MXPA00001341A - Vectores universales de integracion y expresion del cloroplasto, plantas transformadas, y sus productos - Google Patents

Abstract

La invención proporciona vectores universales de integración y expresión del cloroplasto, los cuales son competentes para transformar e integrar de una manera estable los genes de interés en el genoma del cloroplasto de múltiples especies de plantas. Se proporcionan plantas transformadas y su progenie. Se transforman plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que nunca se han transformado hasta ahora. Las plantas transformadas con un gen sintético expresan valiosos polímeros basados en proteína biodegradable (PBPs). Las plantas transformadas producen moléculas de alto valor. Se proporciona resistencia a los cultivos agrícolas contra las principales clases de herbicidas químicos. La resistencia a herbicidas se utiliza como un marcador seleccionable letal para la transformación del cloroplasto. Las plantas transformadas son capaces de expresar, en adición al rasgo dirigido, un rasgo no dirigido secundario deseable. Se proporciona resistencia a insectos a las plantas transformadas, tanto contra insectos que son susceptibles a las toxinas de Bt como contra insectos que han desarrollado resistencia a las toxinas de Bt.

Description

VECTORES UNIVERSALES DE INTEGRACIÓN Y EXPRESIÓN DEL CLOROPLASTO. PLANTAS TRANSFORMADAS. Y SUS PRODUCTOS Esta solicitud reclama los beneficios de la solicitud • provisional pendiente con número de serie 60/055,314, presentada el 7 de agosto de 1997, la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Esta solicitud también reclama el beneficio de la solicitud provisional pendiente con número de serie 60/079,042, presentada el 23 de marzo de 1998, titulada "Vector universal de integración y • expresión del cloroplasto, plantas transformadas y productos de las mismas", la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Además, esta solicitud es una continuación parcial de la solicitud de patente pendiente con número de serie 08/591,407, presentada el 25 de enero de 1996, por Henry Daniell, que es una continuación de la solicitud con número de serie 08/215,020, presentada el 18 de marzo de 1994, ahora abandonada, la cual a su vez fue una continuación de la solicitud con número de serie 07/249,616, presentada el 26 de septiembre de 1988, ahora abandonada.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud pertenece al campo de la ingeniería genética de los genomas de plantas, particularmente la ingeniería genética del genoma de plástidos de plantas, tales como cloroplastos y a la transformación estable del genoma de cloroplasto de cualquier especie vegetal .

CASOS RELACIONADOS • 5 Esta solicitud se relaciona en particular con el vector universal de integración y expresión del cloroplasto que es competente para transformar cualquier planta con uno o más genes de interés. La solicitud de patente anterior con número de serie 08/591,407, muestra células vegetales transformadas por medio de un cásete de expresión que fl comprende una secuencia de ADN exógena la cual está integrada establemente (enlazada covalentemente) al genoma del cloroplasto de la célula de una planta objetivo. Las secuencias de ADN integradas "establemente" son aquellas que se heredan a través de la réplica del genoma o por las células u organismos hijos. Esta estabilidad es exhibida por la habilidad para establecer líneas celulares permanentes, clonas, o plantas transgénicas que comprenden una población que Jfe contiene el ADN exógeno. 20 Igualmente, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,693,507 (1997) para Daniell y McFadden describe esta integración estable por medio de un cásete de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica un rasgo deseado, y las plantas transformadas. 25 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ventajas de la transformación del cloroplasto sobre la transformación nuclear. wm La atracción de la transformación del genoma del cloroplasto sobre la transformación del genoma nuclear se atribuye a los serios riesgos resultantes del último. Una preocupación común es el escape de genes extraños a través de la dispersión del polen de las plantas de cultivos transgénicos a sus parientes hierbas malas. Se ha demostrado que el polen transgénico llevará genes extraños (transgénicos) a otras • plantas sexualmente compatibles (detectadas por la prevalencia del gen marcador en la progenie cosechada de las plantas transgénicas cultivadas en el área circundante) . Por ejemplo, la dispersión del polen desde un terreno de prueba central que contiene plantas de algodón transgénico a plantas no transgénicas circundantes se ha observado a distancias variantes en diferentes direcciones. (Lewellyn y Fitt, 1996); (Umbeck, P.F., y colaboradores, 1991). Además, las frecuencias ^ de los genes marcadores en girasoles silvestres promedió de aproximadamente 28 al 38 por ciento; en fresas silvestres que crecen en 50 metros del campo de fresas, más del 50 por ciento de las plantas silvestres contenían genes marcadores a partir de las fresas cultivadas. (King, J., 1996). El escape de genes extraños a través del polen es especialmente una preocupación ambiental seria, en el caso de genes con resistencia a herbicidas, debido a las altas tasas de flujo de genes entre los cultivos a sus parientes silvestres. La preocupación es que el escape de genes de los cultivos á—, transgénicos a sus hierbas relacionadas crea superhierbas . En el arroz ( Oryza sativa) , el flujo de genes de variedades cultivadas a los parientes silvestres se ha notado, en 0. perennis (Barret, 1983) y en arroz rojo ( 0. Sativa ; Langevin y colaboradores, 1990) . En el sur de los Estados Unidos de Norteamérica, el arroz rojo se ha vuelto una hierba importante debido a que los herbicidas que la matan también matan arroz • cultivado. Se pagan precios disminuidos por arroz cultivado contaminado con arroz rojo. Algunos investigadores han introducido el gen bar que confiere resistencia al glufosinato (Liberty) en arroz cultivado para combatir esta hierba (Oard y colaboradores, 1996; San ula y colaboradores, 1996). Sin embargo, debido a la compatibilidad sexual, la introducción de un gen expresado nuclearmente permitirá la transmisión de ese rasgo de resistencia en el arroz rojo vía el polen. 20 Similarmente, la semilla oleaginosa transgénica de colza, genéticamente traslapada para resistencia herbicida cruzada con una pariente hierba, Brassica campestris (mostaza de campo) y con resistencia herbicida conferida hasta en la generación de cruce hacia atrás bajo condiciones del campo.

(Mikkelson, T. R., y colaboradores, 1996).

La herencia materna de genes introducidos evita el escape de genes a través del polen. Los genes extraños traslapados a través de los genomas de cloroplasto (que se heredan maternalmente para la mayoría de los cultivos) es una • 5 solución a este problema. También, las enzimas objetivo o las proteínas para la mayoría de los herbicidas (por ejemplo sendas biosintéticas de aminoácido/ácido graso o fotosíntesis) se parcializan dentro del cloroplasto. Otra ventaja importante de la transformación del cloroplasto es los altos niveles de la expresión del gen extraño debido a un número de copias muy alto m (5,000-10,000) de genomas de cloroplastos en las células de plantas . Debido a que la maquinaria de transcripción y traducción del cloroplasto es de naturaleza procariótica los genes resistentes al herbicida de origen bacteriano se pueden expresar a niveles extraordinariamente altos en los cloroplastos . Transformación del genoma del cloroplasto. Investigaciones anteriores de la transformación de fe cloroplastos se enfocaron en el desarrollo de sistemas en organelo que usan cloroplastos intactos capaces de transcripción y traducción eficiente y prolongada (Daniell y Rebeiz, 1982; Daniell y colaboradores, 1983) y la expresión de genes extraños en cloroplastos aislados (Daniell y McFadden, 1987) . Estos experimentos se hicieron bajo la premisa de que es posible introducir cloroplastos intactos aislados en protoplastos y regenerar las plantas transgénicas (Daniell, 1993) . El descubrimiento del cañón de genes como un dispositivo de transformación abrió la posibilidad de la transformación de plástido directa en plantas (Daniell, 1993) . 5 La expresión transitoria de genes extraños en plástidos de dicotiledóneas (Daniell y colaboradores, 1990; Ye y colaboradores, 1990) , monocotiledóneas (Daniell y colaboradores, 1991) , prolongó la expresión del gen extraño usando vectores de expresión de cloroplastos de réplica autónomamente (Daniell y colaboradores, 1990) y la integración • estable de un marcador seleccionable en el genoma de cloroplasto de tabaco (Svab y Maliga, 1993) se llevaron a cabo usando el cañón de genes. Las plantas de tabaco resistentes a ciertos insectos se obtuvieron integrando el gen crylAc en el genoma de cloroplasto de tabaco (McBride y colaboradores, 1995; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,451,513, incorporada en la presente mediante referencia) . La transformación de plástidos estables de las plantas superiores • se ha llevado a cabo tan lejos sólo en tabaco. 20 Estudios anteriores sobre el genoma del cloroplasto. Hasta la fecha, la integración estable de un gen extraño en el genoma de cloroplasto de una planta superior se ha reportado solamente en tabaco. Esto se logró con un vector que fue específico para tabaco y que se derivó del gen de cloroplasto del tabaco, esto es, el vector contenía una secuencia homologa solamente al genoma de cloroplasto del tabaco y el cual no es muy conservado en los genomas de los cloroplastos de otras plantas. Este vector no es conveniente A para transformar establemente especies vegetales distintas del 5 tabaco. El único reporte publicado de expresión de gen extraño en una especie vegetal distinta del tabaco es la de las hojas y embriones de trigo (Daniell y colaboradores, 1991) , pero la integración estable no se llevó a cabo. La integración estable de un gen extraño en el genoma de cloroplasto de una planta monocotiledónea nunca se reportó. Cuando menos en cereales ^ (monocotiledóneas) , la transformación previamente desarrollada/protocolos de regeneración pueden no ser dóciles a la transformación de plástidos debido a ineficiencias inherentes dentro de esos sistemas. También, las selecciones secuenciales/seriales (selecciones repetidas) , se consideran importantes para lograr la homoplasmia (Daniell, 1997), puede no ser factibles usando los sistemas de regeneración empleados. El desarrollo reciente de protocolos de transformación/regeneración de maíz (Rudraswamy, 1997) y arroz (no publicado) únicos tienen el potencial de exhibir eficiencias aumentadas sustancialmente y permiten más de una ronda de selección durante la regeneración. Maliga y colaboradores, en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,451,513 y Svab y colaboradores, 1990 proponen una transformación del genoma plástido de tabaco por una técnica de selección no letal que emplea el ADN del plástido que codifica un fenotipo seleccionable no letal. De acuerdo con Maliga y colaboradores, una selección no letal es É - absolutamente esencial para obtener líneas transgénicas. 5 A diferencia de la técnica de Maliga y colaboradores, el método de la invención proporciona una selección que es letal a todas las plantas no transformadas, pero para tabaco. Solamente las plantas transformadas sobreviven y continúan creciendo. Esta selección letal se lleva a cabo con virtualmente todos los antibióticos, incluyendo espectinomicina • y estreptomicina en un medio que contiene el antibiótico en una concentración de 500 - 1,000 µg/mililitro . Condiciones similares se mostraron no letales para tabaco por Maliga y colaboradores. Más aún, a diferencia de la técnica de Maliga y colaboradores, de acuerdo con la invención, la transformación a homoplasmia se puede lograr aún en la primera ronda de selección. En la Solicitud de Patente Europea número 0 251 654, f^ Cannon y colaboradores, describe la transformación de cloroplastos mediados por transposón de tabaco por ejemplo, usando el transposón bacteriano Tn5. El vector que contiene el transposón es dirigido a la región cromosomal conocida por ser una región "transcripcionalmente silenciosa" con el fin de preservar la integridad de la transcripción de los genes originales. Esta región transcripcionalmente silenciosa se identifica que está localizada entre dos promotores divergentes conocidos de genes de cloroplastos, por ejemplo, los promotores de los genes de la gran subunidad de cloroplastos de carboxilato de bifosfato de ribulosa (RbcL, "LS RuBisCo") y • 5 para ßATPasa (atpB) . Estos promotores transcriben los genes en direcciones opuestas alejadas de la región silenciosa del cromosoma. No se proporciona terminador de transcripción en el vector de expresión de Cannon y colaboradores, estas regiones terminadoras se conocen que son absolutamente esenciales para la expresión de genes en plástidos. Finalmente, no se muestra ^ transformación de cloroplastos estable que se lleva a cabo por Cannon y colaboradores . La invención descrita en la presente tienen varias características distinguidas sobre las de Cannon y colaboradores. La invención muestra la transformación estable transmisible a la progenie. La integración no se dirige a una región transcripcionalmente inactiva del cromosoma del cloroplasto. La invención integra un cásete (que contiene un ßp terminador de transcripción como se describe más adelante en la presente) en una región activa transcripcionalmente del genoma del cloroplasto. Los promotores controlan la expresión de uno o más genes. A diferencia de Cannon y colaboradores, ningún transposón está involucrado en la transformación del cloroplasto de acuerdo con la invención. 25 En NATO Asi Series, Daniell y colaboradores, 1994 reportan resistencia a insectos traslapada vía genomas de cloroplastos que muestran la expresión de la proteína CrylIA en plantas para controlar insectos. McBride y colaboradores, • 1995, y la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5 5,545,818 (1996), confirma el reporte de Daniell y colaboradores, y muestran la expresión de Bacillus thuringiensis la proteína CRYIAc en plástidos de planta. Los vectores reportados por McBride se diseñan para introducir la construcción solamente en el genoma de cloroplasto de tabaco.

La necesidad de un vector para transformar una variedad de # plantas. Es evidente del estado de la técnica que existe una importante necesidad de un vector de integración y expresión de cloroplasto para transformar, preferiblemente de manera estable, los genomas del cloroplasto y muchas especies diferentes de plantas. Este "vector universal" permitirá la transformación del genoma de cloroplasto de una planta objetivo seleccionada con una secuencia de codificación de ADN • heteróloga (extraña) y elimina la necesidad de construir vectores los cuales cada uno está específicamente adecuado a transformar el genoma de cloroplasto de la especie de planta particular la cual se va a transformar. El problema de construir este vector universal competente para transformar diferentes plantas tiene hasta lo que sabe el inventor, no se ha resuelto.

Conceptos de la técnica anterior de la región espadadora intergénica. Aunque la secuencia de nucleótidos de las regiones de {?k codificación del genoma, incluyendo el genoma del cloroplasto, frecuentemente se conservan entre las especies, en contraste las secuencias que flanquean los genes funcionales, es decir, las regiones espadadoras entre las regiones de codificación típicamente no se conservan. El dogma aceptado para la falta de conservación, y así el bajo grado de homología entre las especies de las regiones espadadoras, es que las regiones fl espadadoras típicamente no realizan funciones esenciales. Por lo tanto, hay poca, si la hay, presión selectiva para conservar la secuencia de las regiones espadadoras entre especies . La secuencia de las regiones espadadoras se puede alterar sin efectos indeseables. Stummann y colaboradores, 1988, describen el orden de los genes del operón del ARN ribosomal del genoma del cloroplasto es el mismo entre diferentes especies de plantas, <flfc incluyendo tabaco, maíz, y una hepática, Marchantía, y las secuencias de codificación de este operón son muy homologas. Stummann también describe que la homología interespecies del operón es menor que la homología interespecies de las regiones de codificación del gen. Eso es consistente con la falta de conservación de regiones espadadoras; y sugiere que la homología interespecies de las regiones espadadoras en el operón del ARN ribosomal es relativamente bajo. La invención, contrario al dogma de la falta de conservación de las regiones espadadoras, utiliza las regiones • espadadoras que están muy conservadas entre diferentes plantas para construir vectores competentes para transformar una variedad de plantas.

VISTA GENERAL DE LA INVENCIÓN La invención proporciona integración de cloroplastos universal y vectores de expresión que son competentes para • transformar e integrar establemente genes de interés en el genoma del cloroplasto de múltiples especies de plantas. Las plantas transformadas y su progenie su proporcionan. Plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas se transforman que nunca habían sido transformadas hasta la fecha. Las plantas transformadas con un gen sintético expresan polímeros basados en proteína biodegradables valiosos (PBPs) . Las plantas transformadas producen moléculas de alto valor. La resistencia se proporciona a cultivos agrícolas contra las clases principales de herbicidas químicos. La resistencia al herbicida se usa como marcador seleccionable letal para la transformación de cloroplasto. Las plantas transformadas son capaces de expresar además del rasgo objetivo, un rasgo deseable, secundario no objetivo. La resistencia a los insectos se proporciona a las plantas transformadas, tanto contra incendios que son susceptibles a toxinas Bt como contra insectos que han desarrollado una resistencia a las toxinas Bt .

• COMPENDIO DE LA INVENCIÓN 5 La región espaciadora intergénica. El concepto de la invención. Se ha descubierto contrario a la creencia convencional, que el genoma de cloroplasto (ct) de las plantas contiene regiones espadadoras con secuencias de nucleótidos muy conservadas. La naturaleza muy conservada de las • secuencias de nucleótidos de estas regiones espadadoras del genoma del cloroplasto hace estas regiones espadadoras, sea descubierto, ideal para la construcción de vectores para transformar cloroplastos de una amplia variedad de especies de vegetales, estos sin la necesidad de construir vectores individuales para diferentes plantas o especies de cultivos individuales, que requerirían primero una determinación de la secuencia del ADN de cada uno de los genomas de cloroplastos . Este hallazgo tiene numerosas consecuencias útiles e importantes aplicaciones prácticas.

Las distintas modalidades de la invención El vector universal. La invención tiene varias modalidades útiles. La 25 invención proporciona una integración universal y expresión de vector de aquí en adelante denominada "UV" y se usa para la expresión de cuando menos un fenotipo en una variedad de diferentes plantas. ? El vector universal de expresión de integración de la invención comprende un cásete de expresión (que se describirá adicionalmente más adelante) que comprende los elementos genéticos necesarios para transformar transitoriamente o preferiblemente establemente los plástidos por ejemplo, el genoma del cloroplasto de una célula de planta objetivo con un 10 ADN extraño (heterólogo" que codifica una molécula de interés, • como un fenotipo que se va a expresar por la planta o una molécula que no sea de planta y alto valor, tal como un péptido biológicamente activo (o polipéptido) . El vector universal se construye con una región activa transcripcionalmente de un 15 genoma de cloroplasto que está muy conservado en un rango amplio de genomas de cloroplastos de plantas superiores. Preferiblemente la región es la región espaciadora 2; la regi .ó A-n espaciadora intergénica entre el t-RNAHe y la regi.ó zn tRNA Ala . Esta regió--n frecuentemente se conoce en la presente como región "espaciadora" debido a que en el genoma del cloroplasto es intergénica entre varios genes en el operón del ARNr que es transcrita por un promotor. Cuando se construye el vector universal esta región generalmente se conoce en la presente como un "límite" o preferiblemente una "secuencia de flanqueo" o "secuencias de flanqueo". Esto es debido a que el vector universal, los elementos genéticos unidos operablemente para transformar establemente el plástido de la planta objetivo están flanqueados en cada lado por una secuencia es decir un • fragmento de la región espaciadora. Las secuencias de flanqueo 5 en el vector y las secuencias espadadoras en el genoma del cloroplasto tienen suficiente homología entre sí para sufrir recombinación homologa. El vector universal se inserta en el espaciador de una región transcripcionalmente activa en el genoma del cloroplasto. Generalmente, la región espaciadora se coloca en la región de repetición invertida del genoma del • cloroplasto. El resto de la construcción, es decir, distintas de las secuencias de flanqueo y del cásete de expresión, generalmente se conoce en la presente como el "vector" que comprende secuencias bacterianas, como los vectores de clonación de plásmidos pUC, pBR322, pGEM o pBluescript . El vector o cásete de expresión. El vector universal comprende un cásete de expresión que están flanqueado en cada lado por una secuencia de • flanqueo. Un cásete de expresión conveniente para su uso en la invención se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,693,507 (1997), la cual se incorpora en la presente mediante referencia. Este cásete comprende, operablemente unido, una región de iniciación de transcripción funcional en el cloroplasto de la planta, cuando menos una secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula objetivo de interés, por ejemplo, un gen (o fracción funcional del mismo) que codifica un compuesto biológicamente activo, y secuencias de control colocadas corriente arriba de los fl extremos 5' y corriente abajo del extremo 3' y una región de 5 terminación de la transcripción para proporcionar expresión de la secuencia de codificación en el genoma del cloroplasto de una planta objetivo. Preferiblemente, el cásete de expresión está flanqueado por secuencias de ADN de la planta, como secuencias de ADN del cloroplasto, con el fin de facilitar la integración estable del vector de expresión en el genoma del • cloroplasto. En la construcción del cásete de expresión, la secuencia de ADN comprende uno o más sitios de clonación para la integración del gen o los genes de interés. Las secuencias espadadoras que se han identificado en plástidos de plantas superiores se conservan oblicuamente entre una gran variedad de plantas . Esta secuencia se encontró que eran ideales para construir los vectores universales de la invención que son, como resultado, competentes para transformar • el genoma del cloroplasto de una gran variedad (o multiplicidad) de plantas objetivo mediante la recombinación homologa. Esto así es inmaterial para cuál espaciador individual de una planta particular se construye el vector universal . Como se sabe, generalmente será recomendable tener cuando menos una secuencia de nucleótido heterólogo adicional que codifica un fenotipo seleccionable, tal como un gen que proporciona resistencia al antibiótico o una porción funcional del mismo para servir como un marcador asociado con el cásete • de expresión o con el vector de expresión de integración 5 universal. Esto facilita la identificación de las células vegetales en las cuales el gen extraño se ha integrado establemente. Los genes marcadores se conocen en la literatura, por ejemplo, -lactanasa, genes resistentes a la herbicida tales como el gen mutante psipA o EPSPS-aroA, el gen cat que codifica la acetotransferasa cloranfenicol, y el gen • uidA que codifica glucuronidasa (gus) y otros. Se reconoce que el tabaco es el único que no es susceptible al efecto letal de la estreptomicina y espectinomicina. Aunque las hojas de tabaco carecen de pigmentación cuando se exponen a un medio con este antibiótico, se observa crecimiento continuado. Sin embargo, esta propiedad del tabaco fácilmente se supera. Hay numerosos antibióticos disponibles que son letales para el tabaco, tales como las • higromicina. Otro enfoque es seleccionar un gen que expresa un marcador visible como un color, fluorescencia, etcétera, como el gen reportero mGFP, que codifica una proteína verde fluorescente. Método de transformación. La invención proporciona un método de transformación que se puede producir homoplasmia (integración de genes extraños en todos los genomas de cloroplastos de la célula vegetal) después de una primera ronda de selección sin la necesidad de otro proceso de selección. El método para ¡ transformar una planta usa el vector universal construido con 5 secuencias de flanqueo de especies vegetales distintas de las especies de la planta objetivo que se va a transformar. Alternativamente, el vector puede contener secuencias de flanqueo de la misma especie de planta que la planta objetivo, incluyendo tabaco. 10 Método para construir el vector universal. y La invención además proporciona un método para construir el vector de integración y expresión del cloroplasto universal. Para este fin, la porción espaciadora del genoma del cloroplasto de cualquier planta se determina que sea muy 15 homólogo a más de una especie de plantas . Una secuencia de nucleótidos correspondiente a la región espaciadora se obtiene a partir del genoma del cloroplasto identificado (o sintetizado) y se incorpora en un vector conveniente, tal como subclonándola en un plásmido. La región espaciadora se coloca como secuencias de flanqueo al cásete de expresión que comprende elementos genéticos necesarios para la transformación del plástido y la expresión del o los genes extraños. Cualquier método de transformación del cloroplasto se puede usar. Cualquier gen (o porción funcional del mismo) que se puede utilizar para transformar un cloroplasto de planta y codifica un péptido deseado para conseguir el rasgo deseado a la planta objetivo es conveniente para la transformación con el vector universal . • Plantas transformadas. 5 La invención proporciona además plantas en las cuales el genoma del cloroplasto ha sido transformado establemente, es decir, permanentemente con el vector universal de la invención, incluyendo la progenie del mismo. La invención incluye plantas monocotiledóneas como cereales o células vegetales, tales como maíz, arroz, cebada, avena, trigo, y pastos, y su progenie en los cuales el genoma del cloroplasto se ha transformado establemente con el vector universal derivado de las mismas especies o de diferentes especies que la planta transformada. La invención proporciona plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas, establemente transformadas después de una sola ronda de selección, debido a homoplasmia lograble con el vector universal que comprende un origen de réplica de cloroplasto ( ori ) . La invención también proporciona plantas establemente transformadas de diferentes especies, que incluyen variedades de las mismas especies, géneros, familias, órdenes y divisiones de plantas. De acuerdo con la invención, una planta en la cual el genoma de cloroplasto se ha transformado establemente con uno o más genes extraños de interés incluye plantas maduras y la progenie de las mismas, como semillas y embriones. El término "planta" en este contexto también incluye porciones de plantas tales como explantas como cortes, cultivos de tejidos, suspensiones celulares, y callos. ^? De este modo, la invención incluye las plantas multicelulares transformadas establemente, su progenie, la semilla, y los plástidos transformados, por ejemplo, los cloroplastos, etcétera, y métodos para regenerar las plantas transformadas . En esta especificación y en las reivindicaciones, cuando se hace referencia a diferentes "especies", el término • "especie" se refiere no solamente a las "especies" sino a variedades dentro de una especie, género, familia, orden, y divisiones del reino vegetal. De este modo, un vector universal que se pueda usar para transformar plantas de diferentes especies se entiende que es capaz de transformar plantas de diferentes variedades dentro de una especie, diferente género, diferentes familias, diferentes órdenes, y diferentes divisiones. El término "planta" (o "plantas") • pretende ser genérico como se usa en la presente. 20 Expresión de productos no vegetales Genes de biopolímeros. Otra modalidad de la invención que usa el vector de integración y expresión universal proporciona plantas transformadas con un gen de biopolímero sintético que codifica polímeros basados en proteínas biodegradables (PBPs) .

Estos polímeros tienen importantes propiedades de importancia práctica discutidas más adelante en la presente. Producción de moléculas de alto valor-moléculas biológicamente • activas . 5 El intrigante descubrimiento de que la transformación con un gen sintético que no necesita tener un análogo natural en planta o animal, para producir PBPs, es factible, como se muestra en la amplia aplicabilidad del vector en todavía otro campo del comportamiento humano: la producción de moléculas biológicamente activas, tales como productos farmacéuticos en • plantas, desde cualquier gen o fracción funcional del mismo, sintético o natural. Otra modalidad de la invención por lo tanto es el uso de plantas transformadas como biorreactores (como fábricas) para productos biofarmacéuticos . Hay cuando menos dos capacidades frecuentemente necesarias para la producción de proteínas de valor farmacéutico, no posibles en los sistemas procarióticos. Las plantas, a diferencia de las bacterias, son capaces de producir la proteína extraña en una conformación biológicamente activa. Las bacterias también frecuentemente son más tolerables a la alteración de sus sendas biosintéticas. De este modo, las plantas se pueden transformar con un gen no funcional en (o extraño a) plantas, que pueden ser sintéticas o no, que normalmente pueden ser funcionales (competentes) en animales (mamíferos), en ovíparos, en peces u otras especies.

La invención además proporciona plantas transformadas que comprenden un gen proporcionado por un cásete de expresión, preferida por el vector universal, que codifica una variedad de productos deseados, especialmente moléculas biológicamente 5 activas como péptidos (polipéptidos) , proteínas, insulina, albúmina de suero humano (HSA) y otras moléculas que se describen adicionalmente más adelante en la presente. Las plantas se permite o se causa que crezcan, y los productos se aislan a partir del cultivo transformado, como tabaco, maíz, etcétera, y si es deseable, se cosechan primero si es necesario, purificados. ( Tolerancia herbicida. Otra modalidad importante de la invención proporciona plantas resistentes a herbicidas transgénicas en las cuales un transgén extraño que contiene resistencia a uno o más herbicidas se integra, preferiblemente de manera estable, en el genoma del cloroplasto por medio del vector universal . De particular importancia son las plantas transformadas que flfc exhiben resistencia al glifosato y así resistencia a "ROUNDUP®", un herbicida disponible comercialmente por Monsanto Company. El vector universal proporciona un medio efectivo para transformar el genoma del cloroplasto de cualquier planta y para conferir resistencia (o tolerancia) a cualquiera de los productos químicos herbicidas. 25 Un aspecto diferente de la invención proporciona un »AV método para transformar una planta por medio de un cásete de expresión, preferiblemente por medio del vector universal, para causar que produzca un rasgo no objetivo (secundario o • distinto) (o fenotipo). [Véase, por ejemplo, Penazloza, V., y 5 colaboradores, 1995) , quien reporta que la expresión por el gen gromicina ß- fosfotransferasa confiere resistencia al glifosato herbicida] . En otro aspecto de la invención, la tolerancia al herbicida se usa como gen marcador para la transformación de cloroplasto. • Resistencia a los insectos. Otra modalidad de la invención proporciona resistencia a los insectos, con las preocupaciones aumentadas de usar plaguicidas químicos, el uso de formulaciones de Bacillus thuringiensis (Bt) si ha sido defendida ampliamente. El Bacill us thuringiensis produce muchos tipos de inclusiones cristalinas que son tóxicas a los insectos. Las proteínas que comprenden estas inclusiones se han categorizado basándose en • el rango de huésped insecticida, y la homología de proteína.

Las toxinas CRYI y CRYII tienen actividad insecticida contra lepidóptera, o lepidóptera y díptera, respectivamente. Las protoxinas CRYI son de un tamaño de 130-135 kDa que están enzimáticamente disociadas en proteínas de 65 kDa para actividad insecticida. La protoxina CRYII tiene un tamaño de 65 kDa con una proteína con una masa molecular de 60-62 kDa para actividad insecticida. Muchas plagas de insectos importantes comercialmente (especialmente en la familia Pyralidae) son susceptibles a la toxina CrylLA, incluyendo el barrenador de maíz europeo, Ostrinia nubilalis , el barrenador 5 de tallo de maíz menor, Elasmopalpus lignosellus, el barrenador de vaina de chícharo, Maruca testulalis, el gusano de tabaco, Heliothis virescene, el gusano de cuerno de tabaco, Manduca sexta y la polilla gitana Lymantria dispar, (Daniell y colaboradores, 1994) . 10 Sin embargo, las formulaciones Bt no han sido tan efectivas como se anticipó principalmente debido a su susceptibilidad a radiación ultravioleta, inadecuada cobertura, gasto y rango de huésped limitado. La distribución de toxinas Bt vía plantas transgénicas Bt por lo tanto es atractiva. 15 Se ha presentado aceptable control de insectos con el algodón Bt transgénico nuclear contra el gusano de brote de tabaco, Heliothis virescens , pero estas plantas no expresan suficiente toxina Bt para controlar el gusano de capullo de 'fl algodón, Helicoverpa zea . Adicionalmente estos genes Bt pueden cruzarse exógenamente con especies de plantas relacionadas vía el polen. Para controlar estas preocupaciones, la transformación y expresión del cloroplasto se ha evaluado de acuerdo con la invención debido a las siguientes razones. 1) las células vegetales que contienen cloroplastos pueden contener hasta 10,000 copias de genes por célula, 2) los cloroplastos pueden leer el ADN bacteriano intacto, incluyendo operones, y 3) los genomas de los cloroplastos se heredan maternalmente, y por lo tanto, el escape de gen extraño vía el • polen se elimina drásticamente debido a que el ADN del 5 cloroplasto generalmente se degrada en polen. CRY2A se ha elegido debido a que CRY2A es relativamente no homólogo a CRY1A y por lo tanto, despliega solamente ligera resistencia cruzada contra poblaciones de H. virescens resistentes a CRY1A. Debido a que CRY2A es "naturalmente truncado" se pueden lograr altos niveles de expresión sin sacrificar la región 3 ' . De conformidad con esto se ha proporcionado resistencia a los genomas de cloroplastos de tabaco transformados con un vector universal de la invención para insectos normalmente susceptibles a toxinas Bt y también a insectos que han desarrollado resistencia o menos susceptibilidad a las toxinas Bt . Los insectos que nunca han sido eliminados por ninguna toxina CRY mostraron 100 por ciento mortalidad en tabaco transformado. 20 La expresión de cry2A en una planta podría por lo tanto ser una herramienta valuable en controlar múltiples plagas de insectos al mismo tiempo que se sobrepone el desarrollo de resistencia a B . Otras proteínas insecticidas tales como colesterol oxidasa que eliminan el gorgojo de capullo mediante diferentes mecanismos, se expresan en altos niveles de cloroplastos. Otras modalidades de la invención serán aparentes de aquí en adelante. • 5 DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra un mapa del genoma del cloroplasto de tabaco. Las líneas gruesas en el mapa del genoma representan las regiones de repetición invertidas del genoma de cloroplasto. Las flechas etiquetadas "UV" 10 representan las secuencias de inserción para la modalidad • preferida de la integración universal y el vector de expresión (UV) ,- la flecha etiquetada "TV" representa la secuencia de inserción para el vector de tabaco (TV) . La Figura 2A muestra que el vector de cloroplasto de 15 tabaco (TV) pZS-RD-EPSPS para la expresión de resistencia herbicida. La Figura 2B muestra el vector de expresión e integración de cloroplasto universal (UV) , pSBL-RD-EPSPS para la expresión de resistencia herbicida. 20 La Figura 3A muestra el vector de integración y expresión de cloroplasto universal, pSBL-CG-EG121 para la expresión de biopolímero. La Figura 3B muestra la integración de tabaco y la expresión y vector, pZS-CG-EG121 para la expresión del 25 biopolímero .

La Figura 4A-4E muestra la homología de la secuencia de las regiones espaciadoras entre el tabaco y otras especies de cultivos. Un sitio para la inserción del gen extraño se ^ muestra por flechas. Corriente arriba del sitio de la inserción del gen extraño se muestra el sitio de un origen de réplica ( ori ) . La Figura 4F-4G muestra el alineamiento de secuencia de la región espaciadora (64 pares de bases) 16S-23S de ADNr de varias especies de cultivos con la secuencia de cloroplastos de tabaco en donde (+) representa la cadena positiva y (-) la cadena negativa, respectivamente. Las Figuras 5A-C muestran la construcción del límite pSBL-Ct vector. Las Figuras 6A-C muestran la construcción del vector 15 pSBL-CtVl cásete de gen marcador seleccionable que contiene un promotor de ARNr 16S de cloroplasto (Prrn) , el gen aadA y una región 3' no traducida del gen sjA del cloroplasto. Las Figuras 7A-7D muestran los vectores pSBL-CtV2, pSBL-CtV3, pSBL-CtVH, pSBL-CtVHF, respectivamente. 20 Las Figuras 8A-B muestran los vectores pSBL-CtVHBt y pSBL-CtVHBtR, respectivamente. La Figura 9 muestra plantas de tabaco transformadas y no transformadas en presencia de una espectinomicina que indica la selección no letal en el medio (500 µg/mililitro) .

Nótese que el crecimiento de las hojas transformadas (blanqueadas) y no transformadas (verdes) . Las Figuras 10A-10G muestran la transformación y regeneración del plástido de maíz . ÉP La Figura 11 muestra la transformación del plástido de maíz. Las plantas de maíz transformadas crecen normalmente (brote intermedio) mientras que las plantas no transformadas mueren en el medio letal, confirmando la selección letal por el antibiótico, (1000 µg/mililitro espectinomicina) . Las Figuras 12A-12F muestran la transformación y 10 regeneración del plástido de arroz. • Las Figuras 13A y 13B muestran el análisis de reacción de cadena de polimerasa de ADN aislado de las hojas de transformantes de arroz . La Figura 14 muestra la transformación de plástido de cacahuate. Las plantas de cacahuate transformadas crecen normalmente (en medio y del lado izquierdo del plato) mientras que las plantas no transformadas mueren en el medio letal (500 µg/mililitro espectinomicina) . • La Figura 15 muestra la transformación de plástido de 20 frijoles soya. Dos plantas transformadas muestran brotes, las otras plantas mueren en el medio letal, confirmando la selección letal por el antibiótico (500 µg/mililitro) espectinomicina) . La Figura 16 muestra la transformación de embrión de 25 papa dulce en medio de selección letal (500 µg/mililitro) espectinomicina) . La Figura 17 muestra la transformación de células de uva. Las células de cultivo transformadas se vuelven verdes fl mientras que las células no transformadas mueren en el medio de 5 selección letal (500 µg/mililitro) espectinomicina) . La Figura 18 muestra la expresión de biopolímero basado en proteína (PBP) mediante los vectores de integración y expresión de cloroplasto en E. Coli . La Figura 19 muestra el análisis de manchado Southern 10 realizado con los transformantes a partir de plantas # transgénicas PBP usando el vector de tabaco (TV) . Las sondas fueron de secuencias límites de cloroplastos (A) o de secuencia de gen de polímero (EG121) (B) . La Figura 20 muestra el análisis de manchado Southern realizado con los transformantes a partir de plantas transgénicas PBP usando el vector universal (UV) . Las sondas fueron de secuencias límites de cloroplasto (A) o del gen aadA (B) . La Figura 21A muestra niveles de transcripción de gen extraño mediante manchado Northern usando el ARN total aislado del control, los transformantes de cloroplasto y una planta transgénica de tabaco nuclear que expresan mucho el gen de biopolímero sintético (EG121) . La Figura 2IB muestra un agrandamiento de los franjas 25 4-7 de la Figura 21A.

La Figura 22 muestra el análisis de manchado Western de proteína de polímero purificada a partir de plantas transgénicas . P La Figura 23A muestra velocidad de crecimiento más alta de E. Coli que contiene el vector de tabaco con el gen EPSPS. La Figura 23B muestra la velocidad de crecimiento más alta de E. Coli que contiene el vector universal con el gen EPSPS. 10 Las Figuras 24A-24B muestran la integración de genes • extraños en el genoma del plástido mediante reacción de cadena de polimerasa usando los cebadores r-bcL y aadA (A) , o los cebadores 16SRNA y aadA (B) . Las Figuras 25A-25C muestran la integración de un gen aroA en el cloroplasto mediante análisis Southern y la generación alta de homoplasmia usando la sonda EPSPS (A) o la sonda rc£>L-orf"512. El sitio de integración se muestra en (C) . Las Figuras 26A y 26B muestran la generación de • semillas coleccionadas del control y de plantas de tabaco transformadas, respectivamente, en la presencia de los marcadores seleccionables. Las Figuras 27A y 27B muestran las plantas transgénicas y de control de tabaco rociadas con glifosato. Las Figuras 28A y 28B muestran la susceptibilidad del 25 tabaco (control) y resistencia (transformada) a los insectos.

La Figura 29 (análisis de manchado Western) muestra la proteína total aislada del control y de las plantas de tabaco transgénicas . Las modalidades preferidas de la invención se 5 describen en mayor detalle más adelante en la presente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El vector de integración y expresión universal. El vector de integración y expresión universal de la invención es competente para transformar de manera estable los P cloroplastos de varias plantas objetivo diferentes. El ADN heterólogo que codifica secuencia se pueden proporcionar en el cásete para codificar un fenotipo tal como resistencia al herbicida, resistencia a los insectos u otros rasgos. El vector además comprende una secuencia de flanqueo en cada lado de la secuencia de codificación de ADN que es homologa a una secuencia espaciadora del genoma del cloroplasto, esta secuencia espaciadora se conserva en los genomas del P cloroplasto de diferentes plantas. De esta manera, la integración estable del gen heterólogo en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las secuencias límites de flanqueo con secuencias espaciadoras complementarias en el genoma del cloroplasto. El vector universal es competente para transformar cualquier especie de planta.

La región espaciadora t nl y trnA, se ha encontrado que se conserva mucho en gran variedad de especies vegetales, desde cianobacterias hasta plantas superiores, tales como P monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los genes trnl y trnA flanquean en cada lado de la región espaciadora, referida como el espaciador 2 o "región spa 2" (Figura 4F-4G) . Las regiones a cada lado de la región espaciadora igualmente tienen homología casi perfecta con las regiones correspondientes entre las especies de plantas desde la cianobacteria hasta plantas superiores, excepto que las plantas superiores contienen dos • intrones en los genes trnl y trnA . Las secuencias límites más largas tienden a favorecer la integración más eficiente del ADN extraño. Por lo tanto, aunque no esencial, la homología entre especies de los genes trnl y trnA, además de la homología de la región espaciadora, contribuye a la eficiencia de transformación e integración (Figura 4A-4E) . Si las secuencias de límites más largos incluyen porciones no homologas, se incorporan en el vector, la porción • no homologa de la secuencia será "ciclar afuera" y "presionar apagado", en el proceso de recombinación y no integrará el genoma de cloroplasto objetivo. Diferentes vectores universales se pueden construir con la región espaciadora. Por ejemplo, se pueden constituir secuencias de flanqueo más cortas o más largas con parte o 25 todos los genes trnA y trnl adyacentes a "spa 2".

Un vector universal preferido comprende las secuencias de flanqueo y el cásete de expresión que comprende los siguientes elementos genéticos para proporcionar la ífl transcripción y traducción de la secuencia de codificación de 5 ADN organizada en el siguiente orden (desde los extremos 5' a 3'): una parte 5' de la secuencia de flanqueo, un promotor funcional en cloroplasto, una secuencia de ADN con sitio de clonación adecuado para la inserción de una o más secuencias de codificación para el fenotipo deseado o molécula de interés, y 10 para un marcador seleccionable, un terminador de transcripción • y una parte 3' para la secuencia de flanqueo. El orden de las secuencias de ADN que codifican en fenotipo deseado y el marcador seleccionable se pueden cambiar. Se pueden proporcionar secuencias de ADN de planta de flanqueo 15 adicionales para promover la integración estable. Preferiblemente, la secuencia de flanqueo comprende un origen de réplica ( ori ) . En una ilustración particular, la región espaciadora PP muy conservada reside en la repetición invertida del genoma de cloroplasto. Sin embargo, la ubicación particular del espaciador en el genoma de cloroplasto no es tan importante como su gran homología con la región espaciadora de diferentes plantas . Además, como se puede ver en las Figuras 4F-4G, la 25 secuencia espaciadora 2 (o spa 2) que tiene 64 pares de bases de longitud es demasiado corta para incluir el genoma de cloroplasto ori que residen corriente arriba, o ese espaciador. Si se desea incluir el ori , una secuencia espaciadora más larga • que abarque al ori se seleccionará la cual incluirá la 5 secuencia espaciadora y una secuencia adicional en las secuencias de flanqueo. Esto proporcionará una plantilla más larga para la recombinación homologa en el genoma de cloroplasto receptor y promover la homoplasmia. Otro vector preferido es uno en el cual las secuencias de flanqueo comprenden, cada una, además de la • región espaciadora 2, una porción o toda la región espaciadora intergénica entre los genes tRNAIle y el tRNAAla del genoma de cloroplasto (Figura 4A-4E) . Además, las secuencias de flanqueo pueden incluir parte o todos los genes tRNAl TIPc y el tRNAAla, 15 respectivamente. Opcionalmente, las secuencias de flanqueo comprenden una parte o todas las secuencias del gen 16S y/o 23S de ARNr. Vectores universales ilustrativos. • Un vector universal preferido comprende una secuencia 20 de ADN que comprende la secuencia de la región espaciadora 2 entre los genes ürnl y el trnA muy conservados entre los genes de ARNr 16S-23S del genoma de cloroplasto. Preferiblemente, esta región comprende parte o toda la secuencia de ADN (Figura 4F-4G) de los genes trnl y trnA. Esta región se separa de la 25 planta seleccionada como tabaco y se subclona en un plásmido disponible comúnmente como pUC19, por ejemplo, en el sitio PvuII. En el plásmido se inserta el cásete de expresión que contiene un gen marcador seleccionable, un promotor 16SrRNA de cloroplasto, un gen que codifica una enzima que confiere una 5 resistencia a un antibiótico como el gen aadA que codifica aminoglicosida 3 ' adenil transferasa que confiere resistencia a estreptomicina/espectinomicina y la región 3 ' no traducida del gen psbA de cloroplasto. Específicamente, cuando el vector universal se construye con plásmido pSBL-Ct-bor (Figura 5) , un cásete de gen • marcador seleccionable que contiene el promotor ARNr 16S de cloroplasto, el gen aadA que codifica aminoglicosida 3 ' -adenil transferasa que confiere resistencia para estreptomicina/espectinomicina, o un gen de resistencia al herbicida y una región 3 ' no traducida del gen psbA de cloroplasto, se inserta en el plásmido. (Figura 6) Este cásete de gen marcador seleccionable se inserta entonces en el límite universal en dos diferentes orientaciones. El vector pSBL- CtVl, el cásete de gen marcador seleccionable se insertó en el gen trnl (Figura 6A) . En el vector pSBL-CtV2 (Figura 7A) , el cásete de gen marcador seleccionable se insertó entre los genes trnl y trnA en la región espaciadora, en la dirección de la transcripción del ADNr 16S. En el vector pSBL-CtV2 R (el mapa no se muestra) , el cásete del gen marcador seleccionable se inserta entre los genes trnl y trnA en la región espaciadora, en la dirección opuesta del ADNr 16S de transcripción. Varios genes de interés se han insertado en el vector pSBL-CtV2, una modalidad preferida del vector universal. Por PP ejemplo, el vector pSBL-CtV3 (Figura 7B) contiene el gen 5 reportero mGFP que codifica una proteína verde fluorescente, aislada de molusco. Este gen puede ser útil para la selección visible de plantas transformadas o en horticultura ornamental, por ejemplo, en cultivos ornamentales como árboles de navidad o hasta pasto, que puede brillar con fluorescencia verde al 10 iluminarla con luz azul . P El vector pSBL-CtVH (Figura 7C) contiene un marcador seleccionable diferente, higromicina fosfotransferasa (gen hph conducido por el promotor de gen atpB de cloroplasto) , el cual confiere resistencia al antibiótico higromicina. Este vector 15 se puede usar para transformar plantas que son resistentes a otros antibióticos y es particularmente útil para transformar monocotiledóneas, las cuales generalmente son resistentes a otros antibióticos comúnmente usados. Este gen puede conferir rasgos adicionales tales como resistencia herbicida, un rasgo 20 no objetivo. El vector pSBL-CtVHF (Figura 7) contiene los genes GFP y hph, que se pueden usar para selección letal o una combinación de selección letal/visible. Un vector de cloroplasto específico para tabaco y un vector de 25 cloroplasto universal.

El vector de cloroplasto para tabaco pZS-RD-EPSPS (Figura 2A) ("TV") y el vector universal pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B) ("UV") ambos contienen el promotor Prrn (de ARNr 16S, y el gen aadA (para selección de espectinomicina) , el gen aroA • 5 mutante que codifica la enzima EPSPS sintasa (para selección de glifosfato) y la región psbA 3 ' . Las secuencias de flanqueo en pZS-RD-EPSPS contienen r£>cL y orf 512 y en pSBL-RD-EPSPS contienen los genes trnl y trnA que facilitan la integración en ya sea la región de una sola copia grande (Figura 1 en la 10 flecha "TV") o en las regiones de repetición invertidas (Figura pp 1 en las flechas UV) del genoma de cloroplasto de tabaco, respectivamente . El glifosato es el ingrediente activo en el herbicida ROUNDUP® de Monsanto y se usa como un marcador seleccionable 15 para la selección herbicida de plantas transgénicas . Construcción de vectores de cloroplasto. Los protocolos estándares para la construcción de vectores incluyen el Klenow que lleva a cabo la desfosforilación, cuando se usa. El vector de expresión de 20 cloroplasto de tabaco pZS-RD-EPSPS se muestra en la Figura 2A. El vector de cloroplasto universal pSBL-RD. EPSPS se muestra en la Figura 2A. La construcción de estos vectores se muestran además en ejemplos. Ambos plásmidos se amplificaron en la XLl Blue de E. coli . Las curvas de crecimiento se registraron en 25 medio mínimo M-9. Ambos vectores se usaron para la selección de glifosfato para confirmar resistencia a ROUNDUP® . El vector de expresión de cloroplasto pZS-RD-EPSPS es específico para tabaco y como se hizo notar anteriormente, no • es útil para transformar otras plantas (Maier y colaboradores, 5 1995) . En contraste, el vector de expresión e integración de cloroplasto universal pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B) es competente para transformar genomas de cloroplastos de numerosas otras especies vegetales debido a la universalidad del vector como se describe anteriormente. El vector universal integra genes extraños en la región espaciadora 16S-23S del genoma de • cloroplasto. El vector universal utiliza los genes trnA y trnl (ARN que transfiere cloroplasto) que codifican alanina e isoleucina) a partir de la región de repetición invertida del genoma de cloroplasto conforme flanquea secuencias para recombinación homologa. La secuencia límite de cloroplasto usada en esta invención también contiene el origen de réplica de cloroplasto (oriA) , como se confirma en varias especies de cultivos incluyendo chícharo (Nielsen y colaboradores, 1993) y • tabaco (Lu y colaboradores, 1996) , que se puede explicar en la homología de secuencia muy conservada en esta región. Este origen de réplica proporciona un número creciente de plantillas de plásmidos para la integración eficiente en el genoma de cloroplasto receptor y lograr la homoplasmia. Como se mostró anteriormente, en la construcción del vector universal, un cásete de expresión que contiene un promotor de cloroplasto, un gen marcador seleccionable que confiere resistencia a un antibiótico (o a otro marcador seleccionado) , un gen que codifica la molécula objetivo, y los • otros elementos (como se describió en la presente) se insertan en el sitio de restricción conveniente en el fragmento de ADN que contienen una región espaciadora. Si se desea, el gen extraño que codifica la molécula objetivo se puede insertar en el cásete de expresión después de la inserción del cásete en el fragmento de ADN que contiene la región espaciadora conservada de manera que, antes de la inserción, el cásete incluirá múltiples sitios de clonación para la inserción de una o más secuencias de codificación de ADN. La posición del sitio de transición en la secuencia espaciadora puede determinar la longitud respecta de dos secuencias de flanqueo, que serán fracciones (de la misma o diferente longitud) de la región espaciadora. De este modo, las dos secuencias de flanqueo no necesitan ser idénticas en longitud en tanto cada una contenga suficiente complementariedad con el genoma de cloroplasto objetivo para promover la recombinación homologa. Debido a que el vector de la invención tiene alto grado de homología con la región espaciadora de los genomas de cloroplasto de múltiples especies de plantas, es competente para transformar, no sólo las especies de plantas a partir de las cuales la secuencia límite del vector se deriva, sino cualquier especie de planta. Como se usa en esta especificación, el término "homólogo" significa que la secuencia de ADN de una especie de .?k planta posee regiones de identidad de secuencia con porciones de secuencia de ADN de otras especies de plantas. Esto es, si dos secuencias de ADN son muy homologas, las especies de ADN tienen 100 por ciento de identidad de secuencias o menos del 100 por ciento de identidad de secuencias. Por ejemplo, para fines de la integración de genoma de cloroplasto, una secuencia 10 de 400 pares de bases que solamente es 25 por ciento homólogo • total, pero que contiene una porción de 100 pares de bases que es el 85 por ciento a 90 por ciento más homologa, se considera que es muy homologa con el genoma de cloroplasto. La inclusión de un cloroplasto ori dentro de las secuencias de flanqueo del vector universal también se ha mostrado que es benéfico. Sin apegarse a ninguna teoría, se cree que la presencia del ori en el vector universal promueve la homoplasmia después de una sola ronda de selección, sin la P necesidad de un segundo paso de selección. Esto es especialmente importante en la transformación de plantas monocotiledóneas, tales como maíz o arroz, en las cuales un segundo paso de selección no es factible debido a la dificultad de cultivar estas plantas en cultivo a partir de cortes de hojas con la necesidad resultante de cultivar estas plantas a partir de embriones. Si se desea un ori pero se carece de él, se puede introducir en una secuencia de flanqueo o en cualquier otro lado. Si se desea aumentar el número de copias de vector universal introducido, un fragmento de ADN de cloroplasto que contiene un ori se insertará fuera de las secuencias de 5 flanqueo de manera que funcionará solamente para amplificar el número de copias del vector universal y no queda integrado en el genoma de cloroplasto. En oposición a derivarse de una planta específica, las secuencias de flanqueo se pueden derivar de una región espaciadora sintéticamente hecha como se muestra más adelante.

• Para la transcripción y traducción de la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, la región promotora entera de un gen capaz de expresión en el cloroplasto se usa generalmente . La región promotora puede incluir promotores obtenibles de genes de cloroplasto tales como el gen psbA de espinaca o chícharo, la región promotora rbcL y atpB del maíz y los promotores de ARNr. Los promotores competentes también se describen en otras fuentes de literatura y se identifican • en la Patente número 5,693,507. 20 Las secuencias de flanqueo mostradas por la Patente número 5,693,507 y otras publicaciones para promover integración estable son secuencias de no flanqueo en el vector de expresión e integración universal descrito en la presente que están muy conservadas de especies vegetales a especies vegetales, mientras que las secuencias de flanqueo de esa patente y otras publicaciones no lo están. Identificación de secuencias espadadoras intergénicas . La invención proporciona métodos para identificar secuencias espadadoras intergénicas no transcritas apropiadas • 5 en plantas que son adecuadas para construir los vectores universales. El método comprende aislar ADN genómico de plástido, que lleva a cabo la hibridización como una sonda etiquetada radioactiva de un espaciador conocido, que detecta y aisla secuencias de plástidos que exhiben el grado deseado de homología con la sonda. Como ilustración, para determinar que jf un genoma de plástido de estructura y secuencia conocidas posee la porción espaciadora, manchado Southern que utilizan la región espaciadora de tabaco como sondas se llevan a cabo. El ADN genómico de plástido se aisla y se disocia mediante una enzima de restricción apropiada de acuerdo con procedimientos establecidos. La hibridización con la sonda espaciadora se lleva a cabo bajo condición estricta (por ejemplo, 50 por ciento de formamida a 68 °C, lavado en 0.1 X SSC a 68 °C) como condiciones no estrictas (por ejemplo, 6 X SSC, a 68 °C, lavado en 2 X SSC a 50°C) (1 X SSC es 0.15M NaCl , 0.015M citrato de sodio) para detectar las secuencias de plástidos que exhiben aproximadamente 90-100 por ciento de homólogos o 60-100 por ciento del espaciador de tabaco, respectivamente. Las secuencias de plástidos identificadas se aislan. Si es más permisible un requisito de recombinación homologa, un grado menor de hibridización para la sonda, tal como aproximadamente de 60 por ciento puede ser satisfactoria. De este modo, cualquier región conocida o desconocida • espaciadora con suficiente homología para la recombinación es 5 conveniente para la construcción del UV. Igualmente, la secuencia conocida de cualquier secuencia espaciadora conservada intergénicamente altamente se puede usar para identificar y aislar las secuencias de plástidos que son homólogos a una secuencia espaciadora conocida. 10 Alternativamente, el programa BLAST como se describe • en la presente anteriormente se puede usar para identificar regiones altamente conservadas en genomas plástidos de los cuales se conoce la secuencia. Plantas que se pueden transformar. 15 Plantas que se pueden transformar mediante el vector universal de la invención incluyen cualquier planta inferior, tal como cianobacteria, cualquier planta superior como monocotiledónea y especies de plantas dicotiledóneas. Las • plantas que se van a transformar pueden ser plantas solonáceas 20 o plantas que crecen bajo tierra. Una lista no exclusiva de ejemplos de planta superior que se pueden transformar con el vector universal incluyen cereales tales como cebada, maíz, avena, arroz, y trigo, melones tales como pepino, melón, y sandía; leguminosas como frijol, cowpea, chícharo, cacahuate; 25 oleaginosas tales como colza y frijol de soya; plantas solanáceas como tabaco, cultivos de tubérculos como papa y camote, y vegetales, jitomate, pimienta y rábano; frutas como pera, uva, durazno, ciruela, plátano, manzana, y fresa; át cultivos fibrosos, como el Gossypium genus tales como algodón, lino y cáñamo; y otras plantas como betabel, algodón, café, rábano, plantas ornamentales comerciales, tales como claveles y rosas, pastos como caña de azúcar o tepe de césped; árboles perennes tales como madera de pino, picea, y pino, y árboles caducos, tales como maple y roble. De mayor interés presente son los cultivos importantes económicamente como maíz, frijol, • frijol de soya, trigo y algodón. Ninguna de estas plantas a conocimiento del inventor, distintas de tabaco, se ha transformado establemente vía el genoma del cloroplasto y ninguna, incluyendo el tabaco, han sido transformados establemente mediante un vector universal, como se describe en la presente. Una planta de la cual la secuencia de ADN frecuentemente se obtiene es tabaco debido a que la planta más minuciosamente caracterizada pero cualquier otro genoma de ^B cloroplasto de planta es conveniente. 20 Se recordará como se describió anteriormente que el vector usado para transformar establemente el tabaco no fue competente para transformar el genoma de cloroplasto de otras plantas . Método para transformación. 25 Los casetes de expresión se pueden transformar en una célula de planta de interés por cualquier número de métodos conocidos. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los siguientes. Transformación por bombardeo de partículas de jflk tungsteno, transformación mediada por polietilenglicol, uso de 5 un rayo láser, electroporación, microinyección o cualquier otro método capaz de introducir ADN en un cloroplasto. Véase, por ejemplo, Sanford, 1988; Daniell, 1993; Daniell, 1997; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica número 5,693,507; Kin Ying y colaboradores, 1996. El uso de estas técnicas 10 permite la aplicación de la invención descrita en la presente ^ a una amplia variedad tanto de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas . Expresión de moléculas no vegetales a partir de vegetales transformados 15 La utilidad aumentada del vector de integración de expresión universal de la invención claramente se muestra por la competencia del vector para generar vegetales transformados para expresar moléculas no vegetales y moléculas valiosas. fli Polímeros basados en proteína biodegradables. 20 De acuerdo con otra modalidad de la invención, el vector universal se ha usado para transformar tabaco con el gen sintético que expresa polímeros basados en proteína (PBPs) . Estos polímeros, los genes que los expresan, se conocen en la literatura. (Daniell, y colaboradores, 1997) . De particular 25 interés, son los polímeros basados en proteína (PBP) que tienen secuencias de pentámeros de repetición como GVGVP (Yeh y colaboradores, 1987) . Estos polímeros PBP muestran propiedad de transición a temperatura de fase inversa útil . La proteína • se vuelve insoluble cuando la temperatura se eleva por encima 5 del estado de transición. Los PBP ofrecen un amplio rango de materiales similares a los de los polímeros basados en petróleo, tales como hidrogels, elastómeros, y plásticos. También muestran biocompatibilidad notable, habilitando mediante esto un amplio rango de aplicaciones médicas que incluyen la prevención de adhesiones postquirúrgicas, la • reconstrucción de tejidos y la administración programada de fármacos (Urry y colaboradores, 1993) . Del lado no médico, las aplicaciones potenciales incluyen el uso en transductores, máquinas moleculares, superabsorbentes y plásticos biodegradables (Daniell y colaboradores, 1997) . Estos polímeros incluyen el polímero (Val^Pro -Gly -Val -Gly5) n (VPGVP)n en donde "n" puede variar de una a unidades en los cientos, tales como 250 o sus análogos. Importantes • posibilidades comerciales y aspectos relacionados se discuten por Daniell, 1995. Plásticos útiles biodegradables se hacen de PBPs. Los genes que experimentan estos PBP también son útiles en la invención porque se pueden usar como vehículos es decir, los genes de una molécula de interés se pueden fundir en el gen PBP de la integración y expresión del cloroplasto. 25 En un estudio anterior, el gen de polímero sintético que codifica para (GVGVP) 12? fue hiperexpresado en E. coli hasta el grado en que los cuerpos de inclusión de polímero ocuparon cerca del 80-90 por ciento del volumen de la célula (Guda y • colaboradores, 1995; Daniell y colaboradores, 1997) . El mismo 5 gen también fue expresado en el compartimiento nuclear de células de tabaco cultivado (Zhang y colaboradores, 1995) y hojas de plantas de tabaco transgénico (Zhang y colaboradores, 1996) . En un sistema modelo, la región intergénica de los genes trnl y trnA en la región espaciadora de ARNr 16S-23S del • genoma de tabaco (Figura 1) se usó para construir un vector universal para la integración del gen marcador seleccionable aadA y el gen de polímero sintético (EG121) . El vector se insertó en la región de repetición invertida del genoma de cloroplasto. Las plantas de tabaco transformadas expresaron altos niveles de la proteína del polímero. El genoma del cloroplasto de otras especies vegetales, también fue transformable con el gen sintético para expresar el polímero • basado en proteína, usando el vector universal. 20 Producción de moléculas de alto valor. Los estudios con el biopolímero han demostrado que un producto que no es vegetal se puede expresar mediante el gen sintético, haciendo posible de este modo por medio de los vectores de la invención expresar moléculas biológicamente valiosas a partir de plantas transformadas con una gran variedad de secuencias de codificación de ADN. La secuencia de codificación de ADN estará compuesta en un vector universal, o, si se desea, en un cásete de expresión, como se describió • anteriormente . 5 Las plantas transgénicas se sabe que producen valiosas moléculas biológicamente activas mediante la transformación nuclear pero no vía la transformación de cloroplasto. Véase las siguientes referencias de literatura, todas las cuales se incorporan por referencia. Daniell, 1995; Miele, 1997; Lyons, 1996; Daniell, y Guda, 1997; Arntzen, • 1997. Expresión de moléculas biológicamente activas. Las plantas transformadas de acuerdo con la invención con el vector universal o con el cásete de expresión se pueden hacer para expresar moléculas valiosas biológicamente activas en cloroplastos que contienen partes de las plantas. Las plantas se cosecharán mediante prácticas conocidas. Las plantas transformadas que contienen estos productos se pueden • administrar oralmente, Arntzen, 1997. La producción de productos farmacéuticos mediante plantas transgénicas se han realizado con péptidos (proteínas) para muchas aplicaciones farmacéuticas, incluyendo vacunas, inmunomoduladores, factores de crecimiento, hormonas, proteínas sanguíneas, inhibidores, y enzimas. Los productos biológicos derivados de plantas transgénicas típicos que han sido reportados, incluyen vacunas contra enfermedades virales; epítopes de péptido viral, como virus de inmunodeficiencia humana, epítopes de péptido no viral, proteínas antígenas bacterianas,- péptidos bioactivos, # toxinas recombinantes, planticuerpos (anticuerpos 5 recombinantes) , proteínas de suero, y metabolitos secundarios vegetales . Todos estos productos se pueden expresar en cloroplastos de plantas transgénicas de acuerdo con la invención. Los péptidos farmacéuticos típicos o proteínas 10 producidas en plantas transgénicas incluyen el antígeno de • superficie de hepatitis B, la proteína de cápsido de virus Norwalk, virus de enfermedad de pies y boca, rinovirus humano 14, virus de inmunodeficiencia humana, proteína de superficie de S. mutans, enterotoxina de E. coli , subunidad B, epítope de 15 circumsporozoito de malaria, epítope de proteína de ratón ZP3 (vacuna); anticuerpo catalítico de ratón 6D4 , anticuerpo monoclonal de ratón 13 de Guy, anticuerpo monoclonal Bl-8, proteína Fv antifitocromo, antisustancia P (anticuerpo) ,- • albúmina de suero humano (HSA) , proteína humana C (proteína de 20 suero) ; a-tricosantina, ricina (citoxina) ,- factor de crecimiento epidérmico humano (factor de crecimiento) ,- leu- encefalina (neuropéptido) y ácido -glucosidasa humana (hGC) (enzima) . Muchas de estas moléculas se han expresado en tabaco, tubérculo de papa, etcétera. 25 De interés particular, de acuerdo con la invención es la producción de insulina y de albúmina de suero humano (HSA) con el vector de integración y expresión universal o con un vector de expresión. La HSA ya ha sido producida en plantas de flfc papa y tabaco (nuclear) transgénico. Sijmons y colaboradores, 5 1990. Los productos antes mencionados se pueden producir vía la transformación de cloroplasto de acuerdo con la invención. Insulina. La invención proporciona un método para expresar insulina como una proteína de función de polímero a partir de una planta transformada. La planta se puede transformar con un cásete de expresión o con el vector de integración y expresión universal que comprende un gen de biopolímero sintético, como (GVGVP) Q. Una planta conveniente es tabaco debido a la facilidad de ingeniería genética y la necesidad de encontrar usos alternativos de este cultivo controversial . Para la expresión en bacterias, el método comprende construir un vector para expresión en E. coli como una fusión de gen de polímero (GVGVP) 40 con un gen proinsulina, que expresa las proteínas de función de polímero-insulina en E. coli , (cultivadas de una manera conocida), purificando la proteína recombinante utilizando las propiedades de temperatura-transición del polímero basado en proteína, y disociando la insulina del polímero usando métodos muy conocidos . 25 Para la transformación de plantas, un cásete de expresión o el vector de integración y expresión universal, el cual comprende la fusión del gen del polímero con el gen pro- insulina, se introduce en una planta objetivo, como tabaco. La ^ proteína de fusión de polímero-insulina se expresa a partir de 5 la planta, la proteína de fusión de polímero se extrae del cloroplasto y de los compartimentos del citosol de las células vegetales, la insulina se disocia de la proteína del polímero con ditiotreitol (DTT) o los otros métodos conocidos, y la insulina se recolecta. Alternativamente, el producto de la fusión del polímero de insulina se puede expresar en un cultivo comestible o partes comestibles del cultivo. La técnica de fusión de una secuencia de ADN de codificación para una molécula de actividad biológica a un gen sintético que expresa un polímero basado en proteína para expresión, en un huésped bacteriano o levadura o en una planta transformada, es un método muy prometedor de amplia aplicabilidad. Albúmina de suero humano recombinante en plantas . En plantas de tabaco y papa transgénicas, la albúmina de suero humano recombinante (rHSA) que es indistinguible de la proteína humana auténtica ha sido producida (Sijmons y colaboradores, 1990) . Esto mostró la expresión de una proteína valiosa en plantas transgénicas, pero también que fue posible lograr el procesamiento adecuado mediante la fusión de la HSA a una prosecuencia de planta que dio como resultado la disociación y secreción de la proteína correcta. El genoma del cloroplasto de una planta seleccionada como tabaco se puede fácilmente transformar con un vector universal como se describe • en la presente y hacerla expresar la HSA. 5 Aplicabilidad general. Como se describió en la presente el vector universal permite, de acuerdo con la invención, la transformación de plantas, hace que la planta exprese una molécula biológica que puede impartir un fenotipo deseado a la planta y/o producir un 10 producto deseado el cual puede, pero no necesita tener • actividad biológica (o un precursor para un producto final) . La secuencia de nucleótidos de codificación puede ser sintética, o natural. La molécula producida puede ser extraña a las plantas, no funcional en la planta o funcional. El 15 vector universal tiene amplias aplicaciones en el dominio de transformación vegetal. Se contempla que cualquier molécula biológicamente activa (precursor o derivado del mismo) se puede producir • mediante plantas transgénicas transformadas con el vector universal de la invención, con adaptaciones convenientes como pueda requerirse como un paso particular. Tolerancia herbicida de las plantas transformadas de cloroplasto Otra modalidad de la invención se relaciona con el 25 uso del vector universal para conferir resistencia herbicida o tolerancia a las plantas. El avance de la tecnología de transferencia de genes ha hecho posible la introducción de genes de resistencia herbicida en plantas, haciendo mediante esto al herbicida selectivo para un cultivo particular. 5 Modificaciones de la enzima objetivo. El primer paso hacia este enfoque es la identificación y la modificación necesaria de la enzima objetivo (gen) del herbicida para conferir tolerancia, lo cual se ha realizado bastante extensamente. El sulfometurón metilo es un herbicida de sulfonilurea que bloquea el crecimiento de • bacterias, levaduras, y plantas superiores inhibiendo la primera enzima de la senda de aminoácidos de cadena ramificada, acetolactato sintasa (ALS) . Los genes mutantes para ALS se aislaron a partir de E. coli y levadura que confiere resistencia al sulfometurón metilo. Yadav, y colaboradores, (1986) . La resistencia herbicida en tabaco, y varios otros cultivos se ha logrado mediante la ingeniería genética del gen ALS. Gabard, y colaboradores, (1989); Miki, y colaboradores, • (1990) . Todavía otro enfoque a la resistencia herbicida elaborada en plantas ha sido la expresión de la enzima fosfinotricina acetil transferasa (PAT) que destoxifica la fosfinotricina herbicida. DeBlock, y colaboradores, (1987). Glifosato. El glifosato es un herbicida potente, de amplio espectro, que es muy efectivo contra las hierbas anuales y perennes y las hierbas malas de hojas anchas. El glifosato es ambientalmente seguro ya que se degrada rápidamente en la tierra, tiene mínima movilidad en la tierra, y tiene muy baja ^ toxicidad en formas de vida no vegetales. El glifosato trabaja 5 enlazándose con e inhibiendo la enzima 5-enol-piruvil sikimato- 3-fosfato (EPSP) sintasa. La EPSP sintasa (EPSPS) cataliza la formación para el EPSP, que es importante en la senda de biosíntesis de aminoácido aromático, a partir de sikimato-3- fosfato y el fosfato inorgánico. La no toxicidad del glifosato en animales se debe al hecho de que esta reacción se presenta • solamente en plantas y micro-organismos. Desgraciadamente, debido a que la reacción para formar el EPSP se presenta en todas las plantas, el glifosato no tiene selectividad entre hierbas malas y plantas deseables tales como cultivos y plantas ornamentales. Dos enfoques se han usado para intentar desarrollar una planta resistente al glifosato mediante ingeniería genética. Un enfoque se basa en la sobreproducción de EPSP • sintasa de tipo original, de manera que después de la inhibición competitiva de EPSP sintasa mediante glifosato, la EPSP sintasa residual confiere tolerancia al glifosato. El segundo enfoque se basa en la expresión de un gen mutante (aroA) que codifica EPSP sintasa resistente a glifosato. En todos los ejemplos anteriores, sin excepción, los genes resistentes a herbicidas se han introducido al genoma nuclear.

La necesidad de transformación del cloroplasto. Existe una seria necesidad, para desarrollar una planta resistente al herbicida, particularmente una planta P resistente a los herbicidas más ampliamente usados, en la cual la proteína que confiere resistencia herbicida se produce en el cloroplasto, y en la cual el gen que confiere resistencia herbicida no puede escapar mediante el polen al ambiente. El vector universal de la invención responde a esta necesidad mediante la transformación de cualquier planta objetivo para proporcionar tolerancia a cualquier herbicida • seleccionado como glifosato. Los cultivos comerciales importantes como trigo, arroz, maíz, frijol de soya se pueden hacer resistentes al herbicida seleccionado por medio del vector universal . 15 La invención proporciona una planta resistente a herbicida transgénica en la cual un transgén extraño confiere resistencia a uno o más herbicidas se integra al genoma del cloroplasto por medio del vector universal . La planta • transgénica puede ser una planta madura, una planta inmadura, tal como un brote, un embrión, un callo, un tejido cultivado, o una suspensión celular, o una porción de una planta tal como un corte o un callo. Los herbicidas que son convenientes para la invención y para los cuales los genes que confieren resistencia se pueden integrar establemente en el genoma del cloroplasto de acuerdo con la invención incluye todos los herbicidas conocidos (y también para ser desarrollado) . Clases de herbicidas. Los herbicidas controlables por la invención • generalmente se han agrupado en varias clases químicas. 5 Una primera clase incluye los herbicidas PSII (Fotosistema II) que interfieren con la reducción de plastoquinona en el sitio aceptador del PSII que incluye productos químicos tales como triazinas, triazinonas, derivados de urea, biscarmatos, nitrilos, nitrofenoles, piridazinonas sustituidas, fenilcarbamatos, anuidas, cianoacrilato, DCMU, • carboanilidas, uracilos, específicamente por ejemplo, diclorofenildimetilurea, atrazina, metribuzina, lenacil, fenmedifam, ioxinil y dinoseb . Estos productos químicos se enlazan a una proteína de enlace de 32 kDa (proteína QB, Di, proteína que enlaza herbicida) en la membrana tilacoide de cloroplastos, mediante lo cual se bloquea el transporte de electrones fotosintético. El gen plástido que codifica un precursor de la proteína Qg se llama psbA, las secuencias de la • cual muestran un grado muy alto de homología en diferentes plantas. El herbicida PSII más importante es atrazina, desarrollada por Ciba-Geigy. Otras clases son los herbicidas PSI (Fotosistema I) , un complejo de proteínas enlazado en membrana que cataliza la oxidación producida por la luz de plastocianina (PC) y la reducción de ferredoxina (Fd) . Típicos de estos químicos son los herbicidas bipiridilo paraquat y diquat . Otras clases de herbicidas son los ariloxifenoxipropanoatos (APP) o los herbicidas tipo • carboxilasa acetil coenzima A, que inhibe el acetil-CoA 5 carboxilasa y subsecuente biosíntesis de ácido graso en plástidos. Típico de los APPs son cidohexanodiona (CHD), setoxidina, haloxifop, quizalofop, fenoxaprop (y las moléculas alquilo inferior sustituidas de los mismos) dicolofop, setoxidina, cletodina y tralcoxidim. 10 Todavía otra clase de herbicidas, incluye los análogos de auxina como macropop, cloramben, dicamba, benazolina, ácido l-naftilacético; ácido 3,6- dicloropicolónico, picloram, fluoroxipir, quinclorac, MCPA y 2,4-D. 15 Una clase adicional son los herbicidas mitóticos llamados herbicidas de dinitroanilina, como trifluralino, orizalino y pendimetalino. Otra clase química de herbicidas a los cuales se aplica la invención son aquellos que actúan en la biosíntesis de aminoácidos, tales como ácidos terciarios de ácidos amino metil fosfónico clorosulfurón, glufosina y glifosato. Otra clase de herbicidas son los herbicidas que inhiben la acetolactato sintasa (ALS) , como las sulfonilureas, imidazolinonas, triazolopirimidinas y pirimidinil tiobenzoatos, tales como clorosulfurón, imazafir, flumetsulam (y otros enlistados en el capítulo 4, Tabla I de Herbicide Resistance in Plants, 1994, citado más adelante) . Los ejemplos de herbicidas de sulfonilurea son • sulfometurón metilo (el ingrediente activo de Oust®) y 5 clorosulfurón (el ingrediente activo de Glean®) . Imazapir, una de las imidazolinonas, es el ingrediente activo de el herbicida de American Cyanamid Arsenal® e imazametabenz es una mezcla de dos imidazolinonas (Merk Index, llth Ed. 4825) . .Formas mutadas de ALS localizadas en genes estructurales de ALS, ilvG y ILV2 se pueden usar para conferir resistencia herbicida usando el • vector universal . A pesar de las diferencias químicas entre las imidazolinonas y sulfonilureas, estas sustancias inhiben la misma enzima, ALS. Parece que las quinonas y un herbicida de imidazolinona compiten con un herbicida de sulfonilurea a partir de un sitio común en ALS. De conformidad con lo anterior, de acuerdo con la invención, las plantas se pueden transformar que mostrarán una resistencia a ambos grupos de estos y otros herbicidas. 20 Otro grupo de productos químicos controlables por la invención usando el vector universal que tiene actividad herbicida se tipifica mediante la L-fosfinotricina, que es un componente del tripéptido "bialafos". Este tripéptido se vende bajo la marca registrada "Herbiace®" por Meiji Seika, Japón, y como "Basta®" por Hoechst AG, Alemania. L-fosfinotricina es un inhibidor potente de glutamina sintetasa, que causa un incremento rápido de concentración de amoníaco en plantas y conduce a la muerte de las células vegetales. A pesar de estudios extensos, no se ha desarrollado ningún producto satisfactoria para impartir tolerancia herbicida a las plantas mediante la transformación de cloroplasto. Con el herbicida tipo glifosato, se ha reportado que las plantas transgénicas de núcleo transformado regenerado muestran tolerancia al glifosato, pero también muestran crecimiento disparejo, y no han resultado plantas transgénicas con alto nivel de tolerancia al glifosato, Schuitz, y colaboradores, 1990. Transformantes del cloroplasto. De acuerdo con la invención, el cloroplasto de plantas objetivo que es susceptible a herbicidas se transforma con un vector de la invención que lleva a cabo la secuencia de codificación necesaria, confiriendo mediante esto resistencia herbicida. El cloroplasto transformado comprende un genoma que lleva a cabo un transgén extraño que confiere tolerancia herbicida. El cloroplasto puede ser un cloroplasto maduro o puede ser un cloroplasto inmaduro, tal como un etioplasto. Preferiblemente, el gen que confiere resistencia herbicida codifica la sintasa EPSP que enlaza menos fácilmente (tiene afinidad reducida) al glifosato que la que tiene con el tipo original de la EPSP sintasa. Si está presente, el segundo transgén generalmente es un gen que confiere resistencia antibiótica a la planta. De este modo, la resistencia herbicida se puede usar a manera de selección letal como un PP marcador para la transformación del cloroplasto mediante la 5 selección de transformantes por exposición a un medio con concentración letal del herbicida seleccionado, al cual sobrevivirán los transformantes. El origen del segundo gen puede ser procariótico (por ejemplo, bacteriano) o eucariótico (por ejemplo, planta) . 10 La invención también se relaciona con producir una • planta resistente a varios herbicidas, ya sea de la misma clase de herbicida o con diferentes clases de herbicidas, y las plantas resistentes transformadas a múltiples herbicidas. Algunas especies de plantas se sabe que desarrollan 15 una tolerancia natural y no permanente a ciertos tipos de herbicidas . La enseñanza de esta información es fácilmente aplicables a las mismas. La invención incluye un método para producir una • planta resistente al herbicida que comprende transformar el 20 cloroplasto de la planta introduciendo uno o más transgenes extraños los cuales codifican una proteína que confiere resistencia herbicida al genoma del cloroplasto en la planta. Preferiblemente, el transgén codifica una forma mutante de la enzima que tiene afinidad disminuida para un herbicida dado de 25 lo que lo hace la enzima que se presenta naturalmente.

La siguiente Tabla enlista una variedad de tipos de determinantes de resistencia, (productos químicos o "moléculas") que inhiben o los cuales confieren resistencia, y los herbicidas típicos relacionados a los mismos.

Tabla I DETERMINANTE DE RESISTENCIA HERBICIDAS 10 glutationa S-transferasa s-triazina • zimazina cloracetamida metalacloro Análogos de auxina 2, 4-D MCPA mecopop clorambén # EPSP sintasa glifosato 15 Qb (psbA) - Tipo PS II atrazina terbutina diclorofeni-dimetilurea metribuzina • leñadlo fenmedifam loxinilo dinoseb Acetohidroxiacido sintasa (ALS) sulfonilureas • clorosulfurón imazapir sulfometurón metil imidazolinonas Glutamina sintasa fosfinotricina Tipo PS I paraquat • diquat Acetil coenzima A carboxilasa ariloxifenoxipropanoato enzimas inhibidoras (Tipo APP) (APR) , ciclohexanodiona Interruptores de mitosis trifluralina, orizalina, pendimetalina, • dinitroanilina Para una revisión comprensiva del tópico de resistencia herbicida en plantas, véase Herbicide Resistance 5 Crops, Agricultural, Environmental, Economic, Regulatory and Technical Aspects, 1996, CRC Press, Inc., Editor, Stephen 0, Duke y Herbicide Resistance in Plants, Biology and • Biochemistry, 1994, CRC, Press, Editado por Stephen B. Powles y Joseph A.M. Holtum. En el primero de estos libros de referencia, el capítulo 3 en técnicas para producir cultivos resistentes (y las numerosas referencias citadas en el mismo) es de particular interés como antecedentes de la invención. Ambos libros se incorporan en la presente mediante referencia por entero. 15 De acuerdo con la invención se ha descubierto que en • el proceso para expresar un rasgo objetivo se puede expresar otro rasgo por la planta transformada el cual puede ser bastante deseable, sin duda puede ser más deseable que el rasgo inicialmente puesto en el blanco. En estas situaciones, las plantas se permitirá que se expresen y se seleccionarán en base del otro rasgo. La invención se ejemplifica en los siguientes ejemplos no limitantes. Eiemplo 1 Vectores de integración y expresión de cloroplasto universales • de tabaco . 5 Los vectores de cloroplasto universal ejemplares se construyeron cortando primero el fragmento BamHl del ADN de cloroplasto de tabaco (130656-140992) que contenía los genes de ARNr 16S y 23S y subclonándolos en un plásmido bacteriano disponible comúnmente pUC19. Un mapa del genoma de cloroplasto de tabaco se muestra en la Figura 1. Un fragmento HindIII- • EcoRI de 2.1 k pares de bases presente dentro de este fragmento, contenía una secuencia límite universal que comprende los genes trnl y trnA (Figura 5A) , que incluye la región espaciadora entre los genes, se subclonó en el plásmido pUC19 en el sitio PvuII (Figura 5B) . El plásmido resultante se designó pSBL-Ct Bor (Figura 5C) . El vector pSBL-RD-EPSPS (Figura 2B) contiene un gen de EPSP sintasa que codifica la enzima EPSP sintasa. El • glifosato, el ingrediente activo en ROUND UP® de Mosanto, se enlaza a la proteína EPSP sintasa y bloquea la síntesis de aminoácidos esenciales, dando como resultado la muerte de la planta. La EPSP sintasa codificada por el gen mutante no enlaza al glifosato, y por lo tanto confiere resistencia herbicida a las plantas cultivadas. 25 Otros genes, tales como los que confieren resistencia a factores ambientales adversos, tales como tolerancia a la sal, sequía (genes de osmotolerancia tales como betaína aldehido deshidrogenasa, (BADH) , para la sobreproducción de glicina betaína) o termotolerancia (genes que codifican 5 proteínas de choque de calor) o proteínas de tolerancia al choque por frío o resistencia a patógenas, tales como antimicrobianos (péptidos líticos, quitinasa) o antivirales (proteínas de recubrimiento) se pueden insertar de manera única o en combinaciones que no sean conflictivas en el vector de 10 cloroplasto universal, o en diferentes casetes del mismo vector • de cloroplasto universal para transformar la planta objetivo en una con el rasgo deseado. Construcción de un vector de integración de cloroplasto universal gue contiene una región espaciadora sintética 2 15 Un vector de cloroplasto universal que contiene solamente la región espaciadora 2 del genoma de cloroplasto de tabaco se construyó primero subclonando un oligonucleótido sintético que comprende la región espaciadora 2 en el plásmido P bacteriano pUC19. Las cadenas positiva y negativa de la 20 secuencia espaciadora de 64 pares de bases se sintetizaron, la secuencia de la cadena positiva fue como sigue: 5 GCTGCGCCAGGGAAAAGAATAGAAGAAGCATCTGACTACTTCATGCATGCTCCACTTGGCT CGG-3' 25 Los fragmentos sintéticos se mezclaron y se dejaron recocer, después se ligaron en pUC19 en el sitio PvuII. (Figura 5B) la inserción de un gen marcador seleccionable adecuado y el gen heterólogo fue como se describió p anteriormente para pSBL-CtBor. (Figura 5C) . 5 Para preparar una secuencia más larga que incluye los genes tRNAIle y el tRNAAla, se siguió la misma metodología.

TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS DIFERENTES Eiemplo 2 10 Transformación de cloroplasto de tabaco. El siguiente ejemplo describe un protocolo clásico para la transformación de cloroplasto de tabaco para el cual se puede usar cualquier vector. Dos de estos vectores se identifican más adelante. Todos los nuevos vectores de cloroplastos primero se trataron en tabaco como se describió en Daniell, (1997) . Las plantas de tabaco (Nicotiana tabacum var. Petit Havana) crecieron asépticamente mediante la germinación de semillas en medio MSO que contenía sales MS (4.3 gramos (litro) , mezcla de vitamina B5 (mio-inositol, 100 miligramos/litro; tiamina-HCL, 10 miligramos/litro,- ácido nicotínico, 1 miligramo/litro; piridoxina-HCl, 1 miligramo/litro) , sacarosa (30 gramos/litro) y fitagar (6 gramos/litro) con pH 5.8. Hojas verdes completamente extendidas de aproximadamente de plantas de dos meses de edad se seleccionaron para bombardeo.

Las hojas se colocaron con el lado abaxial arriba en un papel filtro Whatman número 1 que estaba en medio RMOP* en cajas de Petri estándares (100 x 15 milímetros) para bombardeo. Microproyectiles de Tungsteno (1 µm) u Oro (0.6 µm) se 5 recubrieron con ADN plásmido, de interés (por ejemplo, pSBL- RD-EPSPS o pZS-RD-EPSPS) y los bombardeos se llevaron a cabo con el dispositivo biolístico PDSIOOO/He (Bio-Rad) como se describió por Daniell, 1997. Después del bombardeo, las cajas de petri se sellaron para película y se incubaron a 24 °C bajo 10 un fotoperíodo de 12 horas. Dos días después del bombardeo, • las hojas se picaron en pedazos pequeños de aproximadamente un tamaño de 5 mm y se colocaron en el medio de selección letal (RMOP que contenía un marcador seleccionable tal como aproximadamente 500 µg/mililitro de dihidrocloruro de 15 espectinomicina) con el lado abaxial copiando el medio en cajas de petri profundas (100 x 25 milímetros) (aproximadamente 10 pedazos por placa) . Seleccionados de los brotes que murieron, los brotes resistentes a espectinomicina se picaron en pequeños • pedazos (aproximadamente 2 mm ) y se subclonaron en cajas de 20 petri profundas nuevas (aproximadamente 5 pedazos por caja) que contenían el mismo medio de selección letal. Los brotes resistentes del segundo ciclo de cultivo se transfirieron a medio de raíz (medio MSO suplementado con IBA, 1 µg/litro y un antibiótico adecuado como 500 µg/mililitro de diclorhidrato de 25 espectinomicina) . Las plantas de raíz se transfirieron a tierra y se cultivaron a 26 °C bajo condiciones de iluminación continua para el análisis posterior. Después de transferirlos al medio de selección de • talco, las explantas gradualmente se volvieron pálidas y en aproximadamente 3-8 semanas, se desarrollaron callos y brotes verdes del lado bombardeado de la hoja. Los brotes resistentes de cada callo se consideraron como una clona. La selección por reacción de cadena de polimerasa para los transformantes de cloroplastos después del primer 10 ciclo de cultivo mostraron que 12 de 20 clonas resistentes • integraron los genes extraños como el gen aadA enlazado al gen EG121 en el genoma de cloroplasto. Estas 12 clonas se avanzaron a otros pasos de regeneración. El proceso entero de regeneración, comenzando desde el bombardeo hasta la 15 transferencia a tierra, se llevó aproximadamente de 3 a 5 meses . La Figura 9 muestra plástidos de tabaco transformados y no transformados que crecen en presencia de espectinomicina • lo que indica la selección no letal en el medio (500 20 µg/mililitro) . Eiemplo 3 Transformación de cloroplasto de maíz. La esterilización superficial y germinación de semillas de maíz. Las semillas de maíz se esterilizaron superficialmente en una solución que contenía 20 por ciento (volumen/volumen) de blanqueador comercial y 0.5 por ciento de SDS durante 15 minutos bajo continuo sacudimiento, luego se enjuagaron serialmente en agua doble destilada estéril (sddw) • de cuatro a cinco veces. El medio de germinación basado en MS 5 líquido (CSG modificado) que contenía sales MS (4.3 gramos/litro), sacarosa (30 gramos/litro), vitaminas DM (1.0 miligramo/litro tiamina-HCl, 0.5 miligramo/litro de ácido nicotínico, 0.5 miligramo/litro piridoxina-HCl y 100 miligramos/litro mio-inositol) y BA (2.0 miligramos/litro) al pH 5.8 se dosificó mediante la caja Magenta® (45 mililitros) • que contenía ocho capas de cascara de queso, y luego se puso en autoclave. Las semillas se colocaron en CSG modificado (16 horas o luz continua,- 25 °C) para germinación. Secciones nodales se separaron asépticamente de los brotes de tres días de edad. La sección nodal pareció una demarcación clara en el brote de germinación y representa el séptimo nodo (Figura 10A) . Cuando se separó, los cortes transversales nodales fueron de aproximadamente 1.2 - 1.5 milímetros de longitud (Figura 10B) .

• Las Figuras 10A-G muestran la transformación de plástido de maíz y el esquema de regeneración. A) los brotes de maíz de tres días de edad; las flechas y la línea representan el séptimo nodo de la separación de la explanta; B) los cortes transversales nodales antes del bombardeo,- las flechas representan el margen de una sección; C) la sección nodal positiva para GUS (transformación nuclear) ; el ensayo histoquímico llevado a cabo tres días después del bombardeo; D) inducción de brote múltiple de una sección nodal (control) después de ocho semanas en cultivo,- E) brote de control en {j—k medio de alargamiento durante tres semanas,- F) planta de control con raíz; G) selección de maíz transformado de plástido en medio líquido que contenía espectinomicina y estreptomicina durante ocho semanas . Inducción de brote múltiple: las explantas de sección nodal se colocaron en medio de inducción de brote de maíz [CSl; sales MS, sacarosa y vitaminas DM como anteriormente, BA (2.0 miligramos/litro), CPA (0.25 miligramo/litro) y fitagar (8 gramos/litro) con pH 5.'8], con el extremo acropetálico hacia arriba, y colocado bajo condiciones de cultivo previamente mencionado. En todos los medios excepto en CSG y RG1 modificados (raíz) , los PGRs y los antibióticos se filtraron esterilizados y se añadieron después de la autoclave. Los tejidos se subcultivaron cada dos semanas en medio CSl nuevo para la formación de múltiples brotes (Figura 10D) . Los brotes adventicios se separaron los ramilletes de brotes después de ocho semanas de cultivo y se alargaron en medio basado MS semisólido que contenía sacarosa, vitaminas DM, glicina (10 miligramos/litro) y asparagina (150 miligramos/litro) con pH .8, durante tres semanas (Figura 10E) . Las plantas se dejaron con raíz (Figura 10F) en el mismo medio que contenía IBA (0.5 miligramo/litro) . Las plantas con raíz se crecieron en MS líquido sin PGR en tubos de ensayo (150 x 25 milímetros) que contenían cascara de queso como el material de ancla para lograr un crecimiento aumentado. Las plantas regeneradas se PP trasplantaron en medio de maceta, se aclimataron luego se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. La Figura 11 muestra la transformación de plástido de maíz. Las plantas de maíz transformadas se crecieron normalmente (brote medio) mientras que las plantas no transformadas murieron en el medio letal, confirmando la 10 selección letal por el antibiótico espectinomicina (100 • µg/mililitro) . Eiemplo 4 Transformación de cloroplasto de arroz. La esterilización superficial de las semillas de arroz y precultivo. Las semillas descascaradas de cualquier genotipo (tipos indica o japónica) se esterilizaron superficialmente primero en 70 por ciento de etanol durante 10 minutos bajo sacudimiento continuo luego se enjuagaron con agua • doble destilada aproximadamente cinco veces. Las semillas se sumergieron en una solución de benlato al 0.2 por ciento (peso/volumen) durante 20 minutos, se enjuagaron con agua bidestilada estéril cinco veces, luego en blanqueador al 50 por ciento durante 20 minutos con repetidos enjuagues de agua bidestilada estéril. Las semillas se precultivaron en medio RGl [sales MS, sacarosa y vitaminas DM como anteriormente, BA (2.0 miligramos/litro) con pH 5.8] . Como con el maíz, el RGl líquido se dosificó con cajas de Magenta® que contenían cascara de queso antes de meterlos a autoclave. Las semillas se • colocaron en RGl (100 semillas de cualquier genotipo por caja) 5 y se precultivaron durante la noche (16 horas o luz continua,- 23 °C) antes del bombardeo al siguiente día. Bombardeo de embriones en semillas de arroz intactas. Las semillas previamente cultivadas se empacaron ajustadamente de manera vertical, con el extremo del embrión hacia arriba (Figura 12A) , en el área central de 2.5 • centímetros de una caja de petri (25 por caja) que contenía medio RGl .1 (RGl más 8.0 gramos/litro de fitagar) y se bombardearon con microproyectiles recubiertos con ADN. Precipitación de ADN. 15 El procedimiento se describe para maíz con las siguientes modificaciones. Diez µl de ADN (1.0 µg/µl) y 20 µl de isopropanol (2X vol de ADN) , 60 µl 2.5 M CaCl2 y 15 µl de 0.1 M de espermidina se usaron. Cada disparo administró 2.0 µg de • ADN y 720 µg de tungsteno. 20 Las Figuras 12A-F muestran la transformación de plástidos de arroz y el esquema de regeneración. A) las semillas de arroz, con el extremo de embrión hacia arriba, justo antes del bombardeo,- las flechas apuntan a los márgenes del embrión; B) inducción de múltiples brotes de un embrión de control después de siete semanas de cultivo,- C) selección de brotes de arroz transformado por plástido surgiendo del embrión de raíz inicial en medios que contenía espectinomicina y estreptomicina después de ocho semanas en medio selectivo,- las • flechas apuntan a dos transformantes putativos,- D) 5 regenerantes de arroz de control; E) priscilla transgénica 2.3; F) priscilla transgénica 2.4. Inducción de múltiples brotes y selección de transplastómicos postbombardeo. Las semillas de arroz se separaron y se dispersaron en medio RGl .1 (manteniendo la polaridad) y se colocaron en la • oscuridad durante dos días después del bombardeo. El extremo de embrión de la semilla se cortó (el embrión más una pequeña cantidad de endospermo) del resto del endospermo que se descartó. Los embriones se colocaron en 50 mililitros de medio RG2 líquido (en matraz de 250 mililitros) para la inducción de múltiples brotes (Figura 12B) . RG2 contenía sales MS , sacarosa y vitaminas DM como anteriormente, y BA (6.0 miligramo/litro) a pH 5.8. RG2 usado para la selección incluye espectinomicina • (1000 µg/mililitro) más sulfato de estreptomicina (100 µg/mililitro) . Los cultivos se colocaron en la cámara de crecimiento (16 horas de fotoperíodo; 25 °C) y se subcultivaron cada dos semanas en medio de selección nuevo. Los brotes verdes se seleccionaron de los ramilletes de brotes que surgían de cada embrión y se colocaron de nuevo en medio selectivo (Figura 12C) . Se logró el enraizado en el medio RG3 [sales MS, sacarosa y vitaminas DM como anteriormente, IBA (0.5 miligramo/litro) con pH 5.8] más antibióticos. , (Los brotes podían estar separadamente enraizados o como ramilletes de P brotes múltiples) . Las plantas se trasplantaron en medio de 5 macetas, se aclimataron y se volvieron a enmacetar en una arcilla,- arena (1:1) en mezcla y se cultivaron hasta la madurez en el invernadero. (Figuras 12D, E, F) . Desarrollo de protocolos de transformación y regeneración de plástidos para maíz y arroz. 10 Como se describió anteriormente los protocolos únicos de transformación y regeneración nuclear del maíz (Figura 10) se desarrollaron (Rudraswamy, 1997) y se adaptaron para la transformación de plástido. (Antes de este trabajo, las explantas de sección nodal no se habían usado para la transformación o regeneración) . Se indujeron múltiples brotes en secciones nodales separadas de brotes de tres días de vida de 21 genotipos (ninguno relacionado con A188 o B73) que incluyeron genotipos híbridos (16 granos, uno dulce) y endogámicos (cuatro) genotipos. Después de ocho semanas en cultivo, 16 - 32 brotes (promedio 24) se generaron por explanta. Los brotes se dejó que les creciera raíz y los regenerantes no desplegaron fenotipos aberrantes en los análisis de invernadero (estudio limitado de dos plantas por genotipo) . El ADN también se pudo administrar en las explantas de sección nodal en todos los genotipos (Figura 10C; expresión /3-glucuronidasa transitoria) . Para la transformación de plástido, las explantas sección nodal se bombardearon con pSBL- ctV2, luego se colocaron en un medio de inducción de brote • múltiple que contenía espectinomicina y estreptomicina. Los 5 brotes que surgieron se separaron y se recolocaron en medio de inducción de brote para rondas subsecuentes de selección. Como se describió anteriormente los objetivos de raíz únicos se dehusked semillas maduras intactas, con el extremo de embrión hacia arriba, no usados en los protocolos de transformación reportado anteriormente se acoplaron con un • protocolo de inducción de brote múltiple (Figura 12) para embriones maduras (separados dos días después del bombardeo) . Brotes múltiples se indujeron en los ocho genotipos probados (Litton, Priscilla - dos cultivos de Misisipí nuevamente liberados, más seis líneas de otra vez crecimiento) . La respuesta anotada deberá ser similar en numerosos otros cultivos ya que la explanta inicial es un embrión maduro. Los regenerantes (no transformados) se están manteniendo para la • recolección de semilla Fl . Después de la transformación del plástido, la multiplicación del brote se presenta en presencia de espectinomicina/estreptomicina y, como con el maíz, los brotes se pudieron sufrir numerosas rondas de selección debido a la proliferación de brotes (desconocido si fueron auxiliares o adventicios en origen) desde la base de brotes separados. La formación de raíz también se llevó a cabo en medio selectivo.

Las Figuras 13A-B muestran análisis de reacción de cadena de polimerasa para ADN aislado de las hojas de la primera generación de transformantes de maíz. El análisis de *^ reacción de cadena de polimerasa se hizo con ADN aislado de las 5 hojas de la primera generación. Los productos de reacción de cadena de polimerasa no fueron abundantes como se observó en las plantas transgénicas de cloroplasto de tabaco (Figura 13A, franja 11, 13B, franja 12) . Esto puede ser debido a dos razones. El protocolo usado para aislar ADN no es conveniente 10 para las hojas de arroz burdas o que los cebadores designados • para trabajo no se recuecen también con ADN ct de arroz. Sin embargo, para análisis preliminar se usaron cebadores de tabaco para probar la integración del gen aadA del genoma de planta del vector universal. La falta de un producto indicaría 15 mutantes espontáneos, capaces de crecer en espectinomicina sin el gen aadA (Figura 13A, franja 7-10) . Un producto de reacción de cadena de polimerasa de 1.57 Kb se detectó en cuatro líneas (Figura 13A, franjas 2-6) transformadas con el vector ^ universal. Después de las condiciones de selección usadas, se 20 detectaron cuatro mutantes de 10 líneas transformadas con el vector universal . Los cebadores también se diseñaron para identificar específicamente la integración en el genoma del plástido. Para el vector universal, el cebador del genoma de cloroplasto nativo se aterrizó en el gen de ARNr 16S, fuera de 25 la secuencia de flanqueo del vector de cloroplasto (1.60 Kb de producto de reacción de cadena de polimerasa) . Los productos esperados se observaron para las líneas transgénicas obtenidas usando el vector universal (Figura 13B, franjas 5,6) . Las • plantas no bombardeadas (controles) no produjeron ningún 5 producto de reacción de cadena de polimerasa, como se esperaba (Figura 13B, franja 2; Figura 13A, franja 1) . La reacción de cadena de polimerasa dio como resultado la identificación de dos plantas de arroz "Priscilla" (2.3 y 2.4) que contenían plástidos transformados (Figuras 12 y 13) . 10 Eiemplo 5 Transformación de cloroplasto de cacahuate (Arachis hipogaea) . Los cacahuates transgénicos que tenían genomas de cloroplastos transformados se obtuvieron usando el vector universal pSBL-CG-CtV2 (Figura 7A) . El tejido de cacahuate se hizo crecer en cultivo de acuerdo con protocolo descrito por Kanyand y colaboradores, 1994. Las condiciones de bombardeo fueron las mismas que para la transformación de cloroplasto de tabaco como se describió anteriormente, excepto que secciones de epicotilo se usaron para bombardeo al mismo tiempo que se usaron discos de ruptura de presión variable. La transformación de cloroplasto de cacahuate nunca se había reportado anteriormente . La Figura 14 muestra la transformación de plástido de cacahuate. Las plantas de cacahuate transformadas crecieron normalmente (en medio y el lado izquierdo del plato) al mismo tiempo que las plantas no transformadas murieron en el medio letal (500 µg/mililitro) .

P Eiemplo 6 5 Transformación de cloroplasto de frijol de soya. El frijol de soya transgénico tenía genomas de cloroplasto transformados se obtuvieron usando el vector universal pSBL-CG-CtV2 (Figura 7A) . Las condiciones de bombardeo fueron como la transformación de cloroplasto de tabaco. La transformación de cloroplasto de frijol de soya flp nunca se había reportado anteriormente . La Figura 15 muestra la transformación plástico del frijol de soya. Dos plantas transformadas muestran brotes, la otra planta murió en el medio letal, confirmando la selección letal mediante la espectinomicina antibiótica (500 µg/mililitro) . Eiemplo 7 Transformación de cloroplasto de camote. w? Las plantas de camote que tenían genomas de cloroplasto transformadas se obtuvieron usando el vector universal pSBL-CG-CtV2 (Figura 7A) . El tejido de camote se cultivó en cultivo de acuerdo con el protocolo descrito por Zhang y colaboradores, 1996. Las condiciones de bombardeo fueron iguales que para la transformación de cloroplasto de tabaco como se describió anteriormente, excepto que los callos y los embriones primarios se bombardearon y, después del bombardeo, se transfirieron a placas que contenían 100 miligramos/mililitro de espectinomicina. La transformación de • cloroplasto de camote nunca se ha reportado anteriormente. 5 La Figura 16 muestra la transformación de embriones de camote sobre el medio de selección de antibiótico espectinomicina letal (500 µg/mililitro) . Nótese los callos blanqueados (derecha) y los embriones verdes (izquierda) . Eiemplo 8 10 Transformación de cloroplasto de uva. • Las plantas de uva transgénicas que tienen genomas de cloroplasto transformadas se obtienen usando el mismo vector universal pSBL-CG-CtV2. El tejido de uva se cultiva en el cultivo de acuerdo con el protocolo de Hebert y colaboradores, 15 1993. Los protocolos de transformación de cloroplasto son como para el tabaco excepto que la célula en la fase exponencial de crecimiento, aproximadamente 4 días después del subcultivo, se usaron para bombardeo. La transformación de cloroplasto de uva • nunca se reportó previamente. 20 La Figura 17 muestra la transformación de las células de uva. Las células de cultivo transformado se vuelven verdes mientras que las células no transformadas mueren en el medio de selección de antibiótico espectinomicina letal (500 µg/mililitro) . 25 Ejemplo 9 Transformación de otras plantas. La transformación de plantas por medio de bombardeo por microproyectiles es una técnica favorecida para introducir • el vector universal que lleva la secuencia de nucleótidos 5 deseada que modifica la molécula de interés en las plantas objetivo. Las plantas transgénicas ilustrativas obtenidas a través del bombardeo por microproyectil se muestran en la Tabla II. Tabla II 10 Plantas transgénicas recuperadas a través de bombardeo de microproyectiles Especies vegetales Explanta utilizada para la transformación Alfalfa Cáliz de petiolo, secciones de tallo Arabidopsis Secciones de raíz 15 C Ceebbaaddaa Callo embriogénico, embriones inmaduros Plátano Células embriogénicas en suspensión Frijol Meristemos Cítricos Células embriogénicas Algodón Suspensiones embriogénicas; meristemos 20 Arándano Secciones de tallo Pepino Cotiledóneos Dendrobium orchid Protocormios Eucalipto Embriones cigóticos Uva Células embriogénicas en suspensión Maíz Suspensiones embriogénicas; embriones inmaduros Avena Embriogénico Papaya embriones cigóticos/somáticos,- hipocotilos Pastura Callos embriogénicos Durazno Callos derivados de embriones Cacahuate Meristemos TTuulliippeerroo Embriogénicos Arroz Embriones cigóticos La transformación de plantas mediante el uso del cañón de genes se describe en Daniell, 1997. Cada cultivo que fue reportado para ser transformable nuclearmente vía bombardeo de microproyectiles en la Tabla puede tener su genoma de cloroplasto transformado usando el vector universal como se describe en la presente. Eiemplo 10 Expresión de productos no vegetales Los ejemplos que siguen, ilustran la expresión de biopolímeros basados en proteína biodegradable (PEPs) y el análisis de transformantes. Vector pSBL-CG-EG121.

El vector pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) contiene el gen (GVGVP) i2imer (designado EG121) que codifica el biopolímero basado en proteína biodegradable (PBP) que tiene muchas • aplicaciones médicas y no médicas. 5 Construcción de vectores de expresión de cloroplasto. Los protocolos estándares para la construcción de vectores fueron como se presentó en Sambrook y colaboradores, 1989. Los vectores de integración y ex de cloroplasto pSBL- CtV2 (Figura 7A) y pZS197 se digirieron, respectivamente, con Xbal (un sitio único entre el gen aadA y el psi_>A de la región • 3') y Spel (un sitio único 120 pares de bases corriente abajo del gen aadA y la región reguladora 3 ' psbA) , lleno por Klenow y desfosforilado . El gen de polímero EG121 junto con la secuencia de Shine-Dalgarno (GAAGGAG) desde el vector pETlld fue separado como un fragmento Xb l-BamHI del plásmido pETlld- EG121. Los extremos pegajosos del fragmento de inserto se llenaron por Klenow y se ligaron con vectores pSBL-CtV2 o pZS197 produciendo vectores de expresión de cloroplasto pSBL- • CG-EG121 (Figura 3A) y pZS-CG-EG121 (Figura 3B) , las cuales integran los genes aadA y EG121 en la repetición invertida (IR) o en la región espaciadora entre los genes rjbcl y orf 512 del genoma de cloroplasto de tabaco. Haciendo referencia a la Figura 1, para "UV" y "TV", sitios de integración, respectivamente . 25 Expresión de biopolímero en E. coli y tabaco.

S El vector de plásmido pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) se transformó en la cepa de E. coli XL-1 Blue y se cultivó en caldo terrífico en presencia de ampicilina (100 µg/mililitro) • a 37 °C durante 24 horas. Se llevó a cabo SDS-PAGE de acuerdo 5 con Laemmli, 1970 usando un gel de resolución al 12 por ciento y un gel de apilamiento al 5 por ciento y se corrió durante 5 horas a corriente constante de 30 mAmps. Extractos de proteína cruda de células de E. coli se prepararon y se electroforaron como se describe por Guda y colaboradores, 1995. Después de electroforesis, los polipéptidos se visualizaron mediante • manchado negativo con CuCA- La Figura 18 muestra la expresión de los vectores de integración y expresión de cloroplasto en la cepa de E. coli HMS174 (DE3) . La franja 1, muestra la proteína de polímero purificada; la franja 2, muestra el control de E. coli no transformado; la franja 3, muestra la cepa de E. coli XL-1 Blue transformada con el vector universal pSBL-CG-EG121 (Figura 3A) ; la franja 4 muestra E. coli transformado con el vector de • tabaco y la franja 5 muestra la cepa de E. coli HMS174 (DE3) transformada con el vector pETlld-EG121, en el cual el promotor T7 transcribe el gen de polímero. El nivel de expresión mediante el promotor Prrn en E. coli fue casi equivalente al del promotor T7 muy eficiente conducido por el gen de polímero. Análisis de manchado Southern. 25 El ADN total se extrajo de hojas de plantas transformadas y del tipo original usando el procedimiento CTAB de Rogers y Bendich, 1988. Las Figuras 19 y 20 muestran el análisis de manchado Southern realizado independientemente con los transformantes obtenidos usando los vectores de tabaco (Figura 19) y el universal (Figura 20) . El ADN total fue digerido con BcoRI y HindIII en caso de los transformantes del vector universal (UV) 0 EcoRI y EcoRV en caso de los transformantes del vector de tabaco (TV) . La presencia de un sitio EcoRI en el extremo 3 ' del gen de polímero permitió la separación de fragmentos de • tamaño previsto en los transformantes de cloroplasto solamente. Para confirmar la integración del gen extraño y la homoplasmia, se probaron manchados individuales con correspondientes secuencias de límite. En el caso de transformantes de vector tabaco después de la segunda o tercera ronda de selección, la secuencia límite se hibridizó con fragmentos de 4.6 y 1.6 kbp (Figura 19A, franjas 2, 3 y 4) y con un fragmento original de 3.1 kbp en el tipo natural (Figura 19A, franja 1) . Por otro • lado, en el caso de transformantes de vector universal, después de la primera ronda de selección, la secuencia límite se hibridizó con fragmentos 4.0 kbp y 1.2 kbp (Figura 20A, franjas 1 y 2) mientras que se hibridizó con un fragmento original de 2.1 kbp en el control (Figura 20A, franja 3) . Más aún, los transformantes de vector de tabaco también mostraron que el fragmento original de 3.1 kbp (Figura 19A, franjas 2 y 3) similar a la planta de tipo natural que indica condición heteroplásmica de los genomas de cloroplasto transformados, aunque han estado bajo varias rondas de selección. Sin embargo, ambos transformantes de vector universal mostraron condición homoplásmica, aún después de la primera ronda de selección (Figura 20A, franjas 1, 2) . La presencia de heteroplasmia aún después de la segunda selección fue reportada más anteriormente y se sugirió que la selección deberá hacerse hasta alcanzar la homoplasmia (Svab y Maliga, 1993) . Esto es consistente con la observación de que un alto grado de heteroplasmia existe después de un segundo ciclo de selección en los transformantes TV (Figura 19A, franjas 2 y 3) . Sin embargo, no se observó ninguna condición heteroplásmica en caso de los transformantes de vector universal lo cual puede ser debido al mecanismo de corrección de copia entre las regiones IR y/o la presencia del origen de réplica de cloroplasto (ori) dentro de la secuencia límite, la cual deberá aumentar el número de copias del plásmido introducido antes de la integración. Los manchados de gel de ADN también se cebaron ya sea con el gen aadA (plantas integradas de vector universal) o con el gen EG121 (plantas integradas con vector de tabaco) para reconfirmar la integración de genes extraños en la sonda de gen hibridizada con un fragmento de 4.6 kbp, solamente en las líneas transformantes de plástido (Figura 19B, franjas 2, 3 y 4) . También, en las plantas integradas de vector universal, la secuencia aadA hibridizadas con un fragmento 4.0 kbp esperado (Figura 20B) el cual también se hibridizó con la secuencia A límite en las líneas de transformante de plástido (Figura 20A, franjas 1 y 2) . Análisis de niveles de transcripción en tabaco transgénico y manchado Northern. Los niveles de transcripción de gen extraños se analizaron mediante manchado Northern (Figura 21) usando ARN total aislado del control, transformantes de cloroplasto y una • planta transgénica de tabaco que expresa altamente el gen de polímero (EG121) vía el genoma nuclear (Zhang y colaboradores, 1996) . El gen de polímero (EG121) es una secuencia hibridizada con un fragmento de 1.8 kbp en los transformantes de cloroplasto (franjas 1-4, 5-6) y también con fragmentos de tamaño menor en uno de los transformantes de cloroplasto (franja 6) . En el caso del transformante nuclear, una transcripción de aproximadamente 2.1 kbp se observó (franja 7) . Esto se debió a la presencia de una cola poli A en el extremo 3 ' de la transcripción de polímero proporcionada por el terminador nos . Los fragmentos de tamaño menor observados en la .franja 6 pueden ser los transcritos de di-, tri- o policistrónico que se están procesando en cloroplastos. Esto es un fenómeno común en la expresión del gen de cloroplasto debido a que muchos genes de plástidos se organizan en unidades de transcripción policistrónicas que dan lugar a conjuntos complejos de ARNm traslapados. La cuantificación de niveles de transcripciones reveló que los transformantes de cloroplasto se # producían 11 veces (franja 5) o más de cincuenta veces (franja 5 6) de transcripciones de polímero sobre de los transformantes nucleares altamente expresados (franja 7, la planta de más alta expresión entre treinta y cinco plantas transgénicas nucleares de vector de tabaco examinada) . Esto se atribuye directamente a la presencia de un número mayor de copias de genes en los cloroplastos de plantas transgénicas. El vector de tabaco (TV) • integró los transformantes plástidos mostró niveles más bajos de transcripción de polímero (franjas 1-4) comparado con los transformantes integrados del vector universal (franja 5, 6) debido a que el gen de polímero existe como dos copias por genoma de plástido transformado en transformantes de vector universal como en contra de una sola copia en los transformantes de vector de tabaco y las condiciones heteroplásmicas observadas en transformantes de vector de • tabaco. 20 Análisis de manchado Western. La proteína de polímero se purificó a partir de hoja de tabaco tipo silvestre, transformante de cloroplasto y plantas transgénicas nucleares siguiendo el método recientemente descrito por Zhang y colaboradores, 1995. El polímero purificado se realizó mediante SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli, 1970 usando un gel de resolución de 12 por ciento y un gel de apilamiento al 5 por ciento y corriendo durante 5 horas a una corriente constante de 30 mAmps. Los polipéptido de • polímero de aproximadamente 60 kDa se visualizaron mediante 5 manchado negativo con 0.3 M CuCl2. Los gels se desmancharon en 0.25 M de EDTA de sodio y 0.25 M de Tris-Cl, pH 9.0 con tres cambios de regulador a intervalos de 10 minutos. El inmunomanchado Western y teñido (Figura 22) se llevó a cabo como se describe por Zhang y colaboradores, 1996 usando un antisuero monoclonal cultivado contra el polímero AVGVP con • reactivos cruzados con polímero GVGVP y el "juego de ensayo de inmunomanchado" (Bio-Rad) . Los polipéptidos de polímero se corrieron a aproximadamente 60 kDa se ven en los transformantes de plástido de plantas integradas IR. La expresión de polímero a partir de la generación de F2 altamente expresada de planta transgénica nuclear (la planta de expresión mayor entre 35 plantas transgénicas examinadas) se ve en la franja 5 (Figura 22) , aunque ningún polímero se expresó en el control no • transformado como se ve en la franja 4 (Figura 22) . De once a cincuenta veces de nivel más alto de transcripciones de polímero se muestra en los transformantes de cloroplasto (Figura 21) . En el caso de proteínas que se presentan naturales cloroplasto como valina y prolina cuyas sendas biosintéticas se comparten en cloroplastos, se puede esperar que se produzcan mayores niveles de proteína.

Eiemplo 11 Ingeniería genética de tolerancia glifosato vía los genomas nuclear y de cloroplasto • Vectores de integración y expresión de cloroplasto con EPSPS en 5 tabaco. La secuencia de codificación EPSPS recientemente se ha integrado en el genoma de cloroplasto de tabaco (Figura 1) . El vector de cloroplasto pZS-RD-EPSPS (Figura 2A) contiene el promotor de ARNr 16S (Prrn) que conduce los genes de aadA y EPSPS con la región 3 ' psbA del genoma de cloroplasto de # tabaco. Esta construcción integra los genes EPSPS y aadA en la región espaciadora entre los genes rbcL y orf 512 del genoma de cloroplasto de tabaco. La Figura 1, en la fecha "TV". Prueba para resistencia glifosato. Expresión de gen en E. coli . Debido a la alta similitud en los sistemas de transcripción y traducción entre E. coli y los cloroplastos (Brixey y colaboradores, 1997) , los vectores de expresión de cloroplastos primero se probaron en JE?_ coli para determinar la resistencia en este caso al glifosato antes de proceder con la transformación de plantas superiores. La velocidad de crecimiento más alta de E. coli que contenía el vector de tabaco en comparación con el control que contenía pZS197 (similar al pZS-RD-EPSPS pero que carecía del gen EPSPS) en presencia de 10 mM y 40 mM de glifosato (Figura 23A) indica tolerancia al glifosato de E. coli que expresa el gen EPSPS. Otra curva de crecimiento (Figura 23B) , confirma la expresión de EPSPS vía el vector universal en E. coli . De este modo, la tolerancia al glifosato de E. coli se debe a la expresión del gen EPSPS, presente tanto en el vector de tabaco como en el universal . CARACTERIZACIÓN DE PLANTAS TRANSGENICAS DE TABACO Integración del gen. Hojas verdes totalmente extendidas de Nicotiana tabaccum variedad Petit Havana se bombardearon con los vectores de cloroplasto de tabaco y el universal . Dos días después del bombardeo, las explantas de hojas se transfirieron a medio letal de selección que contenía espectinomicina (500 µg/mililitro) . Las plantas transgénicas se obtuvieron dentro de los 3-5 meses después del bombardeo. Típicamente, de 16 hojas bombardeadas, 10 brotes transformados independientemente se identificaron. Se realizó análisis de reacción de cadena de polimerasa con ADN aislado de la primera o segunda generación de brotes y también de las plantas transgénicas maduras. Se usaron cebadores para confirmar la integración del gen aadA en el genoma de planta del tabaco así como de los vectores universales. La falta de un producto indicaría mutantes espontáneos, capaces de crecer en espectinomicina en el gen aadA. El producto de la reacción de cadena de polimerasa esperado (887 pares de bases) se obtuvo a partir de seis líneas (Figuras 24 A-B, franjas 1-6) transformados con el vector de tabaco. Un producto de reacción de cadena de polimerasa de • 1.57 Kb se detectó en cuatro líneas (Figuras 24 A-B, franjas 1- 5 4) transformadas con el vector universal. Bajo las condiciones de selección usadas, se detectaron cuatro mutantes de diez líneas transformadas con el vector de tabaco. Por otro lado, todas las líneas transgénicas transformadas con el vector universal mostraron integración del gen aadA. 10 Integración de cloroplasto de reacción de cadena de polimerasa. También se diseñaron cebadores para específicamente identificar la integración en el genoma del plástido. La estrategia aquí fue lanzar un cebador en el genoma de cloroplasto original, adyacente al punto de integración del vector, al mismo tiempo que poner el otro sobre el gen aadA. Un cebador se designó para ponerse inmediatamente fuera del gen rbch en el vector de tabaco (2.08 Kb producto de reacción de cadena de polimerasa) . Para el vector universal, el cebador en el genoma de cloroplasto original se puso en el gen de ARNr 16S (1.60 Kb producto de reacción de cadena de polimerasa). Los productos esperados se observaron para determinar las líneas transgénicas obtenidas usando el vector de tabaco (Figuras 24 A-b, franjas 2-7) así como el vector universal (Figuras 24 A-b, franjas 1-4) . Las plantas no bombardeadas (controles) no produjeron ningún producto de reacción de cadena de polimerasa, como se esperaba (Figuras 24 A, franjas 1 y 9; 24 B, franjas 5 y ll) . De este modo, todas las plantas transgénicas examinadas se volvieron cloroplastos y no transformantes • nucleares quizás debido al requisito de niveles más altos de 5 aminoglicosida adenil transferasa (AADA) en plantas transgénicas bajo condiciones de selección estrictas. Los niveles bajos de AADA presentes en el codicilo de plantas * transgénicas nucleares, deberá haber eliminado los transformantes nucleares. Los resultados del análisis de reacción de cadena de polimerasa son concluyentes y • proporcionan evidencia definitiva de la integración de cloroplastos de genes extraños usando los vectores tanto de tabaco como universal . Análisis Southern. 15 La integración del gen aroA en el cloroplasto también fue confirmado por análisis Southern. Además, el alto nivel de resistencia al glifosato observado (Figura 29 A) fue confirmado mediante la determinación del número de copias del gen extraño • en plantas transgénicas. La sonda, para determinar la integración del gen extraño en el genoma de cloroplasto, comprendía un fragmento de 654 pares de bases del gen EPSPS, el cebador aleatorio etiquetado con P32. El ADN total que comprende tanto organelar como genómico fue digerido con BcoRI . La presencia de un sitio BcoRI de 200 pares de bases corriente arriba del sitio de integración, en el genoma de cloroplasto, se usó para confirmar la integración del gen EPSPS en el genoma de cloroplasto en plantas transgénicas. La sonda hibridizada al gen EPSPS natural, presente en el genoma nuclear, se ve como un fragmento de 4.5 Kb . Además, la sonda hibridizada a los 5 genomas de cloroplasto digeridos de las plantas de tabaco transgénico, generando los fragmentos de 3.5 Kb y 4.35 Kb en la Figura 25 A, franjas 2, 3 y 4. La sonda no hibridizó al genoma de cloroplasto digerido de la planta de control no transformada (Figura 25 A, franja 1) ya que el gen extraño no está presente en el genoma de cloroplasto de tabaco. Esto # claramente establece la integración, del gen EPSPS, en el genoma de cloroplasto. Números de copia de genes . El número de copias del gen integrado se determinó estableciendo la homoplasmia del genoma de cloroplasto transgénico. Los cloroplastos de tabaco contienen 5000-10,000 copias de su genoma por célula. (McBride y colaboradores, 1995) si solamente una fracción del genoma se transforma • actualmente, el número de copias, por omisión, debe ser menor de 10,000. Al establecer que los transgénicos el EPSPS genoma transformado es el único presente, uno podría establecer que el número de copias es de 5000-10,000 por célula. Esto fue mostrado digiriendo el ADN total con BcoRI y sondeando, con secuencias de flanqueo que permiten la recombinación homologa en el genoma de cloroplasto. La sonda comprendía un fragmento de 2.9 Kb de las secuencias rbcL-orf 512. Un genoma de cloroplasto transformado con gen EPSPS, incorpora un sitio .EcoRI entre la región rbch- orf 512 del genoma de cloroplasto, generando mediante esto un fragmento extra cuando se difiere 5 con esta enzima (Figura 25 C) . El análisis de hibridización Southern reveló un fragmento de 4.43 Kb en la Figura 25 B, franja 1 para el control no transformado. En las franjas 2, 3 y 4, dos fragmentos (4.35 Kb y 3 Kb) se generaron debido a la incorporación del gen EPSPS de cásete entre las regiones rbcL y orf512 (Figura 25 C proporciona un diagrama esquemático con # líneas punteadas en gris significando el punto de integración del ADN extraño) . El fragmento de 4.43 Kb presente en el control está ausente en los transgénicos. Esto prueba que solamente el genoma de cloroplasto transgénico está^presente en la célula y no hay genoma de cloroplasto natural, no transformado, sin el gen EPSPS presente. Esto establece la naturaleza homoplásmica de los transformantes, simultáneamente proporcionando una estimación de las 5000-10,000 copias del gen • EPSPS extraño por célula. Esto explicaría entonces los altos niveles de tolerancia de glifosato que se observaron en las plantas de tabaco transgénico (Figura 20 A) . Progenie. Semillas recolectadas de plantas transgénicas autopolinadas se germinaron en presencia de espectinomicina (500 µg/mililitro) . Todas las semillas germinadas, permanecieron verdes y crecieron normalmente (Figura 26B) . La resistencia uniforme a la espectinomicina indicó que el gen aadA fue transmitido a toda la progenie. La falta de • variegación sugirió homoplasmia debido a una condición de 5 heteroplásmica habría dado lugar a progenie variegada sobre espectinomicina (Svab y colaboradores, 1990; Svab y Maliga, 1993) . La falta de variación en pigmentación de clorofila entre la progenie también baja la calificación con la ausencia de efecto de posición, un artefacto de transformación nuclear.

Todas las semillas de control están blanqueadas, y no crecieron • en presencia de espectinomicina (Figura 26A) . Tolerancia de glifosato. Plantas de control y transgénicas de 18 semanas de edad fueron rociadas con volúmenes iguales de glifosato a diferentes concentraciones (0.5 a 5 mM) . Las plantas de tabaco de control fueron extremadamente sensibles al glifosato; murieron dentro de los siete días a 0.5 mM de glifosato (Figura 27B) . Por otro lado, las plantas transgénicas de cloroplasto • sobrevivieron concentraciones tan altas de 5 mM de glifosato (Figura 27A) . Estos resultados son intrigantes, considerando el hecho de que el gen EPSPS de petunia usado en estos vectores de cloroplastos tiene un bajo nivel de tolerancia al glifosato y también contiene el péptido de tránsito para dirigirlo en los cloroplastos . 25 Este es el primer reporte de un gen de expresión nuclear eucariótico dentro del compartimiento del cloroplasto procariótico. Es muy sabido que la preferencia de codón es significativamente diferente entre el compartimiento de cloroplasto procariótico y el compartimiento nuclear 5 eucariótico. Idealmente, un gen aroA mutante (que no enlaza glifosato) a partir de un sistema procariótico deberá expresarse en el compartimiento de cloroplasto. Estos genes están ahora disponibles y exhiben mil veces mayor nivel de resistencia al glifosato que el gen de petunia usado en este 10 trabajo. A la luz de estas observaciones, es posible la • integración de genes de resistencia herbicida procarióticos en el genoma de cloroplasto como se realiza en la presente puede dar como resultado increíblemente altos niveles de resistencia a herbicidas al mismo tiempo que todavía se mantiene la 15 eficacia de la contención biológica, es decir, se evita la diseminación por polen. Eiemplo 12 Tolerancia de maíz al glifosato. • Un vector de cloroplasto universal que usa ADN de 20 cloroplasto de maíz se construye como sigue. Primero, el vector pSBL-Ct-bor (Figura 5C) se construye como sigue: la subclona de ADN de cloroplasto de maíz que contiene una de las regiones de repetición invertida se construye con plásmido bacteriano pUC19. Segundo, una subclona menor que contiene 25 solamente el operón de ARNr se construye a partir de la primera subclona y el fragmento presente en la segunda subclona que contiene los genes trnA y trnl y las regiones espadadoras que representan el límite universal se subclonan en un plásmido pUC19 y el sitio PvuII. El plásmido resultante se designa 5 pSBL-Ct-bor. Dentro del plásmido pSBL-Ct-bor, un cásete de gen marcador seleccionable que contiene un cloroplasto promotor de ARNr 16S, el gen aadA (que codifica aminoglicosida 3' adenil transferasa que contiene resistencia para estreptomicina/espectinomicina) y una región no traducida 3 ' del gen psbA del cloroplasto se inserta para el vector de • construcción pSBL-CORN. El cásete del gen marcador seleccionable se inserta entre los genes trnl y trnA en la región espaciadora, en la dirección de la transcripción de ADNr 16S. 15 El vector pSBL-CORN-aroA, el cual contiene un gen aroA mutante de Salmonella typhimuri um (Stalker y colaboradores, 1985; Comai y colaboradores, 1983) que codifica la enzima EPSPS sintasa, se construye insertando el gen aroA wf mutante en el vector pSBL-CORN. Las plantas de maíz transgénicas que expresan el gen aroA mutante resistente al tratamiento de glifosato como "Roundup®" mientras que las plantas de control no transformadas no lo son.

Eiemplo 13 25 Transformación de cloroplasto para tolerancia a imidizolinonas o sulfonilureas. El plásmido pSBL-CORN es modificado mediante la inserción de un fragmento de ADN que contiene una forma mutada . k del gen de sintasa acetolactato de Saccharomyces cerevisiae (Falco y Dumas, 1985; Yadav y colaboradores, 1986) para generar el plásmido pSBL-CORN-ASLl . Este gen codifica un acetolactato sintasa que no es inhibida por imidizolinonas o sulfonilureas y confiere tolerancia a herbicidas que contienen sulfometurón metilo y herbicidas que contienen Imazapiro. Las plantas de tabaco transformadas que expresan el gen P acetolactato sintasa mutante son resistentes a imidizolinona y rocíos herbicidas de sulfonilurea. El vector pSBL-CORN-ALS2 es un derivado de pSBL-CORN que contiene copias mutadas de los genes de tabaco suRA y suRB (Chaleff y Ray, 1984) . Estos genes codifican el polipéptido de acetolactato sintasa de tabaco. El plásmido pSBL-C0RN-ALS2 se construye ligando los genes suRA y suRB, aislados a partir del ADN genómico de tabaco en el vector pSBL-CORN. El vector flf' resultante confiere resistencia a imidazolinona y a herbicidas de sulfonilurea. Eiemplo 14 Transformación de cloroplasto para tolerancia a inhibidores de fotosistema II. La resistencia herbicida al fotosistema (PS) II se 25 presenta a partir de mutaciones dentro del gen psbA, que incluye la proteína QB y se conserva altamente entre muchas plantas. Las plantas resistentes poseen mutaciones que alteran aminoácidos en posiciones específicas dentro de las proteínas QR, por ejemplo, residuos 219, 251, 255, 264 y 275 (Hirschberg 5 y Mclntosh, 1993; Galloway y Mets, 1984; Gloden y Haselkorn, 1985; Erickson y colaboradores, 1984; Johanningmeier y colaboradores, 1987) . Los genes que poseen estas mutaciones se pueden utilizar así para conferir resistencia a herbicidas que funcionan inhibiendo el transporte de electrones llevado a cabo por el sistema PS II. • Ejemplos de estos herbicidas incluyen diclorofenildimetilurea (DCMU) , atrazina, metribuzina, lenacil, fenmedifam, loxinil y dinoseb. El gen psbA mutante que contiene una serina para mutación glicina en el residuo 264 se aisla del ADN genómico de clamidomonas usando las endonucleasas de restricción adecuadas. El fragmento resultante se puede ligar en el vector de expresión de cloroplasto universal pSBL-ctV2 e introducir en E. • coli XLIBlue. El plásmido purificado de esta cepa de E. coli se utiliza para transformar plantas. Daniell (1997). La incorporación de los genes psioA mutantes en el genoma de cloroplasto y la selección de los transformantes adecuados se lleva a cabo como se describió previamente. Las plantas transformadas que producen la proteína psbA mutada que contiene la sustitución de serina a glicina son resistentes a Atrazina® mientras que las plantas de control no lo son. El gen psbA mutante que contiene una mutación de valina a isoleucina en el residuo 219 se aisla del ADN genómico • de Chlamydomonas usando las endonucleasas de restricción 5 adecuadas. Se construye un vector universal como se describe anteriormente. Las plantas transgénicas como maíz que expresan psbA que contienen la mutación de valina a isoleucina en el residuo 219 se espera que sean resistentes a rocíos de DCMU. Eiemplo 15 10 Tolerancia a análogos de auxina, 2, 4-D. • El vector de expresión de cloroplasto universal psbh- ctV2 se pueden disociar con Xbal y ligar con un fragmento de ADN que contiene un gen que codifica mono-oxigenasa. La construcción resultante se puede transformar en cloroplastos 15 para generar plantas transgénicas que contienen múltiples copias del gen mono-oxigenasa. Las plantas resultantes que expresan altos niveles de mono-oxigenasa y se espera que sean tolerantes a 2, 4-D. • Eiemplo 16 20 Transformación de cloroplasto para resistencia a insectos. Las plantas de tabaco se pueden transformar con el vector universal pSBL-CtVHBt (Figura 8A) que contiene el gen crylIA y expresa la protoxina CrylIA, confiriendo mediante esto resistencia a plagas de insectos como la familia de Pyralidoe, tal como el gusano de tabaco. Aún insectos que han desarrollado una resistencia o son menos susceptibles a la toxina Bt son eliminados por la toxina Bt expresada por el gen en el vector de cloroplasto descrito en la presente. • El vector pSBL-CtVHBt se construye disociando pSBL-CtVH con 5 Smal y ligando el producto con el gen crylIA que codifica la proteína crylIA. El producto contenido en el gen crylIA en la orientación de transcripción correcta (Figura 8A) . La integración del gen crylIA en el genoma de cloroplasto del tabaco ha sido confirmado por análisis de reacción de cadena de polimerasa. El número de copias de crylIA por célula se estimó que es 10,000 realizando manchado Southern. La proteína CrylIA se estimó que es entre 5 y 10 por ciento de la proteína celular total realizando manchados Western. Este es el nivel más alto de proteína CrylIA reportada en plantas transgénicas Bt . Se realizaron bioensayos de hoja separado usando "Petit Havana" no transformado y tabaco transformado crylIA. De cinco a diez larvas se colocaron en cada hoja y se evaluaron para determinar la mortalidad y el daño a la hoja después de 3-5 días. Usando H. Virescens (YDK) susceptible, todas las larvas murieron en los tres días sobre el tabaco transformado con crylI-A mientras que no hubo mortalidad y esencialmente 100 por ciento de desfoliación en el "Petit Havana" transformado. Resultados similares se obtuvieron usando H. Virescens resistente a CrylAc resistente (YHD2, 40-50,000 veces resistente) y resistente a Cryll-A (CXC, 2000 veces resistente) . Además se observó 100 por ciento de mortalidad contra Helicoverpa zea (gusano de algodón) , y Spodoptera exigua (gusano de betabel) , ninguno de los cuales previamente había mostrado ser eliminado por ninguna proteína Cry. La Figura 28A y 28B muestran un bioensayo de planta no transformada de control (A) y planta transgénica (B) . Los insectos probados, demostraron 100 por ciento de mortalidad: gusano de tabaco susceptible a Cryl, gusano de algodón y gusano de betabel resistente a Cryl y Cryll. La Figura 29 muestra la proteína total aislada mediante análisis de manchado Western a partir de plantas de control (franja C) y plantas transgénicas (franja B) . Las franjas D-H representan diferentes concentraciones de proteína CrylIA purificada (1-20 por ciento) . La franja A muestra estándares de proteína. Otros insectos controlables se describieron anteriormente en la descripción de la invención. Como será aparente a los expertos en la técnica, a la luz de la anterior descripción, son posibles muchas modificaciones, alteraciones y sustituciones en la práctica de la invención sin apartarse del espíritu o el alcance de la misma. Se pretende que estas modificaciones, alteraciones, y sustituciones se incluyan en el alcance de las reivindicaciones.

-W.„J ^ Todas las referencias citadas en este texto se incorporan expresamente en la presente mediante referencia.

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Claims (188)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de integración y expresión universal competente para transformar establemente el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales el cual comprende un cásete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula de interés y secuencias de control colocadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3' de la secuencia de codificación para proporcionar la expresión de la secuencia de codificación en el genoma de cloroplasto de una planta objetivo, y flanqueando cada lado del cásete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homologas a una secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la secuencia de codificación heteróloga en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo.

2. Un vector de integración y expresión universal competente para transformar establemente el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales el cual comprende un cásete de expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una péptido de interés y secuencias de control colocadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3' de la secuencia de codificación para proporcionar la expresión de la secuencia de codificación en el genoma de cloroplasto de una planta 5 objetivo, y flanqueando cada lado del cásete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo que son homologas a una secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la 10 secuencia de codificación heteróloga en el genoma del # cloroplasto de la planta objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo.

3. El vector de la reivindicación 2 que comprende 15 una secuencia de nucleótidos heterólogos que codifican un fenotipo seleccionable.

4. El vector de la reivindicación 3 en donde cada una de las secuencias de flanqueo comprende una porción de la • regi ,ó„n espadadora 2 mtergenica entre los genes tRNAHl,et y tRNA"Alaa 20 del genoma del cloroplasto, mediante el cual se facilita la doble recombinación homologa con la región espaciadora 2 conservada en el genoma de cloroplasto objetivo.

5. El vector de la reivindicación 4 en donde cada una de las secuencias de flanqueo comprende, además de la 25 porción de la región espaciadora, parte o todos los genes tRNA TJiet y tRNA A la , respectivamente

6. El vector de la reivindicación 5 en donde cada una de las secuencias de flanqueo comprende, además de la fl porción de la región espaciadora, parte o todos las secuencias 5 de genes rRNA 16S y/o 23S.

7. El vector de la reivindicación 4 en donde la región espaciadora se localiza en una repetición invertida del genoma de cloroplasto.

8. El vector de la reivindicación 5 en donde la 10 región espaciadora se localiza en una repetición invertida del • genoma de cloroplasto.

9. El vector de la reivindicación 6 en donde la región espaciadora se localiza en una repetición invertida del genoma de cloroplasto. 15

10. El vector de la reivindicación 4 el cual comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

11. El vector de la reivindicación 5 el cual 20 comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

12. El vector de la reivindicación 6 el cual comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de 25 cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

13. El vector de la reivindicación 7 el cual comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

14. El vector de la reivindicación 8 el cual comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

15. El vector de la reivindicación 9 el cual comprende en la región espaciadora, un origen de réplica de cloroplasto, mediante el cual se promueve la homoplasmia con el genoma .

16. El vector de la reivindicación 4 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

17. El vector de la reivindicación 5 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

18. El vector de la reivindicación 6 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

19. El vector de la reivindicación 7 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

20. El vector de la reivindicación 8 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

21. El vector de la reivindicación 9 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

22. El vector de la reivindicación 10 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

23. El vector de la reivindicación 11 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

24. El vector de la reivindicación 12 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

25. El vector de la reivindicación 13 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

26. El vector de la reivindicación 14 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

27. El vector de la reivindicación 15 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de una especie vegetal distinta de la del vegetal objetivo.

28. El vector de la reivindicación 13 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de un vegetal distinto del vegetal objetivo de la misma especie vegetal que la especie del vegetal objetivo. •

29. El vector de la reivindicación 14 en donde el 5 ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de un vegetal distinto del vegetal objetivo de la misma especie vegetal que la especie del vegetal objetivo.

30. El vector de la reivindicación 15 en donde el ADN de las secuencias de flanqueo se origina a partir de un 10 vegetal distinto del vegetal objetivo de la misma especie # vegetal que la especie del vegetal objetivo.

31. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 4, o la progenie del mismo. 15

32. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 5, o la progenie del mismo.

33. Un vegetal transformado establemente que • comprende cloroplasto establemente transformado con el vector 20 de la reivindicación 6, o la progenie del mismo.

34. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 7, o la progenie del mismo.

35. Un vegetal transformado establemente que 25 comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 8, o la progenie del mismo.

36. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 9, o la progenie del mismo. 5

37. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 10, o la progenie del mismo.

38. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector 10 de la reivindicación 11, o la progenie del mismo. •

39. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 12, o la progenie del mismo.

40. Un vegetal transformado establemente que 15 comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 25, o la progenie del mismo.

41. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector • de la reivindicación 26, o la progenie del mismo. 20

42. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 27, o la progenie del mismo.

43. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector 25 de la reivindicación 28, o la progenie del mismo.

44. Un vegetal transformado establemente que comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 29, o la progenie del mismo. •

45. Un vegetal transformado establemente que 5 comprende cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 30, o la progenie del mismo.

46. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 31 el cual es una planta solanácea.

47. El vegetal transformado establemente de la 10 reivindicación 32 el cual es una planta solanácea. •

48. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 33 el cual es una planta solanácea.

49. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 40 el cual es una planta solanácea. 15

50. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 41 el cual es una planta solanácea.

51. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 42 el cual es una planta solanácea.

52. El vegetal transformado establemente de la 20 reivindicación 31 el cual es monocotiledóneo .

53. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 32 el cual es monocotiledóneo.

54. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 33 el cual es monocotiledóneo. 25

55. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 31 el cual es dicotiledóneo.

56. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 32 el cual es dicotiledóneo. •

57. El vegetal transformado establemente de la 5 reivindicación 33 el cual es dicotiledóneo.

58. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 34 el cual es monocotiledóneo.

59. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 35 el cual es monocotiledóneo. 10

60. El vegetal transformado establemente de la • reivindicación 36 el cual es monocotiledóneo.

61. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 34 el cual es dicotiledóneo.

62. El vegetal transformado establemente de la 15 reivindicación 35 el cual es dicotiledóneo.

63. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 36 el cual es dicotiledóneo.

64. El vegetal transformado establemente de la • reivindicación 37 el cual es monocotiledóneo. 20

65. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 38 el cual es monocotiledóneo.

66. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 39 el cual es monocotiledóneo.

67. El vegetal transformado establemente de la 25 reivindicación 37 el cual es dicotiledóneo.

68. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 38 el cual es dicotiledóneo.

69. El vegetal transformado establemente de la áfc reivindicación 39 el cual es dicotiledóneo. 5

70. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 40 el cual es monocotiledóneo.

71. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 41 el cual es monocotiledóneo.

72. El vegetal transformado establemente de la 10 reivindicación 42 el cual es monocotiledóneo. •

73. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 64 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo.

74. El vegetal transformado establemente de la 15 reivindicación 65 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo.

75. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 66 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, ^? cebada, avena o trigo. 20

76. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 67 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

77. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 68 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, 25 papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

78. El vegetal tr nsformado establemente de la reivindicación 69 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón. •

79. El vegetal transformado establemente de la 5 reivindicación 70 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo.

80. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 71 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo. 10

81. El vegetal transformado establemente de la • reivindicación 72 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo.

82. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 67 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, 15 papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

83. El vegetal transformado establemente de la reivindicación 68 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

84. El vegetal transformado establemente de la 20 reivindicación 69 el cual es frijol de soya, cacahuate, uva, papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

85. Un proceso para transformar establemente una especie vegetal objetivo que comprende introducir un vector universal de integración y expresión en el genoma de 25 cloroplasto de la planta objetivo y permitir que la planta transformada crezca, siendo el vector competente para transformar establemente el cloroplasto de diferentes especies vegetales y comprendiendo un cásete de expresión que comprende, • operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que 5 codifica una molécula de interés y secuencias de control colocadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3 ' de la secuencia de codificación para proporcionar la expresión de la secuencia de codificación en el cloroplasto del vegetal objetivo, una secuencia heteróloga que codifica un 10 fenotipo seleccionable, y flanqueando cada lado del cásete de • expresión, secuencias de flanqueo de ADN cada una comprendiendo una porción de la región espaciadora intergénica 2 entre los genes tRNAIle y tRNAAla del genoma de cloroplasto, que son homologas a una secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto 15 objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma del cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la secuencia de codificación heteróloga en el genoma de cloroplasto del vegetal objetivo se • facilita a través de la recombinación homologa de las 20 secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo.

86. Un proceso para transformar establemente una especie vegetal objetivo que comprende introducir un vector universal de integración y expresión en el genoma del 25 cloroplasto de la especie vegetal objetivo y permitir que la planta transformada crezca, siendo el vector competente para transformar establemente el cloroplasto de diferentes especies vegetales y comprendiendo un cásete de expresión que comprende, f operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que 5 codifica una péptido de interés y secuencias de control colocadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3 ' de la secuencia de codificación para proporcionar la expresión de la secuencia de codificación en el cloroplasto del vegetal objetivo, una secuencia de nucleótidos heteróloga que 10 codifica un fenotipo seleccionable, y flanqueando cada lado del f cásete de expresión, secuencias de flanqueo de ADN cada una comprendiendo una porción de la región espaciadora intergénica 2 entre los genes tRNAIle y tRNAAla del genoma del cloroplasto, que son homologas a la secuencia espaciadora del genoma de 15 cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la secuencia de codificación heteróloga en el genoma de cloroplasto del vegetal objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las 20 secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo.

87. El proceso de la reivindicación 86 en donde el vegetal transformado es heteroplásmico .

88. El proceso de la reivindicación 86 en donde el 25 vegetal transformado es un vegetal homoplásmico.

89. El proceso de la reivindicación 88 en donde el vegetal transformado es una planta de primera generación.

90. El proceso de la reivindicación 86 en donde el mk vegetal objetivo es una planta solanácea. 5

91. El proceso de la reivindicación 86 en donde el vegetal transformado es monocotiledóneo.

92. El proceso de la reivindicación 86 en donde el vegetal transformado es dicotiledóneo.

93. El proceso de la reivindicación 91 en donde el 10 vegetal transformado es uno de los siguientes vegetales • monocotiledóneos : maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena o trigo.

94. El proceso de la reivindicación 92 en donde el vegetal transformado es una de las siguientes plantas 15 dicotiledóneas: frijol de soya, cacahuate, uva, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

95. El proceso de la reivindicación 86 el cual comprende aislar el péptido de interés. •

96. El proceso de la reivindicación 86 en donde el 20 péptido de interés es un polipéptido.

97. El proceso de la reivindicación 96 en donde el polipéptido es un polímero basado en proteína sintética (PBP) .

98. El proceso de la reivindicación 97 en donde el PBP tiene secuencias de pentámero de repetición (GVGVP) n en 25 donde "n" es un entero del 1 al 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolina.

99. El proceso de la reivindicación 98 en donde "n" es 121. #

100. El proceso de la reivindicación 96 en donde el 5 polipéptido expresado de interés es insulina.

101. El proceso de la reivindicación 100 que comprende aislar la insulina.

102. El proceso de la reivindicación 100 en donde la insulina está en forma de proinsulina. 10

103. El proceso de la reivindicación 102 en donde la • proinsulina se funde a un polímero basado en proteína sintética .

104. El proceso de la reivindicación 100 en donde el vegetal transformado es tabaco. 15

105. El proceso de la reivindicación 96 en donde el polipéptido de interés es albúmina de suero humano (HSA) .

106. El proceso de la reivindicación 105 en donde el vegetal transformado es tabaco. •

107. El vector de la reivindicación 4 en donde el 20 péptido de interés es una molécula biológicamente activa.

108. El vector de la reivindicación 107 en donde el péptido es un polipéptido el cual es un polímero basado en proteína sintética (PBP) .

109. El vector de la reivindicación 108 en donde el 25 polímero basado en proteína tiene secuencias de pentámero de repetición (GVGVP) n "n" es un entero del 1 al 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolina.

110. El vector de la reivindicación 109 en donde el polipéptido es (GVGVP) „ en donde el entero "n" es 121. 5

111. El vector de la reivindicación 108 en donde el polímero basado en proteína sintética se funde a una molécula biológicamente activa.

112. El vector de la reivindicación 111 en donde la molécula biológicamente activa es insulina. 10

113. El vector de la reivindicación 112 en donde la • insulina está en forma de proinsulina.

114. El polipéptido obtenido por el proceso de la reivindicación 96.

115. El polímero basado en proteína obtenido por el 15 proceso de la reivindicación 97.

116. La proinsulina obtenida por el proceso de la reivindicación 102.

117. La albúmina de suero humano obtenida por el • proceso de la reivindicación 105. 20

118. Un vegetal establemente transformado que comprende un genoma de cloroplasto establemente transformado con el vector de la reivindicación 107 que comprende una molécula biológicamente activa.

119. La planta cosechada de la reivindicación 118. 25

120. La molécula biológicamente activa de la planta de la reivindicación 118.

121. La molécula biológicamente activa de la reivindicación 120 la cual es insulina.

122. La planta establemente transformada de la 5 reivindicación 118 la cual es tabaco.

123. Una especie vegetal objetivo resistente al herbicida establemente transformada o la progenie de la misma, que comprende cloroplasto establemente trasformado con un vector de integración y expresión universal competente para la 10 transformación estable de un cloroplasto de diferentes especies • vegetales que comprende un cásete de expresión el cual comprende una proteína heteróloga de interés expresada mediante una secuencia de ADN heteróloga en el genoma de cloroplasto de la especie vegetal objetivo, un fenotipo seleccionado distinto 15 del de la tolerancia con el herbicida, y flanqueando cada lado del cásete de expresión, las secuencias de ADN de flanqueo cada una comprendiendo una porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los genes tRNAIle y tRNAAla del genoma de • cloroplasto, las cuales son homologas a la secuencia 20 espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, cuya secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la proteína heteróloga en el genoma de cloroplasto del vegetal objetivo se facilitó a través de la recombinación homologa de 25 las secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma del cloroplasto objetivo.

124. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 123 en el cual la proteína de interés es una • forma mutante de una enzima que tiene menos afinidad para el 5 herbicida que la enzima que naturalmente se presenta.

125. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 123 en donde el herbicida es glifosato.

126. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 125 en donde el herbicida es EPSP sintasa. 10

127. El vegetal objetivo resistente al herbicida de • la reivindicación 124 en donde el herbicida se selecciona de cuando menos uno de los siguientes tipos: PSI, PSII, APP, análogo de auxina, mitótico, tipo ácidos metilofosfórico amino terciario, y tipos de inhibición de ALS. 15

128. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida es el tipo PSI seleccionado entre paraquat y diquat .

129. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida se selecciona entre 20 atrazina, dinoseb, lenacil y metribuzina.

130. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida es del tipo APP seleccionado entre ciclohexanodiona, haloxifop, cletodim y fenoxaprop, y el compuesto alquilo inferior sustituido de los 25 mismos.

131. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida es un análogo de auxin seleccionado entre MCPA y 2,4-D.

132. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida es un herbicida tipo mitótico el cual es dinitroanilina.

133. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 124 en donde el herbicida es un tipo ácido fosfórico amino metilo terciario, el cual es glifosato.

134. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida es un tipo de inhibición ALS seleccionado de sulfonilurea e imidazolinas.

135. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 en donde el herbicida se selecciona entre bromoxinilo, metil sulfurón, clorosulfurón, fosfinotricina e imazapir .

136.. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 123 en donde el fenotipo expresado es de resistencia a antibiótico.

137. EL vegetal resistente a herbicida de la reivindicación 123 en donde el fenotipo seleccionable es codificado por el gen higromicina que confiere resistencia herbicida.

138. El vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 127 el cual es maíz, arroz, pasto, centeno, cebada, avena, trigo, frijol de soya, cacahuate, uva, papa, camote, chícharo, colza, tabaco, tomate o algodón.

139. El vegetal objetivo resistente al herbicida de • la reivindicación 138 el cual es una planta homoplásmica. 5

140. Un proceso para conferir resistencia herbicida a una especie vegetal objetivo el cual comprende introducir en la planta un vector de integración y expresión universal competente para establemente transformar el cloroplasto de diferentes especies vegetales, el cual comprende un cásete de 10 expresión que comprende, operablemente unidas, una secuencia de • ADN heteróloga que codifica una proteína de interés que confiere resistencia a un herbicida y secuencias de control colocadas corriente arriba del extremo 5' y corriente abajo del extremo 3 ' de la secuencia de codificación para proporcionar la 15 expresión de la secuencia de codificación en el cloroplasto del vegetal objetivo, una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable distinto del de la tolerancia al herbicida, y flanqueando cada lado del cásete de expresión, las secuencias de flanqueo cada una comprendiendo 20 una porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los genes tRNAüe y tRNAAla del genoma de cloroplasto, los cuales son homologas a la secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual 25 la integración estable de la secuencia de codificación heteróloga en el genoma de cloroplasto del vegetal objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo y cultivando el vegetal 5 transformado.

141. El proceso de la reivindicación 140 en donde la secuencia de ADN codifica una forma mutante de una enzima que tiene afinidad menor para el herbicida que la que tiene la enzima que se presenta naturalmente. 10

142. El proceso de la reivindicación 141 en donde la • enzima es EPSP sintasa y el herbicida es glifosato.

143. El proceso de la reivindicación 142 en donde la secuencia de ADN es el gen EPSP sintasa el cual es un gen EPSP sintasa mutante. 15

144. El proceso de la reivindicación 140 el cual comprende seleccionar las plantas objetivos transformadas, viables, de un medio que es letal a plantas no transformadas.

145. El proceso de la reivindicación 144 en donde las • plantas objetivos transformadas viables son plantas 20 homoplásmicas .

146. El proceso de la reivindicación 144 en donde las plantas objetivo transformadas viables son plantas heteroplásmicas .

147. El proceso de la reivindicación 140 en donde la 25 planta objetivo resistente al herbicida es tabaco, la secuencia de nucleótidos codifica un fenotipo seleccionable que es letal al tabaco o para un rasgo visual que permite seleccionar las plantas de tabaco transformadas de las plantas no f transformadas . 5

148. El proceso de la reivindicación 147 en donde el fenotipo seleccionable metal es higromicina al cual el tabaco no es resistente naturalmente.

149. El proceso de la reivindicación 147 en donde el rasgo visual es la expresión de un color. 10

150. El proceso de la reivindicación 140 para P transformar establemente el fenotipo de una especie vegetal objetivo, mediante el crecimiento de la planta transformada que expresa el fenotipo seleccionable y otro rasgo además de la expresión de ese fenotipo. 15

151. El proceso de la reivindicación 150 en donde el fenotipo seleccionado se confiere mediante la expresión de gen higromicina ß-fosfotransferasa y el rasgo adicional que se confiere es resistencia al herbicida glifosato. P

152. Un proceso para determinar la transformación y 20 expresión de cloroplasto de un rasgo objetivo con base en la adquisición de la especie de planta objetivo de resistencia a un herbicida seleccionado debido a la transformación de la especie vegetal que comprende introducir en el vegetal un vector de integración y expresión universal competente para 25 transformar establemente el cloroplasto de diferentes especies vegetales que comprende un cásete de expresión el cual comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica el rasgo objetivo deseado y secuencias • de control colocadas corriente arriba del extremo 5 ' y 5 corriente abajo del extremo 3' de la secuencia de codificación para proporcionar la expresión de la secuencia de codificación, en el cloroplasto de un vegetal objetivo, una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica un fenotipo seleccionable distinto y flanqueando cada lado del cásete de expresión, 10 secuencias de ADN de flanqueo cada una comprendiendo una • porción de una región espaciadora intergénica 2 entre los genes tRNAIle y tRNAAla del genoma de cloroplasto, las cuales son homologas a una secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de 15 cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la secuencia de codificación heteróloga en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo se facilita a través de la recombinación homologa de las • secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el 20 genoma de cloroplasto objetivo, exponiendo las plantas en las cuales el vector ha sido introducido a una concentración letal del herbicida y seleccionando las plantas que no mueren de la exposición al mismo, habiendo mediante esto seleccionado las plantas transformadas que expresan el rasgo objetivo deseado. 25

153. El proceso de la reivindicación 152 en donde el herbicida seleccionado se selecciona de cuando menos uno de los siguientes tipos: PSI, PSII, APP, análogo de auxina, mitótico, tipo ácidos metilofosfórico amino terciario, y tipos de inhibición de ALS .

154. Una especie vegetal objetivo resistente a insectos transformada establemente, o la progenie de la misma, la cual comprende un genoma de cloroplasto establemente transformado con un vector de integración y expresión universal competente para la transformación estable del cloroplasto de diferentes especies vegetales que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia de ADN heteróloga que expresa una proteína objetivo que confiere resistencia a un insecto objetivo en el genoma de cloroplasto de la especie vegetal objetivo, un fenotipo seleccionado distinto de la tolerancia al insecto objetivo, y flanqueando cada lado del cásete de expresión, secuencias de ADN de flanqueo cada una comprendiendo una porción de la región espaciadora 2 intergénica entre los genes tRNAIle y tRNAAla del genoma de cloroplasto, las cuales son homologas a la secuencia espaciadora del genoma de cloroplasto objetivo, esta secuencia se conserva en el genoma de cloroplasto de diferentes especies vegetales, mediante lo cual la integración estable de la proteína heteróloga en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo se facilitó a través de la recombinación homologa de las secuencias de flanqueo con las secuencias homologas en el genoma de cloroplasto objetivo, en donde la proteína heteróloga es la toxina de proteína CrylIA expresada por el gen crylIA, esta proteína confiere resistencia a insectos. •

155. La especie vegetal objetivo resistente a 5 insectos transformada establemente de la reivindicación 154 en donde el insecto es susceptible a la toxina Bt .

156. La especie vegetal objetivo resistente a insectos transformada establemente de la reivindicación 154 en donde se supera la falta de susceptibilidad del insecto a la 10 toxina Bt . •

157. La especie vegetal objetivo resistente a insectos transformada establemente de la reivindicación 155 en donde la planta objetivo es tabaco y el insecto es gusano de brote de tabaco. 15

158. La especie vegetal objetivo resistente a insectos transformada establemente de la reivindicación 156 en donde la planta objetivo es tabaco, algodón o betabel, y el insecto es un gusano de capullo de algodón o gusano de betabel tipo resistente a la toxina Bt . 20

159. La especie vegetal objetivo resistente a insectos transformada establemente de la reivindicación 154 en donde el insecto es gusano de brote de tabaco, gusano de capullo de algodón, o gusano de betabel.

160. Un vector seleccionado de los siguientes: pSBL- 25 RD-EPSPS, pSBL-CG-EG121 , pSBL-Ct-Border, pSBL-Ct-Vl, pSBL-Ct- V2, pSBL-CtV3, pSBL-Ct-VH, pSBL-Ct-VHF, y pSBL-Ct-VHBt .

161. El vector de la reivindicación 160 que es un vector de integración y expresión universal el cual es pSBL-RD- EPSPS, pSBL-CG-EG121, pSBL-CtVl, pSBL-CtV2, pSBL-CtV3, pSBL- CtVH, pSBL-Ct-VHF, Y pSBL-CtVHBt.

162. Una secuencia de ADN aislada que comprende la secuencia de ADN intergénica entre los genes de ADNr 16S y 23S del genoma de cloroplasto vegetal, esta secuencia intergénica se conserva mucho en una multiplicidad de diferentes especies de plantas.

163. La secuencia de ADN aislada de la reivindicación 162 que comprende la región espaciadora 2 la cual es la secuencia de ADN intergénica entre los genes trnl y trnA del genoma de cloroplasto de planta.

164. La secuencia de ADN intergénica aislada de la reivindicación 163 que comprende los genes trnl y trnA.

165. La secuencia de ADN aislada de la reivindicación 163 que comprende una de las repeticiones invertidas del genoma de cloroplasto de la planta.

166. La secuencia de ADN aislada de la reivindicación 165 que comprende un origen de réplica.

167. La secuencia de ADN aislada de la reivindicación 163 que comprende el operón ARNr en la región espaciadora 2.

168. El vector de integración y expresión universal de la reivindicación 4 en donde la región espaciadora 2 comprende el operón de ARNr.

169. El vector de integración y expresión universal de la reivindicación 4 en donde las secuencias de flanqueo son sintéticas .

170. La especie vegetal objetivo resistente al herbicida de la reivindicación 85 en donde la secuencia de ADN que codifica la proteína de interés es de origen procariótico.

171. El vector de integración y expresión universal de la reivindicación 2 que no incluye un transposón.

172. La especie vegetal objetivo transformada establemente de la reivindicación 41 no incluye un transposón.

173. El proceso para transformar establemente una especie vegetal objetivo de la reivindicación 86 en donde el vector universal no incluye un transposón.

174. El vector de integración y expresión universal de la reivindicación 4 que comprende un promotor funcional en cloroplasto.

175. El vector de expresión e integración universal de la reivindicación 4 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un fenotipo seleccionable que permite la identificación y selección de plantas transformadas viables a partir de plantas no transformadas, no viables.

176. El proceso de la reivindicación 86 que comprende seleccionar del medio que es letal a plantas no transformables, la planta objetivo transformada viable.

177. La planta objetivo tolerante al herbicida establemente transformada o la progenie de la misma de la reivindicación 123 que permite la identificación y selección en • base de plantas transformadas viables a partir de planta no 5 transformada, no viable.

178. El proceso de la reivindicación 140 que comprende seleccionar del medio que es letal a plantas no transformadas, la planta objetivo transformada viable.

179. Un cásete de expresión competente para 10 transformar establemente genoma de cloroplasto de un vegetal f objetivo que comprende, operablemente unidas, una secuencia de ADN heteróloga que codifica una molécula de interés, secuencias de control para proporcionar la expresión de secuencia de codificación en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo, 15 un promotor funcional en cloroplasto, y flanqueando cada lado del cásete, secuencias de ADN de la planta para facilitar la integración estable del ADN con el genoma de cloroplasto objetivo mediante recombinación homologa, mediante la cual el f ADN se integra establemente en el mismo y se hereda a través de 20 la réplica de organelo en las células hijas.

180. El cásete de expresión de la reivindicación 175 en donde la secuencia de ADN heteróloga es la secuencia sintética de codificación para un polímero basado en proteína (PBP) . 25

181. El cásete de expresión de la reivindicación 176 en donde el polímero basado en proteína tiene secuencias de pentámero de repetición (GVGVP) n en donde "n" es un entero de 1 a 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolma.

182. El cásete de expresión de la reivindicación 177 en donde la secuencia de codificación sintética es el gen de biopolímero sintético EG121 y el polímero basado en proteína sintética expresado es la proteína de polímero (GVGVP) 12? .

183. Un genoma de cloroplasto de transcripción/ traducción activa transformado establemente de un vegetal objetivo, que es competente para la integración estable de una secuencia de ADN heteróloga, que comprende un cásete de expresión que comprende una molécula heteróloga de interés codificada por una secuencia de ADN heteróloga y expresada mediante secuencias de control en el genoma de cloroplasto de la planta objetivo, y flanqueando el ADN de la planta cada lado del cásete de expresión lo cual facilitó la integración estable del ADN en el genoma del cloroplasto objetivo mediante la recombinación homologa, este ADN se hereda a través de la réplica de organelo en las células hijas.

184. El cloroplasto establemente transformado de la reivindicación 179 en donde la molécula de interés es un polímero basado en proteína (PBP) .

185. El cloroplasto establemente transformado de la reivindicación 180 en donde el polímero basado en proteína tiene secuencias de pentámero de repetición (GVGVP) n en donde n es un entero de 1 a 250, "G" es glicina, "V" es valina y "P" es prolina.

186. El cloroplasto establemente transformado de la reivindicación 181 donde la secuencia de codificación sintética • 5 es el gen de biopolímero sintético EG121 y el polímero basado en proteína expresado es la proteína de polímero (GVGVP) 121.

187. El biopolímero sintético (GVGPP)n que se expresa a partir del cloroplasto establemente transformado de la reivindicación 182, en donde "n", "G", "V" y "P" se definen en 10 la misma. •

188. El biopolímero sintético de la reivindicación 183 el cual es (GVGVP) 121. •