A). En el vector pSBL-CtV2
(Figura 7A), el casete del gen marcador seleccionable se insertó
entre los genes trnI y trnA, en la región
espaciadora, en la dirección de la transcripción del ADNr 16S. En
el vector pSBL-CtV2 R (mapa no mostrado), el casete
del gen marcador seleccionable se insertó entre los genes
trnI y trnA, en la región espaciadora, en la dirección
opuesta de la transcripción de ADNr 16S.
Se han insertado varios genes de interés en el
vector pSBL-CtV2, una realización preferida del
vector universal. Por ejemplo, el vector pSBL-CtV3
(Figura 7B) contiene el gen informador mGFP que codifica una
proteína fluorescente verde, aislada de la medusa. Este gen también
puede ser útil para la selección visible de plantas transformadas,
o en horticultura ornamental, por ejemplo en cosechas ornamentales
como árboles de Navidad o incluso en el césped, que puede brillar
con fluorescencia verde al iluminarlo con luz azul.
El vector pSBL-CtVH (Figura 7C)
contiene un marcador seleccionable diferente, la
higromicinfosfotransferasa (gen de hph accionado por el promotor
del gen atpB del cloroplasto), que confiere resistencia al
antibiótico higromicina. Este vector se puede usar para transformar
plantas que son resistentes a otros antibióticos, y es
particularmente útil para transformar monocotiledóneas, que
generalmente son resistentes a otros antibióticos usados
habitualmente. Este gen puede conferir rasgos adicionales, tales
como resistencia a herbicidas, un rasgo no buscado.
El vector pSBL-CtVHF (Figura 7)
contiene los genes GFP y hph, que se puede usar para la selección
letal, o una combinación de selección letal/visible.
El vector
pZS-RD-EPSPS de cloroplastos del
tabaco (Figura 2A) ("TV") y el vector universal
pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B)
("UV") contienen ambos el promotor Prrn (del ARNr 16S), el gen
aadA (para la selección de espectinomicina), el gen aroA
mutante, que codifica la enzima EPSPS sintasa (para la selección de
glifosato), y la región 3' de psbA. Las secuencias de
flanqueo, en pZS-RD-EPSPS, contienen
rbcL y orf 512, y en
pSBL-RD-EPSPS contienen los genes
trnI y trnA que facilitan la integración en la región
de copia individual grande (Figura 1 en la flecha "TV"), o en
las regiones repetidas invertidas (Figura 1 en las flechas UV), del
genoma de cloroplastos del tabaco, respectivamente.
El glifosato es el ingrediente activo en el
herbicida de Monsanto ROUNDUP^{TM}, y se usa como un marcador
seleccionable para la selección de plantas transgénicas mediante
herbicidas.
Se usaron protocolos estándares para la
construcción de vectores, incluyendo el Klenow que llena la
desfosforilación. En la Figura 2A (ejemplo comparativo) se muestra
el vector de expresión pZS-RD-EPSPS
de cloroplastos del tabaco. En la Figura 2B se muestra el vector
universal pSBL-RD-EPSPS de
cloroplastos. La construcción de estos vectores se muestra
adicionalmente en los ejemplos. Ambos plásmidos se amplificaron en
la cepa XL1 Blue de E. coli. Se registraron curvas de
crecimiento en medio mínimo M-9. Ambos vectores se
usaron para la selección en glifosato, para confirmar la
resistencia a ROUNDUP^{TM}.
El vector de expresión
pZS-RD-EPSPS de cloroplastos es
específico para el tabaco, y ya se ha señalado que no es útil para
transformar otras plantas (Maier et al., 1995). Por el
contrario, el vector universal
pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B) de
expresión de integración de cloroplastos es competente para
transformar genomas de cloroplastos de numerosas especies
vegetales, debido a la universalidad del vector como se describe
anteriormente. El vector universal integra genes extraños en la
región espaciadora 16S-23S del genoma del
cloroplasto. El vector universal usa, como secuencias de blanqueo
para la recombinación homóloga, los genes trnA y trnI
(los ARN de transferencia de cloroplastos que codifican alanina e
isoleucina), procedentes de la región repetida invertida del genoma
del cloroplasto. La secuencia de borde de cloroplasto usada en esta
invención también contiene el origen de replicación (oriA)
de cloroplastos, según se confirma en varias especies de cosechas
incluyendo el guisante (Nielsen et al., 1993) y el tabaco
(Lu et al., 1996), lo que puede explicar la homología de
secuencia altamente conservada en esta región. Este origen de
replicación proporciona un aumento del número de moldes del
plásmido para la integración eficaz en el genoma del cloroplasto del
receptor, y lograr la homoplasmia.
Como se ha demostrado anteriormente, en la
construcción del vector universal, se inserta un gen marcador
seleccionable, que confiere resistencia a un antibiótico (u otro
marcador seleccionado), un gen que codifica la molécula diana, y
los otros elementos (como se describe aquí), en un sitio de
restricción conveniente en el fragmento de ADN que contiene la
región espaciadora. Si se desea, el gen extraño que codifica la
molécula diana se puede insertar en el casete de expresión tras la
inserción del casete en el fragmento de ADN que contiene la región
espaciadora conservada, de forma que, antes de la inserción, el
casete incluirá múltiples sitios de clonación para la inserción de
una o más secuencias codificantes de ADN.
La posición del sitio de restricción en la
secuencia espaciadora puede determinar la longitud respectiva de
las dos secuencias de flanqueo, que serán fracciones (de igual o
diferente longitud) de la región espaciadora. De este modo, las dos
secuencias de flanqueo no necesitan ser idénticas en longitud en
tanto cada una contenga suficiente complementariedad con el genoma
del cloroplasto diana para promover la recombinación homóloga.
Debido a que el vector de la invención tiene tal
grado elevado de homología con la región espaciadora de los genomas
de los cloroplastos de múltiples especies de plantas, es competente
para transformar no sólo las especies de plantas a partir de las
cuales deriva la secuencia borde del vector, sino cualquier especie
vegetal.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término "homólogo" significa que una secuencia de ADN
procedente de una especie vegetal posee regiones de identidad de
secuencia con porciones de una secuencia de ADN procedente de otra
especie vegetal. Esto es, si dos secuencias de ADN son muy
homólogas, la especie de ADN puede tener una identidad de secuencia
del 100%, o una identidad menor que el 100%. Por ejemplo, para los
fines de la integración del genoma del cloroplasto, se considera
que una secuencia de 400 pb, que en conjunto sólo es homóloga en un
25%, pero que contiene una porción de 100 pb que es homóloga en un
85% hasta 90% o más, es altamente homóloga con el genoma del
cloroplasto.
También se ha demostrado que es beneficiosa la
inclusión de un ori del cloroplasto dentro de las secuencias
de flanqueo del vector universal. Sin estar sujeto por la teoría, se
cree que la presencia del ori en el vector universal
promueve la homoplasmia después de una única ronda de selección, sin
la necesidad de una segunda etapa de selección. Esto es
especialmente importante en la transformación de plantas
monocotiledóneas, tales como maíz o arroz, en las que no es
factible una segunda etapa de selección debido a la dificultad de
hacer crecer estas plantas en cultivo procedente de esquejes de
hojas, con la necesidad resultante de hacer crecer estas plantas a
partir de embriones. Si se desea un ori pero falta, se puede
introducir en una secuencia de flanqueo o en cualquier otra parte.
Si se desea aumentar el número de copias del vector universal
introducido, se insertará un fragmento de ADN del cloroplasto, que
contiene un ori, fuera de las secuencias de flanqueo, de
forma que funcionará sólo para amplificar el número de copias del
vector universal, y no se integrará en el genoma del
cloroplasto.
En oposición a derivarlas a partir de una planta
específica, las secuencias de flanqueo se pueden derivar a partir
de una región espaciadora obtenida sintéticamente como se muestra
más abajo.
Para la transcripción y traducción de la
secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, se usa toda
la región promotora procedente de un gen capaz de expresarse en el
cloroplasto. La región promotora puede incluir promotores
obtenibles a partir de genes de cloroplastos, tales como el gen psbA
de la espinaca o del guisante, la región promotora de rbcL y atpB
del maíz, y los promotores de ARNr. En la patente nº 5.693.507
también se describen promotores competentes, y se identifican otras
fuentes de bibliografía.
Las secuencias de flanqueo mostradas por la
patente nº 5.693.507 y las otras publicaciones, para promover la
integración estable, no son las secuencias de flanqueo del vector
universal de expresión y de integración descrito aquí, que se
conservan de forma elevada de una especie vegetal a otra, mientras
que no lo hacen las secuencias de flanqueo de esa patente ni de las
otras publicaciones.
La invención proporciona métodos para
identificar secuencias espaciadoras intergénicas no transcritas
apropiadas en plantas, que son apropiadas para construir los
vectores universales. El método comprende aislar ADN genómico de
plastidios, llevar a cabo la hibridación con una sonda marcada
radiactivamente de un espaciador conocido, detectar y aislar las
secuencias del plastidio que muestren el grado deseado de homología
con la sonda. Como ilustración, para determinar si un genoma de
plastidio, de estructura y de secuencia desconocida, posee la
región espaciadora, se llevan a cabo transferencias Southern
utilizando como sonda la región espaciadora del tabaco. El ADN
genómico del plastidio se aísla y se rompe por escisión mediante una
enzima de restricción apropiada, según procedimientos bien
probados. La hibridación con la sonda espaciadora se realiza tanto
en condición restrictiva (por ejemplo, formamida al 50% a 68ºC,
lavado en 0,1 X SSC a 68ºC) como en condición no restrictiva (por
ejemplo, 6 X SSC, a 68ºC, lavado en 2 X SSC a 50ºC) (1 X SSC es NaCl
0,15 M, citrato de sodio 0,015 M), para detectar las secuencias de
plastidios que muestren una homología aproximadamente del
90-100% o un 60-100% con el
espaciador del tabaco, respectivamente. Después, se aíslan las
secuencias identificadas de los plastidios. Si el requisito de
recombinación homóloga es más permisivo, puede ser satisfactorio un
grado menor de hibridación con la sonda, tal como alrededor de
60%.
De este modo, cualquier región espaciadora
conocida o desconocida, de suficiente homología para la
recombinación, es adecuada para la construcción del UV. Igualmente,
se puede usar la secuencia conocida de cualquier secuencia
espaciadora intergénica altamente conservada para identificar y
aislar secuencias de plastidios que sean homólogas con una
secuencia espaciadora conocida.
Como alternativa, se puede usar el programa
BLAST, como se describe aquí anteriormente, para identificar las
regiones altamente conservadas en genomas de plastidios de los que
se conocen las secuencias.
Las plantas que se pueden transformar mediante
el vector universal de la invención incluyen cualquier planta
inferior, tal como cianobacterias, cualquier planta superior, tales
como especies vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas. Las
plantas a transformar pueden ser plantas solanáceas o plantas que
crecen bajo tierra. Una lista no exclusiva de ejemplos de plantas
superiores que se pueden transformar con el vector universal
incluye cereales tales como cebada, maíz, avena, arroz y trigo,
cucurbitáceas tales como pepino, melón y sandía; legumbres tales
como alubia, judía de vaca, guisante, cacahuete; cosechas de
oleaginosas tales como colza (cánola) y haba de soja; plantas
solanáceas tales como tabaco; cosechas de tubérculos tales como
patata y boniato; y vegetales como tomate, pimiento y rábano;
frutas tales como pera, uva, melocotón, ciruela, plátano, manzana,
y fresa; cosechas de fibras como las del género Gossypium, tales
como algodón, lino y cáñamo, y otras plantas tales como remolacha,
algodón, café, rábano, plantas florales comerciales tales como
clavel y rosas; herbáceas tales como caña de azúcar o césped;
árboles de hoja perenne tales como abeto, picea, y pino; y árboles
de hoja caduca, tales como arce y roble. De mayor interés presente
son las cosechas económicamente más importantes, como maíz, arroz,
haba de soja, trigo y algodón. Ninguna de estas plantas, según se
sabe hasta la presente, distintas del tabaco, nunca se ha
transformado de forma estable vía el genoma de cloroplastos, y
ninguna de ellas, incluyendo el tabaco, se ha transformado de forma
estable mediante un vector universal como se describe aquí. Una
planta a partir de la cual se obtiene frecuentemente la secuencia de
ADN es el tabaco, debido a que es la planta más concienzudamente
caracterizada, pero es adecuado cualquier otro genoma de
cloroplastos.
Se recordará como se describe anteriormente que
el vector usado para transformar de forma estable el tabaco no fue
competente para transformar el genoma de cloroplastos de otras
plantas.
Los casetes de expresión se pueden transformar
en una célula vegetal de interés, mediante cualquiera de un número
de métodos conocidos. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los
siguientes. La transformación mediante bombardeo con partículas de
wolframio, la transformación mediada por polietilenglicol, el uso de
un haz de láser, la electroporación, la microinyección, o cualquier
otro método capaz de introducir ADN en un cloroplasto. Véase, por
ejemplo, Sandford, 1988; Daniell, 1993; Daniell, 1997; Patente U.S.
nº 5.693.507; Kin Ying et al., 1996. El uso de estas
técnicas permite la aplicación de la invención descrita aquí a una
variedad amplia tanto de plantas monocotiledóneas como
dicotiledóneas.
La creciente utilidad del vector universal de
expresión y de integración de la invención se muestra claramente
mediante la aptitud del vector para generar plantas transformadas
para expresar moléculas no vegetales valiosas.
Según otra realización de la invención, el
vector universal se ha usado para transformar tabaco con un gen
sintético que expresa polímeros a base de proteínas (PBP). Tales
polímeros, y los genes que los expresan, son conocidos en la
bibliografía (Daniell, et al., 1997). Son de particular
interés los polímeros a base de proteínas (PBP) que tienen
secuencias pentámeras que se repiten, como GVGVP (Yeh et al.,
1987). Estos polímeros PBP muestran una propiedad útil de
transición a la temperatura de fase inversa. La proteína se hace
insoluble cuando la temperatura se eleva por encima del estado de
transición. Los PBP ofrecen un amplio intervalo de materiales
similares a los de los polímeros a base del petróleo, tales como
hidrogeles, elastómeros, y plásticos. También muestran una
extraordinaria biocompatibilidad, permitiendo de ese modo un
intervalo completo de aplicaciones médicas que incluyen la
prevención de adhesiones postquirúrgicas, reconstrucción de tejido y
suministro programado de fármacos (Urry et al., 1993). Por
la parte no médica, las aplicaciones potenciales incluyen el uso en
transductores, máquinas moleculares, superabsorbentes y plásticos
biodegradables (Daniell et al., 1997). Tales polímeros
incluyen el polímero
(Val'-Pro^{2}-Gly^{3}-Val^{4}-Gly^{5})_{n}
(VPGVP)_{n}, en el que "n" puede variar de 1 hasta centenares de unidades, como 250, o sus análogos. Las posibilidades comerciales importantes y los aspectos relacionables se discuten por Daniell, 1995. Los plásticos biodegradables útiles están fabricados a partir de PBP. Los genes que tienen estos PBP también son útiles en la invención por cuanto se pueden usar como soportes, es decir, el gen de una molécula de interés se puede fundir con el gen de PBP de la integración y expresión de cloroplastos.
(VPGVP)_{n}, en el que "n" puede variar de 1 hasta centenares de unidades, como 250, o sus análogos. Las posibilidades comerciales importantes y los aspectos relacionables se discuten por Daniell, 1995. Los plásticos biodegradables útiles están fabricados a partir de PBP. Los genes que tienen estos PBP también son útiles en la invención por cuanto se pueden usar como soportes, es decir, el gen de una molécula de interés se puede fundir con el gen de PBP de la integración y expresión de cloroplastos.
En un estudio anterior, el gen de polímero
sintético que codifica (GVGVP)_{121} se hiperexpresó en
E. coli hasta el grado en que los cuerpos de inclusión del
polímero ocuparon casi el 80-90% del volumen celular
(Guda et al., 1995; Daniell et al., 1997). El mismo
gen también se expresó en el compartimiento nuclear de células de
tabaco cultivadas (Zhang et al., 1995) y en hojas de plantas
transgénicas del tabaco (Zhang et al., 1996).
En un sistema modelo, se usó la región
intergénica de los genes trnI y trnA, en la región
espaciadora de ARNr 16S-23S del genoma del tabaco
(Figura 1), para construir un vector universal para la integración
del gen marcador seleccionable, gen aadA, y el gen de
polímero sintético (EG121). El vector se insertó en la región
repetida invertida del genoma del cloroplasto. Las plantas de tabaco
transformadas expresaron un nivel elevado de la proteína polímera.
También son transformables los genomas de cloroplastos de otras
especies vegetales con el gen sintético para expresar el polímero a
base de proteína, usando el vector universal.
Los estudios con el biopolímero han mostrado que
se puede expresar un producto no vegetal mediante un gen sintético,
haciendo posible de este modo, por medio de los vectores de la
invención, expresar moléculas biológicamente valiosas a partir de
plantas transformadas con una gran variedad de secuencias
codificantes de ADN. La secuencia codificante de ADN estará
comprendida en un vector universal, o, si se desea, en un casete de
expresión, como se describe anteriormente.
Se sabe que las plantas transgénicas producen
moléculas valiosas biológicamente activas mediante transformación
nuclear pero no vía la transformación de cloroplastos. Véase las
siguientes referencias bibliográficas:
Daniell, 1995; Miele, 1997; Lyons, 1996;
Daniell, y Guda, 1997; Arntzen, 1997.
Se pueden obtener plantas transformadas según la
invención, con el vector universal o con el casete de expresión,
para expresar moléculas valiosas biológicamente activas en partes de
las plantas que contienen cloroplastos. Las plantas se recolectarán
entonces mediante prácticas conocidas. Las plantas transformadas que
contienen esos productos se pueden administrar así oralmente.
Arntzen, 1997. La producción de productos farmacéuticos mediante
plantas transgénicas se ha realizado con péptidos (proteínas) para
muchas aplicaciones farmacéuticas, que incluyen vacunas,
inmunomoduladores, factores de crecimiento, hormonas, proteínas de
la sangre, inhibidores, y enzimas. Los productos biológicos
típicos, derivados de plantas transgénicas, que se han dado a
conocer incluyen vacunas contra enfermedades víricas; epítopos
peptídicos víricos, como el virus de la inmunodeficiencia humana,
epítopos peptídicos no víricos, proteínas antígenas bacterianas;
péptidos bioactivos, toxinas recombinantes, anticuerpos producidos
por plantas (anticuerpos recombinantes), proteínas séricas, y
metabolitos secundarios de las plantas. Todos estos productos se
pueden expresar en cloroplastos de plantas transgénicas, según la
invención.
Los péptidos o proteínas farmacéuticos típicos,
producidos en plantas transgénicas, incluyen antígeno de superficie
de la hepatitis B, proteína de la cápsida del virus de Norwalk, el
virus de la glosopeda, el rinovirus 14 humano, el virus de la
inmunodeficiencia humana, la proteína de superficie de S.
mutans, la enterotoxina de E. coli, la subunidad B,
epítopos del circumsporozoito malárico, epítopo de la proteína ZP3
del ratón (vacuna); el anticuerpo 6D4 catalítico del ratón, el
anticuerpo monoclonal mAB Guy's 13 de ratón, el anticuerpo
monoclonal mAB B1-8, la proteína de Fv
antifitocrómica, la antisustancia P (anticuerpo); la seroalbúmina
humana (HSA), la proteína C humana (proteína sérica); la
\alpha-tricosantina, la ricina (citotoxina); el
factor de crecimiento epidérmico humano (factor de crecimiento); la
leu-encefalina (neuropéptido) y la
\beta-glucosidasa ácida humana (hGC) (enzima).
Muchas de estas moléculas se han expresado en tabaco, tubérculos de
patata, etc.
Es de particular interés, según la invención, la
producción de insulina y seroalbúmina humana (HSA) con el vector
universal de integración y expresión, o con un vector de expresión.
La HSA ya se ha producido en plantas transgénicas (nucleares) de
patata y de tabaco. Sijmons et al., 1990. Los productos
mencionados anteriormente se pueden producir vía la transformación
de cloroplastos según la invención.
La invención proporciona un método para expresar
insulina como una proteína de fusión polimérica a partir de una
planta transformada. La planta se puede transformar con un casete de
expresión o con el vector universal de integración y de expresión
que comprende un gen biopolimérico sintético, como
(GVGVP)_{40}. Una planta adecuada es el tabaco debido a la
facilidad de la manipulación mediante ingeniería genética, y a la
necesidad de encontrar usos alternativos de esta cosecha
controvertida.
Para la expresión en bacterias, el método
comprende construir un vector para la expresión en E. coli
como una fusión del gen (GVGVP)_{40} polímero con un gen
proinsulínico, expresar las proteínas de fusión de
polímero-insulina en E. coli (que se hace
crecer de manera conocida), purificar la proteína recombinante
utilizando las propiedades de transición de temperatura del
polímero a base de proteína, y separar mediante ruptura la insulina
del polímero, usando métodos bien conocidos.
Para la transformación en plantas, se introduce
en una planta diana, como el tabaco, un casete de expresión o el
vector universal de integración y de expresión, que comprende la
fusión del gen polímero con el gen proinsulínico. La proteína de
fusión de polímero-insulina se expresa en la planta,
la proteína de fusión polímera se extrae del cloroplasto y de los
compartimientos citosólicos de las células vegetales, la insulina se
separa mediante ruptura a partir de la proteína polímera con
ditiotreitol (DTT) o con los otros métodos conocidos, y se recoge
la insulina. Como alternativa, el producto de fusión de
insulina-polímero se puede expresar en una cosecha
comestible, o en partes comestibles de la cosecha.
La técnica de fusionar una secuencia de ADN, que
codifica una molécula de actividad biológica, a un gen sintético
que expresa un polímero a base de proteína para la expresión en un
hospedante bacteriano o de levadura adecuado, o en una planta
transformada, es un método muy prometedor de amplia
aplicabilidad.
Se ha producido seroalbúmina humana recombinante
(rHSA), que es indistinguible de la proteína humana auténtica, en
plantas transgénicas nucleares de tabaco y de patata (Sijmons et
al., 1990). Esto demostró la expresión de una proteína valiosa
en plantas transgénicas, pero también que fue posible lograr un
procesamiento apropiado mediante fusión de HSA a una prosecuencia
de una planta que dio como resultado la separación mediante ruptura
y la secreción de la proteína correcta. El genoma del cloroplasto de
una planta seleccionada como el tabaco se puede transformar
fácilmente con un vector universal como se describe aquí en este
documento, y se puede hacer para expresar HSA.
Como se describe aquí, el vector universal
permite, según la invención, la transformación de plantas, hacer
que la planta exprese una molécula biológica que puede proporcionar
un fenotipo deseado a la planta y/o producir un producto deseado el
cual puede tener, aunque no es necesario, actividad biológica (o un
precursor para un producto final). La secuencia nucleotídica
codificante puede ser sintética o natural. La molécula producida
puede ser ajena a las plantas, no funcional en la planta, o
funcional. El vector universal tiene amplias aplicaciones en el
dominio de la transformación de plantas.
Se contempla que se puede producir cualquier
molécula biológicamente activa (precursor o derivado de la misma)
mediante planta transgénica transformada con el vector universal de
la invención, con adaptaciones adecuadas según se requiera para un
caso particular.
Otra realización de la invención se refiere al
uso del vector universal para conferir resistencia o tolerancia a
herbicidas a las plantas. El avance de la tecnología de
transferencia génica ha hecho posible la introducción de genes de
resistencia a herbicidas en las plantas, haciendo de ese modo al
herbicida selectivo para una cosecha particular.
La primera etapa con respecto a este enfoque es
la identificación y modificación necesaria de la enzima diana (gen)
del herbicida para conferir tolerancia, lo cual se ha realizado de
forma bastante extensa. El sulfometuronmetilo es un herbicida de
tipo sulfonilurea que bloquea el crecimiento de bacterias, levadura,
y plantas superiores inhibiendo la primera enzima de la ruta de
aminoácidos de cadena ramificada, la acetolactato sintasa (ALS).
Los genes mutantes para ALS se aislaron de E. coli y de
levadura que confieren resistencia a sulfometuronmetilo. Yadav,
et al. (1986). La resistencia a herbicidas en el tabaco, y en
otras varias cosechas, se ha logrado mediante manipulación por
ingeniería genética del gen de ALS. Gabard, et al. (1989);
Miki, et al. (1990). Aún otro enfoque para manipular
mediante ingeniería la resistencia a herbicidas en plantas ha sido
la expresión de la enzima fosfinotricinaacetiltransferasa (PAT) que
destoxifica el herbicida fosfinotricina. DeBlock, et al.
(1987).
El glifosato es un herbicida potente, de amplio
espectro, que es enormemente eficaz contra hierbas anuales y
perennes y contra malas hierbas de hoja ancha. El glifosato es
medioambientalmente seguro puesto que se degrada rápidamente en el
suelo, tiene una movilidad mínima en el suelo, y tiene muy poca
toxicidad para las formas de vida no vegetales. El glifosato
funciona uniéndose a la enzima
5-enol-piruvilshiquimato-3-fosfato
(EPSP) sintasa, e inhibiéndola. La EPSP sintasa (EPSPS) cataliza la
formación de EPSP, que es importante en la ruta de la biosíntesis
de aminoácidos aromáticos, a partir de
shiquimato-3-fosfato y fosfato
inorgánico. La nula toxicidad del glifosato con respecto a los
animales es debido al hecho de que esta reacción se produce sólo en
las plantas y en los microorganismos. Desafortunadamente, debido a
que la reacción para formar EPSP se produce en todas las plantas,
el glifosato no tiene selectividad entre malas hierbas y plantas
deseadas, tales como cosechas y plantas ornamentales.
Se han usado dos enfoques para intentar
desarrollar una planta resistente al glifosato, mediante
manipulación por ingeniería genética. Un enfoque se basa en la
sobreproducción de EPSP sintasa de tipo salvaje, de forma que,
después de la inhibición competitiva de EPSP sintasa por el
glifosato, la EPSP sintasa residual confiere tolerancia a
glifosato. El segundo enfoque se basa en la expresión de un gen
mutante (aroA) que codifica la EPSP sintasa resistente a
glifosato.
En todos los ejemplos anteriormente mencionados,
sin excepción, los genes resistentes a herbicidas se han
introducido en el genoma nuclear.
Existe una seria necesidad de desarrollar una
planta resistente a herbicidas, particularmente una planta
resistente a los herbicidas más ampliamente usados, en la que la
proteína que confiere resistencia al herbicida se produce en el
cloroplasto, y en la que el gen que confiere resistencia a
herbicidas no pueda escapar al medioambiente a través del
polen.
El vector universal de la invención responde a
esta necesidad mediante transformación de cualquier planta diana
para proporcionar tolerancia a cualquier herbicida seleccionado,
como el glifosato. Las cosechas comerciales importantes, como el
trigo, el arroz, el maíz, la soja, se pueden hacer resistentes a un
herbicida seleccionado por medio del vector universal.
La invención proporciona una planta transgénica
resistente a herbicidas en la que se integra, en el genoma del
cloroplasto, un transgén extraño que confiere resistencia a uno o
más herbicidas, por medio del vector universal. La planta
transgénica puede ser una planta madura, una planta inmadura, tal
como un plantón, un embrión, un callo, un tejido cultivado, o una
suspensión celular, o una porción de una planta tal como un esqueje
o un tallo. Los herbicidas que son adecuados para la invención, para
los cuales los genes que confieren resistencia se pueden integrar
de forma estable en el genoma de cloroplastos según la invención,
incluyen todos los herbicidas conocidos (y también aquellos por
desarrollar).
Los herbicidas controlables mediante la
invención se han agrupado generalmente en varias clases
químicas.
Una primera clase incluye los herbicidas de PSII
(fotosistema II) que interfieren con la reducción de plastoquinona
en el sitio aceptor de PSII, que incluyen productos químicos tales
como triazinas, triazinonas, derivados de urea, biscarbamatos,
nitrilos, nitrofenoles, piridazinonas sustituidas, fenilcarbamatos,
anilidas, cianoacrilato, DCMU, carboanilidas, uracilos,
específicamente por ejemplo diclorofenildimetilurea, atrazina,
metribuzina, lenacilo, fenmedifam, ioxinilo y dinoseb. Estos
productos químicos se unen a una proteína de unión de 32 kDa (la
proteína Q_{B}, D1, proteína de unión a herbicida) en la membrana
de ticaloide de cloroplastos, bloqueando de ese modo el transporte
electrónico fotosintético. El gen del plastidio que codifica un
precursor de la proteína Q_{B} se denomina psbA, cuyas
secuencias muestran un grado muy elevado de homología en plantas
diferentes. El herbicida de PSII más importante es atrazina,
desarrollado por Ciba-Geigy.
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Otra clase es la de los herbicidas de PSI
(fotosistema I), un complejo de proteína unida a membrana que
cataliza la oxidación realizada por la luz de plastocianina (PC) y
la reducción de ferredoxina (Fd). Típicos de estos productos
químicos son los herbicidas bipiridílicos paracuat y dicuat.
Otra clase de herbicidas son los herbicidas de
tipo ariloxifenoxipropanoatos (APP) o de acetil coenzima A
carboxilasa, que inhiben la acetil-CoA carboxilasa y
la biosíntesis subsiguiente de ácidos grasos en plastidios. Típicos
de los APP son la ciclohexanodiona (CHD), setoxidina, haloxifop,
quizalofop, fenoxaprop (y sus moléculas sustituidas con alquilos
inferiores), dicolofop, setoxidina, cletodina y tralcoxidim.
Aún otra clase de herbicidas incluye los
análogos de auxina como macropop, clorambeno, dicamba, benazolina,
ácido 1-naftilacético, ácido
3,6-dicloropicolínico, picloram, fluoroxipir,
quinclorac, MCPA y 2,4-D.
Una clase adicional son los herbicidas
mitóticos, denominados herbicidas dinitroanilínicos, como
trifluralina, orizalina y pendimetalina.
Otra clase química de herbicidas a la que se
aplica la invención es aquella que actúa en la biosíntesis de
aminoácidos, tales como los ácidos aminometilfosfónicos terciarios
clorsulfurón, glufosina y glifosato.
Otra clase de herbicidas son los herbicidas que
inhiben la acetolactato sintasa (ALS), como las sulfonilureas, las
imidazolinonas, triazolopirimidinas y los pirimidiniltiobenzoatos,
tales como clorsulfurón, imazapir, flumetsulam (y otros enumerados
en el capítulo 4, Tabla I de Herbicide Resistance in Plants, 1994,
citada más abajo).
Los ejemplos de herbicidas de tipo sulfonilureas
son sulfometurón metilo (el ingrediente activo de Oust^{TM}) y
clorsulfurón (el ingrediente activo de Glean^{TM}). El imazapir,
una de las imidazolinonas, es el ingrediente activo del herbicida
de American Cyanamid Arsenal^{TM}, y el imazametabenz es una
mezcla de dos imidazolinonas (índice Merk, 11ª edición 4825). Las
formas mutadas de ALS localizadas en los genes estructurales de ALS,
ilvG e ILV2, se pueden usar para conferir resistencia a
herbicidas usando el vector universal.
A pesar de las diferencias químicas entre las
imidazolinonas y las sulfonilureas, estas sustancias inhiben la
misma enzima, ALS. Parece que las quinonas y un herbicida de
imidazolinona compiten con un herbicida de sulfonilurea por un
sitio común en ALS. En consecuencia, según la invención, se pueden
transformar plantas que mostrarán una resistencia a ambos grupos de
estos y de otros herbicidas.
Otro grupo de productos químicos controlables
mediante la invención, usando el vector universal que tiene
actividad herbicida, está tipificado por la
L-fosfinotricina, que es un componente del
tripéptido "bialafós". Este tripéptido está comercializado con
el nombre comercial "Herbiace^{TM}" por Meiji Seika, Japón, y
como "Basta^{TM}" por Hoechst AG, Alemania. La
L-fosfinotricina es un potente inhibidor de la
glutamina sintetasa, que provoca un aumento rápido de la
concentración de amoníaco en plantas, y que conduce a la muerte de
la célula vegetal.
A pesar de los intensos estudios, no se ha
desarrollado ningún producto satisfactorio para proporcionar
tolerancia a herbicidas a las plantas, mediante transformación de
cloroplastos. Con el herbicida de tipo glifosato se ha informado
que las plantas transgénicas transformadas de núcleo regenerado
mostraron tolerancia a glifosato, pero también mostraron un
crecimiento alterado, y no han dado como resultado plantas
transgénicas con un nivel elevado de tolerancia a glifosato; véase
Schultz, et al., 1990.
Según la invención, el cloroplasto de plantas
diana que son susceptibles a herbicidas se transforma con un vector
de la invención que porta la secuencia codificante necesaria,
confiriendo de ese modo una resistencia a herbicidas. El
cloroplasto transformado comprende un genoma que lleva un transgén
extraño que confiere la tolerancia a herbicidas. El cloroplasto
puede ser un cloroplasto maduro, o puede ser un cloroplasto
inmaduro, tal como un etioplasto. Preferiblemente, el gen que
confiere resistencia a herbicidas codifica la EPSP sintasa que se
une a glifosato de forma menos fácil (tiene afinidad reducida) que
como lo hace la EPSP sintasa de tipo natural. Si está presente, el
segundo transgén es generalmente un gen que confiere resistencia a
antibióticos a la planta. De este modo, la resistencia a herbicidas
se puede usar a título de selección letal como un marcador para la
transformación de cloroplastos mediante selección de los
transformantes mediante exposición a un medio con una concentración
letal del herbicida seleccionado, al que sobrevivirán los
transformantes.
El origen del segundo gen puede ser procariota
(por ejemplo, bacteriano) o eucariota (por ejemplo, planta).
La invención también se refiere a la producción
de una planta resistente a varios herbicidas, ya sea de la misma
clase de herbicidas o de diferentes clases de herbicidas, y a la
planta transformada resistente a múltiples herbicidas.
Se sabe que algunas especies vegetales han
desarrollado una tolerancia natural y no permanente a ciertos tipos
de herbicidas. La enseñanza de esta invención es fácilmente
aplicable a esto.
La invención incluye un método para producir una
planta resistente a herbicidas, el cual comprende transformar el
cloroplasto de la planta introduciendo uno o más transgenes extraños
que codifican una proteína que confiere resistencia a herbicidas al
genoma del cloroplasto de la planta. Preferiblemente, el transgén
codifica una forma mutante de la enzima que tiene una afinidad
reducida por un herbicida dado que la que tiene la enzima de origen
natural.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La siguiente Tabla enumera una variedad de tipos
de determinantes de resistencia (productos químicos o
"moléculas"), que inhiben o que confieren resistencia, y los
herbicidas típicos relacionados con esto.
Para un repaso comprensivo sobre el tópico de la
resistencia a herbicidas en plantas, véase Herbicide Resistance
Crops, Agricultural, Environmental, Economic, Regulatory and
Technical Aspects, 1996, CRC Press, Inc., Editor, Stephen O. Duke
and Herbicide Resistance in Plants, Biology and Biochemistry, 1994,
CRC, Press, Editado por Stephen B. Powles y Joseph A.M. Holturn. En
el primero de estos libros de referencia, el capítulo 3 sobre
Técnicas para Producir Cosechas Resistentes (y las numerosas
referencias citadas allí) es de particular interés como antecedente
de la invención.
Según la invención, también se ha descubierto
que, en el procedimiento para expresar un rasgo diana, se puede
expresar otro rasgo mediante la planta transformada que puede ser
bastante deseable, de hecho más deseable que el rasgo inicialmente
perseguido. En esas situaciones, se permitirá que las plantas se
expresen, y se seleccionarán en base a ese otro rasgo.
La invención se ejemplifica en los siguientes
ejemplos no limitantes.
Se construyeron vectores universales ejemplares
de cloroplastos cortando primero el fragmento BamHI
(130656-140992) del ADN del cloroplasto del tabaco
que contiene los genes de ARNr 16S y 23S, y subclonándolo en un
plásmido bacteriano pUC19 habitualmente disponible. En la Figura 1
se muestra un mapa del genoma del cloroplasto del tabaco. En el
plásmido pUC19, en el sitio PVUII (Figura 5B), se subclonó un
fragmento de 2,1 kpb de HindIII-EcoRI presente en
este fragmento, que contiene una secuencia borde universal que
comprende los genes trnI y trnA (Figura 5A),
incluyendo la región espaciadora entre los genes. El plásmido
resultante se denominó pSBL-Ct Bor (Figura 5C).
El vector
pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B) contiene
un gen mutante de la EPSP sintasa que codifica la enzima EPSP
sintasa. El glifosato, el ingrediente activo en ROUND UP^{TM}, de
Monsanto, se une a la proteína EPSP sintasa y bloquea la síntesis
de aminoácidos esenciales, dando como resultado la muerte de una
planta. La EPSP sintasa codificada por el gen mutante no se une a
glifosato, y por lo tanto confiere resistencia a herbicidas a las
plantas de la cosecha.
Otros genes, tales como aquellos que confieren
resistencia a factores medioambientales adversos tales como
tolerancia a sales/sequías (genes de osmotolerancia tales como
betaína aldehído deshidrogenasa, (BADH), para la sobreproducción de
betaína glicínica) o termotolerancia (genes que codifican proteínas
del choque térmico) o proteínas de tolerancia al choque del frío, o
a resistencia a patógenos, tales como antimicrobianos (péptidos
líticos, quitinasa) o antivirales (proteínas de revestimiento), se
pueden insertar de forma individual o en combinaciones sin
conflictos en el vector universal de cloroplastos, o en diferentes
casetes del mismo vector universal de cloroplastos, para
transformar la planta diana en una con el rasgo deseado.
Se construyó un vector universal de
cloroplastos, que contiene sólo la región espaciadora 2 del genoma
del cloroplasto del tabaco, subclonando primero un oligonucleótido
sintético, que comprende la región espaciadora 2, en el plásmido
bacteriano pUC19. Se sintetizaron las hebras positivas y negativas
de la secuencia espaciadora de 64 pares de bases, y la secuencia de
la hebra positiva fue la siguiente:
5'-GCTGCGCCAGGGAAAAGAATAGAAGAAGCATCT
GACTACTTCATGCATGCTCCACTTGGCTCGG-3'
Los fragmentos sintéticos se mezclaron y se
dejaron hibridar, después se ligaron en el plásmido pCU19 en el
sitio PvuII (Figura 5B). La inserción de un gen marcador
seleccionable apropiado, y un gen heterólogo, se realizó como se
describe anteriormente para
pSBL-Ct-Bor (Figura 5C).
Para preparar una secuencia más larga, que
incluye los genes ARNt^{Ile} y el ARNt^{Ala}, se siguió la
misma metodología.
El siguiente ejemplo describe un protocolo
clásico para la transformación de cloroplasto de tabaco para el
cual se puede usar cualquier vector. Más abajo se identifican dos de
tales vectores. Todos los nuevos vectores de cloroplasto se
ensayaron primero en tabaco como se describe en Daniell, (1997). Se
hicieron crecer asépticamente plantas de tabaco (Nicotiana
tabacum, variedad Petit Havana) mediante germinación de semillas
en medio de MSO que contiene sales de MS (4,3 g/litro), mezcla de
vitamina B5 (mioinositol, 100 mg/litro; tiamina-HCl,
10 mg/litro; ácido nicotínico, 1 mg/litro;
piridoxina-HCl, 1 mg/litro), sacarosa (30 g/litro) y
fitagar (6 g/litro), a pH 5,8. Para el bombardeo, se seleccionaron
hojas verdes completamente expandidas de plantas de alrededor de
dos meses.
Las hojas se colocaron con el envés hacia arriba
sobre un papel de filtro Whatman nº 1 que descansa sobre un medio
RMOP* en cápsulas de Petri estándares (100 x 15 mm), para el
bombardeo. Se revistieron microproyectiles de wolframio (1 \mum)
o de oro (0,6 \mum) con ADN de plásmido de interés (por ejemplo,
pSBL-RD-EPSPS o
pZS-RD-EPSPS), y se llevaron a cabo
bombardeos con un dispositivo biolístico PDS1000/He
(Bio-Rad), como se describe por Daniell, 1997. Tras
el bombardeo, las cápsulas de Petri se cerraron herméticamente con
Parafilm, y se incubaron a 24ºC en un fotoperíodo de 12 h. Dos días
después del bombardeo, las hojas se cortaron en pequeñas piezas de
alrededor de 5 mm^{2} de tamaño, y se colocaron en el medio de
selección letal (RMOP que contiene un marcador seleccionable, tal
como alrededor de 500 \mug/ml de dihidrocloruro de
espectinomicina), tocando el envés al medio en cápsulas de Petri
profundas (100 x 25 mm) (alrededor de 10 piezas por cápsula).
Seleccionados de los brotes que murieron, los brotes regenerados
resistentes a espectinomicina se cortaron en trozos pequeños
(alrededor de 2 mm^{2}) y se subclonaron en cápsulas de Petri
profundas recientes (alrededor de 5 piezas por cápsula) que
contienen el mismo medio de selección letal. Los brotes resistentes,
procedentes del segundo ciclo de cultivo, se transfirieron a un
medio de enraizamiento (medio MSO suplementado con IBA, 1
\mug/litro, y un antibiótico apropiado como 500 \mug/ml de
dihidrocloruro de espectinomicina). Las plantas que echaron raíces
se transfirieron al suelo y se hicieron crecer a 26ºC en condiciones
de luz continua para un análisis posterior.
Después de transferirlos al medio de selección
letal, los explantes palidecieron gradualmente y, en alrededor de
3-8 semanas, se desarrollaron callos y brotes desde
el lado bombardeado de la hoja 0. Los brotes resistentes
procedentes de cada callo se consideraron como un clon.
La identificación sistemática mediante PCR de
transformantes de cloroplasto después del primer ciclo de cultivo
mostró que 12 de 20 clones resistentes integran los genes extraños
como el gen aadA ligado al gen de EG121, en el genoma del
cloroplasto. Estos 12 clones se llevaron a otras etapas de
regeneración. Todo el procedimiento de regeneración, partiendo del
bombardeo hasta la transferencia al suelo, toma alrededor de
3-5 meses.
La Figura 9 muestra plastidios de tabaco
transformados y sin transformar que crecen en presencia de
espectinomicina, indicando selección no letal en el medio (500
\mug/ml).
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Esterilización de la superficie y germinación de
semillas de maíz. La superficie de semillas de maíz se esterilizaron
en una disolución que contiene 20% (v/v) de lejía comercial y 0,5%
de SDS, durante 15 minutos, con agitación continua, y después se
aclararon en serie en agua estéril doblemente destilada (sddw),
cuatro a cinco veces. El medio de germinación a base de MS líquido
(CSG modificado), que contiene sales de MS (4,3 g/l), sacarosa (30
g/l), vitaminas de DM (1,0 mg/l de tiamina-HCl, 0,5
mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina-HCl
y 100 mg/l de mioinositol) y BA (2,0 mg/l), a pH 5,8, es
suministrado por la caja Magenta^{TM} (45 ml) que contiene ocho
capas de estopilla, y después se sometió a un autoclave. Las
semillas se colocaron en CSG modificado (25 semillas por cada
genotipo por caja), y se cultivaron durante tres días (16 h o luz
continua; 25ºC) para la germinación. Las secciones nodales se
cortaron asépticamente de plantones de tres días. La sección nodal
aparece como una demarcación clara sobre el plantón germinante, y
representa el séptimo nódulo (Figura 10A). Cuando se cortan, las
secciones transversales nodales tienen aproximadamente
1,2-1,5 mm de longitud (Figura 10B).
Las Figuras 10A-G muestran el
esquema de transformación y regeneración de plastidios de maíz. A)
plantón de maíz de tres días; las flechas y la línea representan el
séptimo nódulo para la escisión del explante; B) secciones
transversales nodales antes del bombardeo; las flechas representan
el margen de una sección; C) sección nodal positiva a GUS
(transformación nuclear); ensayo histoquímico realizado tres días
después del bombardeo; D) inducción de múltiples brotes a partir de
una sección nodal (control) después de ocho semanas en cultivo; E)
brote de control en el medio de alargamiento durante tres semanas;
F) plántula de control enraizada; G) selección de maíz, que tiene
transformado su plastidio, en medio líquido que contiene
espectinomicina y estreptomicina durante ocho semanas.
Inducción de múltiples brotes: los explantes de
sección nodal se colocan en medio de inducción de brotes de maíz
[CSI; sales de MS, sacarosa y vitaminas de DM como antes, BA (2,0
mg/l, CPA (0,25 mg/l y fitagar (8 g/l) a pH 5,8], con el extremo
acropetálico hacia arriba, y se colocaron en las condiciones de
cultivo previamente mencionadas. En todos los medios, excepto para
CSG modificado y RG1 (arroz), tanto los PGR como los antibióticos
se esterilizan mediante filtración, y se añaden después de
someterlos a autoclave. Los tejidos se subcultivan cada dos semanas
en medio CSI reciente para la formación de múltiples brotes (Figura
10D). Los brotes adventicios se separan de los agrupamientos de
brotes después de ocho semanas de cultivo, y se alargan en medio
semisólido a base de MS que contiene sacarosa, vitaminas de DM,
glicina (10 mg/l) y asparagina (150 mg/l), a pH 5,8, durante tres
semanas (Figura 10E). Las plántulas se enraízan (Figura 10F) en el
mismo medio que contiene IBA (0,5 mg/l). Las plántulas enraizadas
se pueden hacer crecer en medio a base de MS líquido libre de PGR,
en tubos de ensayo (150 x 25 mm) que contienen estopilla como el
material de anclaje, para lograr un crecimiento más rápido. Las
plántulas regeneradas se transplantan a medios para colocación en
macetas, se aclimatan y después se hacen crecer hasta la madurez en
el invernadero.
La Figura 11 muestra la transformación de
plastidios de maíz. Las plantas de maíz transformadas crecen
normalmente (brote medio), mientras que las plantas no
transformadas mueren en el medio letal, confirmando la selección
letal mediante el antibiótico espectinomicina (1000 \mug/ml).
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Esterilización de la superficie de semillas de
arroz, y precultivo. Primero se esteriliza la superficie de
semillas sin pelar procedentes de cualquier genotipo (tipos índica o
japónica) en 70% de etanol durante 10 minutos en agitación
continua, y después se aclaran con ddw alrededor de 5 veces. Las
semillas se empapan entonces en una disolución de Benlato al 0,2%
(p/v) durante 20 minutos, se aclaran con sddw cinco veces, y
después en lejía al 50% durante 20 minutos, con los enjuagues de
sddw repetidos. Las semillas se precultivan en medio RG1 [sales de
MS, sacarosa y vitaminas de DM como antes, BA (2,0 mg/l), a pH 5,8].
Al igual que con el maíz, el RG1 líquido se suministra a cajas
Magenta^{TM} que contienen estopilla, antes de someter a un
autoclave. Las semillas se colocan en RG1 (100 semillas de cualquier
genotipo por caja), y se precultivan toda la noche (16 h o luz
continua; 23ºC) antes del bombardeo al día siguiente.
Las semillas precultivadas se empaquetan
fuertemente de forma vertical, con el extremo del embrión hacia
arriba (Figura 12A), en el área central de 2,5 cm de una cápsula de
Petri (25 por cápsula) que contiene medio RG1.1 (RG1 más 8,0 g/l de
fitagar), y se bombardearon con microproyectiles revestidos con
ADN.
El procedimiento es igual al descrito para el
maíz, con las siguientes modificaciones. Se usaron 10 \mul de ADN
(1,0 \mug/\mul) y 20 \mul de isopropanol (2X vol de ADN), 60
\mul de CaCl_{2} 2,5 M y 15 \mul de espermidina 0,1 M. Cada
disparo suministra 2,0 \mug de ADN y 720 \mug de wolframio.
Las Figuras 12A-F muestran el
esquema de transformación y regeneración de plastidios de arroz. A)
semillas de arroz, con el embrión hacia arriba, justo antes del
bombardeo; las flechas apuntan a los márgenes del embrión; B)
inducción de múltiples brotes a partir de un embrión de control
después de siete semanas en cultivo; C) selección de brotes de
arroz con plastidio transformado que proceden de un embrión inicial
de arroz en medios que contienen espectinomicina y estreptomicina
después de ocho semanas en medio selectivo; las flechas apuntan a
dos transformantes putativos; D) regenerantes de arroz de control;
E) Priscilla transgénica 2.3; F) Priscilla transgénica 2.4.
Las semillas de arroz se separan y se extienden
en el medio RG1.1 (manteniendo la polaridad), y se colocan en la
oscuridad durante dos días después del bombardeo. El extremo del
embrión de la semilla se corta entonces (embrión más una pequeña
cantidad de endoesperma) del resto del endoesperma, el cual se
desecha. Los embriones se colocan en 50 ml de medio RG2 líquido (en
un matraz de 250 ml), para la inducción de múltiples brotes (Figura
12B). El medio RG2 contiene sales de MS, sacarosa y vitaminas de DM
como antes, y BA (6,0 mg/l) a pH 5,8. El medio RG2 usado para la
selección incluye espectinomicina (1000 \mug/ml) más sulfato de
estreptomicina (100 \mug/ml). Los cultivos se colocan en la
cámara de crecimiento (fotoperíodo de 16 h; 25ºC), y se subcultivan
cada dos semanas en medios de selección recientes. Los brotes verdes
se seleccionan de las agrupaciones de brotes que proceden de cada
embrión, y se colocan nuevamente en medios selectivos (Figura 12C).
El enraizamiento se logra en medio RG3 [sales de MS, sacarosa y
vitaminas de DM como antes, IBA (0,5 mg/l) a pH 5,8], más
antibióticos. (Los brotes se pueden enraizar separadamente o como
racimos de múltiples brotes). Las plántulas se transplantan a
medios de adaptación a macetas, se aclimatan y después se vuelven a
colocar en macetas en una mezcla de arcilla:arena (1:1), y se hacen
crecer hasta madurez en el invernadero (Figuras 12D, E, F).
Como se describe anteriormente, se desarrollaron
(Rudraswarny, 1997) protocolos únicos de transformación nuclear y
regeneración de maíz (Figura 10), y se adaptaron para la
transformación de plastidios. (Previamente a este trabajo, los
explantes de sección nodal no se habían usado para la transformación
ni la regeneración). Se indujeron múltiples brotes en secciones
nodales cortadas de plantones de tres días de 21 genotipos (ninguno
relacionado con A118 o B73) que incluyeron genotipos híbridos (16 de
grano, uno dulce) y endogámicos (cuatro). Después de ocho semanas
en cultivo, se generaron 16-32 brotes (24 de media)
por explante. Los brotes se enraizaron, y los regenerantes no
mostraron fenotipos aberrantes en los análisis de invernadero
(estudio limitado de dos plantas por genotipo). El ADN también se
pudo suministrar en explantes de sección nodal de todos los
genotipos (Figura 10C; expresión de
\beta-glucuronidasa transitoria). Para la
transformación de plastidios, los explantes de sección nodal se
bombardearon con pSBL-ctV2, y después se colocaron
en un medio de inducción de múltiples brotes que contiene
espectinomicina y estreptomicina. Los brotes que surgen se pudieron
cortar y se volvieron a colocar en medio de inducción de brotes
para las rondas subsiguientes de selección.
Como se describe anteriormente, las semillas de
arroz buscadas maduras intactas, sin pelar, únicas, con el embrión
hacia arriba, no usadas en protocolos de transformación dados a
conocer previamente, se acoplaron con un protocolo de inducción de
múltiples brotes (Figura 12) para embriones maduros (escindidos dos
días después del bombardeo). Se indujeron múltiples brotes en los
ocho genotipos ensayados (Litton, Priscilla - dos variedades de
cultivo de Mississippi recientemente liberadas, más seis líneas de
descendencia). La respuesta observada debería ser similar en otras
numerosas variedades de cultivo, puesto que el explante inicial es
un embrión maduro. Los regenerantes (no transformados) se mantienen
para la recogida de semilla F1. Después de la transformación de
plastidios, la multiplicación de brotes ocurrió en presencia de
espectinomicina/estreptomicina, y, al igual que con el maíz, los
brotes pudieron sufrir numerosas rondas de selección debido a la
proliferación de brotes (de origen axilar o adventicio desconocido)
a partir de la base de brotes cortados. El enraizamiento también se
logró en medios selectivos.
Las Figuras 13A-B muestran el
análisis mediante PCR de ADN aislado a partir de hojas de primera
generación de transformantes de arroz. El análisis mediante PCR se
realizó con ADN aislado de las hojas de la primera generación. Los
productos de la PCR no fueron abundantes como se observa en plantas
transgénicas de cloroplasto del tabaco (Figura 13A, línea 11, 13B,
fila 12). Esto puede ser debido a dos razones. El protocolo usado
para aislar el ADN no es adecuado para hojas bastas de arroz; o los
cebadores diseñados para el tabaco no hibridan también con ADNct
del arroz. No obstante, para el análisis preliminar, se usaron
cebadores del tabaco para ensayar la integración del gen
aadA en el genoma de la planta a partir del vector universal.
La falta de producto indicaría mutantes espontáneos, capaces de
crecer en espectinomicina sin el gen aadA (Figura 13A, filas
7-10). Se detectó un producto de PCR de 1,57 Kb en
cuatro líneas (Figura 13A, filas 2-6) transformadas
con el vector universal. En las condiciones de selección usadas, se
detectaron cuatro mutantes de diez líneas transformadas con el
vector universal. Los cebadores también se diseñaron para
identificar específicamente la integración en el genoma de los
plastidios. Para el vector universal, el cebador en el genoma del
cloroplasto nativo cayó en el gen de ARNr 16S, fuera de la
secuencia de flanqueo del vector del cloroplasto (producto de PCR
de 1,60 Kb). Los productos esperados se observaron para las líneas
transgénicas obtenidas usando el vector universal (Figura 13B,
filas 5, 6). Las plantas no bombardeadas (controles) no produjeron
ningún producto de PCR, como era de esperar (Figura 13B, fila 2;
Figura 13A, fila 1). Los resultados de la PCR identificaron dos
plantas de arroz "Priscilla" (2.3 y 2.4) que contienen
plastidios transformados (Figuras 12 y 13).
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Se obtuvieron cacahuetes transgénicos que tienen
genomas de cloroplastos transformados, usando el vector universal
pSBL-CG-CtV2 (Figura 7A). El tejido
del cacahuete se hizo crecer en cultivo según el protocolo descrito
por Kanyand et al., 1994. Las condiciones del bombardeo
fueron las mismas que para la transformación de cloroplastos del
tabaco, como se describe anteriormente, excepto que se usaron
secciones epicotílicas para el bombardeo mientras se usaron discos
de ruptura de presión variable. Nunca se ha dado a conocer
previamente la transformación de cloroplastos del cacahuete.
La Figura 14 muestra la transformación de
plastidios del cacahuete. Las plantas de cacahuete transformadas
crecen normalmente (en el centro y en el lado izquierdo de la
placa), mientras que las plantas no transformadas mueren en el
medio letal (500 \mug/ml).
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Las habas de soja transgénicas, que tienen
genomas de cloroplastos transformados, se obtuvieron usando el
vector universal pSBL-CG-CtV2
(Figura 7A). Las condiciones del bombardeo fueron las mismas que
para la transformación de cloroplastos del tabaco. Nunca se ha dado
a conocer previamente la transformación de cloroplastos de haba de
soja.
La Figura 15 muestra la transformación de
plastidios de haba de soja. Dos plantas transformadas muestran
brotes, la otra planta muere en el medio letal, confirmando la
selección letal mediante el antibiótico espectinomicina (500
\mug/ml).
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Las plantas de boniato transgénicas, que tienen
genomas de cloroplastos transformados, se obtuvieron usando el
vector universal pSBL-CG-CtV2
(Figura 7A). Los tejidos del boniato se hicieron crecer en cultivo
según el protocolo descrito por Zhang et al., 1996. Las
condiciones del bombardeo fueron las mismas que para la
transformación de cloroplastos del tabaco, como se describe
anteriormente, excepto que se bombardearon los callos y los
embriones primarios, y, tras el bombardeo, se transfirieron a placas
que contienen 100 mg/ml de espectinomicina. Nunca se ha dado a
conocer previamente la transformación de cloroplastos del
boniato.
La Figura 16 muestra la transformación de
embriones de boniato en el medio de selección letal del antibiótico
espectinomicina (500 \mug/ml). Nótense los callos blanqueados (a
la derecha) y los embriones verdes (a la izquierda).
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Las plantas de uva transgénicas, que tienen
genomas de cloroplastos transformados, se obtuvieron usando el
mismo vector universal pSBL-CG-CtV2.
El tejido de la uva se hizo crecer en cultivo según el protocolo de
Hebert et al., 1993. Todos los protocolos de transformación
de cloroplastos fueron iguales que para el tabaco, excepto que,
para el bombardeo, se usaron células en la fase exponencial de
crecimiento, alrededor de 4 días después del subcultivo. Nunca se
ha dado a conocer previamente la transformación de cloroplastos de
la uva.
La Figura 17 muestra la transformación de
células de uva. Las células de cultivo transformadas se pusieron
verdes, mientras que las células no transformadas murieron en el
medio de selección letal del antibiótico espectinomicina (500
\mug/ml).
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La transformación de plantas por medio de
bombardeo de microproyectiles es una técnica favorecida para
introducir, en las plantas diana, el vector universal que tiene la
secuencia nucleotídica deseada que codifica la molécula de interés.
En la Tabla II se muestran plantas transgénicas ilustrativas
obtenidas mediante bombardeo con microproyectiles.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
La transformación de plantas mediante el uso de
la pistola génica se describe en Daniell, 1997. Cada cosecha de la
que se informó que era transformable nuclearmente vía el bombardeo
con microproyectiles en esa Tabla puede tener su genoma del
cloroplasto transformado usando el vector universal como se describe
aquí.
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Los ejemplos que siguen ilustran la expresión de
biopolímeros biodegradables a base de proteínas (PBP), y el
análisis de los transformantes.
El vector
pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) contiene
el gen (GVGVP)_{12imer} (denominado EG121) que codifica un
biopolímero biodegradable a base de proteína (PBP) que tiene muchas
aplicaciones médicas y no médicas.
Los vectores estándares para la construcción de
vectores fueron como se esquematizan mediante Sambrook et
al., 1989. Los vectores de integración y de expresión de
cloroplastos pSBL-CtV2 (Figura 7A) y pZS197 se
digirieron, respectivamente, con XbaI (un sitio único entre
el gen aadA y la región 3' de psbA) y con SpeI
(un sitio único a 120 pb en dirección 3' del gen aadA en la
región reguladora 3' de psbA), se rellenaron con el
fragmento de Klenow, y se desfosforilaron. El gen polímero EG121,
junto con la secuencia de Shine-Dalgarno (GAAGGAG),
del vector pET11d, se escindió como un fragmento
XbaI-BamHI del plásmido pET11d-EG121.
Los extremos pegajosos del fragmento del inserto se llenaron con el
fragmento Klenow, y se ligaron con vectores
pSBL-CtV2 o pZS197, produciendo vectores de
expresión de cloroplastos
pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) y
pZS-CG-EG121 (Figura 3B), que
integran los genes aadA y EG121 en la región repetida
invertida (IR) o en la región espaciadora entre los genes
rbcl y orf 512 del genoma del cloroplasto del tabaco.
Véase la Figura 1 para los sitios de integración de "UV" y
"TV", respectivamente.
El vector del plásmido
pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) se
transformó en la cepa XL-1 Blue de E. coli, y
se hizo crecer en caldo Terrific en presencia de ampicilina (100
\mug/ml) a 37ºC durante 24 h. Se llevó a cabo una
SDS-PAGE según Laemmli, 1970, usando un gel de
resolución al 12% y un gel de apilamiento al 5%, y se llevó a cabo
durante 5 h a una corriente constante de 30 mAmps. Los extractos de
proteína bruta procedentes de las células de E. coli se
prepararon y se sometieron a electroforesis como se describe por
Guda et al., 1995. Después de la electroforesis, los
polipéptidos se visualizaron mediante tinción negativa con
CuCl_{2}.
La Figura 18 muestra la expresión de vectores de
integración y de expresión de cloroplastos en la cepa HMS174 (DE3)
de E. coli. La fila 1 muestra la proteína polímera
purificada; la fila 2 muestra el control de E. coli sin
transformar; la fila 3 muestra la cepa XL-1 Blue de
E. coli transformada con el vector universal
pSBL-CG-EG121 (Figura 3A); la fila 4
muestra E. coli transformada con el vector del tabaco
(ejemplo comparativo); y la fila 5 muestra a la cepa HMS174 (DE3)
de E. coli transformada con el vector
pET11d-EG121, en el que el promotor T7 transcribe
el gen del polímero. El nivel de expresión mediante el promotor Prrn
en E. coli fue casi equivalente al del promotor T7 altamente
eficaz que dirige al gen del polímero.
El ADN total se extrajo de hojas de plantas
transformadas y de tipo salvaje, usando el procedimiento CTAB de
Rogers y Bendich, 1988.
Las Figuras 19 y 20 muestran el análisis de
transferencia Southern realizado independientemente con los
transformantes obtenidos usando los vectores del tabaco (Figura 19)
(ejemplo comparativo) y el universal (Figura 20). El ADN total se
digirió con EcoRI y con HindIII en el caso de los
transformantes del vector universal (UV), o con EcoRI y con
EcoRV en el caso de los transformantes del vector del tabaco
(TV). La presencia de un sitio EcoRI en el extremo 3' del
gen polímero permitió la escisión de fragmentos de tamaño predicho
en los transformantes de los cloroplastos solamente. Para confirmar
la integración de genes extraños y la homoplasmia, se sondaron
transferencias individuales con las secuencias borde
correspondientes. En el caso de los transformantes del TV, después
de la segunda o tercera ronda de selección, la secuencia borde se
hibridó con fragmentos de 4,6 y 1,6 kpb (Figura 19A, filas 2, 3 y
4), y con un fragmento nativo de 3,1 kpb en el tipo salvaje (Figura
19A, fila 1). Por otro lado, en el caso de los transformantes del
UV, después de la primera ronda de selección, la secuencia borde se
hibridó con fragmentos de 4,0 kpb y 1,2 kpb (Figura 20A, filas 1 y
2), mientras que se hibridó con un fragmento nativo de 2,1 kpb en el
control (Figura 20A, fila 3). Además, los transformantes del TV
también mostraron el fragmento nativo de 3,1 kpb (Figura 19A, filas
2 y 3) similar al de la planta de tipo salvaje, indicando una
condiciones heteroplásmica de los genomas de cloroplastos
transformados, incluso aunque han estado bajo varias rondas de
selección. Sin embargo, ambos transformantes del UV mostraron una
condición homoplásmica, incluso después de la primera ronda de
selección (Figura 20A, filas 1, 2).
Ya se dio a conocer anteriormente la presencia
de heteroplasmia incluso después de la segunda selección, y se
sugirió que la selección se debería realizar hasta lograr la
homoplasmia (Svab y Maliga, 1993). Esto es consistente con la
observación de que existe un grado elevado de heteroplasmia después
de un segundo ciclo de selección en los transformantes del TV
(Figura 19A, filas 2 y 3). Sin embargo, en el caso de los
transformantes del UV, no se observó condición heteroplásmica, lo
cual puede ser debido al mecanismo de corrección de copias entre
las dos regiones IR y/o a la presencia del origen de replicación
(ori) del cloroplasto en la secuencia borde, lo que debería
aumentar el número de copias del plásmido introducido, antes de la
integración.
Las transferencias en gel de ADN también se
sondaron con el gen aadA (plantas integradas con el UV) o
con el gen EG121 (plantas integradas con el TV), para reconfirmar la
integración de genes extraños en los genomas de los cloroplastos.
En las plantas integradas con el TV, la sonda del gen polímero se
hibridó con un fragmento de 4,6 kpb, sólo en las líneas de los
transformantes de los plastidios (Figura 19B, filas 2, 3 y 4).
También, en las plantas integradas con el UV, la secuencia de
aadA se hibridó con un fragmento de 4,0 kpb esperado (Figura
20B), que también se hibridó con la secuencia borde en las líneas de
los transformantes de plastidios (Figura 20A, filas 1 y 2).
Los niveles de transcritos de genes extraños se
analizaron mediante transferencia Northern (Figura 21) usando ARN
total aislado de los transformantes de cloroplastos, del control, y
una planta transgénica de tabaco que expresa de forma elevada el
gen polímero (EG121) vía el genoma nuclear (Zhang et al.,
1996). La secuencia del gen polímero (EG121) se hibridó con un
fragmento de 1,8 kpb en los transformantes de los cloroplastos
(filas 1-4, 5-6), y también con
fragmentos de mayor tamaño en uno de los transformantes de
cloroplastos (fila 6). En el caso del transformante nuclear, se
observó un transcrito de alrededor de alrededor de 2,1 kpb (fila
7). Esto fue debido a la presencia de una cola poli A en el extremo
3' del transcrito del polímero proporcionada por el terminador
nos. Los fragmentos de mayor tamaño, observados en la fila 6,
pueden ser los transcritos di-, tri- o policistrónicos que están
siendo procesados en los cloroplastos. Esto es un fenómeno habitual
en la expresión de genes de cloroplastos debido a que muchos genes
de plastidios se organizan en unidades transcripcionales
policistrónicas que dan lugar a conjuntos complejos de ARNm que
solapan. La cuantificación de los niveles de transcritos reveló que
los transformantes de los cloroplastos estaban produciendo 11 veces
(fila 5), o más de cincuenta veces (fila 6), más de los transcritos
del polímero con respecto a un transformante nuclear que expresa de
forma elevada (fila 7, planta con la mayor expresión entre treinta y
cinco plantas transgénicas nucleares con TV examinadas). Esto se
atribuye directamente a la presencia de un mayor número de copias
génicas en los cloroplastos de plantas transgénicas. Los
transformantes de plastidios integrados con el vector del tabaco
(TV) mostraron niveles más bajos de transcrito de polímero (filas
1-4), en comparación con los transformantes
integrados con el vector universal (filas 5, 6), debido a que el gen
polímero existe como dos copias por genoma de plastidio
transformado, en transformantes con el vector universal, frente a
una única copia en los transformantes con el TV y las condiciones
heteroplásmicas observadas en los transformantes con el TV.
La proteína polímera se purificó a partir de
hojas procedentes de transformantes de cloroplastos del tabaco de
tipo salvaje y plantas transgénicas nucleares, siguiendo el método
descrito recientemente por Zhang et al., 1995. El polímero
purificado se analizó mediante SDS-PAGE según
Laemmli, 1970, usando un gel de resolución al 12% y un gel de
apilamiento al 5%, y realizando el experimento durante 5 h a una
corriente constante de 30 mAmps. Los polipéptidos polímeros de
alrededor de 60 kDa se visualizaron mediante tinción negativa con
CuCl_{2} 0,3 M. Los geles se destiñeron en EDTA sódico 0,25 M y
Tris-HCl 0,25 M, pH 9,0, con tres cambios de tampón
a intervalos de 10 minutos. La inmunotransferencia Western y la
tinción (Figura 22) se llevaron a cabo como se describe por Zhang
et al., 1996, usando un antisuero monoclonal surgido frente
al polímero AVGVP que reacciona bien de forma cruzada con el
polímero GVGVP y el "Immuno-Blot Assay Kit"
(Bio-Rad). Los polipéptidos polímeros a alrededor
de 60 kDa se observan en los transformantes de plastidios de plantas
integradas con IR. En la fila 5 (Figura 22) se observa la expresión
del polímero a partir de una planta transgénica nuclear de
generación F2 que expresa de forma elevada (planta de mayor
expresión entre 35 plantas transgénicas examinadas), mientras que,
como se observa en la fila 4 (Figura 22), en el control sin
transformar no se expresó ningún polímero. En los transformantes de
los cloroplastos se muestra un nivel once a cincuenta veces mayor de
transcritos del polímero (Figura 21). En el caso de proteínas de
origen natural de los cloroplastos, como valina y prolina, cuyas
rutas biosintéticas están compartimentadas en cloroplastos, es de
esperar que se produzcan mayores niveles de proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia que codifica EPSPS se ha integrado
recientemente en el genoma del cloroplasto del tabaco (Figura 1).
El vector del cloroplasto
pZS-RD-EPSPS (Figura 2A) contiene el
promotor de ARNr 16S (Prrn) que dirige los genes aadA y
EPSPS con la región 3' de psbA del genoma del cloroplasto del
tabaco. Este constructo integra a los genes de EPSPS y aadA
en la región espaciadora entre los genes rbcL y orf512
del genoma del cloroplasto del tabaco. Figura 1, en la flecha del
"TV".
Debido a la gran similitud en los sistemas de
transcripción y traducción entre E. coli y cloroplastos
(Brixey et al., 1997), primero se ensayaron los vectores de
expresión del cloroplasto en E. coli para determinar la
resistencia en este caso a glifosato antes de proceder con la
transformación de plantas superiores. La mayor tasa de crecimiento
de E. coli que contiene el vector del tabaco, comparada con
el control que contiene pZS197 (similar a
pZS-RD-EPSPS pero que carece del gen
de EPSPS), en presencia de 10 mM y 40 mM de glifosato (Figura 23A),
indica tolerancia a glifosato de E. coli que expresa el gen
de EPSPS. Otra curva de crecimiento (Figura 23B) confirma la
expresión de EPSPS vía el vector universal en E. coli. De
este modo, la tolerancia a glifosato de E. coli es debida a
la expresión del gen de EPSPS, presente tanto en el vector del
tabaco como en el vector universal.
Se bombardearon hojas verdes completamente
expandidas de Nicotiana tabaccum var. Petit Havana con los
vectores de cloroplastos de tabaco (ejemplo comparativo) y el
universal. Dos días después del bombardeo, los explantes de hoja se
transfirieron a medio letal de selección que contiene
espectinomicina (500 \mug/ml). Se obtuvieron plantas transgénicas
en 3-5 meses después del bombardeo. Típicamente, de
las 16 hojas bombardeadas, se identificaron 10 brotes transformados
independientemente.
El análisis mediante PCR se realizó con ADN
aislado de los brotes de la primera o de la segunda generación, y
también de las plantas transgénicas maduras. Se usaron cebadores
para confirmar la integración del gen aadA en el genoma de
la planta del tabaco así como de los vectores universales. La falta
de un producto indicaría mutantes espontáneos, capaces de crecer en
espectinomicina sin el gen aadA. El producto de la PCR
esperado (887 pb) se obtuvo a partir de seis líneas (Figuras
24A-B, filas 1-6) transformadas con
el vector del tabaco (ejemplo comparativo). Se detectó un producto
de PCR de 1,57 Kb en cuatro líneas (Figuras 24A-B,
filas 1-4) transformadas con el vector universal.
En las condiciones de selección usadas, se detectaron cuatro
mutantes de diez líneas transformadas con el vector del tabaco. Por
otro lado, todas las líneas transgénicas transformadas con el
vector universal mostraron integración del gen aadA.
También se diseñaron cebadores para identificar
específicamente la integración en el genoma del plastidio. La
estrategia aquí fue descargar un cebador sobre el genoma del
cloroplasto nativo, adyacente al punto de integración del vector,
mientras se descarga el otro sobre el gen aadA. Se diseñó un
cebador para que cayese inmediatamente fuera del gen rbcL en
el vector del tabaco (producto de PCR de 2,08 Kb). Para el vector
universal, el cebador en el genoma del cloroplasto nativo cayó en el
gen de ARNr 16S (producto de PCR de 1,60 Kb). Los productos
esperados se observaron para las líneas transgénicas obtenidas
usando el vector del tabaco (Figuras 24A-B, filas
2-7) así como el vector universal (Figuras
24A-B, filas 1-4). Las plantas no
bombardeadas (controles) no produjeron ningún producto de PCR, como
era de esperar (Figuras 24A, filas 1 y 9; 24B, filas 5 y 11). De
este modo, todas las plantas transgénicas examinadas resultaron ser
transformantes de cloroplastos y no transformantes nucleares,
quizás debido al requisito de mayores niveles de aminoglicósido
adenil transferasa (AADA) en plantas transgénicas en condiciones de
selección restrictivas. Los bajos niveles de AADA, presentes en el
codicilo de plantas transgénicas nucleares, habrían eliminado los
transformantes nucleares. Los resultados del análisis de PCR son
concluyentes, y proporcionan una señal definitiva de la integración
de genes extraños en el cloroplasto usando los vectores tanto del
tabaco como universales.
La integración del gen aroA en el
cloroplasto también se confirmó mediante análisis de Southern.
Además, el nivel elevado de resistencia a glifosato observado
(Figura 20A) se confirmó mediante la determinación del número de
copias del gen extraño en las plantas transgénicas. La sonda, para
determinar la integración del gen extraño en el genoma del
cloroplasto, comprendía un fragmento de 654 pb del cebador aleatorio
del gen EPSPS, marcado con P^{32}. El ADN total, que comprende
tanto ADN de orgánulos como ADN genómico, se digirió con
EcoRI. La presencia de un sitio EcoRI de 200 pb en
dirección 5' desde el sitio de integración, en el genoma del
cloroplasto, se usó para confirmar la integración del gen de EPSPS
en el genoma del cloroplasto en plantas transgénicas. La sonda
hibridada al gen nativo de EPSPS, presente en el genoma nuclear, se
observa como un fragmento de 4,5 Kb. Además, la sonda se hibridó a
los genomas de cloroplastos digeridos de las plantas de tabaco
transgénicas, generando los fragmentos de 3,5 Kb y 4,35 Kb en la
Figura 25A, filas 2, 3 y 4. La sonda no se hibridó al genoma del
cloroplasto digerido de la planta de control sin transformar (Figura
25A, fila 1), puesto que el gen extraño no está presente en el
genoma del cloroplasto del tabaco. Esto demuestra claramente la
integración, del gen de EPSPS, en el genoma del cloroplasto.
El número de copias del gen integrado se
determinó estableciendo la homoplasmia para el genoma de cloroplasto
transgénico. Los cloroplastos del tabaco contienen
5000-10.000 copias de su genoma por célula (McBride
et al., 1995). Si sólo se transforma realmente una fracción
de los genomas, el número de copias, por defecto, debe ser menor
que 10.000. Estableciendo que en los transgénicos el genoma
transformado con EPSPS es el único presente, se podría afirmar que
el número de copias es 5000-10.000 por célula. Esto
se demostró digiriendo el ADN total con EcoRI y sondando con
las secuencias de flanqueo que permiten la recombinación homóloga
en el genoma del cloroplasto. La sonda comprendía un fragmento de
2,9 Kb de las secuencias de rbcL-orf 512. Un
genoma de cloroplasto transformado con el gen de EPSPS incorpora un
sitio de EcoRI entre la región
rbcL-orf 512 del genoma del cloroplasto,
generando de ese modo un fragmento adicional cuando se digiere con
esta enzima (Figura 25C). El análisis de hibridación Southern reveló
un fragmento de 4,43 Kb en la Figura 25B, fila 1, para el control
sin transformar. En las filas 2, 3 y 4, se generaron dos fragmentos
(4,35 Kb y 3 Kb) debido a la incorporación del casete del gen de
EPSPS entre las regiones rbcL y orf512 (la Figura 25C
proporciona un diagrama esquemático, significando las líneas
punteadas en gris el punto de integración del ADN extraño). El
fragmento de 4,43 Kb, presente en el control, está ausente en los
transgénicos. Esto prueba que sólo el genoma del cloroplasto
transgénico está presente en la célula, y que no hay genoma del
cloroplasto nativo, sin transformar, sin el gen de EPSPS. Esto
demuestra la naturaleza homoplásmica de los transformantes,
proporcionando simultáneamente una estimación de
5000-10.000 copias del gen de EPSPS extraño por
célula. Esto explicaría entonces los niveles elevados de tolerancia
a glifosato que se observaron en las plantas de tabaco transgénicas
(Figura 20A).
Las semillas recogidas de plantas transgénicas
autopolinizadas se hicieron germinar en presencia de espectinomicina
(500 \mug/ml). Todas las semillas germinaron, permanecieron
verdes y crecieron normalmente (Figura 26B). La resistencia
uniforme a espectinomicina indicó que el gen aadA se
transmitió a toda la progenie. La falta de diversificación sugirió
homoplasmia debido a que una condición heteroplásmica habría dado
lugar a una progenie diversificada en espectinomicina (Svab et
al., 1990; Svab y Maliga, 1993). La falta de variación en la
pigmentación clorofílica entre la progenie también subraya la
ausencia de efecto de posición, un artificio de la transformación
nuclear. Todos los plantones del control estaban blanqueados, y no
crecieron en presencia de espectinomicina (Figura 26A).
Se pulverizaron plantas de control y
transgénicas de dieciocho semanas con volúmenes iguales de glifosato
a diferentes concentraciones (0,5 a 5 mM). Las plantas de tabaco
del control fueron extremadamente sensibles al glifosato. Murieron
en siete días, incluso a una concentración de 0,5 mM de glifosato
(Figura 27B). Por otro lado, las plantas transgénicas en su
cloroplasto sobrevivieron a concentraciones tan altas como 5 mM de
glifosato (Figura 27A). Estos resultados son intrigantes,
considerando el hecho de que el gen de EPSPS de la petunia usado en
estos vectores de cloroplasto tiene un nivel bajo de tolerancia a
glifosato, y también contiene el péptido de tránsito para la
selección en los cloroplastos.
Esta es la primera noticia de una expresión de
un gen nuclear eucariótico en el compartimiento de un cloroplasto
procariótico. Es bien sabido que la preferencia del codón es
significativamente diferente entre el compartimiento del
cloroplasto procariótico y el compartimiento nuclear eucariótico. De
forma ideal, un gen mutante aroA (que no se une a
glifosato), procedente de un sistema procariota, se debería expresar
en el compartimiento del cloroplasto. Tales genes están ahora
disponibles y muestran un nivel mil veces mayor de resistencia a
glifosato que el gen de la petunia usado en este trabajo. A la luz
de estas observaciones, es posible que la integración de genes
procariotas con resistencia a herbicidas, en el genoma del
cloroplasto, como se realiza aquí, pueda dar como resultado niveles
increíblemente elevados de resistencia a herbicidas a la vez que aún
se mantenga la eficacia de la prevención de la expansión biológica,
es decir, se evita la diseminación mediante el polen.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construye un vector universal de cloroplasto
usando el ADN del cloroplasto de maíz según lo siguiente. Primero,
se construye el vector pSBL-Ct-bor
(Figura 5C) según lo siguiente: el subclón de ADN de cloroplasto de
maíz, que contiene una de las regiones repetidas invertidas, se
construye con el plásmido bacteriano pUC19. En segundo lugar, se
construye un subclón más pequeño, que contiene sólo el operón de
ARNr, a partir del primer subclón, y el fragmento presente en el
segundo subclón, que contiene los genes trnA y trnI, y
las regiones espaciadoras que representan la borde universal se
subclonan en un plásmido pUC19 en el sitio de PvuII. El
plásmido resultante se denomina
pSBL-Ct-bor. Dentro del plásmido
pSBL-Ct-bor, se inserta un casete
de un gen marcador seleccionable que contiene un promotor de ARNr
16S de cloroplasto, el gen aadA (que codifica aminoglicósido
3'-adeniltransferasa que confiere resistencia a
estreptomicina/espectinomicina) y una región no traducida 3' del
gen psbA del cloroplasto, para construir el vector
pSBL-CORN. El casete del gen marcador seleccionable
se inserta entre los genes trnI y trnA en la región
espaciadora, en la dirección de la transcripción de ADNr 16S.
El vector
pSBL-CORN-aroA, que contiene un gen
mutante aroA procedente de Salmonella typhimurium
(Stalker et al., 1985; Comai et al., 1983), que
codifica la enzima EPSPS sintasa, se construye insertando el gen
mutante aroA en el vector pSBL-CORN. Las plantas de
maíz transgénicas que expresan el gen mutante aroA son resistentes
al tratamiento con glifosato, como "Roundup^{TM}", mientras
que las plantas del control sin transformar no lo son.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSBL-CORN se
modifica mediante inserción de un fragmento de ADN que contiene una
forma mutada del gen de acetolactato sintasa de Saccharomyces
cerevisiae (Falco y Dumas, 1985; Yadav et al., 1986),
para generar el plásmido
pSBL-CORN-ASL1. Este gen codifica
una acetolactato sintasa que no es inhibida por imidazolinonas o
sulfonilureas, y confiere tolerancia a herbicidas que contienen
sulfometurón metilo, y a herbicidas que contienen imazapir. Las
plantas de tabaco transformadas, que expresan el gen mutante de
acetolactato sintasa, son resistentes a pulverizaciones de
herbicidas de tipo imidazolinona y sulfonilureas.
El vector
pSBL-CORN-ALS2 es un derivado de
pSBL-CORN que contiene copias mutadas de los genes
suRA y suRB del tabaco (Chaleff y Ray, 1984). Estos genes codifican
el polipéptido de acetolactato sintasa del tabaco. El plásmido
pSBL-CORN-ALS2 se construye ligando
los genes suRA y suRB, aislados del ADN genómico del tabaco, en el
vector pSBL-CORN. El vector resultante confiere
resistencia a herbicidas de tipo imidazolinonas y sulfonilureas.
\vskip1.000000\baselineskip
La resistencia a herbicidas del fotosistema (PS)
II se produce a partir de mutaciones dentro del gen psbA,
que encierra a la proteína Q_{B} y que se conserva enormemente
entre muchas plantas. Las plantas resistentes poseen mutaciones que
alteran a aminoácidos en posiciones específicas dentro de las
proteínas Q_{B}, por ejemplo, los restos 219, 251, 255, 264 y 275
(Hirschberg y McIntosh, 1993; Galloway y Mets, 1984; Gloden y
Haselkorn, 1985; Erickson et al., 1984; Johanningmeier et
al., 1987). De este modo, los genes que poseen estas mutaciones
se pueden utilizar para conferir resistencia a herbicidas que
funcionan inhibiendo el transporte de electrones llevado a cabo por
el sistema del PS II.
Los ejemplos de estos herbicidas incluyen
diclorofenildimetilurea (DCMU), atrazina, metribuzina, lenacilo,
fenmedifam, loxinilo y dinoseb.
El gen mutante psbA, que contiene una
mutación de serina a glicina en el resto 264, se aísla de ADN
genómico de Chlamydomonas, usando las endonucleasas de restricción
apropiadas. El fragmento resultante se puede ligar en el vector de
expresión de cloroplastos universal pSBL-ctV2, y se
puede introducir en XL1 Blue de E. coli. El plásmido
purificado procedente de esta cepa de E. coli se utiliza para
transformar plantas. Daniell (1997). La incorporación de los genes
mutantes psbA en el genoma del cloroplasto, y la selección de
los transformantes apropiados, se lleva a cabo como se ha descrito
previamente. Las plantas transformadas que producen la proteína
mutada psbA, que contiene la sustitución de serina a glicina,
son resistentes a Atrazine^{TM}, mientras que las plantas del
control no lo son.
El gen mutante psbA, que contiene una
mutación de valina a isoleucina en el resto 219, se aísla de ADN
genómico de Chlamydomonas, usando las endonucleasas de
restricción apropiadas. El vector universal se construye como se
describe anteriormente. Es de esperar que las plantas transgénicas
como el maíz, que expresan psbA que contiene la mutación de
valina a isoleucina en el resto 219, son resistentes a
pulverizaciones de DCMU.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector universal de expresión de cloroplastos
psbL-ctV2 se puede escindir con XbaI, y se puede
ligar con un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica
monooxigenasa. El constructo resultante se puede transformar en
cloroplastos para generar plantas transgénicas que contienen
múltiples copias del gen de la monooxigenasa. Es de esperar que las
plantas resultantes, que expresan niveles elevados de monooxigenasa,
sean tolerantes a 2,4-D.
\vskip1.000000\baselineskip
Las plantas del tabaco se pueden transformar con
el vector universal pSBL-CtVHBt (Figura 8A) que
contiene el gen cryIIA y que expresa la protoxina CryIIA,
confiriendo de este modo resistencia a plagas de insectos como la
familia Pyralidoae, tales como el gusano de cuerno del tabaco.
Incluso los insectos que han desarrollado una resistencia o son
menos susceptibles a la toxina Bt son exterminados por la toxina Bt
expresada por el gen en el vector del cloroplasto descrito
aquí.
El vector pSBL-CtVHBt se
construye escindiendo mediante ruptura pSBL-CtVH con
SmaI y ligando el producto con el gen cryIIA que
codifica la proteína CryIIA. El producto contenía el gen
cryIIA en la orientación transcripcional correcta (Figura
8A).
La integración del gen cryIIA en el
genoma del cloroplasto del tabaco se ha confirmado mediante análisis
de PCR. Se estimó que el número de copias de cryIIA por
célula era 10.000 mediante la realización de transferencias
Southern. Se estimó que la proteína CryIIA era entre un 5 y un 10%
de la proteína celular total, mediante la realización de
transferencias Western. Este es el nivel más elevado de proteína
CryIIA jamás dado a conocer en plantas transgénicas con Bt. Se
realizaron bioensayos de hojas cortadas usando tabaco "Petit
Havana" no transformado y tabaco transformado con cryIIA.
Se colocaron cinco a diez larvas sobre cada hoja, y se evaluaron
para determinar la mortalidad y el daño a la hoja después de
3-5 días. Usando H. virescens (YDK)
susceptible, todas las larvas murieron en un período de 3 días en el
tabaco transformado con cryII-A, mientras
que no hubo ninguna mortalidad y hubo una desfoliación esencialmente
del 100% en el "Petit Havana" no transformado. Se obtuvieron
resultados similares usando H. virescens resistente a CryIAc
(YHD2, resistente unas 40-50.000 veces) y
resistente a CryII-A (CXC, resistente unas 2000
veces). Además, se observó una mortalidad del 100% frente a
Helicoverpa zea (gusano del capullo del algodón), y frente a
Spodoptera exigua (gardama), ninguno de los cuales ha
demostrado previamente que es exterminado por una proteína Cry.
La Figura 28A y 28B muestran un bioensayo de (A)
planta no transformada de control, y (B) planta transgénica. Los
insectos ensayados demostraron una mortalidad del 100%: el cogollero
del tabaco es susceptible a CryI, y el gusano del capullo del
algodón y la gardama son resistentes a CryI y CryII.
La Figura 29 muestra la proteína total aislada
mediante análisis de transferencia Western de plantas del control
(fila C) y plantas transgénicas (fila B). Las filas
D-H representan concentraciones diferentes de
proteína CryIIA purificada (1-20%). La fila A
muestra patrones de proteína.
Otros insectos controlables se describen
anteriormente en la descripción de la invención.
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Apartados
1-188
1. Un vector universal de integración y de
expresión, competente para transformar de forma estable el genoma
del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un
casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una
secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula de interés, y
secuencias de control situadas en dirección 5' desde el extremo 5'
y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante,
para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el
genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada
lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son
homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto
diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, con lo que se facilita la
integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación
homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas
en el genoma del cloroplasto diana.
2. Un vector universal de integración y de
expresión, competente para transformar de forma estable el genoma
del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un
casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una
secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y
secuencias de control situadas en dirección 5' desde el extremo 5'
y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante,
para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el
genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada
lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son
homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto
diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, con lo que se facilita la
integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación
homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas
en el genoma del cloroplasto diana.
3. El vector del apartado 2, que comprende una
secuencia nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo
seleccionable.
4. El vector del apartado 3, en el que las
secuencias de flanqueo comprenden, cada una, una porción de la
región espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, con lo que se facilita, en
el genoma del cloroplasto diana, la recombinación homóloga doble con
la región espaciadora 2 conservada.
5. El vector del apartado 4, en el que las
secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la porción
de la región espaciadora, parte o todos los genes de ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala}, respectivamente.
6. El vector del apartado 5, en el que las
secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la porción
de la región espaciadora, parte o todas las secuencias de genes de
ARNr 16S y/o 23S.
7. El vector del apartado 4, en el que la región
espaciadora está localizada en una repetición invertida del genoma
del cloroplasto.
8. El vector del apartado 5, en el que la región
espaciadora está localizada en una repetición invertida del genoma
del cloroplasto.
9. El vector del apartado 6, en el que la región
espaciadora está localizada en una repetición invertida del genoma
del cloroplasto.
10. El vector del apartado 4, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
11. El vector del apartado 5, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
12. El vector del apartado 6, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
13. El vector del apartado 7, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
14. El vector del apartado 8, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
15. El vector del apartado 9, que comprende, en
la región espaciadora, un origen de la replicación del cloroplasto,
con lo que se promueve la homoplasmia con el genoma.
16. El vector del apartado 4, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
17. El vector del apartado 5, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
18. El vector del apartado 6, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
19. El vector del apartado 7, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
20. El vector del apartado 8, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
21. El vector del apartado 9, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
22. El vector del apartado 10, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
23. El vector del apartado 11, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
24. El vector del apartado 12, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
25. El vector del apartado 13, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
26. El vector del apartado 14, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
27. El vector del apartado 15, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie
vegetal distinta de la planta diana.
28. El vector del apartado 13, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una planta
distinta de la planta diana procedente de la misma especie vegetal
que la especie vegetal diana.
29. El vector del apartado 14, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una planta
distinta de la planta diana procedente de la misma especie vegetal
que la especie vegetal diana.
30. El vector del apartado 15, en el que el ADN
de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una planta
distinta de la planta diana procedente de la misma especie vegetal
que la especie vegetal diana.
31. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 4, o la progenie de la misma.
32. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 5, o la progenie de la misma.
33. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 6, o la progenie de la misma.
34. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 7, o la progenie de la misma.
35. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 8, o la progenie de la misma.
36. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 9, o la progenie de la misma.
37. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 10, o la progenie de la misma.
38. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 11, o la progenie de la misma.
39. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 12, o la progenie de la misma.
40. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 25, o la progenie de la misma.
41. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 26, o la progenie de la misma.
42. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 27, o la progenie de la misma.
43. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 28, o la progenie de la misma.
44. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 29, o la progenie de la misma.
45. Una planta transformada de forma estable,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con el
vector del apartado 30, o la progenie de la misma.
46. La planta transformada de forma estable del
apartado 31, que es una planta solanácea.
47. La planta transformada de forma estable del
apartado 32, que es una planta solanácea.
48. La planta transformada de forma estable del
apartado 33, que es una planta solanácea.
49. La planta transformada de forma estable del
apartado 40, que es una planta solanácea.
50. La planta transformada de forma estable del
apartado 41, que es una planta solanácea.
51. La planta transformada de forma estable del
apartado 42, que es una planta solanácea.
52. La planta transformada de forma estable del
apartado 31, que es monocotiledónea.
53. La planta transformada de forma estable del
apartado 32, que es monocotiledónea.
54. La planta transformada de forma estable del
apartado 33, que es monocotiledónea.
55. La planta transformada de forma estable del
apartado 31, que es dicotiledónea.
56. La planta transformada de forma estable del
apartado 32, que es dicotiledónea.
57. La planta transformada de forma estable del
apartado 33, que es dicotiledónea.
58. La planta transformada de forma estable del
apartado 34, que es monocotiledónea.
59. La planta transformada de forma estable del
apartado 35, que es monocotiledónea.
60. La planta transformada de forma estable del
apartado 36, que es monocotiledónea.
61. La planta transformada de forma estable del
apartado 34, que es dicotiledónea.
62. La planta transformada de forma estable del
apartado 35, que es dicotiledónea.
63. La planta transformada de forma estable del
apartado 36, que es dicotiledónea.
64. La planta transformada de forma estable del
apartado 37, que es monocotiledónea.
65. La planta transformada de forma estable del
apartado 38, que es monocotiledónea.
66. La planta transformada de forma estable del
apartado 39, que es monocotiledónea.
67. La planta transformada de forma estable del
apartado 37, que es dicotiledónea.
68. La planta transformada de forma estable del
apartado 38, que es dicotiledónea.
69. La planta transformada de forma estable del
apartado 39, que es dicotiledónea.
70. La planta transformada de forma estable del
apartado 40, que es monocotiledónea.
71. La planta transformada de forma estable del
apartado 41, que es monocotiledónea.
72. La planta transformada de forma estable del
apartado 42, que es monocotiledónea.
73. La planta transformada de forma estable del
apartado 64, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
74. La planta transformada de forma estable del
apartado 65, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
75. La planta transformada de forma estable del
apartado 66, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
76. La planta transformada de forma estable del
apartado 67, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
77. La planta transformada de forma estable del
apartado 68, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
78. La planta transformada de forma estable del
apartado 69, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
79. La planta transformada de forma estable del
apartado 70, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
80. La planta transformada de forma estable del
apartado 71, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
81. La planta transformada de forma estable del
apartado 72, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
82. La planta transformada de forma estable del
apartado 67, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
83. La planta transformada de forma estable del
apartado 68, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
\newpage
84. La planta transformada de forma estable del
apartado 69, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
85. Un procedimiento para transformar de forma
estable una especie vegetal diana, que comprende introducir un
vector universal de integración y de expresión en el genoma del
cloroplasto de la planta diana, y permitir que la planta
transformada crezca, siendo el vector competente para transformar de
forma estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales, y
comprendiendo un casete de expresión que comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula
de interés, y secuencias de control situadas en dirección 5' desde
el extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia
codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el cloroplasto de la planta diana, una secuencia
heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable, y, flanqueando
cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo
que comprenden, cada una, una porción de la región espaciadora 2
intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma
del cloroplasto, que son homólogas con una secuencia espaciadora del
genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el
genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, con lo que
se facilita la integración estable de la secuencia codificante
heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante
la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las
secuencias homólogas, en el genoma del cloroplasto diana.
86. Un procedimiento para transformar de forma
estable una especie vegetal diana, que comprende introducir un
vector universal de integración y de expresión en el genoma del
cloroplasto de la especie vegetal diana, y permitir que la planta
transformada crezca, siendo el vector competente para transformar de
forma estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales, y
comprendiendo un casete de expresión que comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de
interés, y secuencias de control situadas en dirección 5' desde el
extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia
codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el cloroplasto de la planta diana, una secuencia
nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de
flanqueo que comprenden, cada una, una porción de la región
espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, que son homólogas con una
secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia
la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes
especies vegetales, con lo que se facilita la integración estable de
la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto de
la planta diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias
de flanqueo con las secuencias homólogas, en el genoma del
cloroplasto diana.
87. El procedimiento del apartado 86, en el que
la planta transformada es heteroplásmica.
88. El procedimiento del apartado 86, en el que
la planta transformada es homoplásmica.
89. El procedimiento del apartado 88, en el que
la planta transformada es una planta de primera generación.
90. El procedimiento del apartado 86, en el que
la planta diana es una planta solanácea.
91. El procedimiento del apartado 86, en el que
la planta transformada es monocotiledónea.
92. El procedimiento del apartado 86, en el que
la planta transformada es monocotiledónea.
93. El procedimiento del apartado 91, en el que
la planta transformada es una de las siguientes plantas
monocotiledóneas: maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
94. El procedimiento del apartado 92, en el que
la planta transformada es una de las siguientes plantas
dicotiledóneas: haba de soja, cacahuete, uva, boniato, guisante,
cánola, tabaco, tomate o algodón.
95. El procedimiento del apartado 86, que
comprende aislar el péptido de interés.
96. El procedimiento del apartado 86, en el que
el péptido de interés es un polipéptido.
97. El procedimiento del apartado 96, en el que
el polipéptido es un polímero sintético a base de proteína
(PBP).
98. El procedimiento del apartado 97, en el que
el PBP tiene secuencias pentámeras que se repiten
(GVGVP)_{n}, en las que "n" es un número entero de 1
a 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es
prolina.
99. El procedimiento del apartado 98, en el que
"n" es 121.
100. El procedimiento del apartado 96, en el que
el polipéptido expresado de interés es insulina.
101. El procedimiento del apartado 100, que
comprende aislar la insulina.
102. El procedimiento del apartado 100, en el
que la insulina está en forma de proinsulina.
103. El procedimiento del apartado 102, en el
que la proinsulina está fusionada con un PSP.
104. El procedimiento del apartado 100, en el
que la planta transformada es tabaco.
105. El procedimiento del apartado 96, en el que
el polipéptido de interés es seroalbúmina humana (HSA).
106. El procedimiento del apartado 105, en el
que la planta transformada es tabaco.
107. El vector del apartado 4, en el que el
péptido de interés es una molécula biológicamente activa.
108. El vector del apartado 107, en el que el
péptido es un polipéptido que es un polímero sintético a base de
proteína (PBP).
109. El vector del apartado 108, en el que el
PBP tiene secuencias pentámeras que se repiten (GVGVP)_{n},
en las que "n" es un número entero de 1 a 250, "G" es
glicina, "V" es valina y "P" es prolina.
110. El vector del apartado 109, en el que el
polipéptido es (GVGVP)_{n}, en la que el número entero
"n" es 121.
111. El vector del apartado 108, en el que el
PBP está fusionado a una molécula biológicamente activa.
112. El vector del apartado 111, en el que la
molécula biológicamente activa es insulina.
113. El vector del apartado 112, en el que la
insulina está en forma de proinsulina.
114. El polipéptido obtenido mediante el
procedimiento del apartado 96.
115. El PBP obtenido mediante el procedimiento
del apartado 97.
116. La proinsulina obtenida mediante el
procedimiento del apartado 102.
117. La HSA obtenida mediante el procedimiento
del apartado 105.
118. Una planta transformada de forma estable,
que comprende un genoma de cloroplasto transformado de forma
estable con el vector del apartado 107, que comprende una molécula
biológicamente activa.
119. La planta cosechada del apartado 118.
120. La molécula biológicamente activa aislada
de la planta del apartado 118.
121. La molécula biológicamente activa del
apartado 120, que es insulina.
122. La planta transformada de forma estable del
apartado 118, que es tabaco.
123. Una especie vegetal diana, resistente a
herbicidas, transformada de forma estable, o la progenie de la
misma, que comprende cloroplasto transformado de forma estable con
un vector universal de integración y de expresión, competente para
la transformación estable del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, que comprende un casete de expresión el cual comprende
una proteína heteróloga de interés expresada mediante una secuencia
de ADN heteróloga en el genoma del cloroplasto de la especie vegetal
diana, un fenotipo seleccionado distinto de la tolerancia a dicho
herbicida, y, flanqueando cada lado del casete de expresión,
secuencias de ADN de flanqueo que comprenden, cada una, una porción
de la región espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile}
y ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, que son homólogas con una
secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia
la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes
especies vegetales, con lo que se facilita la integración estable de
la proteína heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta
diana mediante la recombinación homóloga de las secuencias de
flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto
diana.
124. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 123, en la que la proteína de interés es una forma mutante
de una enzima que tiene una afinidad por el herbicida menor que la
que tiene la enzima de origen natural.
125. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 123, en el que el herbicida es glifosato.
126. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 125, en la que la enzima es EPSP cintaza.
127. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 124, en el que el herbicida se selecciona de al menos uno
de los siguientes tipos: de tipo PSI, PSII, APP, análogo de la
auxina, mitótico, ácidos aminometilfosfóricos terciarios, y de los
tipos inhibidores de ALS.
128. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida es del tipo PSI seleccionado
de paracuat y dicuat.
\newpage
129. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida se selecciona de atrazina,
dinoseb, lenacilo y metribuzina.
130. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida es del tipo APP seleccionado
de ciclohexanodiona, haloxifop, cletodim, y fenoxaprop, y sus
moléculas sustituidas con alquilos inferiores.
131. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida es un análogo de la auxina
seleccionado de MCPA y 2,4-D.
132. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida es un herbicida de tipo
mitótico, que es dinitroanilina.
133. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 124, en la que el herbicida es un tipo de ácido
aminometilfosfórico terciario, que es glifosato.
134. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida es un tipo inhibidor de ALS,
seleccionado de sulfonilureas e imidazolinas.
135. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, en la que el herbicida se selecciona de bromoxinilo,
metilsulfurón, clorsulfurón, fosfinotricina e imazapir.
136. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 123, en la que el fenotipo expresado es resistencia a
antibióticos.
137. La planta resistente a herbicidas del
apartado 123, en la que el fenotipo seleccionable está codificado
por el gen de higromicina que confiere resistencia a herbicidas.
138. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 127, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena,
trigo, haba de soja, cacahuete, uva, boniato, guisante, cánola,
tabaco, tomate o algodón.
139. La planta diana resistente a herbicidas del
apartado 138, que es una planta homoplásmica.
140. Un procedimiento para conferir resistencia
a herbicidas a una especie vegetal diana, que comprende introducir
en la planta un vector universal de integración y de expresión,
competente para transformar de forma estable el cloroplasto de
diferentes especies vegetales, vector el cual comprende un casete de
expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN
heteróloga que codifica una proteína de interés que confiere
resistencia a un herbicida, y secuencias de control situadas en
dirección 5' desde el extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo
3' de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la
secuencia codificante en el cloroplasto de la planta diana, una
secuencia nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo
seleccionable distinto de la tolerancia a dicho herbicida, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de
flanqueo que comprenden, cada una, una porción de la región
espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, las cuales son homólogas
con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana,
secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, con lo que se facilita la
integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación
homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas
en el genoma del cloroplasto diana; y hacer crecer a la planta
transformada.
141. El procedimiento del apartado 140, en el
que la secuencia de ADN codifica una forma mutante de una enzima
que tiene una afinidad por el herbicida menor que la que tiene la
enzima de origen natural.
142. El procedimiento del apartado 141, en el
que la enzima es EPSP sintasa, y el herbicida es glifosato.
143. El procedimiento del apartado 142, en el
que la secuencia de ADN es el gen de EPSP sintasa, que es un gen de
EPSP sintasa mutante.
144. El procedimiento del apartado 140, que
comprende seleccionar las plantas diana transformadas, viables, de
un medio que es letal para las plantas no transformadas.
145. El procedimiento del apartado 144, en el
que las plantas diana transformadas viables son plantas
homoplásmicas.
146. El procedimiento del apartado 144, en el
que las plantas diana transformadas viables son plantas
heteroplásmicas.
147. El procedimiento del apartado 140, en el
que la planta diana resistente a herbicidas es tabaco, la secuencia
nucleotídica codifica un fenotipo seleccionable que es letal para el
tabaco, o un rasgo visual que permite seleccionar las plantas de
tabaco transformadas de las plantas no transformadas.
148. El procedimiento del apartado 147, en el
que el fenotipo seleccionable letal es higromicina, a la que el
tabaco no es resistente de forma natural.
149. El procedimiento del apartado 147, en el
que el rasgo visual es la expresión de un color.
150. El procedimiento del apartado 140, para
transformar de forma estable el fenotipo de una especie vegetal
diana, con lo que la planta transformada crecida expresa el fenotipo
seleccionable y otro rasgo, además de la expresión de ese
fenotipo.
151. El procedimiento del apartado 150, en el
que el fenotipo seleccionado se confiere mediante expresión del gen
de la higromicina \beta-fosfotransferasa, y el
rasgo adicional que se confiere es la resistencia al herbicida
glifosato.
152. Un procedimiento para determinar la
transformación del cloroplasto y la expresión de un rasgo diana en
base a la adquisición por la especie vegetal diana de resistencia a
un herbicida seleccionado debido a la transformación de la especie
vegetal, que comprende introducir en la planta un vector universal
de integración y de expresión, competente para transformar de forma
estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales, que
comprende un casete de expresión el cual comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica el rasgo diana
deseado, y secuencias de control situadas en dirección 5' desde el
extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia
codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el cloroplasto de una planta diana, una secuencia
nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de
flanqueo que comprenden, cada una, una porción de la región
espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, que son homólogas con una
secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia
la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes
especies vegetales, con lo cual se facilita la integración estable
de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto
de la planta diana mediante recombinación homóloga de las
secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma
del cloroplasto diana; exponer a las plantas, en las que se ha
introducido el vector, a una concentración letal del herbicida; y
seleccionar las plantas que no mueren frente a su exposición,
seleccionándose de ese modo a las plantas transformadas que
expresan el rasgo diana deseado.
153. El procedimiento del apartado 152, en el
que el herbicida seleccionado se selecciona de al menos uno de los
siguientes tipos: de tipo PSI, PSII, APP, análogo de la auxina,
mitótico, ácidos aminometilfosfóricos terciarios, y de los tipos
inhibidores de ALS.
154. Una especie vegetal diana establemente
transformada, resistente a insectos, o la progenie de la misma, que
comprende genoma de cloroplasto transformado de forma estable con un
vector universal de integración y de expresión, competente para la
transformación estable del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, que comprende un casete de expresión el cual comprende
una secuencia de ADN heteróloga que expresa una proteína diana que
confiere resistencia a un insecto diana en el genoma del cloroplasto
de la especie vegetal diana, un fenotipo seleccionado distinto de
la tolerancia al insecto diana, y, flanqueando cada lado del casete
de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que comprenden, cada
una, una porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los
genes ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, las
cuales son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del
cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del
cloroplasto de diferentes especies vegetales, con lo que se facilita
la integración estable de la proteína heteróloga en el genoma del
cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de
las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el
genoma del cloroplasto diana, en la que la proteína heteróloga es
la toxina de la proteína CryIIA expresada por el gen cryIIA,
proteína la cual confiere resistencia a insectos.
155. La especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, del apartado 154, en la que
el insecto es susceptible a la toxina de Bt.
156. La especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, del apartado 154, en la que
se supera la falta de susceptibilidad del insecto a la toxina de
Bt.
157. La especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, del apartado 155, en la que
la planta diana es tabaco, y el insecto es el cogollero del
tabaco.
158. La especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, del apartado 156, en la que
la planta diana es tabaco, algodón o remolacha, y el insecto es un
gusano del capullo del algodón o una gardama, de tipo resistente a
la toxina de Bt.
159. La especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, del apartado 156, en la que
el insecto es el cogollero del tabaco, el gusano del capullo del
algodón, o gardama.
160. Un vector seleccionado de los siguientes:
pSBL-RD-EPSPS,
pSBL-CG-EG121,
pSBL-Ct-Borde,
pSBL-Ct-V1,
pSBL-Ct-V2,
pSBL-Ct-V3,
pSBL-Ct-VH,
pSBL-Ct-VHF, y
pSBL-Ct-VHBt.
161. El vector del apartado 160, que es un
vector universal de integración y expresión que es
pSBL-RD-EPSPS,
pSBL-CG-EG121,
pSBL-CtV1, pSBL-CtV2,
pSBL-CtV3, pSBL-CtVH,
pSBL-Ct-VHF, y
pSBL-Ct-VHBt.
162. Una secuencia de ADN aislada, que comprende
la secuencia de ADN intergénica entre los genes de ADNr 16S y 23S
del genoma del cloroplasto de la planta, secuencia intergénica la
cual se conserva enormemente en una multiplicidad de diferentes
especies de plantas.
163. La secuencia de ADN aislada del apartado
162, que comprende la región espaciadora 2 que es la secuencia
intergénica de ADN entre los genes de trnI y trnA del genoma del
cloroplasto de la planta.
164. La secuencia intergénica de ADN aislada del
apartado 163, que comprende los genes de trnI y trnA.
165. La secuencia de ADN aislada del apartado
163, que comprende una de las repeticiones invertidas del genoma
del cloroplasto de la planta.
166. La secuencia de ADN aislada del apartado
165, que comprende un origen de la replicación.
167. La secuencia de ADN aislada del apartado
163, que comprende el operón de ARNr en la región espaciadora
2.
168. El vector universal de integración y de
expresión del apartado 4, en el que la región espaciadora 2
comprende el operón de ARNr.
169. El vector universal de integración y de
expresión del apartado 4, en el que las secuencias de flanqueo son
sintéticas.
170. La especie vegetal diana resistente a
herbicidas del apartado 85, en la que la secuencia de ADN, que
codifica la proteína de interés, es de origen procariota.
171. El vector universal de integración y de
expresión del apartado 2, que no incluye un transposón.
172. La especie vegetal diana transformada de
forma estable del apartado 41, que no incluye un transposón.
173. El procedimiento para transformar de forma
estable una especie vegetal diana del apartado 86, en el que el
vector universal no incluye un transposón.
174. El vector universal de integración y de
expresión del apartado 4, que comprende un promotor funcional en el
cloroplasto.
175. El vector universal de integración y de
expresión del apartado 4, que comprende una secuencia nucleotídica
que codifica un fenotipo seleccionable que permite la identificación
y selección de plantas transformadas, viables, de plantas no
transformadas, no viables.
176. El procedimiento del apartado 86, que
comprende seleccionar, de un medio que es letal para las plantas no
transformadas, la planta diana transformada viable.
177. La planta diana establemente transformada,
tolerante a herbicidas, o la progenie de la misma del apartado 123,
que permite la identificación y selección de las plantas
transformadas, viables, frente a las plantas no transformadas, no
viables.
178. El procedimiento del apartado 140, que
comprende seleccionar, de un medio que es letal para las plantas no
transformadas, la planta diana transformada viable.
179. Un casete de expresión competente para
transformar de forma estable genoma del cloroplasto de una planta
diana, que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN
heteróloga que codifica una molécula de interés, secuencias de
control para proporcionar la expresión de la secuencia codificante
en el genoma del cloroplasto de la planta diana, y, flanqueando
cada lado del casete, secuencias de ADN de la planta para facilitar
la integración estable del ADN con el genoma del cloroplasto diana
mediante recombinación homóloga, con lo que el ADN se integra de
forma estable en él, y se hereda a través de la replicación de los
orgánulos en las células hijas.
180. El casete de expresión del apartado 175, en
el que la secuencia de ADN heteróloga es una secuencia sintética
que codifica un polímero a base de proteína (PBP).
181. El casete de expresión del apartado 176, en
el que el PBP tiene secuencias pentámeras que se repiten
(GVGVP)_{n}, en las que "n" es un número entero de 1 a 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolina.
(GVGVP)_{n}, en las que "n" es un número entero de 1 a 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolina.
182. El casete de expresión del apartado 177, en
el que la secuencia codificante sintética es el gen biopolímero
sintético EG121, y el PBP expresado es la proteína polímera
(GVGVP)_{121}.
183. Un genoma de cloroplasto de una planta
diana, transformado de forma estable, activo en la transcripción y
en la traducción, el cual es competente para la integración estable
de una secuencia de ADN heterologa, que comprende un casete de
expresión que comprende una molécula heteróloga de interés
codificada por una secuencia de ADN heteróloga y expresada por
secuencias de control en el genoma del cloroplasto de la planta
diana, y ADN de la planta que flanquea cada lado del casete de
expresión lo que facilitó la integración estable del ADN en el
genoma del cloroplasto diana mediante recombinación homóloga, ADN el
cual se hereda a través de la replicación de orgánulos en células
hijas.
184. El cloroplasto transformado de forma
estable del apartado 179, en el que la molécula de interés es un
polímero a base de proteína (PBP).
185. El cloroplasto transformado de forma
estable del apartado 180, en el que el PBP tiene secuencias
pentámeras que se repiten (GVGVP)_{n}, en las que "n"
es un número entero de 1 a 250, "G" es glicina, "V" es
valina y "P" es prolina.
186. El cloroplasto transformado de forma
estable del apartado 181, en el que la secuencia codificante
sintética es el gen biopolímero sintético EG121, y el PBP expresado
es la proteína polímera (GVGVP)_{121}.
187. El biopolímero sintético
(GVGVP)_{n} que se expresa a partir del cloroplasto
transformado de forma estable del apartado 182, en el que "n",
"G", "V" y "P" son como se definen aquí.
188. El biopolímero sintético del apartado 183,
que es (GVGVP)_{121}.
Claims (45)
1. Un vector universal de integración y de
expresión, competente para transformar de forma estable el genoma
del cloroplasto de diferentes especies vegetales, que comprende un
casete de expresión que comprende, operablemente unidas, una
secuencia de ADN heteróloga que codifica un péptido de interés, y
secuencias de control situadas en dirección 5' desde el extremo 5'
y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante,
para proporcionar la expresión de la secuencia codificante en el
genoma del cloroplasto de una planta diana, y, flanqueando cada
lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son
homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto
diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en
una región espaciadora transcripcionalmente activa entre los dos
genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita
la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación
homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas
en el genoma del cloroplasto diana; en el que el vector puede
transformar maíz y tabaco.
2. El vector de la reivindicación 1, que
comprende una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica un
fenotipo seleccionable.
3. El vector de la reivindicación 2, en el que
las secuencias de flanqueo comprenden, cada una, una porción de la
región espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, con lo que se facilita en
el genoma del cloroplasto diana la recombinación homóloga doble con
la región espaciadora 2 conservada.
4. El vector de la reivindicación 3, en el que
las secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la
porción de la región espaciadora, parte o todos los genes de
ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala}, respectivamente.
5. El vector de la reivindicación 4, en el que
las secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la
porción de la región espaciadora, parte o todas las secuencias de
genes de ARNr 16S y/o 23S.
6. El vector de la reivindicación 3, en el que
la región espaciadora está localizada en una repetición invertida
del genoma del cloroplasto.
7. El vector de la reivindicación 3, en el que
el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una
especie vegetal distinta de la planta diana.
8. Una planta o célula vegetal transformada de
forma estable, o la progenie de la misma, que comprende cloroplasto
transformado de forma estable con el vector de la reivindicación
3.
9. La planta transformada de forma estable de la
reivindicación 8, que es monocotiledónea.
10. La planta transformada de forma estable de
la reivindicación 8, que es dicotiledónea.
11. La planta transformada de forma estable de
la reivindicación 9, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada,
avena o trigo.
12. La planta transformada de forma estable de
la reivindicación 10, que es haba de soja, cacahuete, uva, patata,
boniato, guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
13. Un procedimiento para transformar de forma
estable una especie vegetal diana, que comprende introducir un
vector universal de integración y de expresión en el genoma del
cloroplasto de la especie vegetal diana, y permitir que la planta
transformada crezca, siendo el vector competente para transformar de
forma estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales, y
comprendiendo un casete de expresión que comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula de
interés, y secuencias de control situadas en dirección 5' desde el
extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia
codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el cloroplasto de la planta diana, una secuencia
heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable, y, flanqueando
cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo
que comprenden, cada una, una porción de la región espaciadora 2
intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma
del cloroplasto, que son homólogas con una secuencia espaciadora
del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en
el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, con lo
que se facilita la integración estable de la secuencia codificante
heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante
la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las
secuencias homólogas, en el genoma del cloroplasto diana.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la planta transformada es monocotiledónea.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la planta transformada es dicotiledónea.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que la planta transformada es una de las siguientes plantas
monocotiledóneas: maíz, arroz, hierba, centeno, cebada, avena o
trigo.
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que la planta transformada es una de las siguientes plantas
dicotiledóneas: haba de soja, cacahuete, uva, boniato, guisante,
cánola, tabaco, tomate o algodón.
18. El procedimiento de la reivindicación 13,
que comprende además aislar el péptido de interés.
19. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el péptido de interés es un polímero sintético a base de
proteína (PBP).
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que el PBP tiene secuencias pentámeras que se repiten (GVGVP),
en las que "n" es un número entero de 1 a 250, "G" es
glicina, "V" es valina y "P" es prolina.
21. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el péptido de interés es insulina.
22. El procedimiento de la reivindicación 21,
que comprende aislar la insulina.
23. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que la insulina está en forma de proinsulina.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en
el que la proinsulina está fusionada con un PSP.
25. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que la planta transformada es tabaco.
26. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que el péptido de interés es seroalbúmina humana (HSA).
27. El procedimiento de la reivindicación 26, en
el que la planta transformada es tabaco.
28. El vector de la reivindicación 3, en el que
el péptido de interés es una molécula biológicamente activa.
29. Una planta o célula transformada de forma
estable, que comprende un genoma de cloroplasto transformado de
forma estable con el vector de la reivindicación 28, que comprende
una molécula biológicamente activa.
30. Una célula vegetal diana, resistente a
herbicidas, transformada de forma estable, o la progenie de la
misma, que comprende cloroplasto transformado de forma estable con
un vector universal de integración y de expresión, competente para
la transformación estable del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, que comprende un casete de expresión el cual codifica
una proteína heteróloga de interés, que confiere resistencia a
herbicidas, expresada mediante una secuencia de ADN heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la especie vegetal diana, un fenotipo
seleccionado distinto de la tolerancia a dicho herbicida, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de
flanqueo que comprenden, cada una, una porción de la región
espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto diana, que son homólogas
con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana,
secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, con lo que se facilita la integración
estable de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del
cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga
de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el
genoma del cloroplasto diana.
31. La planta diana resistente a herbicidas de
la reivindicación 30, en la que el herbicida es glifosato.
32. La planta diana resistente a herbicidas de
la reivindicación 30, que es maíz, arroz, hierba, centeno, cebada,
avena, trigo, haba de soja, cacahuete, uva, patata, boniato,
guisante, cánola, tabaco, tomate o algodón.
33. Un procedimiento para conferir resistencia a
herbicidas a una especie vegetal diana, que comprende introducir en
la planta un vector universal de integración y de expresión,
competente para transformar de forma estable con un vector
universal de integración y de expresión, competente para transformar
de forma estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales,
vector el cual comprende un casete de expresión que comprende,
operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica
una proteína de interés que confiere resistencia a un herbicida, y
secuencias de control situadas en dirección 5' desde el extremo 5' y
en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante en
el cloroplasto de la planta diana, una secuencia nucleotídica
heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable distinto de la
tolerancia a dicho herbicida, y, flanqueando cada lado del casete
de expresión, secuencias de flanqueo que comprenden, cada una, una
porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los genes
ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto diana, las
cuales son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del
cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del
cloroplasto de diferentes especies vegetales, con lo que se facilita
la integración estable de la secuencia codificante heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación
homóloga de las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas
en el genoma del cloroplasto diana; y hacer crecer la planta
transformada.
34. El procedimiento de la reivindicación 33, en
el que la secuencia de ADN codifica una forma mutante de una enzima
que tiene una afinidad por el herbicida menor que la que tiene la
enzima de origen natural.
35. El procedimiento de la reivindicación 34, en
el que la enzima es EPSP sintasa, y el herbicida es glifosato.
36. El procedimiento de la reivindicación 33,
para transformar de forma estable el fenotipo de una especie
vegetal diana, con lo que la planta transformada crecida expresa el
fenotipo seleccionable y otro rasgo, además de la expresión de ese
fenotipo.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que el fenotipo seleccionado se confiere mediante expresión del
gen de la higromicina \beta-fosfotransferasa, y el
rasgo adicional que se confiere es la resistencia al herbicida
glifosato.
38. Un procedimiento para determinar la
transformación del cloroplasto y la expresión de un rasgo diana en
base a la adquisición por la especie vegetal diana de resistencia a
un herbicida seleccionado debido a la transformación de la especie
vegetal, que comprende introducir en la planta un vector universal
de integración y de expresión, competente para transformar de forma
estable el cloroplasto de diferentes especies vegetales, que
comprende un casete de expresión el cual comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica el rasgo diana
deseado, y secuencias de control situadas en dirección 5' desde el
extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo 3' de la secuencia
codificante, para proporcionar la expresión de la secuencia
codificante en el cloroplasto de una planta diana, una secuencia
nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de
flanqueo que comprenden, cada una, una porción de la región
espaciadora 2 intergénica entre los genes ARNt^{Ile} y
ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, que son homólogas con una
secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia
la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes
especies vegetales, con lo cual se facilita la integración estable
de la secuencia codificante heteróloga en el genoma del cloroplasto
de la planta diana mediante recombinación homóloga de las
secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma
del cloroplasto diana; exponer a las plantas, en las que se ha
introducido el vector, a una concentración letal del herbicida; y
seleccionar las plantas que no mueren frente a su exposición,
seleccionándose de ese modo a las plantas transformadas que
expresan el rasgo diana deseado.
39. Una especie vegetal diana establemente
transformada, resistente a insectos, o la progenie de la misma, que
comprende genoma de cloroplasto transformado de forma estable con un
vector universal de integración y de expresión, competente para la
transformación estable del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, que comprende un casete de expresión el cual comprende
una secuencia de ADN heteróloga que expresa una proteína diana que
confiere resistencia a un insecto diana en el genoma del cloroplasto
de la especie vegetal diana, un fenotipo seleccionado distinto de
la tolerancia al insecto diana, y, flanqueando cada lado del casete
de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que comprenden, cada
una, una porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los
genes ARNt^{Ile} y ARNt^{Ala} del genoma del cloroplasto, las
cuales son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del
cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del
cloroplasto de diferentes especies vegetales, con lo que se facilita
la integración estable de la proteína heteróloga en el genoma del
cloroplasto de la planta diana mediante la recombinación homóloga de
las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el
genoma del cloroplasto diana; en la que la proteína heteróloga es
la toxina de la proteína CryIIA expresada por el gen cryIIA,
proteína la cual confiere resistencia a insectos.
40. Un genoma de cloroplasto de una planta
diana, transformado de forma estable, activo en la transcripción y
en la traducción, genoma del cloroplasto el cual se ha transformado
con el vector de la reivindicación 1.
41. Un procedimiento para transformar de forma
estable una especie vegetal diana, que comprende introducir el
vector universal de integración y de expresión de la reivindicación
1 en el genoma del cloroplasto de la especie vegetal diana, y
permitir que la planta transformada crezca.
42. Una especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a herbicidas, o la progenie de la misma,
que comprende cloroplasto transformado de forma estable con un
vector universal de integración y de expresión, competente para la
transformación estable del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, que comprende un casete de expresión el cual codifica
una proteína heteróloga de interés, que confiere resistencia a
herbicida, expresada mediante una secuencia de ADN heteróloga en el
genoma del cloroplasto de la especie vegetal diana, un fenotipo
seleccionado distinto de la tolerancia a dicho herbicida, y,
flanqueando cada lado del casete de expresión, secuencias de ADN de
flanqueo que son homólogas con una secuencia espaciadora del genoma
del cloroplasto diana, secuencia la cual se conserva en el genoma
del cloroplasto de diferentes especies vegetales, y secuencia la
cual se inserta en una región espaciadora transcripcionalmente
activa en el genoma del cloroplasto que está entre dos genes
localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se facilita la
integración estable de la proteína heteróloga en el genoma del
cloroplasto de la planta diana mediante recombinación homóloga de
las secuencias de flanqueo con las secuencias homólogas en el genoma
del cloroplasto diana; en el que el vector puede transformar maíz y
tabaco.
43. Un procedimiento para conferir resistencia a
herbicidas a una especie vegetal diana, el cual comprende
introducir en la planta un vector universal de integración y de
expresión para transformar de forma estable el genoma del
cloroplasto de diferentes especies vegetales, vector el cual
comprende un casete de expresión que comprende, operablemente
unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una proteína de
interés que confiere resistencia a un herbicida, y secuencias de
control situadas en dirección 5' desde el extremo 5' y en dirección
3' desde el extremo 3' de la secuencia codificante en el cloroplasto
de la planta diana, una secuencia nucleotídica heteróloga que
codifica un fenotipo seleccionable distinto de la tolerancia a dicho
herbicida, y, flanqueando cada lado del casete de expresión,
secuencias de flanqueo, que son homólogas con una secuencia
espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se
conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora
transcripcionalmente activa en el genoma del cloroplasto que está
entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se
facilita la integración estable de la secuencia codificante
heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante
recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con las
secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana, y hacer
crecer a la planta transformada; en el que el vector puede
transformar maíz y tabaco.
44. Un procedimiento para determinar la
transformación de cloroplastos y la expresión de un rasgo diana en
base a una adquisición de resistencia a un herbicida seleccionado
por la especie vegetal diana debido a la transformación de la
especie vegetal, que comprende introducir en la planta un vector
universal de integración y de expresión, competente para
transformar de forma estable el cloroplasto de diferentes especies
vegetales, el cual comprende un casete de expresión que comprende,
operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica
el rasgo diana deseado, y secuencias de control situadas en
dirección 5' desde el extremo 5' y en dirección 3' desde el extremo
3' de la secuencia codificante, para proporcionar la expresión de la
secuencia codificante en el cloroplasto de una planta diana, una
secuencia nucleotídica heteróloga que codifica un fenotipo
seleccionable, y, flanqueando cada lado del casete de expresión,
secuencias de ADN de flanqueo que son homólogas con una secuencia
espaciadora del genoma del cloroplasto diana, secuencia la cual se
conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies
vegetales, y secuencia la cual se inserta en una región espaciadora
transcripcionalmente activa en el genoma del cloroplasto que está
entre dos genes localizados en la misma hebra de ADN, con lo que se
facilita la integración estable de la secuencia codificante
heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana mediante
la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo con la
secuencia homóloga en el genoma del cloroplasto diana; exponer las
plantas, en las que se ha introducido el vector, a una
concentración letal del herbicida; y seleccionar las plantas que no
mueren debido a la exposición al mismo, seleccionándose de ese modo
las plantas transformadas que expresan el rasgo diana deseado; en el
que el vector puede transformar maíz y tabaco.
45. Una especie vegetal diana, transformada de
forma estable, resistente a insectos, o la progenie de la misma,
que comprende un genoma de cloroplasto transformado de forma estable
con un vector universal de integración y de expresión, competente
para la transformación estable del cloroplasto de diferentes
especies vegetales, el cual comprende un casete de expresión que
comprende una secuencia de ADN heteróloga que expresa una proteína
diana que confiere resistencia a un insecto diana en el genoma del
cloroplasto de la especie vegetal diana, un fenotipo seleccionado
distinto de la tolerancia al insecto diana, y, flanqueando cada lado
del casete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son
homólogas con una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto
diana, secuencia la cual se conserva en el genoma del cloroplasto de
diferentes especies vegetales, y secuencia la cual se inserta en
una región espaciadora transcripcionalmente activa en el genoma del
cloroplasto que está entre dos genes localizados en la misma hebra
de ADN, con lo que se facilita la integración estable de la
proteína heteróloga en el genoma del cloroplasto de la planta diana
mediante la recombinación homóloga de las secuencias de flanqueo
con las secuencias homólogas en el genoma del cloroplasto diana, en
la que la proteína heteróloga es la toxina de la proteína CryIIA
expresada por el gen cryIIA, proteína la cual confiere resistencia
a insectos; en la que el vector puede transformar maíz y tabaco.
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