DE69830317T2

DE69830317T2 - Universelle integrations- und expressionsvektoren für chloroplasten, transformierte pflanzen und produkte hiervon

Info

Publication number: DE69830317T2
Application number: DE69830317T
Authority: DE
Inventors: Henry Daniell
Original assignee: Auburn University
Current assignee: Auburn University
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: ES2401438T3; EP1002115B2; EP2319933B1; ATE296355T1; CN1276835A; AU8457398A; CN1262661C; BR9815611B1; DE69830317T3; EP1002115A1; CA2299609C; WO1999010513A1; DE69830317D1; JP2002524023A; ES2244073T3; NZ502742A; AU748210B2; US7803991B2; ES2244073T5; EP1002115B9

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Anmeldung liegt auf dem Gebiet der Gentechnik von Pflanzengenomen, insbesondere der Gentechnik des Genoms von Pflanzenplastiden, wie beispielsweise Chloroplasten, und der stabilen Transformation des Chloroplastgenoms beliebiger Pflanzenspezies.
Verwandte Fälle
Diese Anmeldung betrifft im Besonderen einen universellen Chloroplastexpressions- und -integrationsvektor, der geeignet ist, beliebige Pflanzen mit einem oder mehreren Genen von Interesse zu transformieren. Die frühere Patentanmeldung Seriennr. 08/591,407 lehrt Pflanzenzellen, die mittels einer Expressionskassette, welche eine exogene DNA-Sequenz, die stabil in das Chloroplastgenom der Zelle einer Zielpflanze integriert (kovalent verknüpft) ist, transformiert sind. "Stabil" integrierte DNA-Sequenzen sind solche, welche durch Genomreplikation durch Tochterzellen oder Organismen vererbt sind. Diese Stabilität zeigt sich durch die Fähigkeit, permanente Zelllinien, Klone oder transgene Pflanzen herzustellen, die aus einer Population, welche die exogene DNA enthält, bestehen.
US-Patent 5,693,507 (1997) von Daniell und McFadden offenbart ebenfalls eine solche stabile Integration mittels einer Expressionskassette, welche eine exogene DNA-Sequenz umfasst, die für ein gewünschtes Merkmal codiert und die transformierten Pflanzen.
Hintergrund der Erfindung
Vorteile der Chloroplast-Transformation gegenüber der Transformation des Kerns. Die Attraktivität der Transformation des Chloroplastgenoms gegenüber der Transformation des Kerngenoms ist den beträchtlichen Risiken zuzuschreiben, die von dieser letzteren herrühren. Ein allgemeines Problem ist das Entkommen von Fremdgenen durch die Zerstreuung von Pollen von transgenen Anbaupflanzen zu ihren Unkrautverwandten. Es ist gezeigt worden, dass transgene Pollen fremde (transgene) Gene zu anderen sexuell kompatiblen Pflanzen zuführen (nachgewiesen durch die Prävalenz von Markergen in geernteten Abkömmlingen von nicht-transgenen Pflanzen, die in der Umgebung wuchsen). Z.B. ist eine Zerstreuung von Pollen von einem zentralen Teststück, welches transgene Baumwollpflanzen enthielt, zu nichttransgenen Pflanzen in der Umgebung bei verschiedenen Abständen in unterschiedlichen Richtungen beobachtet worden (Lewellyn und Fitt, 1996); (Umbeck, P.F., et al., 1991). Außerdem lagen die Häufigkeiten von Markergenen in wilden Sonnenblumen im Mittel bei etwa 28 bis 38%; in wilden Erdbeeren, die im Umkreis von 50 m eines Erdbeerfelds wuchsen, enthielten mehr als 50% der Wildpflanzen Markergene aus Kultur-Erdbeeren. (King, J., 1996).
Das Entkommen von Fremdgenen durch Pollen ist insbesondere im Fall von Herbizidresistenz-Genen aufgrund der hohen Raten von Genfluss von Anbaupflanzen zu wilden Verwandten eine ernsthafte Umweltangelegenheit. Beunruhigend ist, dass durch das Entkommen von Genen aus transgenen Anbaupflanzen zu ihren Unkraut-Verwandten Super-Unkräuter erzeugt werden. Bei Reis (Oryza sativa) ist kein Genfluss von Kultur-Sorten zu wilden Verwandten, in O. perennis (Barrett, 1983) und rotem Reis (O. sativa; Langevin et al., 1990) bemerkt worden. Im Süden der USA hat sich roter Reis zu einem wichtigen Unkraut entwickelt, da Herbizide, welche ihn vernichten, auch Kultur-Reis vernichten. Für Kultur-Reis, der mit rotem Reis kontaminiert ist, werden niedrigere Preise bezahlt. Einige Forscher haben das bar-Gen, welches Resistenz gegenüber Glufosinat verleiht (Liberty) in Kultur-Reis eingeführt, um dieses Unkraut zu bekämpfen (Oard et al., 1996; Sankula et al., 1996). Aufgrund der sexuellen Kompatibilität ermöglicht das Einbringen eines im Kern exprimierten Gens jedoch auch die Übertragung dieses Resistenzmerkmals über Pollen in roten Reis.
Ebenso wurden transgene Rapsölsamen, die gentechnisch für Herbizidresistenz entwickelt wurden, mit einem Unkraut-Verwandten, Brassica campestris (Ackersenf) gekreuzt und verliehen selbst in der ersten Rückkreuzungsgeneration unter Feldbedingungen Herbizidresistenz. (Mikkelson, T. R., et al., 1996).
Die mütterliche Vererbung von eingeführten Genen verhindert das Entweichen von Genen durch Pollen. Die Erzeugung fremder Gene durch Chloroplastgenome (welche bei den meisten Anbaupflanzen mütterlich vererbt werden) stellt eine Lösung für dieses Problem dar. Auch die Zielenzyme oder Proteine sind bei den meisten Herbiziden (z.B. biosynthetische Aminosäure/Fettsäure Wege oder Photosynthese) innerhalb des Chloroplasten unterteilt. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Chloroplast-Transformation sind die höheren Mengen an Fremdgen-Expression aufgrund einer sehr hohen Kopienanzahl (5000-10000) von Chloroplastgenomen in Pflanzenzellen. Da die Transkriptions- und Translations-Systeme des Chloroplasten von prokaryotischer Natur sind, können herbizidresistente Gene bakteriellen Ursprungs in Chloroplasten in außerordentlich großen Mengen exprimiert werden.
Transformation des Chloroplastgenoms. Frühe Untersuchungen der Chloroplast-Transformation konzentrierten sich auf die Entwicklung von Organellsystemen unter Verwendung intakter Chloroplasten, die zur effizienten und verlängerten Transkription und Translation in der Lage sind (Daniell und Rebeiz, 1982; Daniell et al., 1983) und auf die Expression von Fremdgenen in isolierten Chloroplasten (Daniell und McFadden, 1987). Diese Experimente wurden unter der Annahme durchgeführt, dass es möglich sei, isolierte intakte Chloroplasten in Protoplasten einzubringen und transgene Pflanzen zu regenerieren (Carlson, 1973). Die Entdeckung der Genkanone als Transformationsvorrichtung eröffnete die Möglichkeit der direkten Plastid-Transformation in Pflanzen (Daniell, 1993). Die transiente Expression fremder Gene in Plastiden von Dicots (Daniell et al., 1990; Ye et al., 1990), Monocots (Daniell et al., 1991), die verlängerte Fremdgen-Expression unter Verwendung von autonom replizierenden Chloroplast-Expressionsvektoren (Daniell et al., 1990) und die stabile Integration eines selektierbaren Markers in das Tabak-Chloroplastgenom (Svab und Maliga, 1993) wurden unter Verwendung der Genkanone bewerkstelligt. Tabakpflanzen, die gegenüber bestimmten Insekten resistent waren, wurden erhalten, indem das cryIAc-Gen in das Tabak-Chloroplastgenom integriert wurde (McBride et al., 1995; US-Patent 5,451,513. Die stabile Plastid-Transformation höherer Pflanzen wurde bislang nur in Tabak bewerkstelligt.
Frühere Studien des Chloroplastgenoms. Bis heute wurde eine stabile Integration eines fremden Gens in das Chloroplastgenom einer höheren Pflanze nur bei Tabak berichtet. Dies wurde mit einem Vektor erzielt, der spezifisch für Tabak war und der von dem Tabak-Chloroplastgenom abgeleitet war, d.h. der Vektor enthielt eine Sequenz, die nur zu dem Tabak-Chloroplastgenom homolog war und die in dem Chloroplastgenom anderer Pflanzen nicht hoch konserviert ist. Ein solcher Vektor ist zum stabilen Transformieren anderer Pflanzenspezies als Tabak ungeeignet. Der einzige veröffentlichte Bericht über die Fremdgen-Expression in einer anderer Pflanzenspezies als Tabak ist der über Weizenblätter und -embryos (Daniell et al., 1991), eine stabile Integration wurde jedoch nicht erzielt. Es wurde nie von einer stabilen Integration eines fremden Gens in das Chloroplastgenom einer monokotyledonen Pflanze berichtet. Zumindest in Getreide (Monocot) können zuvor entwickelte Transformations-/Regenerations-Protokolle aufgrund von Schwächen, die solchen Systemen eigen sind, nicht auf die Plastid-Transformation angewendet werden. Sequenzielle/serielle Selektionen (wiederholte Selektionen), die für das Erreichen von Homoplasmie als wichtig erachtet werden (Daniel), 1997), können bei Verwendung solcher eingesetzter Regenerationssysteme ebenfalls nicht machbar sein. Die gegenwärtige Entwicklung von individuellen Mais(Rudraswamy, 1997) und Reis- (unveröffentlicht) Transformations-/Regenerations-Protokollen bietet möglicherweise wesentlich erhöhte Wirksamkeiten und erlaubt mehr als eine Selektionsrunde während der Regeneration.
Maliga et al. in US-Patent 5,451,513 und Svab et al., 1990 schlagen eine Transformation des Plastidgenoms von Tabak durch eine nicht-letale Selektionstechnik vor, bei welcher Plastid-DNA eingesetzt wird, die für einen nicht-letalen selektierbaren Phänotyp codiert. Gemäß Maliga et al. ist eine nicht-letale Selektion absolut wesentlich, um transplastgene Linien zu erhalten.
Anders als bei dem Verfahren von Maliga et al. ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine Selektion, die für alle nicht transformierten Pflanzen außer für Tabak letal ist. Nur die transformierten Pflanzen überleben und wachsen weiter. Diese letale Selektion erfolgt bei praktisch allen Antibiotika einschließlich Spectinomycin und Streptomycin in einem Medium, welches das Antibiotikum in einer Konzentration von 500-1000 μg/ml enthält. Ähnliche Bedingungen erwiesen sich für Tabak gemäß Maliga et al. als nicht-letal. Außerdem kann im Gegensatz zu dem Verfahren von Maliga et al. erfindungsgemäß selbst in der ersten Selektionsrunde eine Transformation zu Homoplasmie erzielt werden.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 251 654 beschreiben Cannon et al. die Transposon-vermittelte Chlorplast-Transformation von beispielsweise Tabak unter Verwendung des bakteriellen Transposon Tn5. Der Vektor, welcher das Transposon enthält, ist auf einen chromosomalen Bereich gerichtet, von dem bekannt ist, dass er ein "transkriptionell stiller" Bereich ist, um die transkriptionelle Integrität der nativen Gene aufrechtzuerhalten. Es wurde erkannt, dass sich ein solcher transkriptionell stiller Bereich zwischen zwei bekannten divergenten Promotoren von Chloroplastgenen, z.B. den Promotoren für die Gene für die große Chloroplastuntereinheit von Ribulosebiphosphatcarboxylat (RbcL, "LS RuBisCo") und für β-ATPase (atpB), befindet. Diese Promotoren transkribieren die Gene in entgegengesetzten Richtungen von dem stillen Bereich des Chromosoms weg. In dem Expressionsvektor von Cannon et al. wird kein Transkriptionsterminator bereitgestellt, es ist bekannt, dass solche Terminatorbereiche für die Genexpression in Plastiden absolut wesentlich sind. Schließlich ist von Cannon et al. nicht gezeigt worden, dass eine stabile Chloroplast-Transformation zu bewerkstelligen ist.
Die hierin beschriebene Erfindung weist verschiedene Merkmale auf, die sich von Cannon et al. unterscheiden. Die Erfindung lehrt eine stabile Transformation, die auf den Abkömmling übertragbar ist. Die Integration ist nicht auf einen transkriptionell inaktiven Bereich des Chlorplast-Chromosoms gerichtet. Die Erfindung integriert eine Kassette (welche einen Transkriptionsterminator enthält, wie im Folgenden hierin weiter beschrieben) in einen transkriptionell aktiven Bereich des Chloroplastgenoms. Promotoren kontrollieren die Expression eines oder mehrerer Gene. Anders als bei Cannon et al. ist erfindungsgemäß kein Transposon an der Transformation des Chloroplasten beteiligt.
In NATO Asi Series, 1994, berichten Daniell et al. die über Entwicklung von Insektenresistenz über Chloroplastgenome, wobei gezeigt wird, dass die Expression des CryIIA-Proteins in Pflanzen Insekten kontrolliert. McBride et al., 1995 und US-Patent 5,545,818 (1996) bestätigen den Bericht von Daniell et al. und zeigen die Expression von Bacillus thuringiensis-CRYIAc-Protein in Pflanzenplastiden. Die von McBride berichteten Vektoren sind dafür entworfen, das Konstrukt nur in das Tabak-Chloroplastgenom einzubringen.
Der Bedarf an einem Vektor, um eine Vielfalt von Pflanzen zu transformieren. Es ist ausgehend vom Stand der Technik offensichtlich, dass ein wichtiger Bedarf an einem Chloroplastintegrations- und -expressionsvektor besteht, um die Chloroplastgenome vieler verschiedener Pflanzenspezies zu transformieren, bevorzugt um sie stabil zu transformieren. Ein solcher "universeller Vektor" würde die Transformation des Chloroplastgenoms einer ausgewählten Zielpflanze mit einer heterologen (fremden) codierenden DNA-Sequenz erlauben und das Erfordernis ausräumen, Vektoren zu konstruieren, die jeweils speziell dazu geeignet sind, um das Chloroplastgenom der bestimmten Pflanzenspezies, die transformiert werden soll, zu transformieren.
Das Problem, einen solchen universellen Vektor zu konstruieren, der dazu geeignet ist, verschiedene Pflanzen zu transformieren, ist nach Kenntnis des Erfinders bislang nicht gelöst worden.
Konzepte des Standes der Technik der intergenen Spacerregion. Während die Nukleotidsequenzen von codierenden Regionen des Genoms einschließlich des Chloroplastgenoms häufig über Spezies hinweg konserviert sind, sind im Gegensatz dazu die Sequenzen, welche funktionelle Gene flankieren, d.h. die Spacerregionen zwischen codierenden Regionen typischerweise nicht konserviert. Das akzeptierte Dogma für die mangelnde Konservierung und somit das niedrige Maß an Homologie von Spacerregionen über Spezies hinweg ist, dass die Spacerregionen typischerweise keine wesentlichen Funktionen erfüllen. Daher besteht, wenn überhaupt, ein geringer Selektionsdruck, die Sequenz von Spacerregionen über Spezies hinweg zu konservieren. Die Sequenz der Spacerregionen kann ohne unerwünschte Auswirkungen verändert werden.
Stummann et al., 1988, offenbaren, dass die Genfolge des ribosomalen RNA-Operons des Chloroplastgenoms bei verschiedenen Pflanzenspezies einschließlich Tabak, Mais und einem Leberblümchen, Marchantia, gleich ist und dass die codierenden Sequenzen dieses Operons hoch homolog sind. Stummann offenbart auch, dass die Interspezies-Homologie des Operons geringer ist als die Interspezies-Homologie der codierenden Genregionen. Dies stimmt mit der mangelnden Konservierung von Spacerregionen überein und lässt vermuten, dass die Interspezies-Homologie von Spacerregionen in dem ribosomalen RNA-Operon relativ gering ist.
Die Erfindung verwendet im Gegensatz zu dem Dogma mangelnder Konservierung der Spacerregionen solche Spacerregionen, die zwischen verschiedenen Pflanzen hoch konserviert sind, um Vektoren zu konstruieren, die dazu geeignet sind, eine Vielfalt von Pflanzen zu transformieren.
Überblick der Erfindung
Die Erfindung stellt universelle Chloroplastintegrations- und -expressions-Vektoren bereit, die geeignet sind, um Gene von Interesse stabil zu transformieren und in das Chloroplastgenom mehrerer Pflanzenspezies zu integrieren. Transformierte Pflanzen und deren Abkömmlinge werden bereitgestellt. Monokotyledone und dikotyledone Pflanzen werden transformiert, die niemals zuvor transformiert worden sind. Pflanzen, die mit einem synthetischen Gen transformiert wurden, exprimieren wertvolle biologisch abbaubare Polymere auf Proteinbasis (PBPs). Transformierte Pflanzen produzieren wertvolle Moleküle. Es wird Resistenz für landwirtschaftliche Anbaupflanzen gegenüber den Hauptklassen chemischer Herbizide bereitgestellt. Herbizidresistenz wird als ein letaler selektierbarer Marker für die Chloroplast-Transformation verwendet. Die transformierten Pflanzen sind in der Lage, zusätzlich zu dem Zielmerkmal ein gewünschtes zweites Nichtzielmerkmal zu exprimieren. Insektenresistenz wird sowohl gegenüber Insekten, die für Bt-Toxine anfällig sind als auch gegenüber Insekten, die eine Resistenz gegen Bt-Toxine entwickelt haben, für transformierte Pflanzen bereitgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die intergene Spacerregion. Das Konzept der Erfindung.
Es wurde im Gegensatz zu der herkömmlichen Annahme entdeckt, dass das Chloroplast (ct)-Genom von Pflanzen Spacerregionen mit hoch konservierten Nukleotidsequenzen enthält. Die hoch konservierte Natur der Nukleotidsequenzen dieser Spacerregionen des Chloroplastgenoms macht solche Spacerregionen, wie herausgefunden wurde, ideal für die Konstruktion von Vektoren, um Chloroplasten einer breiten Vielfalt von Pflanzenspezies zu transformieren, ohne dass es erforderlich ist, individuelle Vektoren für unterschiedliche Pflanzen oder individuelle Anbaupflanzenspezies zu konstruieren, wofür es erforderlich wäre, zunächst die DNA-Sequenz jedes der Chloroplastgenome zu bestimmen. Dieses Ergebnis besitzt zahlreiche nützliche Auswirkungen und wichtige praktische Anwendungen.
Die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung
Der universelle Vektor. Die Erfindung weist mehrere nützliche Ausführungsformen auf. Die Erfindung stellt einen universellen Integrations- und Expressionsvektor, im Folgenden hierin als "UV" bezeichnet, und dessen Verwendung für die Expression wenigstens eines Phänotyps in einer Vielfalt unterschiedlicher Pflanzen bereit.
Der universelle Integrations-Expressionsvektor der Erfindung umfasst eine Expressionskassette (im Folgenden weiter beschrieben), welche die notwendigen genetischen Elemente umfasst, um die Plastide, z.B. das Chloroplastgenom einer Zielpflanzenzelle, transient oder bevorzugt stabil mit einer fremden (heterologen) DNA zu transformieren, die für ein Molekül von Interesse codiert, wie beispielsweise für einen Phänotyp, der durch die Pflanze exprimiert werden soll oder ein nicht pflanzliches wertvolles Molekül wie beispielsweise ein biologisch aktives Peptid (oder Polypeptid). Der universelle Vektor ist mit einer transkriptionell aktiven Region eines Chloroplastgenoms konstruiert, die in einem weiten Bereich von Chloroplastgenomen höherer Pflanzen konserviert ist. Bevorzugt ist diese Region die Spacer 2-Region; die intergene Spacerregion zwischen der t-RNA^Ile und der t-RNA^Ala-Region. Eine solche Region wird häufig hierin als "Spacer"-Region bezeichnet, da sie in dem Chloroplastgenom intergen zwischen verschiedenen Genen in dem RNA-Operon ist, welches durch einen Promotor transkribiert wird. Wenn sie in den universellen Vektor eingebaut ist, wird eine solche Region im Allgemeinen hierin als eine "Rand" oder bevorzugt als eine "flankierende Sequenz" oder "flankierende Sequenzen" bezeichnet. Der Grund dafür ist, dass die funktionsfähig verbundenen genetischen Elemente zum stabilen Transformieren des Plastiden der Zielpflanze in dem universellen Vektor auf jeder Seite durch eine Sequenz, d.h. ein Fragment der Spacerregion, flankiert sind. Die flankierenden Sequenzen in dem Vektor und die Spacersequenzen in dem Chloroplastgenom besitzen ausreichende Homologie zueinander, um eine homologe Rekombination zu durchlaufen. Der universelle Vektor wird in den Spacer einer transkriptionell aktiven Region in dem Chloroplastgenom eingebracht. Im Allgemeinen befindet sich die Spacerregion in der umgekehrten Repeatregion des Chloroplastgenoms. Der Rest des Konstrukts, d.h. ohne die flankierenden Sequenzen und die Expressionskassette, wird hierin im Allgemeinen als der "Vektor" bezeichnet, was bakterielle Sequenzen wie die Plasmidklonierungsvektoren pUC, pBR322, pGEM oder pBlueScript umfasst.
Expressionsvektor oder Kassette. Der universelle Vektor umfasst eine Expressionskassette, die auf jeder Seite von einer flankierenden Sequenz flankiert ist. Eine geeignete Expressionskassette zur Verwendung in der Erfindung ist in US-Patent 5,693,507 (1997) beschrieben. Diese Kassette umfasst, funktionsfähig verbunden, eine transkriptionelle Initiationsregion, die im Pflanzenchloroplast funktionsfähig ist, wenigstens eine heterologe DNA-Sequenz, die für ein Zielmolekül von Interesse codiert, z.B. ein Gen (oder ein funktioneller Abschnitt davon), welches eine biologisch aktive Verbindung codiert und Kontrollsequenzen, die stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes angeordnet sind und eine Transkriptionsterminationsregion, um die Expression der codierenden Sequenz in dem Chloroplastgenom einer Zielpflanze zu ermöglichen. Bevorzugt ist die Expressionskassette von Pflanzen-DNA-Sequenzen flankiert wie beispielsweise Chloroplast-DNA-Sequenzen, um eine stabile Integration des Expressionsvektors in das Chloroplastgenom zu erleichtern. In der Konstruktion der Expressionskassette umfasst die DNA-Sequenz ein oder mehrere Klonierungsstellen für die Integration des Gens/der Gene von Interesse.
Die Spacersequenzen, die in Plastiden höherer Pflanzen identifiziert worden sind, sind über eine große Vielfalt von Pflanzen hinweg konserviert. Es wurde herausgefunden, dass diese Sequenzen ideal sind, um die erfindungsgemäßen universellen Vektoren zu konstruieren, die als Folge davon geeignet sind, das Chloroplastgenom einer großen Vielfalt (oder Vielzahl) von Zielpflanzen durch homologe Rekombination zu transformieren. Es ist somit unwesentlich, von welchem individuellen Spacer einer bestimmten Pflanze der universelle Vektor konstruiert wird.
Wie bekannt ist, wird es im Allgemeinen ratsam sein, dass in Verbindung mit der Expressionskassette oder mit dem universellen Integrations-Expressionsvektor wenigstens eine zusätzliche heterologe Nukleotidsequenz vorliegt, die für einen selektierbaren Phänotyp codiert, wie beispielsweise ein Gen, welches Antibiotikaresistenz ermöglicht oder die für einen funktionellen Abschnitt davon codiert, der als Marker dienen kann. Dies erleichtert die Identifikation von Pflanzenzellen, in welche das fremde Gen stabil integriert worden ist. Markergene sind in der Literatur bekannt, z.B. β-Lactamase, Herbizidresistenz-Gene wie beispielsweise das mutante psbA-Gen oder EPSPS-aroA, das cat-Gen, welches für Chloramphenicolacetotransferase codiert und das uidA-Gen, welches für β-Glucuronidase (gus) codiert und andere.
Es wird anerkannt, dass Tabak insofern einzigartig ist, dass es nicht der letalen Wirkung von Streptomycin und Spectinomycin unterliegt. Obwohl Tabakblätter keine Pigmentierung aufweisen, wenn sie einem Medium mit einem solchen Antibiotikum ausgesetzt sind, so ist ein andauerndes Wachstum zu beobachten. Diese Eigenschaft von Tabak ist jedoch leicht zu umgehen. Es sind zahlreiche Antibiotika verfügbar, die für Tabak letal sind, wie beispielsweise Hygromycin. Ein weiterer Ansatz ist es, ein Gen auszuwählen, welches einen sichtbaren Marker wie beispielsweise eine Farbe, Fluoreszenz, etc. exprimiert, wie z.B. das Reportergen mGFP, welches für ein grünes Fluoreszenzprotein codiert.
Transformationsverfahren. Die Erfindung stellt ein Transformationsverfahren bereit, welches nach einer ersten Selektionsrunde Homoplasmie (Integration von Fremdgenen in sämtliche Chloroplastgenome der Pflanzenzelle) erzeugen kann, ohne dass ein weiterer Selektionsvorgang erforderlich ist. Das Verfahren zur Transformation einer Pflanze verwendet den universellen Vektor, der mit flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als der Spezies der Zielpflanze, die transformiert werden soll, konstruiert ist. Alternativ kann der Vektor flankierende Sequenzen von derselben Pflanzenspezies wie der Zielpflanze, einschließlich von Tabak, enthalten.
Verfahren zur Konstruktion des universellen Vektors. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, um den universellen Chloroplastintegrations- und -expressionsvektor zu konstruieren. Zu diesem Zweck wird ein Spacerabschnitt des Chloroplastgenoms von einer beliebigen Pflanze bestimmt, der hoch homolog zu mehr als einer Pflanzenspezies ist. Eine Nukleotidsequenz, welche dieser Spacerregion entspricht, wird aus dem identifizierten Chloroplastgenom erhalten (oder synthetisiert) und sie wird in einen geeigneten Vektor eingefügt, beispielsweise durch Subklonieren in ein Plasmid. Die Spacerregion ist als flankierende Sequenzen zu der Expressionskassette angeordnet, welche die notwendigen genetischen Elemente für die Transformation des Plastids und die Expression des Fremdgens/der Fremdgene umfasst.
Es kann ein beliebiges Verfahren zur Transformation des Chloroplasten verwendet werden. Jedes beliebige Gen (oder ein funktioneller Abschnitt davon), das verwendet werden kann, um einen Pflanzenchloroplasten zu transformieren und für ein gewünschtes Peptid zu codieren, um der Zielpflanze das gewünschte Merkmal zu verleihen, ist zur Transformation mit dem universellen Vektor geeignet.
Transformierte Pflanzen. Die Erfindung stellt ferner Pflanzen bereit, in welchen das Chloroplastgenom stabil, d.h. permanent mit dem universellen Vektor der Erfindung transformiert wurde, einschließlich deren Abkömmling.
Die Erfindung schließt monokotyledone Pflanzen wie Getreide oder Pflanzenzellen wie beispielsweise Mais, Reis, Gerste, Hafer, Weizen und Gräser und deren Abkömmling bereit, in denen das Chloroplastgenom stabil transformiert wurde mit dem universellen Vektor, der von derselben Spezies oder von einer anderen Spezies als der transformierten Pflanze abgeleitet ist.
Die Erfindung stellt dikotyledone und monokotyledone Pflanzen bereit, die aufgrund der Homoplasmie, die mit dem universellen Vektor, der einen Chloroplast-Replikationsursprung (ori) umfasst, erzielt werden kann, nach einer einzelnen Selektionsrunde stabil transformiert wurden. Die Erfindung stellt auch stabil transformierte Pflanzen unterschiedlicher Spezies bereit, einschließlich Variationen derselben Spezies, Gattung, Familien, Ordnungen und Klassen von Pflanzen.
Erfindungsgemäß schließt eine Pflanze, in welcher das Chloroplastgenom mit einem oder mehreren Fremdgenen von Interesse stabil transformiert wurde, mature Pflanzen und deren Abkömmlinge wie beispielsweise Sämlinge und Embryos ein. Die Bezeichnung "Pflanze" schließt in diesem Zusammenhang auch Teile von Pflanzen wie beispielsweise Explantate wie Stecklinge, Gewebekulturen, Zellsuspensionen und Calli ein.
Die Erfindung schließt somit die stabil transformierten multizellulären Pflanzen, deren Abkömmling und die Samen und die transformierten Plastide, z.B. den Chloroplasten etc. sowie Verfahren zur Regenerierung der transformierten Pflanzen ein.
In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen betrifft die Bezeichnung "Spezies", wenn auf verschiedene "Spezies" Bezug genommen wird, nicht nur "Spezies" sondern schließt Formen innerhalb einer Spezies, Gattung, Familien, Ordnung und Klassen des Pflanzenreichs ein. Somit versteht man unter einem universellen Vektor, der verwendet werden kann, um Pflanzen unterschiedlicher Spezies zu transformieren, dass er in der Lage ist, Pflanzen unterschiedlicher Variationen innerhalb einer Spezies, unterschiedlicher Gattungen, unterschiedlicher Familien, unterschiedlicher Ordnungen und unterschiedlicher Klassen zu transformieren. Die Bezeichnung "Pflanze" (oder "Pflanzen") soll wie hierin verwendet generisch sein.
Expression nicht pflanzlicher Produkte
Biopolymer-Gene. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung des universellen Integrations- und Expressionsvektors stellt Pflanzen bereit, die mit einem synthetischen Biopolymergen transformiert sind, welches für biologisch abbaubare Polymere auf Proteinbasis (PBPs) codiert.
Diese Polymere besitzen wichtige Eigenschaften von praktischer Bedeutung, die hierin im Folgenden diskutiert werden.
Produktion wertvoller Moleküle – biologisch aktive Moleküle. Die faszinierende Entdeckung, dass eine Transformation mit einem synthetischen Gen, welches kein natürliches Analogon in Pflanzen oder Tieren aufweisen muss, um PBPs zu erzeugen, machbar ist, hat die breite Anwendbarkeit des Vektors in noch einem weiteren Gebiet menschlicher Bemühungen gezeigt: Die Produktion biologisch aktiver Moleküle wie beispielsweise Pharmazeutika in Pflanzen aus einem beliebigen Gen oder funktionellen Abschnitt davon, synthetisch oder natürlich.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Verwendung von transformierten Pflanzen als Bioreaktoren (als Fabriken) für Biopharmazeutika. Es gibt mindestens zwei Fähigkeiten, die häufig für die Produktion von Proteinen mit pharmazeutischem Wert benötigt werden, die in prokaryotischen Systemen nicht möglicht sind. Pflanzen sind im Gegensatz zu Bakterien in der Lage, das fremde Protein in einer biologisch aktiven Konformation zu produzieren. Pflanzen sind außerdem häufig toleranter gegenüber der Veränderung ihrer biosynthetischen Wege. Somit können die Pflanzen mit einem Gen transformiert werden, das in Pflanzen nicht funktional ist (oder pflanzenfremd ist), das synthetisch oder nicht-synthetisch sein kann, das in Tieren (Säugern), in Oviparen, in Fischen oder anderen Spezies normalerweise funktional (kompetent) sein kann.
Die Erfindung stellt ferner transformierte Pflanzen bereit, die ein Gen umfassen, das durch eine Expressionskassette, bevorzugt einen universellen Vektor, bereitgestellt wird, welcher für eine Vielfalt von erwünschten Produkten, insbesondere biologisch aktive Moleküle wie beispielsweise Peptide (Polypeptide), Proteine, Insulin, humanes Serumalbumin (HSA) und andere Moleküle, die im Folgenden hierin weiter beschrieben werden, codiert. Die Pflanzen werden wachsen gelassen oder zum Wachsen angeregt und die Produkte werden aus der transformierten Anbaupflanze wie Tabak, Mais, etc. isoliert und, falls wünschenswert, zuerst geerntet und, wenn notwendig, gereinigt.
Herbizidtoleranz. Eine weitere wichtige Ausführungsform der Erfindung stellt transgene herbizidresistente Pflanzen bereit, in welche ein fremdes Transgen, das Resistenz gegenüber einem oder mehreren Herbiziden verleiht, in das Chloroplastgenom mittels des universellen Vektors integriert, bevorzugt stabil integriert ist. Von besonderer Wichtigkeit sind transformierte Pflanzen, welche Glyphosatresistenz aufweisen und somit resistent gegenüber "ROUNDUP^TM", einem von Monsanto Company kommerziell erhältlichen Herbizid sind. Der universelle Vektor stellt ein effektives Mittel bereit, um das Chloroplastgenom beliebiger Pflanzen zu transformieren und Resistenz (oder Toleranz) gegenüber beliebigen herbiziden Chemikalien zu vermitteln.
Ein anderer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um eine Pflanze mittels einer Expressionskassette, bevorzugt mittels des universellen Vektors, zu transformieren, um es dazu anzuregen, ein Nicht-Zielmerkmal (ein zweites oder anderes Merkmal) (oder einen Phänotyp) zu produzieren. [Siehe z.B. Penazloza, V., et al. (1995), welche berichten, dass die Expression durch Hygromycin-β-phosphotransferase-Gen Resistenz gegenüber dem Herbizid Glyphosat verleiht.]
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird Herbizidtoleranz als ein Markergen für die Chloroplast-Transformation verwendet.
Insektenresistenz. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Insektenresistenz bereit. Mit den gesteigerten Anforderungen an die Verwendung chemischer Pestizide ist die Verwendung von Bacillus thuringiensis (Bt)-Formulierungen weithin befürwortet worden. Bacillus thuringiensis produziert viele Arten kristalliner Einschlüsse, die für Insekten toxisch sind. Die Proteine, welche diese Einschlüsse umfassen, sind auf Grundlage von Insektizid-Wirtsbereich und Proteinhomologie kategorisiert worden. Die CRYI- und CRYII-Toxine besitzen insektizide Wirkung gegenüber Lepidoptera bzw. Lepidoptera und Diptera. CRYI-Protoxine sind 130-135 kDa groß und werden für eine insektizide Wirksamkeit enzymatisch in ein Protein mit einer Größe von 65 kDa gespalten. CRYII-Protoxin ist 65 kDa groß mit einem Protein mit einer molekularen Masse von 60-62 kDa für insektizide Wirksamkeit. Viele kommerziell wichtige Insektenplagen (insbesondere in der Familie Pyralidae) sind anfällig für CRYIIA-Toxin, einschließlich Maisstengelbohrer, Ostrinia nubilalis, kleiner Maisstengelbohrer, Elasmopalpus lignosellus, Hülsenbohrer, Maruca testulalis, Tabak-Budworm, Heliothis virescens, Tabakschwärmer, Manduca sexta und Schwammspinner Lymantria dispar, Daniell et al. 1994.
Bt-Formulierungen sind jedoch aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber UV-Strahlung, unzureichender Bedeckung, Kosten und eingeschränktem Wirtsbereich nicht so wirksam gewesen wie zunächst angenommen. Die Zufuhr von Bt-Toxinen über Bt-transgene Pflanzen ist daher dringend erforderlich.
Eine akzeptable Insektenkontrolle ist bei Kern-transgener Bt-Baumwolle gegen den Tabak-Budworm, Heliothis virescens aufgetreten, aber diese Pflanzen exprimieren nicht genügend Bt-Toxin, um den Baumwoll-Kapselbohrer, Helicoverpa zea, zu kontrollieren. Außerdem können diese Bt-Gene über Pollen mit verwandten Pflanzenspezies kreuzen. Um diese Probleme zu umgehen, ist die Chloroplast-Transformation und -expression erfindungsgemäß aus den folgenden Gründen bewertet worden. 1) Pflanzenzellen, die Chloroplasten enthalten, können bis zu 10000 Genkopien pro Zelle enthalten, 2) Chloroplasten können intakte bakterielle DNA einschließlich Operons lesen und 3) Chloroplastgenome werden mütterlich vererbt und daher wird das Entweichen fremder Gene über die Pollen drastisch verhindert, da Chloroplast-DNA im Allgemeinen in Pollen abgebaut ist.
CRY2A wurde ausgewählt, da CRY2A verhältnismäßig nicht-homolog zu CRY1A ist und daher nur eine geringe Kreuzresistenz gegenüber einigen CRY1A-resistenten H. virescens-Populationen zeigt. Da CRY2A "natürlich verkürzt" ist, können hohe Expressionsmengen erzielt werden, ohne die 3'-Region zu opfern.
Entsprechend ist für das Tabak-Chloroplastgenom, welches mit einem universellen Vektor der Erfindung transformiert wurde, Resistenz gegenüber Insekten bereitgestellt worden, die normalerweise empfindlich gegenüber Bt-Toxinen sind und auch gegenüber Insekten, die Resistenz oder eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Bt-Toxinen entwickelt haben. Insekten, die niemals zuvor durch irgendein CRY-Toxin vernichtet wurden, zeigten bei transformiertem Tabak eine 100%-ige Sterblichkeit.
Die Expression von cry2A in einer Pflanze könnte daher ein wertvolles Werkzeug zur Kontrolle mehrerer Insektenplagen darstellen, während zugleich die Entwicklung von Bt-Resistenz überwunden wird. Andere insektizide Proteine wie beispielsweise Cholesterinoxidase, welche den Baumwollrüßler über einen anderen Mechanismus vernichten, werden in großen Mengen in Chloroplasten exprimiert.
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden hieraus ersichtlich werden.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Karte des Tabak-Chloroplastgenoms. Die dicken Linien in der Genomkarte stellen die umgekehrten Repeatregionen des Chloroplastgenoms dar. Die mit "UV" gekennzeichneten Pfeile stellen die Insertionssequenzen für die bevorzugte Ausführungsform des universellen Integrations- und Expressionsvektors (UV) dar; der mit "TV" markierte Pfeil stellt die Insertionssequenz für den Tabakvektor (TV) dar.
2A zeigt den Tabak-Chloroplastvektor (TV) pZS-RD-EPSPS für die Expression von Herbizidresistenz (Vergleichsbeispiel).
2B zeigt den universellen Chloroplastexpressions- und -integrationsvektor (UV), pSBL-RD-EPSPS für die Expression von Herbizidresistenz.
3A zeigt den universellen Chloroplastintegrations- und -expressionsvektor, pSBL-CG-EG121 für die Biopolymer-Expression.
3B zeigt den Tabak-Integrations- und -expressionsvektor pZS-CG-EG121 für die Biopolymer-Expression (Vergleichsbeispiel).
4A-4E zeigt die Sequenzhomologie von Spacerregionen zwischen Tabak und anderen Anbaupflanzenspezies. Eine Stelle für die Fremdgeninsertion ist durch Pfeile angezeigt. Stromaufwärts der Stelle für die Fremdgeninsertion ist die Stelle eines Replikationsursprungs (ori) gezeigt.
4F-4G zeigt das Sequenzalignment der Spacer (64 bp)-Region 16S-23S rDNA aus verschiedenen Anbaupflanzenspezies mit der Tabak- Chloroplastsequenz, wobei (+) den positiven bzw. (-) den negativen Strang darstellt.
5A-C zeigt die Konstruktion des pSBL-Ct Vektor-Randes.
6A-C zeigt die Konstruktion der Vektor pSBL-CtV1 selektierbarer Marker-Genkassette, die einen Chloroplast 16S-rRNA-Promotor (Prrn), das aadA-Gen und eine 3'-untranslatierte Region des Chloroplast psbA-Gens enthält.
7A-7D zeigt die Vektoren pSBL-CtV2, pSBL-CtV3, pSBL-CtVH bzw. pSBL-CtVHF.
8A-B zeigt die Vektoren pSBL-CtVHBt bzw. pSBL-CtVHBtR.
9 zeigt transformierte und untransformierte Tabakpflanzen, die in Anwesenheit von Spectinomycin wachsen, was nicht-letale Selektion auf dem Medium (500 μg/ml) zeigt. Man bemerke das Wachstum von transformierten (gebleichten) und untransformierten Blättern (grün).
10A-10G zeigt Mais-Plastidtransformation und -regeneration.
11 zeigt Mais-Plastidtransformation. Transformierte Maispflanzen wachsen normal (mittlere Aufnahme), während untransformierte Pflanzen auf dem letalen Medium absterben, was die letale Selektion durch das Antibiotikum bestätigt (1000 μg/ml Spectinomycin).
12A-12F zeigt Reis-Plastidtransformation und -regeneration.
13A und 13B zeigt eine PCR-Analyse von DNA, die aus den Blättern von Reistransformanten isoliert wurde.
14 zeigt Erdnuss-Plastidtransformation. Transformierte Erdnusspflanzen wachsen normal (mittlere und linke Seite der Platte), während untransformierte Pflanzen in dem letalen Medium absterben (500 μg/ml Spectinomycin).
15 zeigt Sojabohnen-Plastidtransformation. Zwei transformierte Pflanzen zeigen Triebe, die anderen Pflanzen sterben auf dem letalen Medium ab, was die letale Selektion durch das Antibiotikum bestätigt (500 μg/ml Spectinomycin).
16 zeigt Süßkartoffel-Embryotransformation auf letalem Selektionsmedium (500 μg/ml Spectinomycin).
17 zeigt Weintrauben-Zelltransformation. Die transformierten Kulturzellen werden grün, während die untransformierten Zellen in dem letalen Selektionsmedium absterben (500 μg/ml Spectinomycin).
18 zeigt die Expression von Biopolymer auf Proteinbasis (PBP) durch Chloroplastintegrations- und -expressionvektoren in E. coli.
19 zeigt eine Southern blot-Analyse, die mit den Transformanten aus PBP-transgenen Pflanzen unter Verwendung des Tabakvektors (TV) durchgeführt wurde (Vergleichsbeispiel). Die Sonden stammten aus Chloroplast-Randsequenzen (A) oder von Polymer (EG121)-Gensequenzen (B).
20 zeigt eine Southern blot-Analyse, die mit den Transformanten aus PBP-transgenen Pflanzen unter Verwendung des universellen Vektors (UV) durchgeführt wurde. Sonden stammten von den Chloroplast-Randsequenzen (A) oder von dem aadA-Gen (B).
21 A zeigt Fremdgen-Transkriptionsmengen, analysiert durch Northern blot-Verfahren unter Verwendung der Gesamt-RNA, die aus der Kontrolle, Chloroplasttransformanten und einer Kern-transgenen Tabakpflanze, die das synthetische Biopolymergen (EG121) stark exprimiert, isoliert wurden.
21 B zeigt eine Vergrößerung der Bahnen 4-7 aus 21A.
22 zeigt eine Western blot-Analyse von gereinigtem Polymerprotein aus transgenen Pflanzen.
23A zeigt die höhere Wachstumsrate von E. coli, welche den Tabakvektor mit dem EPSPS-Gen enthalten (Vergleichsbeispiel).
23B zeigt die höhere Wachstumsrate von E. coli, welche den universellen Vektor mit dem EPSPS-Gen enthalten.
24A-24B zeigen die Integration von Fremdgenen in das Plastidgenom durch PCR unter Verwendung von rbcL- und aadA-Primern (A) oder 16S RNA- und aadA-Primern (B).
25A-25C zeigen die Integration des aroA-Gens in den Chloroplasten durch Southern-Analyse und die starke Bildung von Homoplasmie unter Verwendung von EPSPS-Sonde (A) oder rcbL-orf512-Sonde. Die Integrationsstelle ist in (C) gezeigt.
26A und 26B zeigen die Erzeugung von Samen, die aus Kontrollpflanzen bzw. transformierten Tabakpflanzen gesammelt wurden, in Anwesenheit der selektierbaren Marker.
27A und 27B zeigen transgene Pflanzen und Kontroll-Tabakpflanzen, die mit Glyphosat besprüht wurden.
28A und 28B zeigen die Suszeptibilität (Kontrolle) und Resistenz (transformiert) von Tabak gegenüber Insekten.
29 zeigt (Western blot-Analyse) das aus Kontrollpflanzen und transgenen Tabakpflanzen isolierte Gesamt-Protein.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden hierin ausführlicher beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der universelle Integrations- und Expressionsvektor. Der universelle Integrations- und Expressionsvektor der Erfindung ist zum stabilen Transformieren von Chloroplasten verschiedener unterschiedlicher Zielpflanzen geeignet. Heterologe codierende DNA-Sequenzen können in der Kassette bereitgestellt werden, um für einen Phänotyp wie beispielsweise Herbizidresistenz, Insektenresistenz oder andere Merkmale zu codieren. Der Vektor umfasst ferner eine flankierende Sequenz auf jeder Seite der codierenden DNA-Sequenz, die homolog zu einer Spacersequenz des Chloroplastgenoms ist, wobei die Spacersequenz in den Chloroplastgenomen verschiedener Pflanzen konserviert ist. Auf diese Weise wird eine stabile Integration des heterologen Gens in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Randsequenzen mit komplementären Spacersequenzen in dem Chloroplastgenom erleichtert. Der universelle Vektor ist dazu geeignet, eine beliebige Pflanzenspezies zu transformieren.
Es wurde herausgefunden, dass die trnI- und trnA-Spacerregion in einer großen Vielfalt von Pflanzenspezies, von Cyanobakterien bis zu höheren Pflanzen wie beispielsweise monokotyledonen und dicotyledonen Pflanzen, hoch konserviert ist. Die trnI- und trnA-Gene flankieren auf jeder Seite eine Spacerregion, die als Spacer 2 oder 'spa-2'-Region bezeichnet wird (4F-4G). Die Regionen auf jeder Seite der Spacerregion haben wiederum eine nahezu perfekte Homologie mit entsprechenden Regionen zwischen Spezies von Pflanzen von Cyanobakterien bis zu höheren Pflanzen mit der Ausnahme, dass die höheren Pflanzen zwei Introns in den trnI- und trnA-Genen enthalten. Längere Randsequenzen neigen dazu, eine effizientere Integration von Fremd-DNA zu begünstigen. Daher trägt die Homologie der trnI- und trnA-Gene zwischen Spezies, obwohl sie nicht essenziell ist, zusätzlich zu der Homologie der Spacerregion zu der Wirksamkeit der Transformation und Integration bei ( 4A-4E).
Wenn längere Randsequenzen, welche nicht homologe Abschnitte beinhalten, in den Vektor eingebaut werden, so wird der nicht homologe Abschnitt der Sequenz in dem Rekombinationsprozess "looped out" und "clipped off" (ausgeklammert) und er wird nicht in das Ziel-Chloroplastgenom eingefügt.
Verschiedene universelle Vektoren können mit der Spacerregion konstruiert werden. Beispielsweise können kürzere oder längere flankierende Sequenzen mit einem Teil oder den gesamten trnA- und trnI-Genen, die zu 'spa 2' benachbart sind, eingesetzt werden.
Ein bevorzugter universeller Vektor umfasst die flankierenden Sequenzen und eine Expressionskassette, welche die folgenden genetischen Elemente in der folgenden Reihenfolge (vom 5'- zum 3'-Ende) umfasst, um die Transkription und Translation der codierenden DNA-Sequenz zu ermöglichen: ein 5'-Teil der flankierenden Sequenz, einen im Chloroplast funktionsfähigen Promotor, eine DNA-Sequenz mit entsprechender Klonierungsstelle(n) zur Insertion einer oder mehrerer für den gewünschten Phänotyp oder das Molekül von Interesse und für einen selektierbaren Marker codierender Sequenz(en), einen Transkriptionsterminator und einen 3'-Teil der flankierenden Sequenz. Die Reihenfolge der DNA-Sequenzen, die für den gewünschten Phänotyp und den selektierbaren Marker codieren, kann ausgetauscht werden. Zusätzliche flankierende pflanzliche DNA-Sequenzen können bereitgestellt werden, um eine stabile Integration zu fördern. Bevorzugt umfasst die flankierende Sequenz einen Replikationsursprung (ori).
In einer bestimmten Darstellung befindet sich die hoch konservierte Spacerregion in dem umgekehrten Repeat des Chloroplastgenoms. Die bestimmte Anordnung des Spacers in dem Chloroplastgenom ist jedoch nicht so wichtig wie ihre hohe Homologie mit der Spacerregion verschiedener Pflanzen.
Darüber hinaus ist, wie in den 4F-4G ersichtlich ist, die Spacer 2 (oder spa 2)-Sequenz, welche 64 bp lang ist, zu kurz, um den Chloroplastgenom ori, der sich stromabwärts dieses Spacers befindet, einzuschließen. Wenn es gewünscht ist, den ori einzuschließen, so wird eine längere Spacersequenz, die den ori umfasst, ausgewählt, welche die Spacersequenz und eine zusätzliche Sequenz in den flankierenden Sequenzen beinhaltet. Dadurch wird eine längere Matrize für eine homologe Rekombination in das Empfänger-Chloroplastgenom bereitgestellt und Homoplasmie gefördert.
Ein weiterer bevorzugter Vektor ist ein Vektor, in welchem die flankierenden Sequenzen jeweils zusätzlich zu der Spacer 2-Region einen Abschnitt oder die gesamte intergene Spacerregion zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen (4A-4E). Ferner können die flankierenden Sequenzen teilweise oder vollständig die tRNA^Ile- bzw. die tRNA^Ala-Gene enthalten. Ggf. umfassen die flankierenden Sequenzen jeweils teilweise oder vollständig die 16S- und/oder 23S-rRNA-Gensequenzen.
Veranschaulichende universelle Vektoren. Ein bevorzugter universeller Vektor umfasst eine DNA-Sequenz, welche die Sequenz der Spacer 2-Region zwischen den hoch konservierten trnI- und den trnA-Genen zwischen den 16S- 23S-rRNA-Genen des Chloroplastgenoms umfasst. Bevorzugt umfasst diese Region teilweise oder vollständig die DNA-Sequenz (4F-4G) der trnI- und der trnA-Gene. Diese Region wird aus einer ausgewählten Pflanze wie beispielsweise Tabak ausgeschnitten und in ein allgemein verfügbares Plasmid wie beispielsweise pUC19, z.B. an der Pvull-Stelle subkloniert. In das Plasmid ist die Expressionskassette eingefügt, welche ein selektierbares Markergen, einen Chloroplast-16SrRNA-Promotor, ein Gen, welches für ein Enzym codiert, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleiht, wie beispielsweise das aadA-Gen, welches für Aminoglycosid-3'-adenyltransferase codiert, welche Resistenz gegenüber Streptomycin/Spectinomycin verleiht und die 3'-untranslatierte Region des Chloroplast-psbA-Gens enthält.
Im Besonderen wurde dann, wenn ein universeller Vektor mit Plasmid pSBL-Ct-bor (5) konstruiert wird, eine selektierbarer Marker-Genkassette, die einen Chloroplast-16S-rRNA-Promotor, das aadA-Gen, welches für Aminoglycosid-3'-adenyltransferase codiert, die Resistenz gegenüber Streptomycin/Spectinomycin verleiht oder ein Herbizidresistenzgen und eine 3'-untranslatierte Region des Chloroplast-psbA-Gens in das Plasmid eingefügt. (6). Diese selektierbarer Marker-Genkassette wurde anschließend in zwei unterschiedlichen Orientierungen in den universellen Rand eingefügt. In dem Vektor pSBL-CtV1 wurde die selektierbarer Marker-Genkassette in das trnI-Gen eingefügt (6A). In dem Vektor pSBL-CtV2 (7A) wurde die selektierbarer Marker-Genkassette zwischen die trnI- und trnA-Gene in der Spacerregion in der Richtung der 16S-rDNA-Transkription eingefügt. In dem Vektor pSBL-CtV2 R (Karte nicht gezeigt) wurde die selektierbarer Marker-Genkassette zwischen die trnI- und trnA-Gene in der Spacerregion in der entgegengesetzten Richtung zu der 16S-rDNA-Transkription eingefügt.
Verschiedene Gene von Interesse sind in den pSBL-CtV2-Vektor, eine bevorzugte Ausführungsform des universellen Vektors, eingefügt worden. Beispielsweise enthält der Vektor pSBL-CtV3 (7B) das Reportergen mGFP, welches für ein grünes Fluoreszenzprotein codiert, das aus Quallen isoliert wurde. Dieses Gen kann außerdem zur sichtbaren Selektion transformierter Pflanzen oder in ornamentaler Gartenbaukunst z.B. in ornamentalen Anbaupflanzen wie Christbäumen oder selbst Rasen nützlich sein, welche bei Bestrahlung mit blauem Licht mit grüner Fluoreszenz leuchten können.
Der Vektor pSBL-CtVH (7C) enthält einen anderen selektierbaren Marker, Hygromycinphosphotransferase (hph-Gen angetrieben durch den Chloroplast-atpB-Genpromotor), welcher Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin verleiht. Dieser Vektor kann verwendet werden, um Pflanzen zu transformieren, die gegenüber anderen Antibiotika resistent sind und er ist insbesondere nützlich, um Monocots zu transformieren, die im Allgemeinen resistent gegenüber anderen üblicherweise verwendeten Antibiotika sind. Dieses Gen kann zusätzliche Merkmale wie beispielsweise Herbizidresistenz, ein Nicht-Zielmerkmal, verleihen.
Der Vektor pSBL-CtVHF (7) enthält die GFP- und hph-Gene, die für eine letale Selektion oder eine Kombination aus letaler und sichtbarer Selektion verwendet werden können.
Ein Chloroplastvektor, der spezifisch für Tabak ist (Vergleichsbeispiel) und ein universeller Chloroplastvektor. Der Tabak-Chloroplastvektor pZS-RD-EPSPS (2A) ("TV") und der universelle Vektor pZS-RD-EPSPS ( 2B) ("UV") enthalten beide den Prrn-Promotor (von der 16S-rRNA), das aadA-Gen (für Spectinomycinselektion), das Mutant-aroA-Gen, das für das Enzym EPSPS-Synthase codiert (für Glyphosatselektion) und die psbA-3'-Region. Die flankierenden Sequenzen in pZS-RD-EPSPS enthalten rbcL und orf 512 und die flankierenden Sequenzen in pSBL-RD-EPSPS enthalten die trnI- und trnA-Gene, welche jeweils die Integration in die Large Single Copy-Region (1 bei dem Pfeil "TV") bzw. die umgekehrten Repeatregionen (1 bei den UV-Pfeilen) des Tabak-Chloroplastgenoms erleichtern.
Glyphosat ist der aktive Bestandteil in Monsantos Herbizid ROUNDUP^TM und wird als selektierbarer Marker für die Herbizidselektion transgener Pflanzen verwendet.
Konstruktion von Chloroplastvektoren. Es wurden Standardprotokolle für die Vektorkonstruktion einschließlich der Dephosphorylierung durch Auffüllung mit Klenow-Fragment verwendet. Der Tabak-Chloroplastexpressionsvektor pZS-RD-EPSPS ist in 2A gezeigt (Vergleichsbeispiel). Der universelle Chloroplastvektor pSBL-RD-EPSPS ist in 2A gezeigt. Die Konstruktion dieser Vektoren ist ferner in den Beispielen gezeigt. Beide Plasmide wurden in den XL1 Blue Strain von E. coli amplifiziert. Wachstumskurven wurden in M-9-Minimalmedium aufgenommen. Beide Vektoren werden für die Selektion von Glyphosat verwendet, um Resistenz gegenüber ROUNDUP^TM zu bestätigen.
Der Chloroplastexpressionsvektor pZS-RD-EPSPS ist spezifisch für Tabak und wie zuvor angemerkt ist er nicht für die Transformation anderer Pflanzen verwendbar (Maier et al., 1995). Im Gegensatz dazu ist der universelle Chloroplastexpressions- und -integrationsvektor pSBL-RD-EPSPS (2B) aufgrund der oben beschriebenen universellen Eignung des Vektors dazu geeignet, um Chloroplastgenome zahlreicher anderer Pflanzenspezies zu transformieren. Der universelle Vektor integriert fremde Gene in die 16S-23S-Spacerregion des Chloroplastgenoms. Der universelle Vektor verwendet die trnA- und trnI-Gene (Chloroplasttransfer-RNAs), die für Alanin und Isoleucin codieren, aus der umgekehrten Repeatregion des Chloroplastgenoms als flankierende Sequenzen für die homologe Rekombination. Die Chloroplast-Randsequenz, die in dieser Erfindung verwendet wird, enthält außerdem den Chloroplast-Replikationsursprung (oriA), wie in verschiedenen Anbaupflanzenspezies einschließlich Erbsen (Nielsen et al., 1993) und Tabak (Lu et al., 1996) bestätigt wurde, was die hoch konservierte Sequenzhomologie in dieser Region erklären kann. Dieser Replikationsursprung ermöglicht eine erhöhte Anzahl von Plasmidmatrizen für eine effiziente Integration in das Empfänger-Chloroplastgenom und das Erreichen von Homoplasmie
Wie oben gezeigt werden bei der Konstruktion des universellen Vektors eine Expressionskassette, die einen Chloroplastpromotor, ein selektierbares Markergen, das Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (oder einem anderen ausgewählten Marker) verleiht, ein Gen, das für das Zielmolekül codiert und die anderen Elemente (wie hierin beschrieben) enthält, an einer günstigen Restriktionsstelle in das DNA-Fragment eingefügt, welches die Spacerregion enthält. Wenn gewünscht, kann das Fremdgen, welches für das Zielmolekül codiert, in die Expressionskassette nach der Insertion der Kassette in das DNA-Fragment, welches die konservierte Spacerregion enthält, eingefügt werden, so dass die Kassette vor der Insertion mehrere Klonierungsstellen für die Insertion einer oder mehrerer codierender DNA-Sequenzen beinhaltet.
Die Position der Restriktionsstelle in der Spacersequenz kann die jeweilige Länge der beiden flankierenden Sequenzen bestimmen, bei denen es sich um Teile (mit unterschiedlicher oder gleicher Länge) der Spacerregion handelt. Somit brauchen die beiden flankierenden Sequenzen nicht gleich lang zu sein, solange sie jeweils ausreichend komplementär zu dem Ziel-Chloroplastgenom sind, um eine homologe Rekombination zu fördern.
Da der Vektor der Erfindung ein derart hohes Ausmaß an Homologie zu der Spacerregion des Chloroplastgenoms mehrerer Pflanzenspezies aufweist, ist er dazu geeignet, nicht nur die Pflanzenspezies, aus der die Randsequenz des Vektors abgeleitet ist, sondern beliebige Pflanzenspezies zu transformieren.
Wie in dieser Beschreibung verwendet, bedeutet die Bezeichnung "homolog", dass eine DNA-Sequenz aus einer Pflanzenspezies Sequenzregionen besitzt, die identisch zu Abschnitten einer DNA-Sequenz aus einer anderen Pflanzenspezies sind. D.h., dass, wenn zwei DNA-Sequenzen hoch homolog sind, die DNA-Spezies eine 100%-ige Sequenzidentität oder weniger als 100% Identität aufweisen kann. Z.B. wird für den Zweck der Chloroplastgenomintegration eine 400 bp-Sequenz, die insgesamt nur 25% homolog ist, die aber einen 100 bp-Abschnitt enthält, der 85% bis 90% oder mehr homolog ist als hoch homolog zu dem Chloroplastgenom angesehen.
Der Einschluss eines Chloroplast-ori innerhalb der flankierenden Sequenzen des universellen Vektors hat sich als vorteilhaft erwiesen. Ohne an diese Theorie gebunden zu sein, nimmt man an, dass die Anwesenheit des ori in dem universellen Vektor Homoplasmie nach einer einzigen Selektionsrunde fördert, ohne dass ein zweiter Selektionsschritt erforderlich ist. Dies ist insbesondere bei der Transformation von monokotyledonen Pflanzen wie beispielsweise Mais oder Reis wichtig, bei welchen ein zweiter Selektionsschritt aufgrund der Schwierigkeit, die Pflanzen in Kultur aus Laub-Stecklingen anzubauen, mit der daraus resultierenden Notwendigkeit, diese Pflanzen aus Embryos aufzuziehen, nicht machbar. Wenn ein ori gewünscht wird, dieser aber fehlt, so kann er in eine flankierende Sequenz oder an andere Stelle eingeführt werden. Wenn es gewünscht wird, die Kopienanzahl des eingefügten universellen Vektors zu erhöhen, so wird ein Chloroplast-DNA-Fragment, welches einen ori enthält, außerhalb der flankierenden Sequenzen eingefügt, so dass er nur dazu dient, die Kopienanzahl des universellen Vektors zu amplifizieren und nicht in das Chloroplastgenom integriert wird.
Abgesehen davon, dass die flankierenden Sequenzen aus einer speziellen Pflanze abgeleitet sein können, so können sie, wie im Folgenden gezeigt, auch aus einer synthetisch hergestellten Spacerregion abgeleitet sein.
Für die Transkription und Translation der DNA-Sequenz, die für das Polypeptid von Interesse codiert, wird üblicherweise die gesamte Promotorregion aus einem Gen, das zur Expression in dem Chloroplast in der Lage ist, verwendet. Die Promotorregion kann Promotoren beinhalten, die aus Chloroplastgenen erhältlich sind, wie beispielsweise das psbA-Gen aus Spinat oder Erbse, die rbcL- und atpB-Promotorregion aus Mais und rRNA-Promotoren. Geeignete Promotoren sind ebenfalls beschrieben und weitere Literaturquellen sind in Patent Nr. 5,693,507 angegeben.
Die flankierenden Sequenzen, von denen in Patent Nr. 5,693,507 und den anderen Veröffentlichungen gezeigt wurde, dass sie eine stabile Integration fördern, sind nicht die flankierenden Sequenzen des hierin beschriebenen universellen Expressions- und Integrationsvektors, die von Pflanzenspezies zu Pflanzenspezies hoch konserviert sind, was bei den flankierenden Sequenzen des obigen Patents und der anderen Veröffentlichungen nicht der Fall ist.
Identifizierung von intergenen Spacersequenzen. Die Erfindung stellt Verfahren bereit, um geeignete nicht transkribierte intergene Spacersequenzen in Pflanzen zu identifizieren, die geeignet sind, um die universellen Vektoren zu konstruieren. Das Verfahren umfasst das Isolieren von genomischer DNA aus Plastiden, Durchführen von Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten Sonde eines bekannten Spacers, Bestimmen und Isolieren von Plastidsequenzen, welche das gewünschte Ausmaß an Homologie mit der Sonde aufweisen. Als eine Veranschaulichung werden Southern blot-Analysen unter Verwendung der Tabak-Spacerregion als Sonde ausgeführt, um zu bestimmen, ob ein Plastidgenom mit unbekannter Struktur und Sequenz die Spacerregion aufweist. Genomische DNA aus Plastiden wird isoliert und entsprechend der üblichen Vorgehensweise durch ein passendes Restriktionsenzym gespalten. Eine Hybridisierung mit der Spacersonde wird sowohl unter stringenten (z.B. 50% Formamid bei 68 °C, Waschen in 0,1 × SSC bei 68 °C) als auch unter nicht stringenten Bedingungen (z.B. 6 × SSC bei 68 °C, Waschen in 2 × SSC bei 50 °C) (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) durchgeführt, um Plastidsequenzen zu bestimmen, die ungefähr 90 bis 100% Homologie bzw. 60 bis 100% Homologie zu dem Tabakspacer aufweisen. Die identifizierten Plastidsequenzen werden anschließend isoliert.
Wenn die Anforderungen der homologen Rekombination toleranter sind, so kann ein geringerer Grad an Hybridisierung zu der Sonde wie beispielsweise 60% ausreichend sein.
Somit ist eine beliebige bekannte oder unbekannte Spacerregion mit ausreichender Homologie zur Rekombination für die Konstruktion des UV geeignet. Ebenso kann die bekannte Sequenz einer beliebigen intergenen hoch konservierten Spacersequenz verwendet werden, um Plastidsequenzen zu identifizieren und zu isolieren, welche homolog zu einer bekannten Spacersequenz sind.
Alternativ kann das BLAST-Programm, wie hierin beschrieben, verwendet werden, um hoch konservierte Regionen in Plastidgenomen, deren Sequenzen bekannt sind, zu identifizieren.
Pflanzen, welche transformiert werden können. Pflanzen, die durch den universellen Vektor der Erfindung transformiert werden können, schließen beliebige niedere Pflanzen wie beispielsweise Cyanobakterien, beliebige höhere Pflanzen wie beispielsweise monokotyledone und dikotyledone Pflanzenspezies ein. Die Pflanzen, welche transformiert werden sollen, können Nachtschattengewächse oder Pflanzen, die unter der Erde wachsen, sein. Eine nicht begrenzende Liste von Beispielen höherer Pflanzen, die mit dem universellen Vektor transformiert werden können, schließt Getreide wie beispielsweise Gerste, Mais, Hafer, Reis und Weizen, Melonen wie beispielsweise Gurke, Zuckermelone und Wassermelone; Hülsenfrüchte wie beispielsweise Bohnen, Augenbohnen, Erbse, Erdnuss; Ölpflanzen wie beispielsweise Canola und Sojabohne; Nachtschattengewächse wie beispielsweise Tabak, Knollengewächse wie beispielsweise Kartoffel und Süßkartoffel und Gemüse wie beispielsweise Tomate, Pfeffer und Rettich; Obst wie beispielsweise Birne, Weintraube, Pfirsich, Pflaume, Banane, Apfel und Erdbeere; Fasergewächse beispielsweise den Genus Gossypium wie Baumwolle, Flachs und Hanf; und andere Pflanzen wie beispielsweise Runkelrübe, Baumwolle, Kaffee, Rettich, kommerzielle Blühpflanzen wie beispielsweise Nelke und Rosen; Gräser wie beispielsweise Zuckerrohr oder Rasen; immergrüne Bäume wie beispielsweise Tanne, Fichte und Kiefer, und Laubbäume wie beispielsweise Ahorn und Eiche ein. Von größtem Interesse sind hier die ökonomisch bedeutendsten Anbaupflanzen wie Mais, Reis, Sojabohne, Weizen und Baumwolle. Keine dieser Pflanzen außer Tabak ist nach Kenntnis der Erfinder jemals zuvor über das Chloroplastgenom stabil transformiert worden, und keine, einschließlich Tabak, ist durch einen universellen Vektor wie hierin beschrieben stabil transformiert worden. Eine Pflanze, aus der die DNA-Sequenz häufig erhalten wird ist Tabak, da dies die am sorgfältigsten charakterisierte Pflanze ist, es ist jedoch jedes beliebige andere Pflanzenchloroplastgenom geeignet.
Es wird nochmals darauf hingewiesen, dass, wie oben beschrieben, der für die stabile Transformation von Tabak verwendete Vektor nicht dazu geeignet war, das Chloroplastgenom anderer Pflanzen zu transformieren.
Verfahren für die Transformation. Die Expressionskassetten können durch jedes beliebige von zahlreichen bekannten Verfahren in eine Pflanzenzelle von Interesse transformiert werden. Diese Verfahren beinhalten beispielsweise die folgenden. Transformation durch Beschuss mit Wolframpartikeln, Polyethylenglykol-vermittelte Transformation, Verwendung eines Laserstrahls, Elektroporation, Mikroinjektion und jedes beliebige andere Verfahren, das dazu geeignet ist, DNA in einen Chloroplasten einzubringen. Siehe z.B. Sanford, 1988; Daniell, 1993; Daniell, 1997; U.S. Patent Nr. 5,693,507; Kin Ying et al., 1996. Die Verwendung dieser Techniken erlaubt die Anwendung der hierin beschriebenen Erfindung auf eine breite Vielfalt von sowohl monokotyledonen als auch dicotyledonen Pflanzen.
Expression nicht pflanzlicher Moleküle aus transformierten Pflanzen
Die verbesserte Verwendbarkeit des universellen Expressions-Integrationsvektors der Erfindung wird durch die Fähigkeit des Vektors, transformierte Pflanzen zu erzeugen, um nicht pflanzliche und wertvolle Moleküle zu exprimieren, klar gezeigt.
Biologisch abbaubare Polymere auf Proteinbasis. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der universelle Vektor verwendet worden, um Tabak mit einem synthetischen Gen zu transformieren, welches Polymere auf Proteinbasis (PBPs) exprimiert. Solche Polymere und die Gene, welche diese exprimieren, sind in der Literatur bekannt. (Daniell et al., 1997). Von besonderem Interesse sind Polymere auf Proteinbasis (PBP), welche wiederholte Pentamersequenzen aufweisen, wie beispielsweise GVGVP (Yeh et al., 1987). Diese PBP-Polymere zeigen nützliche Inversphasen-Übergangstemperatur-Eigenschaften. Das Protein wird unlöslich, wenn die Temperatur über den Übergangszustand hinaus erhöht wird. PBPs bieten einen breiten Bereich von Materialien, die denen von Polymeren auf Erdölbasis wie beispielsweise Hydrogelen, Elastomeren und Plastik ähneln. Sie zeigen auch eine bemerkenswerte Biokompatibilität, wodurch eine ganze Bandbreite medizinischer Anwendungen einschließlich der Vorbeugung von postchirurgischen Adhäsionen, Geweberekonstruktion und programmierte Arzneistoffzufuhr ermöglicht wird (Urry et al., 1993). Auf nicht medizinischer Seite beinhalten potenzielle Anwendungen die Verwendung in Transducern, molekularen Maschinen, Superabsorbentien und biologisch abbaubaren Kunststoffen (Daniell et al., 1997). Solche Polymere beinhalten das Polymer (Val¹-Pro²-Gly³-Val⁴-Gly⁵)_n (VPGVP)_n, wobei "n" im Bereich von 1 bis Werten von Hunderten wie beispielsweise 250 liegen kann oder deren Analoga. Wichtige kommerzielle Möglichkeiten und verwandte Aspekte werden von Daniell, 1995 diskutiert. Nützliche biologisch abbaubare Kunststoffe sind aus PBPs hergestellt. Die Gene, welche diese PBPs exprimieren, sind auch in der Erfindung nützlich, da sie als Träger verwendet werden können, d.h. das Gen eines Moleküls von Interesse kann mit dem PBP-Gen der Chloroplastintegration und -expression verbunden werden.
In einer vorhergehenden Untersuchung wurde das synthetische Polymer-Gen, welches für (GVGVP)₁₂₁ codiert, in E. coli in einem solchen Ausmaß überexprimiert, dass Polymereinschlusskörper nahezu 80-90% des Zellvolumens einnahmen (Guda et al., 1995; Daniell et al., 1997). Dasselbe Gen wurde auch in dem Kernabschnitt kultivierter Tabakzellen exprimiert (Zhang et al., 1995) und in Blättern von transgenen Tabakpflanzen (Zhang et al., 1996).
In einem Modellsystem wurde die intergene Region der trnI- und der trnA-Gene in der 16S-23S-rRNA-Spacerregion des Tabakgenoms (1) verwendet, um einen universellen Vektor für die Integration des selektierbarer Marker-Gens aadA-Gen und des synthetischen Polymergens (EG121) zu konstruieren. Der Vektor wurde in die umgekehrte Repeatregion des Chloroplastgenoms eingefügt. Transformierte Tabakpflanzen exprimierten große Mengen des Polymerproteins. Chloroplastgenome anderer Pflanzenspezies sind ebenfalls unter Verwendung des universellen Vektors mit dem synthetischen Gen transformierbar, um das Polymer auf Proteinbasis zu exprimieren.
Produktion hochwertiger Moleküle. Die Studien mit dem Biopolymer haben gezeigt, dass ein nicht pflanzliches Produkt durch ein synthetisches Gen exprimiert werden kann, wodurch es ermöglicht wird, mittels der Vektoren der Erfindung mit einer großen Vielfalt von codierenden DNA-Sequenzen biologisch wertvolle Moleküle aus transformierten Pflanzen zu exprimieren. Die codierende DNA-Sequenz ist in einem universellen Vektor oder, falls gewünscht, in einer Expressionskassette wie oben beschrieben enthalten.
Es ist bekannt, dass transgene Pflanzen wertvolle biologisch aktive Moleküle durch Transformation des Kerns, aber nicht durch Chloroplast-Transformation produzieren. Siehe die folgenden Literaturreferenzen.
Daniell, 1995; Miele, 1997; Lyons, 1996; Daniell und Guda, 1997; Arntzen, 1997.
Expression von biologisch aktiven Molekülen. Pflanzen, die erfindungsgemäß mit dem universellen Vektor oder mit der Expressionskassette transformiert sind, können hergestellt werden, um wertvolle biologisch aktive Moleküle in Teilen der Pflanzen, welche Chloroplasten enthalten, zu exprimieren. Die Pflanzen werden anschließend durch bekannte Vorgehensweisen geerntet. Die transformierten Pflanzen, welche diese Produkte enthalten, können somit oral verabreicht werden. Arntzen, 1997. Die Herstellung von pharmazeutischen Mitteln durch transgene Pflanzen ist für viele pharmazeutische Anwendungen einschließlich Vakzine, Immunomodulatoren, Wachstumsfaktoren, Hormone, Blutproteine, Inhibitoren und Enzymen mit Peptiden (Proteinen) durchgeführt worden. Typische biologische Stoffe, die aus transgenen Pflanzen gewonnen wurden, von denen berichtet wurde, beinhalten Vakzine gegen vitale Erkrankungen, virale Peptidepitope wie beispielsweise menschlicher Immunschwäche-Virus, nicht virale Peptidepitope, bakterielle antigene Proteine, bioaktive Peptide, rekombinante Toxine, Plantibodies (rekombinante Antikörper), Serumproteine und sekundäre Pflanzenmetaboliten. Alle diese Produkte können erfindungsgemäß in Chloroplasten von transgenen Pflanzen exprimiert werden.
Typische pharmazeutische Peptide oder Proteine, die in transgenen Pflanzen hergestellt werden, beinhalten Hepatitis B-Oberflächenantigen, Norwalkvirus-Capsidprotein, Maul- und Klauenseuche-Virus, humanes Rhinovirus 14, humanes Immunschwäche-Virus, S. mutans-Oberflächenprotein, E. coli-Enterotoxin, B-Untereinheit, Malaria-Circumsporozoit-Epitope, Maus-ZP3- Protein-Epitope (Vakzin); katalytischer Maus-Antikörper 6D4, Maus-MAB-Guy's 13, MAB B1-8, Anti-Phytochrom-Fv-Protein, Anti-Substanz P (Antikörper); humanes Serumalbumin (HSA), humanes Protein C (Serumprotein); α-Trichosanthin, Ricin (Cytotoxin); humaner epidermaler Wachstumsfaktor (Wachstumsfaktor); leu-Enkephalin (Neuropeptid) und humane Säure-β-glucosidase (hGC) (Enzym). Viele dieser Moleküle sind in Tabak, Kartoffel-Knollen etc. exprimiert worden.
Von besonderem Interesse ist erfindungsgemäß die Herstellung von Insulin und humanem Serumalbumin (HSA) mit dem universellen Integrations- und Expressionvektor oder mit einem Expressionsvektor. Das HSA ist bereits in transgenen (Kern) Kartoffel- und Tabakpflanzen hergestellt worden. Sijmons et al., 1990. Die zuvor erwähnten Produkte können erfindungsgemäß durch Chloroplast-Transformation hergestellt werden.
Insulin. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um Insulin als ein Polymerfusionsprotein in einer transformierten Pflanze zu exprimieren. Die Pflanze kann mit einer Expressionskassette oder mit dem universellen Integrations- und Expressionsvektor transformiert werden, welcher ein synthetisches Biopolymergen wie beispielsweise (GVGVP)₄₀ umfasst. Eine geeignete Pflanze ist Tabak, aufgrund der einfachen genetischen Technik und dem Erfordernis, alternative Verwendungen dieser umstrittenen Nutzpflanze zu finden.
Für eine Expression in Bakterien umfasst das Verfahren die Konstruktion eines Vektors für die Expression in E. coli als Polymer (GVGVP)₄₀-Genfusion mit einem Proinsulin-Gen, Exprimieren der Polymer-Insulin-Fusionsproteine in E. coli (auf bekannte Weise gezüchtet), Reinigen des rekombinanten Proteins unter Ausnützung der Übergangstemperatur-Eigenschaften des Polymers auf Proteinbasis und Abspalten des Insulins von dem Polymer unter Verwendung bekannter Verfahren.
Für die Pflanzentransformation wird eine Expressionskassette oder der universelle Integrations- und Expressionsvektor, der die Polymergenfusion mit dem Pro-Insulin-Gen umfasst, in eine Zielpflanze wie beispielsweise Tabak eingebracht. Das Polymer-Insulin-Fusionsprotein wird von der Pflanze exprimiert, das Polymer-Fusionsprotein wird aus dem Chloroplasten und den Cytosol-Kompartementen der Pflanzenzellen extrahiert, das Insulin wird mit Dithiothreitol (DTT) oder anderen bekannten Verfahren von dem Polymerprotein abgespalten und das Insulin wird gesammelt. Alternativ kann das Insulin-Polymer-Fusionsprodukt in einer essbaren Nutzpflanze oder essbaren Teilen der Nutzpflanze exprimiert werden.
Die Technik der Fusion einer DNA-Sequenz, die für ein Molekül mit biologischer Wirksamkeit codiert, an ein synthetisches Gen, welches ein Polymer auf Proteinbasis exprimiert, für die Expression in einem geeigneten bakteriellen Wirt oder Hefewirt oder einer transformierten Pflanze ist ein viel versprechendes Verfahren mit breiter Anwendbarkeit.
Rekombinantes humanes Serumalbumin in Pflanzen. In Kern-transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen ist rekombinantes humanes Serumalbumin (rHSA), welches von dem authentischen humanen Protein nicht unterscheidbar ist, hergestellt worden (Sijmons et al., 1990). Dies zeigte die Expression eines wertvollen Proteins in transgenen Pflanzen, aber auch, dass es möglich ist, durch Fusion von HSA an eine Pflanzen pro-Sequenz eine korrekte Verarbeitung zu erreichen, die zur Abspaltung und Sekretion des korrekten Proteins führte. Das Chloroplastgenom einer ausgewählten Pflanze wie beispielsweise Tabak kann leicht mit einem universellen Vektor wie hierin beschrieben transformiert werden und dazu gebracht werden, HSA zu exprimieren.
Allgemeine Anwendbarkeit. Wie hierin beschrieben, erlaubt der universelle Vektor erfindungsgemäß die Transformation von Pflanzen, die Pflanze dazu zu bringen, ein biologisches Molekül, welches der Pflanze einen gewünschten Phänotyp verleihen kann, zu exprimieren und/oder ein gewünschtes Produkt herzustellen, welches biologische Wirksamkeit aufweisen kann, aber nicht muss (oder einen Vorläufer eines Endprodukts). Die codierende Nukleotidsequenz kann synthetisch oder natürlich sein. Das hergestellte Molekül kann für die Pflanzen fremd sein, in der Pflanze nicht funktional oder funktional sein. Der universelle Vektor besitzt ein breites Anwendungsspektrum im Bereich der Pflanzentransformation.
Es ist beabsichtigt, dass ein beliebiges biologisch aktives Molekül (Vorläufer oder Derivat davon) durch eine transgene Pflanze hergestellt werden kann, die mit dem erfindungsgemäßen universellen Vektor transformiert ist, wobei für einen bestimmten Fall geeignete Anpassungen erforderlich sein können.
Herbizidtoleranz von Chloroplast-transformierten Pflanzen
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung des universellen Vektors, um Pflanzen Herbizidresistenz oder -toleranz zu verleihen. Der Fortschritt der Gentransfertechnologie hat das Einbringen von Herbizidresistenzgenen in Pflanzen möglich gemacht, wodurch das Herbizid selektiv für eine bestimmte Nutzpflanze gemacht wird.
Modifikationen des Zielenzyms. Der erste Schritt in Richtung dieses Ansatzes ist die Identifizierung und notwendige Modifizierung des Zielenzyms (Gens) des Herbizids, um Toleranz zu verleihen, was ziemlich ausgiebig durchgeführt worden ist. Sulfometuronmethyl ist ein Sulfonylharnstoff-Herbizid, welches das Wachstum von Bakterien, Hefe und höheren Pflanzen blockiert, indem das erste Enzyms des verzweigtkettigen Aminosäurewegs, Acetolactatsynthase (ALS), gehemmt wird. Mutantgene für ALS, die Resistenz gegenüber Sulfometuronmethyl verleihen, wurden aus E. coli und Hefe isoliert. Yadav et al. (1986). Herbizidresistenz in Tabak und verschiedenen anderen Nutzpflanzen ist durch Gentechnik des ALS-Gens erreicht worden. Gabard et al. (1989); Miki, et al. (1990). Noch ein weiterer Ansatz, um Herbizidresistenz in Pflanzen zu erzeugen, ist die Expression des Enzyms Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) gewesen, welches das Herbizid Phosphinothricin unschädlich macht. DeBlock et al. (1987).
Glyphosat. Glyphosat ist ein wirkungsvolles Breitbandherbizid, welches hochwirksam gegen einjährige und mehrjährige Gräser und breitblättrige Unkräuter ist. Glyphosat ist für die Umwelt unschädlich, da es im Boden leicht abgebaut wird, minimale Beweglichkeit im Boden aufweist und gegenüber nicht pflanzlichen Lebensformen eine sehr geringe Toxizität aufweist. Die Wirkung von Glyphosat beruht auf der Bindung und Hemmung des Enzyms 5-Enol-pyruvyl-shikimat-3-phosphat (EPSP)-synthase. EPSP-Synthase (EPSPS) katalysiert die Bildung von EPSP, welches in dem aromatische Aminosäure-Biosyntheseweg wichtig ist, aus Shikimat-3-phosphat und anorganischem Phosphat. Die Ungiftigkeit von Glyphosat gegenüber Tieren beruht auf der Tatsache, dass diese Reaktion nur in Pflanzen und Mikroorganismen auftritt. Leider besitzt Glyphosat keine Selektivität zwischen Unkräutern und erwünschten Pflanzen wie beispielsweise Nutzpflanzen und Zierpflanzen, da die Reaktion zur Bildung von EPSP in allen Pflanzen auftritt.
Es sind zwei Ansätze verwendet worden, um es zu erreichen, eine glyphosatresistente Pflanze durch Gentechnik zu entwickeln. Ein Ansatz beruht auf der Überproduktion von Wildtyp-EPSP-Synthase, so dass nach vollständiger Hemmung der EPSP-Synthase durch Glyphosat die restliche EPSP-Synthase Glyphosat-Toleranz verleiht. Der zweite Ansatz beruht auf der Expression eines Mutantgens (aroA), welches glyphosatresistente EPSP-Synthase codiert.
In allen zuvor erwähnten Beispielen sind ohne Ausnahme herbizidresistente Gene in das Kerngenom eingebracht worden.
Der Bedarf an einer Chloroplast-Transformation. Es besteht ein großer Bedarf, eine herbizidresistente Pflanze zu entwickeln, insbesondere eine Pflanze, die gegenüber den am häufigsten verwendeten Herbiziden resistent ist, in der das Protein, welches Herbizidresistenz vermittelt, in dem Chloroplasten produziert wird und bei der das Gen, welches Herbizidresistenz verleiht, nicht durch Pollen in die Umgebung entweichen kann.
Der universelle Vektor der Erfindung antwortet auf diesen Bedarf, indem eine beliebige Zielpflanze transformiert wird, um Toleranz gegenüber einem beliebigen ausgewählten Herbizid wie beispielsweise Glyphosat zu verleihen. Wichtige kommerzielle Nutzpflanzen wie Weizen, Reis, Mais, Sojabohne können durch den universellen Vektor gegenüber einem ausgewählten Herbizid resistent gemacht werden.
Die Erfindung stellt eine transgene herbizidresistente Pflanze bereit, in welcher ein fremdes Transgen, das Resistenz gegenüber einem oder mehreren Herbiziden verleiht, durch den universellen Vektor in das Chloroplastgenom integriert wird. Die transgene Pflanze kann eine mature Pflanze, eine nicht mature Pflanze wie beispielsweise ein Sämling, ein Embryo, ein Callus, ein kultiviertes Gewebe oder eine Zellsuspension oder ein Teil einer Pflanze wie beispielsweise ein Steckling oder Callus sein. Herbizide, die für die Erfindung geeignet sind und für die erfindungsgemäß Resistenz-vermittelnde Gene stabil in das Chloroplastgenom integriert werden können, beinhalten alle bekannten Herbizide (und auch zu entwickelnde Herbizide).
Herbizidklassen. Herbizide, die durch die Erfindung kontrolliert werden können, sind üblicherweise in verschiedene chemische Klassen eingeteilt worden.
Eine erste Klasse beinhaltet die PSII (Photosystem II)-Herbizide, die die Reduktion von Plastochinon an der Akzeptorstelle von PSII stören, welche solche Chemikalien wie beispielsweise Triazine, Triazinone, Harnstoffderivate, Biscarbamate, Nitrile, Nitrophenole, substituierte Pyridazinone, Phenylcarbamate, Anilide, Cyanoacrylat, DCMU, Carboanilide, Uracile, insbesondere z.B. Dichlorphenyldimethylharnstoff, Atrazin, Metribuzin, Lenacil, Phenmidipham, Ioxynil und Dinoseb einschließen. Diese Chemikalien binden an ein 32 kDa-Bindungsprotein (Q₃-Protein, D1, Herbizid-Bindungsprotein) in der Thylakoid-Membran von Chloroplasten, wodurch der photosynthetische Elektronentransport blockiert wird. Das Plastidgen, welches für einen Vorläufer des Q₃-Proteins codiert, wird psbA genannt, wobei dessen Sequenzen ein sehr hohes Ausmaß an Homologie in verschiedenen Pflanzen zeigen. Das wichtigste PSII-Herbizid ist Atrazin, entwickelt von Ciba-Geigy.
Eine weitere Klasse sind die PSI (Photosystem I)-Herbizide, ein membrangebundener Proteinkomplex, der die durch Licht erzeugte Oxidation von Plastocyanin (PC) und die Reduktion von Ferredoxin (Fd) katalysiert. Typisch für diese Chemikalien sind die Bipyridyl-Herbizide Paraquat und Diquat.
Eine weitere Klasse von Herbiziden sind die Aryloxyphenoxypropanoate (APP) oder Herbizide vom Typ Acetylcoenzym A-carboxylase, welche die Acetyl-CoA-carboxylase und die anschließende Fettsäurebiosynthese in Plastiden hemmen. Typisch für diese APPs sind Cyclohexandion (CND), Sethoxydin, Haloxyfop, Quizalofop, Phenoxaprop (und deren Niederalkyl-substituierte Moleküle), Dicolofop, Sethoxydin, Clethodin und Tralkoxydim.
Noch eine weitere Klasse von Herbiziden beinhaltet die Auxin-Analoga wie beispielsweise Macropop, Chloramben, Dicamba, Benazolin, 1-Naphthylessigsäure; 3,6-Dichlorpicolinsäure, Picloram, Fluoroxypyr, Quinchlorac, MCPA und 2,4-D.
Eine weitere Klasse sind die mitotischen Herbizide, genannt Dinitroanilin-Herbizide, wie beispielsweise Trifluoranilin, Oryzalin und Pendimethalin.
Eine weitere chemische Klasse von Herbiziden, auf welche sich die Erfindung richtet, sind solche, die in der Biosynthese von Aminosäuren wirken, wie die tertiären Aminomethylphosphonsäuren Chlorsulfuron, Glufosin und Glyphosat.
Eine weitere Klasse von Herbiziden sind die Acetolactatsynthase hemmenden Herbizide (ALS), wie die Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone, Triazolpyrimidine und Pyrimidinylthiobenzoate wie beispielsweise Chlorsulfuron, Imazaphyr, Flumetsulam (und andere Herbizide, die in Kapitel 4, Tabelle I des nachfolgend zitierten Herbizide Resistance in Plants, 1994, aufgelistet sind).
Beispiele für Sulfonylharnstoff-Herbizide sind Sulfometuronmethyl (der aktive Bestandteil von Oust^TM) und Chlorsulfuron (der aktive Bestandteil von Glean^TM). Imazaphyr, eines der Imidazolinone, ist der aktive Bestandteil des Herbizids Arsenal^TM von American Cyanamid und Imazamethabenz ist ein Gemisch aus zwei Imidazolinonen (Merk Index, 11. Ed. 4825). Mutierte Formen von ALS, die sich in den strukturellen Genen von ALS, ilvG und ILV2 befinden, können verwendet werden, um unter Verwendung des universellen Vektors Herbizidresistenz zu verleihen.
Trotz der chemischen Unterschiede zwischen den Imidazolinonen und Sulfonylharnstoffen hemmen diese Substanzen dasselbe Enzym ALS. Anscheinend wetteifern Chinone und ein Imidazolinon-Herbizid mit einem Sulfonylharnstoff-Herbizid um eine gemeinsame Stelle an ALS. Dementsprechend können erfindungsgemäß Pflanzen transformiert werden, welche eine Resistenz gegenüber beiden Gruppen dieser und anderer Herbizide zeigen.
Typisch für eine weitere Gruppe von Chemikalien mit herbizider Wirkung, die durch die Erfindung unter Verwendung des universellen Vektors kontrolliert werden kann, ist L-Phosphinothricin, bei dem es sich um eine Komponente des Tripeptids "Bialaphos" handelt. Dieses Tripeptid wird unter dem Handelsnamen "Herbiace^TM" von Meiji Seika, Japan und als "Basta^TM" von Hoechst AG, Deutschland vermarktet. L-Phosphinothricin ist ein wirksamer Inhibitor der Glutaminsynthetase, die einen schnellen Anstieg der Ammoniakkonzentration in Pflanzen hervorruft und zum Absterben der Pflanzenzelle führt.
Trotz der ausgiebigen Studien ist kein zufrieden stellendes Produkt entwickelt worden, um Pflanzen durch Chloroplast-Transformation Herbizidtoleranz zu verleihen. Bei dem Herbizid vom Typ Glyphosat ist berichtet worden, dass regenerierte Kern-transformierte transgene Pflanzen Toleranz gegenüber Glyphosat zeigten, jedoch auch ein beeinträchtigtes Wachstum zeigten und nicht zu transgenen Pflanzen mit hoher Toleranz gegenüber Glyphosat führten, Schultz et al., 1990.
Chloroplast-Transformanten. Der Chloroplast von Zielpflanzen, die empfindlich gegenüber Herbiziden sind, wird erfindungsgemäß mit einem Vektor der Erfindung transformiert, der die erforderliche codierende Sequenz trägt, wodurch Herbizidresistenz verliehen wird. Der transformierte Chloroplast umfasst ein Genom, welches ein fremdes Transgen trägt, das die Herbizidtoleranz verleiht. Der Chloroplast kann ein maturer Chloroplast oder ein nicht maturer Chloroplast sein wie beispielsweise ein Etioplast. Bevorzugt codiert das Gen, welches Herbizidresistenz verleiht, für EPSP-Synthase die weniger leicht an Glyphosat bindet (verringerte Affinität aufweist) als die Wildtyp-EPSP-Synthase. Falls vorhanden, ist das zweite Transgen im Allgemeinen ein Gen, welches der Pflanze Antibiotikaresistenz verleiht. Somit kann die Herbizidresistenz über die letale Selektion als ein Marker für die Chloroplast-Transformation verwendet werden, durch Selektion der Transformanten, indem eine Aussetzung gegenüber einem Medium mit letaler Konzentration des ausgewählten Herbizids erfolgt, welche die Transformanten überleben.
Der Ursprung des zweiten Gens kann prokaryotisch (z.B. bakteriell) oder eukaryotisch (z.B. pflanzlich) sein.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung einer Pflanze, die gegenüber verschiedenen Herbiziden aus derselben Klasse von Herbiziden oder aus unterschiedlichen Klassen von Herbiziden resistent ist und sie betrifft weiter die transformierte Pflanze, die gegenüber mehreren Herbiziden resistent ist.
Es sind einige Pflanzenspezies bekannt, die eine natürliche und nicht permanente Toleranz gegenüber bestimmten Arten von Herbiziden entwickelt haben. Die Lehre dieser Erfindung ist jederzeit darauf anwendbar.
Die Erfindung schließt ein Verfahren zur Herstellung einer herbizidresistenten Pflanze ein, welches das Transformieren des Chloroplasten der Pflanze umfasst, indem ein oder mehrere fremde Transgene, die für ein Protein, welches dem Genom des Chloroplasten der Pflanze Herbizidresistenz verleiht, codiert. Bevorzugt codiert das Transgen für eine mutierte Form des Enzyms, die eine gegenüber dem natürlich auftretenden Enzym verringerte Affinität für ein bestimmtes Herbizid aufweist.

In der folgenden Tabelle ist eine Vielfalt von Typen von Resistenz bestimmenden Substanzen (Chemikalien oder "Moleküle") aufgelistet, welche hemmen oder Resistenz verleihen und typische damit verwandte Herbizide. Tabelle I

RESISTENZ BESTIMMENDE SUBSTANZ	HERBIZIDE
Gluthation-S-transferase	S-Triazin Simazin Chloracetamid Metalachlor
Auxin-Analoga	2, 4-D MCPA Mecopop Chloramben
EPSP-Synthase	Glyphosat
Q_b(psbA)-PSII-Typ	Atrazin Terbutine Dichlorphenydimethylharnstoff Metribuzin Lenacil Phenmedipham Loxynil Dinoseb
Acetohydroxysäuresynthase (ALS)	Sulfonylharnstoffe Chlorsulfuron Imazapyr Sulfometuronmethyl Imidazolinone
Glutaminsynthase	Phosphinothricin
PS I-Typ	Paraquat Diquat
Acetylcoenzym-A-carboxylase hemmende Enzyme (APP-Typ)	Aryloxyphenoxypropanoat (APR), Cyclohexandion
Mitoseunterbrecher	Trifluoralin, Oryzalin, Pendimethalin, Dinitroanilin

Für einen zusammenfassenden Überblick über das Thema Herbizidresistenz in Pflanzen siehe Herbicide Resistance Crops, Agricultural, Environmental, Economic, Regulatory and Technical Aspects, 1996, CRC Press, Inc., Herausgeber, Stephen O. Duke und Herbicide Resistance in Plants, Biology and Biochemistry, 1994, CRC, Press, herausgegeben von Stephen B. Powles und Joseph A. M. Holtum. In dem ersten dieser Referenzbücher ist Kapitel 3 über Techniques for Producing Resistant Crops (und die zahlreichen darin zitierten Referenzen) von besonderem Interesse als Hintergrund der Erfindung.
Es ist erfindungsgemäß auch entdeckt worden, dass in dem Verfahren zur Expression eines Zielmerkmals durch die transformierte Pflanze ein weiteres Merkmal exprimiert werden kann, welches sehr wünschenswert sein kann und welches tatsächlich wünschenswerter als das ursprüngliche Zielmerkmal sein kann. In solchen Situationen lässt man die Pflanzen exprimieren und sie werden auf Grundlage dieses anderen Merkmals selektiert.
Die Erfindung wird in den folgenden, nicht begrenzenden Beispielen beispielhaft dargestellt.
Beispiel 1
Universelle Chloroplastintegrations- und -expressionsvektoren
Tabak. Beispielhafte universelle Chloroplastvektoren wurden erzeugt, indem zunächst das Tabak-Chloroplast-DNA-BamHl-Fragment (130656-140992), welches die 16S- und 23S-rRNA-Gene enthält, ausgeschnitten wurde und es in ein allgemein erhältliches bakterielles Plasmid pUC19 subkloniert wurde. Eine Karte des Tabak-Chloroplastgenoms ist in 1 gezeigt. Ein 2.1 kbp-Hindlll-EcoRl-Fragment, welches innerhalb dieses Fragments vorliegt, welches eine universelle Randsequenz enthält, die die trnI- und trnA-Gene umfasst (5A) einschließlich der Spacerregion zwischen den Genen, wurde in das pUC19- Plasmid an der Pvull-Stelle subkloniert (5B). Das resultierende Plasmid wurde als pSBL-Ct-Bor bezeichnet (5C).
Der Vektor pSBL-RD-EPSPS (2B) enthält ein mutiertes EPSP-Synthasegen, welches für das Enzym EPSP-Synthase codiert. Glyphosat, der aktive Bestandteil in ROUND UPTM von Monsanto bindet an die Protein-EPSP-Synthase und blockiert die Synthese essenzieller Aminosäuren, was zum Absterben einer Pflanze führt. Die von dem mutierten Gen codierte EPSP-Synthase bindet Glyphosat nicht und verleiht Nutzpflanzen daher Herbizidresistenz.
Andere Gene wie beispielsweise solche, die Resistenz gegenüber schädigenden Umweltfaktoren verleihen, wie Salz-/Trockenheitstoleranz (Osmotoleranzgene wie beispielsweise Betainaldehyddehydrogenase (BADH) für die Überproduktion von Glycinbetain) oder Wärmetoleranz (Gene, welche für Hitzeschockproteine codieren) oder Kälteschocktoleranz-Proteine oder Pathogenresistenz wie beispielsweise antimikrobielle Wirkung (lytische Peptide, Chitinase) oder antivirale Wirkung (Mantelproteine), können einzeln oder in einander nicht beeinträchtigenden Kombinationen in den universellen Chloroplastvektor oder in verschiedene Kassetten des selben universellen Chloroplastvektors insertiert werden, um die Zielpflanze in eine mit dem gewünschten Merkmal zu transformieren.
Erzeugung eines universellen Chloroglastintegrationsvektors, der eine synthetische Spacer 2-Region enthält.
Ein universeller Chloroplastvektor, der nur die Spacer 2-Region des Tabak-Chloroplastgenoms enthält, wurde erzeugt, indem zunächst ein synthetisches Oligonukleotid, welches die Spacer 2-Region umfasst, in das bakterielle Plasmid pUC19 subkloniert wurde. Die positiven und negativen Stränge der 64 Basenpaar-Spacersequenz wurden synthetisiert, die Sequenz des positiven Strangs war wie folgt:
5' – GCTGCGCCAGGGAAAAGAATAGAAGAAGCATCTGACTACTTCATGCA TGCTCCACTTGGCTCGG – 3'
Die synthetischen Fragmente wurden gemischt und ihre Annelierung wurde ermöglicht, anschließend wurden sie in pUC19 an der Pvull-Stelle ligiert ( 5B) Die Insertion eines geeigneten selektierbaren Markergens und eines heterologen Gens wurden wie oben für pSBL-CtBor beschrieben durchgeführt (5C).
Um eine längere Sequenz herzustellen, welche die tRNA^Ile- und die tRNA^Ala-Gene einschließt, folgt man derselben Vorgehensweise.
TRANSFORMATION VERSCHIEDENER PFLANZEN
Beispiel 2
Chloroplast-Transformation von Tabak. Das folgende Beispiel beschreibt ein klassisches Protokoll für die Transformation des Tabak-Chloroplasten, wobei ein beliebiger Vektor verwendet werden kann. Zwei solche Vektoren sind im Folgenden genannt. Alle neuen Chloroplastvektoren wurden zunächst wie von Daniell (1997) beschrieben in Tabak getestet. Tabak (Nicotiana tabacum var. Petit Havana)-Pflanzen wurden aseptisch aufgezogen durch Keimung von Samen auf MSO-Medium, welches MS-Salze (4,3 g/l), B5-Vitaminmischung (Myo-Inositol, 100 mg/l; Thiamin-HCl 10 mg/l; Nikotinsäure, 1 mg/l; Pyridoxin-HCl, 1 mg/l), Saccharose (30 g/l) und Phytagar (6 g/l enthielt, bei pH 5.8. Vollständig entfaltete grüne Blätter von etwa 2 Monate alten Pflanzen wurden für den Beschuss ausgewählt.
Die Blätter wurden für den Beschuss mit der abaxialen Seite nach oben auf ein Whatman Nr. 1-Filterpapier, das auf RMOP*-Medium in Standard-Petrischalen (100 × 15 mm) lag, platziert. Wolfram- (1 μm) oder Gold (0,6 μm)-Mikroprojektile wurden mit Plasmid-DNA von Interesse (z.B. pSBL-RD-EPSPS oder pZS-RD-EPSPS) beschichtet und der Beschuss wurde jeweils mit der biolistischen Vorrichtung PDS1000/He (Bio-Rad) durchgeführt, wie von Daniell, 1997 beschrieben. Nach dem Beschuss wurden die Petrischalen mit Parafilm verschlossen und bei 24 °C bei einer 12-stündigen Lichtperiode inkubiert. Zwei Tage nach dem Beschuss wurden die Blätter in kleine Stücke von etwa 5 mm² Größe zerteilt und auf das letale Selektionsmedium (RMOP, welches einen selektierbaren Marker wie beispielsweise etwa 500 μg/ml Spectinomycindihydrochlorid enthielt) in tiefen (100 × 25 mm) Petrischalen (etwa 10 Stücke pro Schale) platziert, wobei die abaxiale Seite das Medium berührte. Die regenerierten Spectinomycin-resistenten Proben wurden von abgestorbenen Proben selektiert und in kleine Stücke zerteilt (etwa 2 mm²) und in frische tiefe Petrischalen (etwa 5 Stücke pro Schale), welche dasselbe letale Selektionsmedium enthielten, subkultiviert. Resistente Proben des zweiten Kulturzyklus wurden in Wurzelmedium (MSO-Medium, welches mit IBA, 1 μg/l und einem geeigneten Antibiotikum wie 500 μg/ml an Spectinomycindihydrochlorid ergänzt war) transferiert. Pflanzen, die Wurzeln ausbildeten, wurden für weitere Untersuchungen auf Erdboden übertragen und bei 26 °C unter Dauerlichtbedingungen gezüchtet.
Nach der Übertragung auf das letale Selektionsmedium verblassten die Explantate allmählich und in etwa 3-8 Wochen entwickelten sich von der beschossenen Stelle des Ausgangsblattes (0) Calli und Triebe. Resistente Triebe von jedem Callus wurden als ein Klon angesehen.
Ein PCR-Screening auf Chloroplasttransformanten nach dem ersten Kulturzyklus zeigte, dass 12 von 20 resistenten Klonen die fremden Gene wie beispielsweise das an das EG121 gebundene aadA-Gen in das Chloroplastgenom integrieren. Diese 12 Klone wurden für weitere Regenerierungsschritte verwendet. Der gesamte Vorgang der Regenerierung ausgehend von dem Beschuss bis zur Übertragung auf Erdboden erfordert etwa 3-5 Monate.
9 zeigt transformierte und nicht transformierte Tabakplastide, die in Anwesenheit von Spectinomycin wachsen, was eine nicht-letale Selektion auf dem Medium (500 μg/ml) zeigt.
Beispiel 3
Mais-Chloroplasttransformation. Oberflächensterilisierung und Keimung von Maissamen. Maissamen werden in einer Lösung, die 20% (v/v) kommerzielles Bleichmittel und 0,5% SDS enthält, für 15 min bei kontinuierlichem Schütteln oberflächlich sterilisiert und anschließend aufeinanderfolgend in sterilem zweifach destillierten Wasser (sddw) vier- bis fünfmal gespült. Flüssiges, Keimungsmedium auf Basis von MS (modifiziertes CSG), welches MS-Salze (4,3 g/l), Saccharose (30 g/l), DM-Vitamine (1,0 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Nikotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl und 100 mg/l Myo-Inositol) und BA (2,0 mg/l) enthielt, wird bei pH 5,8 durch Magenta^TM-Box (45 ml), welche acht Schichten Käseleinen enthält, verteilt und anschließend autoklaviert. Die Samen werden in modifiziertes CSG (25 Samen eines Genotyps pro Box) platziert und zur Keimung für 3 Tage kultiviert (16 h oder kontinuierliches Licht; 25 °C). Knoten-Sektionen werden aseptisch von 3 Tage alten Sämlingen ausgeschnitten. Die Knoten-Sektion erscheint als eine klare Abgrenzung auf den keimenden Sämlingen und stellt den siebten Knoten dar (10A). Wenn sie abgeschnitten sind, sind die Knoten-Querschnitte ungefähr 1,2 bis 1,5 mm lang (10B).
Die 10A-G zeigen ein Maisplastidtransformations- und -regenerationsschema. A) Drei Tage alter Maissämling; Pfeile und Linie zeigen den siebten Knoten für die Explantat-Exzision; B) Knoten-Querschnitte vor dem Beschuss; Pfeile zeigen die Begrenzung einer Sektion; C) GUS-positive Knoten-Sektion (Kern-Transformation); histochemische Untersuchung 3 Tage nach Beschuss durchgeführt; D) mehrfache Triebauslösung aus einer Knoten-Sektion (Kontrolle) nach 8 Wochen in Kultur; E) Kontroll-Trieb auf Elongationsmedium für 3 Wochen; F) Kontrollpflanzling mit Wurzeln; G) Selektion von Plastid-transformiertem Mais in Flüssigmedium, welches Spectinomycin und Streptomycin enthält, für 8 Wochen.
Mehrfache Triebauslösung: Knoten-Sektions-Explantate werden mit dem akropetalen Ende nach oben auf Mais-Triebinduktionsmedium platziert [CSI; MS-Salze, Saccharose und DM-Vitamine wie oben, BA (2,0 mg/l), CPA (0,25 mg/l) und Phytagar (8 g/l) bei pH 5,8], und den zuvor erwähnten Kulturbedingungen unterzogen. In allen Medien außer modifiziertem CSG und RG1 (Reis) werden PGRs und Antibiotika filtersterilisiert und nach Autoklavieren hinzugefügt. Gewebe werden alle zwei Wochen auf frischem CSI-Medium für mehrfache Triebbildung subkultiviert. (10D). Adventive Triebe werden nach 8 Wochen Kultur von den Triebklumpen abgetrennt und auf halbfestem MS-basierten Medium, welches Saccharose, DM-Vitamine, Glycin (10 mg/l) und Asparagin (150 mg/l) enthält, bei pH 5,8 für 3 Wochen gezüchtet (10E). Die Pflanzlinge bilden Wurzeln (10F) auf demselben Medium, welches IBA (0,5 mg/l) enthält. Pflanzlinge mit Wurzeln können in PGR-freiem flüssigem MS in Testgefäßen (150 × 25 mm) welche Käseleinen als Ankermaterial enthalten gezüchtet werden, um ein schnelleres Wachstum zu erreichen. Regenerierte Pflanzlinge werden in Topfmedien umgepflanzt, akklimatisiert und anschließend bis zur Reife in dem Gewächshaus aufgezogen.
11 zeigt Mais-Plastidtransformation. Transformierte Maispflanzen wachsen normal (mittlere Aufnahme), während nicht transformierte Pflanzen auf dem letalen Medium absterben, was eine letale Selektion durch das Antibiotikum Spectinomycin (1000 μg/ml) bestätigt.
Beispiel 4
Reis-Chloroplasttransformation. Oberflächensterilisierung von Reissamen und Vorkultur. Geschälte Samen eines beliebigen Genotyps (indische oder japanische Arten) werden zunächst für 10 min unter kontinuierlichem Schütteln in 70%-igem Ethanol oberflächlich sterilisiert, anschließend mit ddw etwa fünfmal gespült. Die Samen werden anschließend für 20 min in eine 0,2%-ige Benlat (w/v)-Lösung eingetaucht, fünfmal mit sddw gespült, anschließend für 20 min in 50%-igem Bleichmittel eingetaucht, wobei die sddw-Spülungen wiederholt werden. Die Samen werden in dem Medium RG1 [MS-Salze, Saccharose und DM-Vitamine wie oben, BA (2,0 mg/l) bei pH 5,8] vorkultiviert. Ebenso wie bei Mais wird flüssiges RG1 durch Magenta^TM-Boxen, welche Käseleinen enthalten, verteilt, bevor Autoklavieren erfolgt. Die Samen werden in RG1 platziert (100 Samen eines Genotyps pro Box) und über Nacht vorkultiviert (16 h oder kontinuierliches Licht; 23 °C), vor dem Beschuss am nächsten Tag.
Beschuss von Embryos auf intakten Reissamen. Vorkultivierte Samen werden mit dem Embryoende nach oben in dem mittleren 2,5 cm-Bereich einer Petrischale (25 pro Schale), welche Medium RG1.1 enthält (RG1 plus 8,0 g/l Phytagar) vertikal dicht gepackt (12A) und mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen beschossen.
DNA-Präzipitation. Die Vorgehensweise ist wie für Mais beschrieben, mit den folgenden Modifikationen. 10 μl DNA (1,0 μg/μl) und 20 μl Isopropanol (2 × Vol. an DNA), 60 μl 2,5 M CaCl₂ und 15 μl 0,1 M Spermidin werden verwendet. Jeder Beschuss liefert 2,0 μg DNA und 720 μg Wolfram.
Die 12A-F zeigen ein Reisplastid-Transformations- und Regenerationsschema. A) Reissamen, Embryoende nach oben, unmittelbar vor dem Beschuss; Pfeile zeigen auf Embryogrenzen; B) Mehrfache Triebauslösung aus einem Kontrollembryo nach 7 Wochen in Kultur; C) Selektion von Plastid-transformierten Reistrieben, die aus einem ursprünglichen Reisembryo erwachsen, in Medium, das Spectinomycin und Streptomycin enthält, nach 8 Wochen in selektivem Medium; Pfeile zeigen auf zwei putative Transformanten; D) Kontroll-Reisregeneranten; E) transgene Priscilla 2.3; F) transgene Priscilla 2.4.
Mehrfache Triebauslösung und Selektion von transplastomischen Trieben nach Beschuss. Die Reissamen werden getrennt und auf dem RG1.1-Medium ausgebreitet (wobei die Polarität beibehalten wurde) und für zwei Tage nach Beschuss in der Dunkelheit gehalten. Anschließend wird das Embryoende des Samens (Embryo plus kleine Menge an Endosperm) von dem Rest des Endosperms, der verworfen wird, abgeschnitten. Embryos werden in 50 ml flüssiges RG2-Medium (in 250 ml-Kolben) platziert für eine mehrfache Triebauslösung (12B). RG2 enthält MS-Salze, Saccharose und DM-Vitamine wie oben und BA (6,0 mg/l) bei pH 5,8. Für die Selektion verwendetes RG2 beinhaltet Spektinomyzin (1000 μg/ml) plus Streptomyzinsulfat (100 μg/ml). Die Kulturen werden in der Wachstumskammer positioniert (16 h Lichtzeitraum; 25 °C) und alle zwei Wochen in frisches Selektionsmedium subkultiviert. Grüne Triebe werden aus den Triebklumpen, die aus jedem Embryo erwachsen, ausgewählt und zurück in Selektionsmedium gegeben (12C). Wurzelbildung wird im Medium RG3 [MS-Salze, Saccharose und DM-Vitamine wie oben, IBA (0,5 mg/ml) bei pH 5,8] plus Antibiotika erzielt. (Triebe können entweder einzeln oder als mehrfacher Triebcluster Wurzeln bilden). Die Pflanzlinge werden in Topfmedium umgepflanzt, akklimatisiert und anschließend in ein Ton:Sand (1:1)- Gemisch umgetopft und bis zur Reife im Gewächshaus gezüchtet. (12D, E, F).
Entwicklung von Plastidtransformations- und Regenerationsprotokollen für Mais und Reis. Wie oben beschrieben, wurden einzigartige Mais-Kerntransformations- und -regenerationsprotokolle (10) entwickelt (Rudraswamy, 1997) und an die Plastidtransformation angepasst. (Vor dieser Arbeit sind keine Knoten-Sektions-Explantate für die Transformation oder Regeneration verwendet worden). Mehrfache Triebe wurden an Knoten-Sektionen ausgelöst, die aus drei Tage alten Sämlingen von 21 Genotypen (keine mit A188 oder B73 verwandt), unter denen Hybrid- (16 Korn, 1 süß) und Inzucht (vier) -Genotypen enthalten waren, ausgeschnitten wurden. Nach acht Wochen in Kultur wurden 16-32 Triebe (Durchschnitt 24) pro Explantat erzeugt. Die Triebe bildeten Wurzeln und die Regeneranten zeigten bei einer Gewächshausanalyse (Untersuchung auf zwei Pflanzen pro Genotyp begrenzt) keine abweichenden Phänotypen. DNA konnte auch in Explantate von Knoten-Sektionen aller Genotypen eingebracht werden (10C; transiente β-Glukuronidase-Expression). Für die Plastidtransformation wurden Explantate von Knoten-Sektionen mit pSBL-ctV2 beschossen, anschließend auf ein Mehrfach-Triebinduktionsmedium, welches Spektinomyzin und Streptomycin enthielt, gegeben. Aufkommende Triebe konnten abgeschnitten und für anschließende Selektionsrunden erneut auf Triebinduktionsmedium gegeben werden.
Wie oben beschrieben wurden einzigartige Reisziele, geschälte intakte mature Samen, Embryoende nach oben, welche in zuvor berichteten Transformationsprotokollen nicht verwendet worden waren, für mature Embryos (abgeschnitten zwei Tage nach Beschuss) mit einem Mehrfach-Triebinduktionsprotokoll (12) gekoppelt. Auf allen acht getesteten Genotypen (Litton, Priscilla – zwei neu erschiene Mississippi-Sorten plus sechs Breeding-Lines) wurden mehrfache Triebe induziert. Die beobachtete Antwort sollte in zahlreichen anderen Sorten ähnlich sein, da das anfängliche Explantat ein maturer Embryo ist. Regeneranten (nicht-transformiert) werden für die Gewinnung von F1-Samen aufbewahrt. Nach Plastid-Transformation trat in Gegenwart von Spektinomyzin/Streptomycin eine Triebvervielfältigung ein und ebenso wie bei Mais konnten die Triebe aufgrund von Triebproliferation (nicht bekannt, ob axillaren oder adventen Ursprung) ausgehend von abgeschnittenen Trieben zahlreiche Selektionsrunden durchlaufen. Auch in selektivem Medium erfolgte Wurzelbildung.
Die 13A-B zeigen eine PCR-Analyse von DNA, die aus Blättern der ersten Generation von Reistransformanten isoliert wurde. Die PCR-Analyse wurde mit DNA durchgeführt, die aus Blättern der ersten Generation isoliert wurde. Die PCR-Produkte waren nicht so reichlich wie bei transgenen Tabak-Chloroplastpflanzen beobachtet (13A, Bahn 11, 13B, Bahn 12). Dies kann auf zwei Ursachen zurückzuführen sein. Das für die Isolierung von DNA verwendete Protokoll ist nicht für grobe Reisblätter geeignet oder die für Tabak entwickelten Primer annelieren nicht ebenso gut mit Reis ct-DNA. Dennoch wurden für eine vorläufige Analyse Tabakprimer verwendet, um die Integration des aadA-Gens in das Pflanzengenom von dem universellen Vektor zu untersuchen. Das Fehlen eines Produktes würde spontane Mutanten anzeigen, die in der Lage sind, ohne das aadA-Gen auf Spektinomyzin zu wachsen ( 13A, Bahnen 7-10). Es wurde in vier Bahnen ein PCR-Produkt mit 1,57 Kb detektiert (13A, Bahnen 2-6), das mit dem universellen Vektor transformiert ist. Unter den verwendeten Selektionsbedingungen wurden aus 10 Bahnen, die mit dem universellen Vektor transformiert waren, vier Mutanten detektiert. Es wurden außerdem Primer entworfen, um spezifisch die Integration in das Plastidgenom zu identifizieren. Für den universellen Vektor gelangte der Primer auf dem nativen Chloroplastgenom in das 16srRNA-Gen außerhalb der flankierenden Sequenz des Chloroplastvektors (1,60 Kb PCR-Produkt). Die erwarteten Produkte wurden für die transgenen Linien beobachtet, die unter Verwendung des universellen Vektors erhalten wurden (13B, Bahnen 5, 6). Nicht beschossene Pflanzen (Kontrollen) ergaben wie erwartet keinerlei PCR-Produkte (13B, Bahn 2; 13A, Bahn 1). Die PCR-Ergebnisse identifizierten zwei „Priscilla"-Reispflanzen (2,3 und 2,4), welche transformierte Plastide enthalten (12 und 13).
Beispiel 5
Erdnuss-Chloroplasttransformation (Arachis hypogaea).
Transgene Erdnüsse mit transformierten Chloroplastgenomen wurden unter Verwendung des universellen Vektors pSBL-CG-CtV2 (7A) erhalten. Erdnussgewebe wurde in Kultur gemäß dem von Kanyand et al., 1994 beschriebenen Protokoll aufgezogen. Die Beschussbedingungen waren dieselben wie für Tabak-Chloroplasttransformation wie oben beschrieben, außer dass Epikotyl-Abschnitte für den Beschuss verwendet wurden, wobei Berstscheiben mit variablem Druck eingesetzt wurden. Von einer Erdnuss-Chloroplasttransformation ist nie zuvor berichtet worden.
14 zeigt Erdnuss-Plastidtransformation. Transformierte Erdnusspflanzen wachsen normal (Mitte und auf der linken Seite der Platte), während nicht transformierte Pflanzen in dem letalen Medium (500 μg/ml) absterben.
Beispiel 6
Sojabohnen-Chloroplasttransformation. Transgene Sojabohnen mit transformierten Chloroplastgenomen wurden unter Verwendung des universellen Vektors pSBL-CG-CtV2 erhalten (7A). Die Beschussbedingungen waren dieselben wie für Tabak-Chloroplasttransformation. Es wurde nie zuvor von Sojabohnen-Chloroplasttransformation berichtet.
15 zeigt die Sojabohnen-Plasmidtransformation. Zwei transformierte Pflanzen zeigen Triebe, die anderen Pflanzen sterben auf dem letalen Medium ab, was letale Selektion durch das antibiotische Spektinomyzin zeigt (500 μg/ml).
Beispiel 7
Süßkartoffel-Chloroplasttransformation. Transgene Süßkartoffelpflanzen mit transformierten Chloroplastgenomen wurden unter Verwendung des universellen Vektors pSBL-CG-CtV2 erhalten (7A). Süßkartoffelgewebe wurde in Kultur gemäß dem von Zhang et al., 1996 beschriebenen Protokoll gezüchtet. Die Beschussbedingungen waren dieselben wie für Tabak-Chloroplasttransformation wie zuvor beschrieben, außer das Calli- und primäre Embryos beschossen wurden und sie nach dem Beschuss auf Platten, welche 100 mg/ml Spektinomyzin enthielten, übertragen wurden. Es wurde nie zuvor von Süßkartoffel-Chloroplasttransformation berichtet.
16 zeigt Süßkartoffel-Embryotransformation auf dem letalen antibiotischen Spektinomyzin-Selektionsmedium (500 μg/ml). Man bemerke gebleichte Kalli (rechts) und grüne Embryos (links).
Beispiel 8
Weintrauben-Chloroplasttransformation. Transgene Weintraubenpflanzen mit transformierten Chloroplastgenomen werden unter Verwendung desselben universellen Vektors pSBL-CG-CtV2 erhalten. Weintraubengewebe werden in Kultur gemäß dem Protokoll von Hebert et al., 1993 gezüchtet. Alle Chloroplast-Transformationsprotokolle sind wie diejenigen für Tabak, außer dass Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase, etwa 4 Tage nach Subkultivierung für den Beschuss verwendet wurden. Es wurde nie zuvor von Weintrauben-Chloroplasttransformation berichtet.
17 zeigt Weintrauben-Zelltransformation. Die transformierten Kulturzellen werden grün während die untransformierten Zellen in dem letalen antibiotischen Spektinomyzin-Selektionsmedium absterben (500 μg/ml).
Beispiel 9
Transformation anderer Pflanzen. Die Transformation von Pflanzen mittels Mikroprojektilbeschuss ist eine günstige Technik, um den universellen Vektor, der die gewünschte Nukleotidsequenz trägt, welche für das Molekül von Interesse kodiert, in die Zielpflanzen einzuführen. Veranschaulichende transgene Pflanzen, die durch Mikroprojektilbeschuss erhalten wurden, sind in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II
Die Transformation von Pflanzen durch die Verwendung der Genkanone ist in Daniell, 1997 beschrieben. Das Chloroplastgenom jeder Nutzpflanze in der Tabelle, von der berichtet wurde, dass sie durch Mikroprojektilbeschuss Kerntransformierbar ist, kann unter Verwendung des hierin beschriebenen Vektors transformiert werden.
Beispiel 10
Expression nicht-pflanzlicher Produkte
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Expression biologisch abbaubarer Biopolymere auf Proteinbasis (PBPs) und die Analyse von Transformanten.
Vektor pSBL-CG-EG121. Der Vektor psBL-CG-EG121 (3A) enthält das Gen (GVGVP)₁₂₁ _mer (als EG121 bezeichnet), welches für ein biologisch abbaubares Biopolymer auf Proteinbasis (PBP) kodiert, welches viele medizinische und nicht medizinische Anwendungen besitzt.
Konstruktion von Chloroplast-Expressionsvektoren. Die Standardprotokolle für die Vektorkonstruktion waren wie von Sambrook et al., 1989 dargestellt. Die Chloroplastintegrations- und -expressionsvektoren psBL-CtV2 (7A) bzw. pZS197 wurden jeweils mit Xbal (eine einzige Stelle zwischen dem aadA-Gen und der psbA-3'-Region) und Spel (eine einzige Stelle bei 120 bp stromabwärts des aadA-Gens in der psbA-3'-Regulatorischen Region) verdaut, Klenowgefüllt und dephosphoryliert. Das Polymergen EG121 wurde zusammen mit der Shine-Dalgarno-Sequenz (GAAGGAG) von dem pET11d-Vektor als ein Xbal-BamHl-Fragment aus dem Plastid pET11d-EG121 ausgeschnitten. Überhängende Enden des Einschubfragments wurden Klenow-gefüllt und mit den Vektoren pSBL-CtV2 oder pZS197 ligiert, was die Chloroplast-Expressionsvektoren pSBL-CG-EG121 (3A) und pZS-CG-EG121 ( 3B) ergab, welche die aadA- und EG121-Gene an dem umgekehrten Repeat (IR) oder in die Spacer-Region zwischen den rbcl- und orf 512-Genen des Tabak-Chloroplastgenoms integrieren. Es wird auf 1 verwiesen für „UV"- bzw. „TV"-Integrationsstellen.
Biopolymerexpression in E. coli und Tabak. Der Plastidvektor pSBL-CG-EG121 (3A) wurde in den E. coli-Stamm XL-1 Blue transformiert und in Terrific Brühe in Anwesenheit von Ampizillin (100 μg/ml) bei 37 °C für 24 h aufgezogen. SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli, 1970 unter Verwendung eines 12-%igen Trenn-Gels und eines 5-prozentigen Sammel-Gels durchgeführt und für 5 h bei einem konstanten Strom von 30 mAmps laufen gelassen. Rohe Proteinextrakte aus E. coli-Zellen wurden präpariert und wie von Guda et al., 1995 beschrieben, einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden Polypeptide durch negatives Anfärben mit CuCl₂ sichtbar gemacht.
18 zeigt die Expression von Chloroplastintegrations- und -expressionsvektoren in E. coli-Stamm HMS174 (DE3). Bahn 1 zeigt das gereinigte Polymerprotein; Bahn 2 zeigt die nicht transformierte E. coli-Kontrolle; Bahn 3 zeigt den E. coli-Stamm XL-1 Blue, der mit dem universellen Vektor pSBL-CG-EG121 transformiert ist (3A); Bahn 4 zeigt mit dem Tabakvektor transformierte E. coli (Vergleichsbeispiel) und Bahn 5 zeigt den E. coli-Stamm HMS174 (DE3), der mit dem pET11d-EG121-Vektor transformiert wurde, in dem der T7-Promotor das Polymergen transkribiert. Die Expressionsmenge durch den Prrn-Promotor in E. coli war nahezu gleich derjenigen des hocheffizienten T7-Promotors, der das Polymergen steuert.
Southern Blot Analyse. Gesamt-DNA wurde aus Blättern transformierter Pflanzen und von Wildpflanzen unter Verwendung der CTAB-Prozedur von Rogers und Bendich, 1988 extrahiert.
Die 19 und 20 zeigen eine Southern Blot Analyse, die unabhängig mit den unter Verwendung des Tabak-Vektors (19) (Vergleichsbeispiel) und des universellen Vektors (20) erhaltenen Transformanten durchgeführt wurde. Die Gesamt-DNA wurde mit EcoRI und HindIII im Fall der Transformanten des universellen Vektors (UV) oder mit EcoRI und EcoRV im Fall der Transformanten des Tabakvektors (TV) verdaut. Das Vorliegen einer EcoRI-Stelle am 3'-Ende des Polymergens erlaubte nur bei den Chloroplast-Transformanten das Ausschneiden von Fragmenten mit vorhergesagter Größe. Um die Fremdgen-Integration und Homoplasmie zu bestätigen, wurden einzelne Blots mit entsprechenden Randsequenzen sondiert. Im Fall der TV-Transformanten nach der zweiten oder dritten Selektionsrunde hybridisierte die Randsequenz mit 4,6 und 1,6 kbp Fragmenten (19A, Bahnen 2, 3 und 4) und in dem Wildtyp mit einem nativen 3,1 kbp Fragment (19A, Bahn 1). Andererseits hybridisierte die Randsequenz im Fall der UV-Transformanten nach der ersten Selektionsrunde mit 4,0 kbp und 1,2 kbp Fragmenten ( 20A, Bahnen 1 und 2), während sie in der Kontrolle mit einem nativen 2,1 kbp Fragment hybridisierte (20A, Bahn 3). Außerdem zeigten TV-Transformanten ebenso wie die Wildtyp-Pflanze auch das native Fragment von 3,1 kbp (19A, Bahnen 2 und 3), was einen heteroplasmischen Zustand der transformierten Chloroplastgenome anzeigt, obwohl sie mehrere Selektionsrunden durchliefen. Beide UV-Transformanten zeigten jedoch selbst nach der ersten Selektionsrunde einen homoplasmischen Zustand (20A, Bahnen 1, 2).
Es wurde früher schon von dem Vorliegen von Heteroplasmie selbst nach der zweiten Selektion berichtet und es ist vermutet worden, dass die Selektion solange durchgeführt werden sollte bis Homoplasmie erreicht ist (Svab und Maliga, 1993). Dies stimmt mit der Beobachtung überein, dass in den TV-Transformanten nach einem zweiten Selektionszyklus ein hohes Maß an Heteroplasmie vorliegt (19A, Bahnen 2 und 3). Jedoch wurde im Fall der UV-Transformanten kein heteroplasmischer Zustand beobachtet, was auf den Kopie-Korrektur-Mechanismus zwischen den beiden IR-Regionen und/oder das Vorliegen eines Chloroplast-Replikationsursprungs (ori) innerhalb der Randsequenz zurückzuführen sein kann, was die Kopienanzahl des eingebrachten Plasmids vor der Integration erhöhen sollte.
DNA-Gel-Blots wurden auch entweder mit dem aadA-Gen (UV-integrierte Pflanzen) oder dem EG121-Gen (TV-integrierte Pflanzen) sondiert, um die Integration fremder Gene in die Chloroplastgenome wieder zu bestätigen. In den TV-integrierten Pflanzen hybridisierte die Polymergensonde nur in den Plastidtransformationslinien mit einem 4,6 kbp Fragment (19B, Bahnen 2, 3 und 4). Außerdem hybridisierte in den UV-integrierten Pflanzen die aadA-Sequenz auch mit einem erwarteten 4,0 kbp Fragment (20B), welches auch mit der Randsequenz in Plasmidtransformationslinien hybridisierte ( 20A, Bahnen 1 und 2).
Analyse der Transkriptionsmengen in transgenem Tabak und Northern Blot. Fremdgen-Transkriptionsmengen wurden durch Northern Blot Verfahren (21) analysiert, unter Verwendung der Gesamt-RNA, die isoliert wurde von der Kontrolle, Chloroplasttransformanten und einer transgenen Tabakpflanze, die das Polymergen (EG121) stark exprimierte über das Kerngenom (Zhang et al.), 1996. Die Polymergen-(EG121) Sequenz hybridisierte in den Chloroplast-Transformanten mit einem 1,8 kbp Fragment (Bahnen 1-4, 5-6) und in einem der Chloroplasttransformanten (Bahn 6) auch mit größeren Fragmenten. Im Fall des Kerntransformanten wurde ein Transkript von etwa 2,1 kbp beobachtet (Bahn 7). Dies lag daran, dass an dem 3'-Ende des Polymertranskripts ein Poly-A-Schwanz vorlag, der durch den nos-Terminator bereit gestellt wurde. Die in Bahn 6 beobachteten größeren Fragmente können di-, tri- oder polycistronische Transkripte sein, die in den Chloroplasten verarbeitet werden. Dies ist ein bei Chloroplast-Genexpression übliches Phänomen, da viele Plastid-Gene in polycistronischen Transkriptionseinheiten organisiert sind, die komplexe Sätze überlappender mRNAs ergeben. Die quantitative Bestimmung der Transkriptionsmengen ergab, dass die Chloroplast-Transformanten die 11-fache (Bahn 5) oder mehr als 50-fache (Bahn 6) Menge an Polymertranskripten erzeugen, im Vergleich zu einem stark exprimierenden Kerntransformanten (Bahn 7, am stärksten exprimierende Pflanze von 35 untersuchten TV-kerntransgenen Pflanzen). Dies ist direkt darauf zurückzuführen, dass in den Chloroplasten transgener Pflanzen eine größere Anzahl von Genkopien vorliegt. Die Plastid-Transformanten, in die der Tabakvektor (TV) integriert ist, zeigten geringere Mengen an Polymertranskript (Bahnen 1-4) im Vergleich zu den Transformanten in die der universelle Vektor integriert ist (Bahnen 5, 6), da das Polymergen in den Transformanten des universellen Vektors als zwei Kopien pro transformiertes Plastidgenom vorliegt, wohingegen es in den TV-Transformanten nur als einzelne Kopie vorliegt, und in den TV-Transformanten heteroplasmische Bedingungen beobachtet werden.
Western Blot Analyse. Polymer-Protein wurde gemäß dem vor kurzem von Zhang et al., 1995 beschriebenen Verfahren aus den Blättern von Wildtyp-Tabak, Chloroplasttransformanten und Kern-transgenen Pflanzen gereinigt. Das gereinigte Polymer wurde durch SDS-PAGE gemäß Laemmli, 1970 unter Verwendung eines 12-%igen Trenn-Gels und eines 5-%igen Sammel-Gels analysiert und für 5 h bei einem konstanten Strom von 30 mAmps laufen gelassen. Polymer-Polypeptide von etwa 60 kDA wurden durch negatives Anfärben mit 0,3 M CuCl₂ sichtbar gemacht. Die Gele wurden in 0,25 M Natrium-EDTA und 0,025 M Tris-Cl, pH 9,0 entfärbt, wobei der Puffer in Intervallen von 10 Minuten ausgetauscht wurde. Western Immunoblotting und Anfärben (22) wurde wie von Zhang et al., 1996 beschrieben unter Verwendung eines monoklonalen Antiserums das gegen das Polymer AVGVP gerichtet ist, welches gut mit dem Polymer GVGVP kreuzreagiert und dem „Immuno-Blot-Assay Kit" (Bio-Rad) durchgeführt. Die Polymer-Polypeptide, welche bei etwa 60 kDa laufen, werden in Plastidtransformanten von IR-integrierten Pflanzen beobachtet. Die Polymerexpression aus einer stark exprimierenden Kern-transgenen Pflanze der F2-Generation (am stärksten exprimierende Pflanze von 35 untersuchten transgenen Pflanzen) ist in Bahn 5 ersichtlich (22), wohingegen in der untransformierten Kontrolle, wie in Bahn 4 ersichtlich (22), kein Polymer exprimiert wurde. 11-50-fach höhere Mengen an Polymertranskripten sind in den Chloroplast-Transformanten ( 21) gezeigt. Bei dem Chloroplasten nativ vorkommender Proteine wie Valin und Prolin, deren biosynthetische Wege in Chloroplasten compartmentalisiert sind, kann davon ausgegangen werden, dass größere Mengen an Protein produziert werden.
Beispiel 11
Gentechnik für Glyphosat-Toleranz über die Kern-Genome und Chloroplast-Genome
Chloroplastintegrations- und -expressionsvektoren mit EPSPS in Tabak. Die EPSPS-kodierende Sequenz ist vor kurzem in das Tabak-Chloroplastgenom integriert worden (1). Der Chloroplastvektor pZS-RD-EPSPS (2A) enthält den 16S rRNA-Promotor (Prrn), welcher die aadA- und EPSPS-Gene steuert, mit der psbA-3'-Region von dem Tabak-Chloroplastgenom. Dieses Konstrukt integriert die EPSPS- und aadA-Gene in die Spacer-Region zwischen den rbcL- und orf512-Genen des Tabak-Chloroplastgenoms. 1 bei dem Pfeil „TV".
Test auf Glyphosat-Resistenz. Genexpression in E. coli. Aufgrund der starken Ähnlichkeit der Transkriptions- und Translationssysteme von E. coli und Chloroplasten (Brixey et al., 1997) wurden Chloroplast-Expressionsvektoren zunächst in E. coli auf Resistenz, in diesem Fall gegenüber Glyphosat, getestet, bevor man zu der Transformation höherer Pflanzen überging. Die höhere Wachstumsrate von E. coli welche den Tabakvektor enthalten, im Vergleich zu der Kontrolle welche pZS197 (ähnlich zu pZS-RD-EPSPS, aber ohne das EPSPS-Gen) enthält, in Gegenwart von 10 mM und 40 mM Glyphosat ( 23A) zeigt Glyphosat-Toleranz von E. coli, welche das EPSPS-Gen exprimieren. Eine weitere Wachstumskurve (23B) bestätigt die Expression von EPSPS über den universellen Vektor in E. coli. Somit ist die Glyphosat-Toleranz von E. coli auf die Expression des EPSPS-Gens, das sowohl in dem Tabakvektor als auch dem universellen Vektor vorliegt, zurückzuführen.
Charakterisierung transgener Tabakpflanzen
Integration des Gens. Vollständig entfaltete grüne Blätter von Nicotiana tabaccum var. Petit Havana wurden mit dem Tabakvektor (Vergleichsbeispiel) und den universellen Chloroplastvektoren beschossen. Zwei Tage nach Beschuss wurden die Blattexplantate auf letales Selektionsmedium übertragen, das Spektinomyzin enthielt (500 μg/ml). Transgene Pflanzen wurden innerhalb von 3-5 Monaten nach Beschuss erhalten. Typischerweise wurden von 16 beschossenen Blättern 10 unabhängig transformierte Triebe identifiziert.
PCR-Analyse wurde mit DNA, die aus den Trieben der ersten oder zweiten Generation und auch aus den maturen transgenen Pflanzen isoliert wurde, durchgeführt. Es wurden Primer verwendet, um die Integration des aadA-Gens von dem Tabakvektor sowie den universellen Vektoren in das Pflanzengenom zu bestätigen. Das Fehlen eines Produkts würde spontane Mutanten anzeigen, die ohne das aadA-Gen in der Lage sind, auf Spektinomyzin zu wachsen. Das erwartete PCR-Produkt (887 bp) wurde aus sechs Linien (24A-B, Bahnen 1-6) erhalten, die mit dem Tabakvektor transformiert waren (Vergleichsbeispiel). Ein PCR-Produkt mit 1,57 kb wurde in vier Linien detektiert (24A-B, Bahnen 1-4), die mit dem universellen Vektor transformiert waren. Unter den verwendeten Selektionsbedingungen wurden aus 10 mit dem Tabakvektor transformierten Linien vier Mutanten detektiert. Andererseits zeigten alle transgenen Linien, die mit dem universellen Vektor transformiert wurden, die Integration des aadA-Gens.
PCR-Chloroplastintegration. Es wurden außerdem Primer entwickelt, um spezifisch die Integration in das Plastidgenom zu identifizieren. Die Strategie war hierbei, einen Primer auf dem nativen Chloroplastgenom benachbart zu der Integrationsstelle des Vektors zu platzieren, während der andere auf dem aadA-Gen platziert wird. Es wurde ein Primer entwickelt, der unmittelbar außerhalb des rbcL-Gens in dem Tabakvektor (2,08 Kb PCR-Produkt) landet. Für den universellen Vektor landete der Primer auf dem nativen Chloroplastgenom in dem 16s rRNA-Gen (1,60 Kb PCR-Produkt). Die erwarteten Produkte wurden für die unter Verwendung des Tabakvektors (24A-B, Bahnen 2-7) sowie für die unter Verwendung des universellen Vektors (24A-B, Bahnen 1-4) erhaltenen transgenen Linien beobachtet. Nicht beschossene Pflanzen (Kontrollen) ergaben wie erwartet keinerlei PCR-Produkte (24A, Bahnen 1 und 9; 24B, Bahnen 5 und 11). Somit zeigte sich, dass es sich bei allen untersuchten transgenen Pflanzen um Chloroplast-Transformanten und nicht um Kern-Transformanten handelte, möglicherweise aufgrund dessen, dass in transgenen Pflanzen unter stringenten Selektionsbedingungen höhere Mengen an Aminoglykosid-Adenyl-Transferase (AADA) erforderlich sind. Geringe Mengen an AADA, die in Zusätzen von Kern-transgenen Pflanzen vorliegen, sollten Kern-Transformanten eliminiert haben. Die Ergebnisse der PCR-Analyse sind schlüssig und stellen einen eindeutigen Beweis für die Chloroplastintegration fremder Gene sowohl unter Verwendung des Tabakvektors als auch unter Verwendung universeller Vektoren dar.
Southern Analyse. Die Integration des aroA-Gens in den Chloroplasten wurde ebenfalls durch Southern Analyse bestätigt. Außerdem wurde das beobachtete hohe Ausmaß an Resistenz gegenüber Glyphosat (20A) durch die Bestimmung der Kopienanzahl des fremden Gens in den transgenen Pflanzen bestätigt. Die Sonde um die Integration des Fremdgens in das Chloroplastgenom zu bestimmen, umfasste ein 654 bp Fragment des EPSPS-Gens, Zufallsprimer markiert mit P³². Die Gesamt-DNA, einschließlich sowohl organell als auch genomisch, wurde mit EcoRI verdaut. Das Vorliegen einer EcoRI-Stelle 200 bp stromaufwärts von der Integrationsstelle in dem Chloroplastgenom wurde verwendet, um die Integration des EPSPS-Gens in das Chloroplastgenom in transgenen Pflanzen zu bestätigen. Die Sonde, die an das native EPSPS-Gen hybridisiert, das in dem Kerngenom vorhanden ist, ist als ein 4,5 Kb Fragment erkennbar. Außerdem hybridisierte die Sonde an die verdauten Chloroplastgenome der transgenen Tabakpflanzen, wobei die 3,5 kb und 4,35 Kb Fragmente in 25A, Bahnen 2, 3 und 4, erzeugt wurden. Die Sonde hybridisierte nicht an das verdaute Chloroplastgenom der nicht transformierten Kontrollpflanze (25A, Bahn 1), da das Fremdgen in dem Chloroplastgenom von Tabak nicht vorliegt. Dies bestätigt deutlich die Integration des EPSPS-Gens in das Chloroplastgenom.
Genkopienanzahl. Die Kopienanzahl des integrierten Gens wurde durch Erreichen von Homoplasmie für die transgenen Chloroplastgenome bestätigt. Tabak-Chloroplasten enthalten 5 000-10 000 Kopien ihres Genoms pro Zelle (McBride et al., 1995). Wenn nur ein Teil der Genome tatsächlich transformiert ist, dann muss die Kopienanzahl zwingend kleiner als 10 000 sein. Indem festgestellt wird, dass in den Transgenen ausschließlich das EPSPS-transformierte Genom vorhanden ist, konnte bestätigt werden, dass die Kopienanzahl 5 000-10 000 pro Zelle beträgt. Die wurde gezeigt, indem die Gesamt-DNA mit EcoRI verdaut wurde und mit den flankierenden Sequenzen, welche homologe Rekombination in das Chloroplastgenom ermöglichen, sondiert wurde. Die Sonde umfasste ein 2,9 Kb Fragment der rbcL-orf 512-Sequenzen. Ein Chloroplastgenom, das mit dem EPSPS-Gen transformiert ist, beinhaltet eine EcoRI-Stelle zwischen der rbcL-orf 512-Region des Chloroplastgenoms, wodurch ein zusätzliches Fragment erzeugt wird, wenn mit diesem Enzym verdaut wird (25C). Die Southern Hybridisierungsanalyse ergab ein 4,43 Kb Fragment in 25B, Bahn 1, für die nicht transformierte Kontrolle. In den Bahnen 2, 3 und 4 wurden zwei Fragmente erzeugt (4,35 Kb und 3 Kb) aufgrund des Einbaus der EPSPS-Genkassette zwischen die rbcL- und orf 512-Regionen (25C stellt ein schematisches Diagramm dar, wobei die gepunkteten Linien in Grau den Integrationspunkt der Fremd-DNA bedeuten). Das in der Kontrolle vorhandene 4,43 KB Fragment fehlt in den Transgenen. Dies beweist, dass nur das transgene Chloroplastgenom in der Zelle vorliegt und dass kein natives, nicht transformiertes Chloroplastgenom ohne das EPSPS-Gen vorhanden ist. Dies bestätigt die homoplasmische Natur der Transformanten, während gleichzeitig eine Abschätzung der Kopienanzahl des fremden EPSPS-Gens auf 5000 – 10 000 Kopien bereitgestellt wird. Dies würde dann das hohe Ausmaß an Toleranz gegenüber Glyphosat erklären, das in den transgenen Tabakpflanzen beobachtet wurde (20A).
Abkömmling. Samen, die aus selbstbestäubenden transgenen Pflanzen gesammelt wurden, wurden in Gegenwart von Spektinomyzin (500 μg/ml) gekeimt. Alle Samen keimten, blieben grün und wuchsen normal (26B). Die einheitliche Spektinomyzin-Resistenz zeigte, dass das aadA-Gen in alle Abkömmlinge übertragen wurde. Fehlende Vielfalt ließ auf Homoplasmie schließen, da heteroplasmische Bedingungen auf Spektinomyzin zu vielfältigen Abkömmlingen geführt hätten (Svab et al., 1990; Svab und Maliga, 1993). Die fehlende Variation der Chlorophyllpigmentierung unter den Abkömmlingen unterstreicht auch die Abwesenheit eines Positionseffekts, eines Artefakts der Kern-Transformation. Alle Kontrollsämlinge sind gebleicht und wuchsen in Gegenwart von Spektinomyzin nicht (26A).
Toleranz gegenüber Glyphosat. 18 Wochen alte Kontrollpflanzen und transgene Pflanzen wurden mit gleichen Volumina an Glyphosat mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,5-5 mM) besprüht. Tabak-Kontrollpflanzen waren extrem empfindlich gegenüber Glyphosat; sie starben selbst bei 0,5 mM Glyphosat innerhalb von sieben Tagen ab (27B). Andererseits überlebten die Chloroplast-transgenen Pflanzen so hohe Konzentrationen wie 5 mM Glyphosat (27A). Diese Ergebnisse sind erstaunlich in Anbetracht der Tatsache, dass das EPSPS-Gen von Petunien, das in diesen Chloroplastvektoren verwendet wurde, ein geringes Maß an Toleranz gegenüber Glyphosat aufweist und außerdem das Transportpeptid für die Zielsteuerung in Chloroplasten enthält.
Dies ist der erste Bericht über eine eukaryotische Kerngen-Expression in dem prokaryotischen Chloroplastabschnitt. Es ist gut bekannt, dass sich die Codonpräferenz zwischen dem prokaryotischen Chloroplastabschnitt und dem eukaryotischen Kernabschnitt deutlich unterscheidet. Idealerweise sollte ein Mutant aroA-Gen (welches nicht Glyphosat bindet) von einem prokaryotischen System in dem Chloroplastabschnitt exprimiert werden. Solche Gene sind nun verfügbar und weisen ein tausendfach höheres Ausmaß an Resistenz gegenüber Glyphosat auf, als das in dieser Arbeit verwendete Petuniengen. In Anbetracht dieser Beobachtungen ist es möglich, dass die Integration von prokaryotischen Herbizid-Resistenzgenen in das Chloroplastgenom wie hierin durchgeführt zu einem unglaublich hohen Ausmaß an Resistenz gegenüber Herbiziden führen kann, während die Wirksamkeit des biologischen Einschließens noch erhalten bleibt, d.h. eine Verbreitung durch Pollen wird vermieden.
Beispiel 12
Toleranz von Mais gegenüber Glyphosat. Ein universeller Chloroplastvektor unter Verwendung von Maischloroplast-DNA wird wie folgt erzeugt. Zunächst wird der Vektor pSBL-Ct-bor (5C) wie folgt erzeugt: ein Maischloroplast-DNA-Subklon, welcher eine der umgekehrten Repeatregionen enthält, wird mit dem bakteriellen Plasmid pUC19 erzeugt. Zweitens wird ein kleinerer Subklon, der nur das rRNA Operon enthält, aus dem ersten Subklon erzeugt und das in dem zweiten Subklon vorliegende Fragment, welches die trnA- und trnI-Gene enthält und Spacer-Regionen, die die universellen Ränder darstellen, werden in ein pUC19 Plasmid an der Pvull-Stelle subkloniert. Das resultierte Plasmid wird als pSBL-Ct-bor bezeichnet. In das Plasmid pSBL-Ct-bor wird eine selektierbarer Marker-Genkassette, die einen Chloroplast 16S rRNA-Promotor, das aadA-Gen (welches Aminoglykosidase-3'-adenyl-transferase kodiert, die Resistenz gegenüber Streptomycin/Spektinomyzin verleiht, kodiert) und eine 3' nicht translatierte Region des Chloroplast-psbA-Gens enthält, insertiert, um den Vektor pSBL-CORN zu erzeugen. Die selektierbarer Marker-Genkassette wird zwischen die trnI- und trnA-Gene in die Spacer-Region in Richtung der 16S rDNA-Transkription eingefügt.
Der Vektor pSBL-CORN-aroA, welcher ein mutiertes aroA-Gen von Salmonella typhimurium (Stalker et al. 1985; Comai et al., 1983) enthält, welches das Enzym EPSPS-Synthase kodiert, wird erzeugt, indem das mutierte aroA-Gen in den pSBL-CORN-Vektor insertiert wird. Transgene Maispflanzen, welche das mutierte aroA-Gen exprimieren sind resistent gegenüber Glyphosatbehandlung wie „Roundup^TM", wohingegen dies bei den nicht transformierten Kontrollpflanzen nicht der Fall ist.
Beispiel 13
Chloroplast-Transformation für Toleranz gegenüber Imidazolinonen oder Sulfonylharnstoffen. Das Plasmid pSBL-CORN wird modifiziert, indem ein DNA-Fragment, das eine mutierte Form des Acetolactat-Synthasegens von Saccharonyces cerevisiae enthält (Falco und Dumas, 1985; Yadav et al., 1986) eingefügt wird, um das Plasmid pSBL-CORN-ASL1 zu erzeugen. Dieses Gen kodiert für eine Acetolactat-Synthase, die nicht durch Imidazolinone oder Sulfonylharnstoffe gehemmt wird und es verleiht Toleranz gegenüber Herbiziden, die Sulfometeronmetyl enthalten und gegenüber Herbiziden, die Imazapyr enthalten. Transformierte Tabakpflanzen, die das mutierte Acetolactat-Synthasegen exprimieren sind resistent gegenüber Imidizolinon- und Sulfonylharnstoff-Herbizidsprays.
Der Vektor pSBL-CORN-ALS2 ist ein Derivat von pSBL-CORN, das mutierte Kopien der Tabak-suRA- und suRB-Gene enthält (Chaleff und Ray, 1984). Diese Gene kodieren für das Tabak-Acetolactase-Synthasepolypeptid. Das Plasmid pSBL-CORN-ALS2 wird erzeugt durch Ligieren der suRA- und suRB-Gene, die aus genomischer Tabak-DNA isoliert sind, in den pSBL-CORN-Vektor. Der resultierende Vektor verleiht Resistenz gegenüber Imidazolinon- und Sulfonylharnstoff-Herbiziden.
Beispiel 14
Chloroplast-Transformation für Toleranz gegenüber Photosystem II-Hemmern. Photosystem (PS) II-Herbizidresistenz tritt bei Mutationen in dem psbA-Gen auf, welche das Q_B-Protein beinhalten und ist unter vielen Pflanzen hoch konserviert. Resistente Pflanzen besitzen Mutationen, bei denen Aminosäuren an spezifischen Positionen innerhalb der Q_B-Proteine verändert sind, z.B. die Reste 219, 251, 255, 264 und 275 (Hirschberg und McIntosh, 1993; Galloway und Mets, 1984; Gloden und Haselkorn, 1985; Erickson et al., 1984; Johanningmeier et al., 1987). Gene, welche diese Mutationen aufweisen, können somit eingesetzt werden um Resistenz gegenüber Herbiziden zu verleihen, deren Funktion auf der Hemmung des Elektronentransports, der durch das PSII-System durchgeführt wird, basieren.
Beispiele für diese Herbizide beinhalten Dichlorphenyldimethylharnstoff (DCMU), Atrazin, Metribuzin, Lenazil, Phenmedipham, Loxynil und Dinoseb.
Das mutierte psbA-Gen, welches eine Serin zu Glycin-Mutation an Rest 264 aufweist, wird unter Verwendung der passenden Restriktionsendonukleasen aus genomischer DNA von Chlamydomonas isoliert. Das resultierende Fragment kann in den universellen Chloroplastexpressionsvektor pSBL-ctV2 ligiert werden und in E. coli XL-1 Blue eingefügt werden. Ein gereinigtes Plasmid von diesem E. coli-Stamm wird eingesetzt, um Pflanzen zu transformieren. Daniell (1997). Der Einbau der mutierten psbA-Gene in das Chloroplastgenom und die Selektion der geeigneten Transformanten wird wie zuvor beschrieben durchgeführt. Transformierte Pflanzen, welche das mutierte psbA-Protein erzeugen, das eine Substitution von Serin gegen Glycin aufweist, sind resistent gegenüber Atrazin^TM, wohingegen dies bei Kontrollpflanzen nicht der Fall ist.
Das mutierte psbA-Gen, welches eine Valin zu Isoleucin-Mutation an Rest 219 enthält, wird unter Verwendung der passenden Restriktionsendonukleasen aus genomischer DNA von Chlamydomonas isoliert. Ein universeller Vektor wird wie zuvor beschrieben konstruiert. Man erwartet, dass transgene Pflanzen wie Mais, die psbA, welches die Valin zu Isoleucin-Mutation an Rest 219 enthält, exprimieren, resistent gegenüber DCMU-Sprays sind.
Beispiel 15
Toleranz gegenüber Auxin-Analoga. 2,4-D. Der universelle Chloroplastexpressionsvektor psbL-ctV2 kann mit Xbal gespalten werden und mit einem DNA-Fragment, das das Gen, welches für Monooxygenase kodiert, enthält, ligiert werden. Das resultierende Konstrukt kann in Chloroplasten transformiert werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, die mehrere Kopien des Monooxygenase-Gens enthalten. Die resultierenden Pflanzen exprimieren größere Mengen an Monooxygenase und es wird erwartet, dass sie tolerant gegenüber 2,4-D sind.
Beispiel 16
Chloroplast-Transformation für Insekten-Resistenz. Tabakpflanzen können mit dem universellen Vektor pSBL-CtVHBt (8A) transformiert werden, der das cryIIA-Gen enthält und das CryIIA-Protoxin exprimiert, wodurch Resistenz gegenüber Insektenschädlingen verliehen wird, wie beispielsweise gegenüber der der Familie Pyralidae, wie beispielsweise der Tabakschwärmer. Selbst Insekten, die eine Resistenz entwickelt haben oder weniger empfindlich gegenüber Bt-Toxinen sind, werden durch das Bt-Toxin getötet, das durch das Gen in dem Chloroplastvektor, der hier beschrieben wurde, exprimiert wird.
Der Vektor pSBL-CtVHBt wird durch Spaltung von pSBL-CtVH mit Smal und Ligieren des Produkts mit dem cryIIA-Gen, welches das CryIIA-Protein kodiert, erzeugt. Das Produkt enthielt das cryIIA-Gen der richtigen Transkriptionsausrichtung (8A).
Die Integration des cryIIA-Gens in das Tabak-Chloroplastgenom ist durch PCR-Analyse bestätigt worden. Die Kopienanzahl von cryIIA pro Zelle wurde auf 10000 abgeschätzt, indem Southern Blots durchgeführt wurden. Es wurde abgeschätzt, dass das CryIIA-Protein zwischen 5 und 10 % des gesamten zellulären Proteins beträgt, indem Western Blots durchgeführt wurden. Dies ist die größte Menge an CryIIA-Protein, von der jemals in Bt-transgenen Pflanzen berichtet wurde. Bioassays unter Verwendung von abgeschnittenen Blättern wurden unter Verwendung von nicht transformiertem „Petit Havana" und cryIIA-transformiertem Tabak durchgeführt. Fünf bis zehn Larven wurden auf jedem Blatt platziert und nach 3-5 Tagen auf Sterblichkeit und Blattschädigung bewertet. Bei Verwendung von empfindlichem H. virescens (YDK) starben innerhalb von drei Tagen alle Larven auf cryIIA-transformiertem Tabak, wohingegen auf dem nicht transformierten „Petit Havana" keine Sterblichkeit auftrat und im Wesentlichen 100-prozentige Entlaubung erfolgte. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von CryIAc-resistenten (YHD2, 40-50000-fach resistent) und CryIIA-resistenten (CXC, 2000-fach resistent) H. virescens erhalten. Außerdem wurde bei Helicoverpa zea (Baumwollkapselbohrer) und Spodoptera exigua (Zuckerrübeneule) eine 100-prozentige Sterblichkeit beobachtet, wobei von keinem davon zuvor gezeigt worden ist, dass er durch irgendein Cry-Protein getötet werden kann.
28A und 28B zeigt einen Bioassay von (A) nicht transformierte Kontrollpflanze und (B) transgene Pflanze. Die getesteten Insekten zeigten 100 Sterblichkeit: Tabakbudworm (Heliothis virescens) empfindlich gegen CryI, Baumwollkapselbohrer und Zuckerrübeneule resistent gegenüber CryI und CryII.
29 zeigt das durch Western Blot Analyse aus Kontrolle (Bahn C) und transgenen Pflanzen (Bahn B) isolierte Gesamt-Protein. Die Bahnen D-H stellen unterschiedliche Konzentrationen an gereinigtem CryIIA-Protein (1-20 %) dar. Bahn A zeigt Proteinstandards.
Andere kontrollierbare Insekten sind zuvor in der Beschreibung der Erfindung beschrieben worden.
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BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ANMELDUNG
Positionen 1-188

1. Universeller Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplastgenoms verschiedener Pflanzenspezies, welcher umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Molekül von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz befinden um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplastgenom einer Zielpflanze bereit zu stellen, umfasst, flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird.
2. Universeller Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplastgenoms verschiedener Pflanzenspezies, welcher umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz befinden um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplastgenom einer Zielpflanze bereit zu stellen, umfasst und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird.
3. Vektor nach Position 2, welcher eine heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert.
4. Vektor nach Position 3, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, wodurch eine doppelte homologe Rekombination mit der konservierten Spacer-2-Region in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird.
5. Vektor nach Position 4, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils zusätzlich zu dem Abschnitt der Spacer-Region teilweise oder vollständig die tRNA^Ile- bzw. tRNA^Ala-Gene umfassen.
6. Vektor nach Position 4, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils zusätzlich zu dem Abschnitt der Spacer-Region teilweise oder vollständig die 16S und/oder 23S rRNA-Gensequenzen umfassen.
7. Vektor nach Position 4, wobei die Spacer-Region sich in einem umgekehrten Repeat des Chloroplastgenoms befindet.
8. Vektor nach Position 5, wobei sich die Spacer-Region sich in einem umgekehrten Repeat des Chloroplastgenoms befindet.
9. Vektor nach Position 6, wobei die Spacer-Region sich in einem umgekehrten Repeat des Chloroplastgenoms befindet.
10. Vektor nach Position 4, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
11. Vektor nach Position 5, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
12. Vektor nach Position 6, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
13. Vektor nach Position 7, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
14. Vektor nach Position 8, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
15. Vektor nach Position 9, welcher in der Spacer-Region einen Chloroplast-Replikationsursprung umfasst, wodurch Homoplasmie mit dem Genom gefördert wird.
16. Vektor nach Position 4, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
17. Vektor nach Position 5, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
18. Vektor nach Position 6, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
19. Vektor nach Position 7, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
20. Vektor nach Position 8, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
21. Vektor nach Position 9, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
22. Vektor nach Position 10, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
23. Vektor nach Position 11, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
24. Vektor nach Position 12, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
25. Vektor nach Position 13, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
26. Vektor nach Position 14, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
27. Vektor nach Position 15, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Zielpflanze stammen.
28. Vektor nach Position 13, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanze als der Zielpflanze von derselben Pflanzenspezies wie die Zielpflanzenspezies stammen.
29. Vektor nach Position 14, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanze als der Zielpflanze von derselben Pflanzenspezies wie die Zielpflanzenspezies stammen.
30. Vektor nach Position 15, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanze als der Zielpflanze von derselben Pflanzenspezies wie die Zielpflanzenspezies stammen.
31. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 4 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
32. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 5 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
33. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 6 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
34. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 7 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
35. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 8 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
36. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 9 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
37. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 10 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
38. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 11 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
39. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 12 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
40. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 25 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
41. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 26 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
42. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 27 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
43. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 28 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
44. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 29 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
45. Stabil transformierte Pflanze, welche einen Chloroplasten umfasst, der stabil mit dem Vektor von Position 30 transformiert ist, oder deren Abkömmling.
46. Stabil transformierte Pflanze nach Position 31, welche ein Nachtschattengewächs ist.
47. Stabil transformierte Pflanze nach Position 32, welche ein Nachtschattengewächs ist.
48. Stabil transformierte Pflanze nach Position 33, welche ein Nachtschattengewächs ist.
49. Stabil transformierte Pflanze nach Position 40, welche ein Nachtschattengewächs ist.
50. Stabil transformierte Pflanze nach Position 41, welche ein Nachtschattengewächs ist.
51. Stabil transformierte Pflanze nach Position 42, welche ein Nachtschattengewächs ist.
52. Stabil transformierte Pflanze nach Position 31, welche monocotyledon ist.
53. Stabil transformierte Pflanze nach Position 32, welche monocotyledon ist.
54. Stabil transformierte Pflanze nach Position 33, welche monocotyledon ist.
55. Stabil transformierte Pflanze nach Position 31, welche dicotyledon ist.
56. Stabil transformierte Pflanze nach Position 32, welche dicotyledon ist.
57. Stabil transformierte Pflanze nach Position 33, welche dicotyledon ist.
58. Stabil transformierte Pflanze nach Position 34, welche monocotyledon ist.
59. Stabil transformierte Pflanze nach Position 35, welche monocotyledon ist.
60. Stabil transformierte Pflanze nach Position 36, welche monocotyledon ist.
61. Stabil transformierte Pflanze nach Position 34, welche dicotyledon ist.
62. Stabil transformierte Pflanze nach Position 35, welche dicotyledon ist.
63. Stabil transformierte Pflanze nach Position 36, welche dicotyledon ist.
64. Stabil transformierte Pflanze nach Position 37, welche monocotyledon ist.
65. Stabil transformierte Pflanze nach Position 38, welche monocotyledon ist.
66. Stabil transformierte Pflanze nach Position 39, welche monocotyledon ist.
67. Stabil transformierte Pflanze nach Position 37, welche dicotyledon ist.
68. Stabil transformierte Pflanze nach Position 38, welche dicotyledon ist.
69. Stabil transformierte Pflanze nach Position 39, welche dicotyledon ist.
70. Stabil transformierte Pflanze nach Position 40, welche monocotyledon ist.
71. Stabil transformierte Pflanze nach Position 41, welche monocotyledon ist.
72. Stabil transformierte Pflanze nach Position 42, welche monocotyledon ist.
73. Stabil transformierte Pflanze nach Position 64, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
74. Stabil transformierte Pflanze nach Position 65, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
75. Stabil transformierte Pflanze nach Position 66, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
76. Stabil transformierte Pflanze nach Position 67, welche Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
77. Stabil transformierte Pflanze nach Position 68, welche Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
78. Stabil transformierte Pflanze nach Position 69, welche Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
79. Stabil transformierte Pflanze nach Position 70, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
80. Stabil transformierte Pflanze nach Position 71, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
81. Stabil transformierte Pflanze nach Position 72, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
82. Stabil transformierte Pflanze nach Position 67, welche Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
83. Stabil transformierte Pflanze nach Position 68, welche Sojabohne, Erdnuss, Traube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
84. Stabil transformierte Pflanze nach Position 69, welche Sojabohne, Erdnuss, Traube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
85. Verfahren zum stabilen Transformieren einer Zielpflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in das Chloroplastgenom der Zielpflanze und Wachsenlassen der transformierten Pflanze, wobei der Vektor geeignet ist um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren und wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Molekül von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz befinden um eine Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Zielpflanze bereitzustellen, umfasst, eine heterologe Sequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird.
86. Verfahren zum stabilen Transformieren einer Zielpflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in das Chloroplastgenom der Zielpflanzenspezies und Wachsenlassen der transformierten Pflanze, wobei der Vektor geeignet ist um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren und wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz befinden um eine Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Zielpflanze bereitzustellen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird.
87. Verfahren nach Position 86, wobei die transformierte Pflanze heteroplasmisch ist.
88. Verfahren nach Position 86, wobei die transformierte Pflanze eine homoplasmische Pflanze ist.
89. Verfahren nach Position 88, wobei die transformierte Pflanze eine Pflanze der ersten Generation ist.
90. Verfahren nach Position 86, wobei die Zielpflanze ein Nachtschattengewächs ist.
91. Verfahren nach Position 86, wobei die transformierte Pflanze monocotyledon ist.
92. Verfahren nach Position 86, wobei die transformierte Pflanze dicotyledon ist.
93. Verfahren nach Position 91, wobei die transformierte Pflanze eine der folgenden monokotyledonen Pflanzen ist: Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen.
94. Verfahren nach Position 92, wobei die transformierte Pflanze eine der folgenden dicotyledonen Pflanzen ist: Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak, Tomate oder Baumwolle.
95. Verfahren nach Position 86, welches das Isolieren des Peptids von Interesse umfasst.
96. Verfahren nach Position 86, wobei das Peptid von Interesse ein Polypeptid ist.
97. Verfahren nach Position 96, wobei das Polypeptid ein synthetisches Polymer auf Proteinbasis (PBP) ist.
98. Verfahren nach Position 97, wobei das PBP sich wiederholende Pentamersequenzen (GVGVP)_n aufweist, worin „n" eine ganze Zahl von 1 bis 250 ist, „G" Glycin ist, „V" Valin ist und „P" Prolin ist.
99. Verfahren nach Position 98, worin „n" 121 ist.
100. Verfahren nach Position 96, wobei das exprimierte Polypeptid von Interesse Insulin ist.
101. Verfahren nach Position 100, welches das Isolieren des Insulins umfasst.
102. Verfahren nach Position 100, wobei das Insulin in Form von Pro-Insulin vorliegt.
103. Verfahren nach Position 102, wobei das Pro-Insulin an ein PBP gebunden ist.
104. Verfahren nach Position 100, wobei die transformierte Pflanze Tabak ist.
105. Verfahren nach Position 96, wobei das Polypeptid von Interesse humanes Serumalbumin (HSA) ist.
106. Verfahren nach Position 105, wobei die transformierte Pflanze Tabak ist.
107. Vektor nach Position 4, wobei das Polypeptid von Interesse ein biologisch aktives Molekül ist.
108. Vektor nach Position 107, wobei das Peptid ein Polypeptid ist, bei dem es sich um ein synthetisches Polymer auf Proteinbasis (PBP) handelt.
109. Vektor nach Position 108, wobei das PBB sich wiederholende Pentamersequenzen (GVGVP)_n aufweist, worin „n" eine ganze Zahl von 1 bis 250 ist, „G" Glycin ist, „V" Valin ist und „P" Prolin ist.
110. Vektor nach Position 109, wobei das Polypeptid (GVGVP)_n ist, wobei die ganze Zahl „n" 121 ist.
111. Vektor nach Position 108, wobei das PBP an ein biologisch aktives Molekül gebunden ist.
112. Vektor nach Position 111, wobei das biologisch aktive Molekül Insulin ist.
113. Vektor nach Position 112, wobei das Insulin in Form von Pro-Insulin vorliegt.
114. Polypeptid, erhalten durch das Verfahren von Position 96.
115. PBP, erhalten durch das Verfahren von Position 97.
116. Proinsulin, erhalten durch das Verfahren von Position 102.
117. HSA, erhalten durch das Verfahren von Position 105.
118. Stabil transformierte Pflanze, welche ein Chloroplastgenom umfasst, das stabil transformiert ist mit dem Vektor von Position 107, welches ein biologisch aktives Molekül umfasst.
119. Geerntete Pflanze von Position 118.
120. Biologisch aktives Molekül, welches aus der Pflanze von Position 118 isoliert ist.
121. Biologisch aktives Molekül von Position 120, bei dem es sich um Insulin handelt.
122. Stabil transformierte Pflanze von Position 118, welche Tabak ist.
123. Stabil transformierte herbizidresistente Zielpflanzenspezies oder deren Abkömmling, welcher) einen Chloroplasten umfasst, der stabil transformiert ist mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist, um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche ein heterologes Protein von Interesse, das durch eine heterologe DNA-Sequenz in dem Chloroplastgenom der Zielpflanzenspezies exprimiert wird, umfasst, einen anderen selektiven Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid, flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenom sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wurde.
124. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 123, in der das Protein von Interesse eine mutierte Form eines Enzyms ist, die verringerte Affinität für das Herbizid aufweist als das natürlich auftretende Enzym.
125. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 123, wobei das Herbizid Glyphosat ist.
126. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 125, wobei das Enzym EPSP-Synthase ist.
127. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 124, wobei das Herbizid ausgewählt ist aus mindestens einem der folgenden Typen: PSI, PSII, APP, Auxin-Analogon, mitotisch, tertiäres Aminomethyl-Phosphorsäuren-Typ und ALS-hemmende Typen.
128. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid der PSI-Typ ist, ausgewählt aus Paraquat und Diquat.
129. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid ausgewählt ist aus Atrazin, Dinoseb, Lenazil und Metribuzin.
130. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid vom APP-Typ ist, ausgewählt aus Cyklohexandion, Haloxyfop, Clethodim und Phenoxaprop und der Niederalkyl-substituierten Verbindung davon.
131. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid ein Auxin-Analogon ist, ausgewählt aus MCPA und 2,4-D.
132. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid ein Herbizid vom Typ mitotisch ist, wobei es sich um Dinitroanilin handelt.
133. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 124, wobei das Herbizid ein tertiäres Aminomethyl-Phosphorsäure-Typ ist, wobei es sich um Glyphosat handelt.
134. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid ein ALS-hemmender Typ ist, ausgewählt aus Sulfonylharnstoffen und Imidazolinen.
135. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, wobei das Herbizid ausgewählt ist aus Bromoxynil, Methylsulforon, Chlorsulfuron, Phosphinothrizin und Imazapyr.
136. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 123, wobei der exprimierte Phänotyp Antibiotika-Resistenz ist.
137. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 123, wobei der selektierbare Phänotyp von dem Hygromyzin-Gen kodiert ist, das Herbizidresistenz verleiht.
138. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 127, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Sojabohne, Erdnuss, Weintraube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Kanola, Tabak oder Baumwolle ist.
139. Herbizidresistente Zielpflanze nach Position 138, welche eine homoplasmische Pflanze ist.
140. Verfahren, um einer Zielpflanzenspezies Herbizidresistenz zu verleihen, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in die Pflanze, der geeignet ist, um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, welches Resistenz gegenüber einem Herbizid verleiht, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Zielpflanze befinden, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen anderen selektierbaren Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid kodiert, und flankierende Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wird, und Anbau der transformierten Pflanze.
141. Verfahren nach Position 140, wobei die DNA-Sequenz für eine mutierte Form eines Enzyms kodiert, welches eine gegenüber dem natürlich vorkommenden Enzym verringerte Affinität für das Herbizid aufweist.
142. Verfahren nach Position 141, wobei das Enzym EPSP-Synthase ist und das Herbizid Glyphosat ist.
143. Verfahren nach Position 142, wobei die DNA-Sequenz das EPSP-Synthasegen ist, welches ein mutiertes EPSP-Synthasegen ist.
144. Verfahren nach Position 140, welches das Selektieren der lebensfähigen, transformierten Zielpflanzen aus einem Medium, das für nicht transformierte Pflanzen letal ist, umfasst.
145. Verfahren nach Position 144, wobei die lebensfähigen transformierten Zielpflanzen homoplasmische Pflanzen sind.
146. Verfahren nach Position 144, wobei die lebensfähigen transformierten Zielpflanzen heteroplasmische Pflanzen sind.
147. Verfahren nach Position 140, wobei die herbizidresistente Zielpflanze Tabak ist, die Nukleotidsequenz für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, der für Tabak letal ist oder für ein sichtbares Merkmal, das es ermöglicht, die transformierten Tabakpflanzen von den nicht transformierten Pflanzen zu selektieren.
148. Verfahren nach Position 147, wobei der letale selektierbare Phänotyp Hygromycin ist, gegenüber dem Tabak nicht natürlich resistent ist.
149. Verfahren nach Position 147, wobei das sichtbare Merkmal die Expression einer Farbe ist.
150. Verfahren nach Position 140, zum stabilen Transformieren des Phänotyps einer Zielpflanzenspezies, wobei die gewachsene transformierte Pflanze den selektierbaren Phänotyp und zusätzlich zu der Expression des Phänotyps ein weiteres Merkmal exprimiert.
151. Verfahren nach Position 150, wobei der gewählte Phänotyp durch Expression des Hygromycin-β-Phosphotransferase-Gens vermittelt wird und das zusätzliche Merkmal Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat ist.
152. Verfahren zur Bestimmung der Chloroplast-Transformation und Expression eines Zielmerkmals auf Basis des Erwerbs von Resistenz gegenüber einem ausgewählten Herbizid einer Zielpflanzenspezies, durch die Transformation der Pflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies in die Pflanze, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für das gewünschte Zielmerkmal kodiert, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5'- und stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Zielpflanze befinden, um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten einer Zielpflanze zu ermöglichen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, und flankierende Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom ermöglicht wird, Exponieren der Pflanzen in welche der Vektor eingebracht wurde gegenüber einer letalen Konzentration des Herbizids, und Selektieren der Pflanzen, die an der Exposition gegenüber dieser Konzentration nicht absterben, wodurch diejenigen transformierten Pflanzen ausgewählt worden sind, die das gewünschte Zielmerkmal exprimieren.
153. Verfahren nach Position 152, wobei das ausgewählte Herbizid ausgewählt ist aus mindestens einem der folgenden Typen: PSI, PSII, APP, Auxin-Analogon, mitotisch, tertiäres Aminomethyl-Phosphorsäuren und ALShemmende Typen.
154. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies oder deren Abkömmling, welcher) ein Chloroplastgenom umfasst, das stabil transformiert ist mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der zur stabilen Transformation des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies geeignet ist, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche umfasst: eine heterologe DNA-Sequenz, welche in dem Chloroplastgenom der Zielpflanzenspezies ein Zielprotein exprimiert, das Resistenz gegenüber einem Zielinsekt verleiht, einen anderen ausgewählten Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Zielinsekt und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer-2-Region zwischen den tRNA^Ile- und den tRNA^Ala-Genen des Chloroplastgenoms umfassen, welche homolog zu einer Spacersequenz des Zielchloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Zielpflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Zielchloroplastgenom erleichtert wurde, wobei das heterologe Protein, das durch das cryIIA-Gen exprimierte CryIIA-Protein-Toxin ist, welches Resistenz gegenüber Insekten verleiht.
155. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies nach Position 154, wobei das Insekt gegenüber dem Bt-Toxin empfindlich ist.
156. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies nach Position 154, wobei die fehlende Empfindlichkeit des Insekts gegenüber dem Bt-Toxin überwunden ist.
157. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies nach Position 155, wobei die Zielpflanze Tabak ist und das Insekt Tabakbudworm (lat. Heliothis virescens) ist.
158. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies nach Position 156, wobei die Zielpflanze Tabak, Baumwolle oder Rübe ist und das Insekt ein Bt-Toxin-resistenter Typ Baumwollkapselwurm oder Zuckerrübeneule ist.
159. Stabil transformierte Insekten-resistente Zielpflanzenspezies nach Position 154, wobei das Insekt Tabakbudworm, Baumwollkapselwurm oder Zuckerrübeneule ist.
160. Vektor ausgewählt aus den folgenden: pSBL-RD-EPSPS, pSBL-CG-EG121, pSBL-Ct-Border, pSBL-Ct-V1, pSBL-Ct-V2, pSBL-CtV3, pSBL-Ct-VH, pSBL-CtV3, pSBL-CtVH, pSBL-Ct-VHF und pSBL-CtVHBt.
161. Vektor nach Position 160, der ein universeller Integrations- und Expressionsvektor ist, bei dem es sich um pSBL-RD-EPSPS, pSBL-CG-EG121, pSBL-CtV1, pSBL-CtV2, pSBL-CtV3, pSBL-CtVH, pSBL-Ct-VHF und pSBL-CtVHBt handelt.
162. Isolierte DNA-Sequenz, welche die intergene DNA-Sequenz zwischen den 16S- und 23S-rDNA-Genen des Pflanzenchloroplastgenoms umfasst, wobei die intergene Sequenz in zahlreichen unterschiedlichen Pflanzenspezies hoch konserviert ist.
163. Isolierte DNA-Sequenz nach Position 162, welche die Spacer-2-Region umfasst, welche die intergene DNA-Sequenz zwischen den trnI- und den trnA-Genen des Pflanzenchloroplastgenoms ist.
164. Isolierte intergene DNA-Sequenz nach Position 163, welche die trnI- und die trnA-Gene umfasst.
165. Isolierte DNA-Sequenz nach Position 163, welche einen der umgekehrten Repeats des Chloroplastgenoms der Pflanze umfasst.
166. Isolierte DNA-Sequenz nach Position 165, welche einen Replikationsursprung umfasst.
167. Isolierte DNA-Sequenz nach Position 163, welche das rRNA-Operon in der Spacer-2-Region umfasst.
168. Universeller Integrations- und Expressionsvektor nach Position 4, wobei die Spacer-2-Region das rRNA-Operon umfasst.
169. Universeller Integrations- und Expressionsvektor nach Position 4, wobei die flankierenden Sequenzen synthetisch sind.
170. Herbizidresistente Zielpflanzenspezies nach Position 85, wobei die DNA-Sequenz, welche für das Protein von Interesse kodiert, prokaryotischen Ursprungs ist.
171. Universeller Integrations- und Expressionsvektor nach Position 2, der kein Transposon beinhaltet.
172. Stabil transformierte Zielpflanzenspezies nach Position 41, welche kein Transposon beinhaltet.
173. Verfahren zum stabilen Transformieren einer Zielpflanzenspezies nach Position 86, wobei der universelle Vektor kein Transposon beinhaltet.
174. Universeller Integrations- und Expressionsvektor nach Position 4, welcher einen in Chloroplasten funktionellen Promotor umfasst.
175. Universeller Expressions- und Integrationsvektor nach Position 4, welcher eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, der die Identifikation und Selektion lebensfähiger transformierter Pflanzen von nicht lebensfähigen, nicht transformierten Pflanzen erleichtert.
176. Verfahren nach Position 86, welches Selektieren der lebensfähigen transformierten Zielpflanze aus einem Medium, das für nicht transformierte Pflanzen letal ist, umfasst.
177. Stabil transformierte Herbizid-tolerante Zielpflanze oder deren Abkömmling nach Position 123, welcher) die Identifikation und Selektion auf Basis lebensfähiger transformierter Pflanzen von nicht lebensfähigen, nicht transformierten Pflanzen ermöglicht.
178. Verfahren nach Position 140, welches Selektieren der lebensfähigen transformierten Zielpflanze aus einem Medium, das für nicht transformierte Pflanzen letal ist, umfasst.
179. Expressionskassette, die geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplastgenoms einer Zielpflanze, welche eine funktionsfähige verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Molekül von Interesse kodiert, Kontrollsequenzen um Expression der kodierenden Sequenz in den Chloroplastgenom der Zielpflanze bereitzustellen, einen im Chloroplasten funktionellen Promotor umfasst, und pflanzliche DNA-Sequenzen, die jede Seite der Kassette flankieren um eine stabile Integration der DNA mit dem Zielchloroplastgenom durch homologe Rekombination zu erleichtern, wodurch die DNA darin stabil integriert wird und durch Organell-Replikation in Tochterzellen vererbt wird.
180. Expressionskassette nach Position 175, wobei die heterologe DNA-Sequenz eine synthetische Sequenz ist, die für ein Polymer auf Proteinbasis (PBP) kodiert.
181. Expressionskassette nach Position 176, wobei das PBP sich wiederholende Pentamersequenzen (GVGVP)_n aufweist, worin „n" eine ganze Zahl von 1 bis 250 ist, „G" Glycin ist, „V" Valin ist und „P" Prolin ist.
182. Expressionskassette nach Position 177, wobei die synthetische kodierende Sequenz das synthetische Biopolymergen EG121 ist und das exprimierte PBP das Polymerprotein (GVGVP)₁₂₁ ist.
183. Stabil transformiertes transkriptions-/translations-aktives Chloroplastgenom einer Ziel-Pflanze, das zur stabilen Integration einer heterologen DNA-Sequenz geeignet ist, welches umfasst: eine Expressionskassette, die ein heterologes Molekül von Interesse, das von einer heterologen DNA-Sequenz kodiert wird und durch Kontrollsequenzen in dem Chloroplastgenom der Zielpflanze exprimiert wird umfasst, und pflanzliche DNA, die jede Seite der Expressionskassette flankiert, wodurch die stabile Integration der DNA in das Ziel-Chloroplastgenom durch homologe Rekombination erleichtert wurde, wobei die DNA durch Organell-Replikation in Tochterzellen vererbt wurde.
184. Stabil transformierter Chloroplast nach Position 179, wobei das Molekül von Interesse ein Polymer auf Proteinbasis (PBP) ist.
185. Stabil transformierter Chloroplast nach Position 180, wobei das PBP sich wiederholende Pentamer-Sequenzen (GVGVP)_n aufweist, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 250 ist, "G" Glycin ist, "V" Valin ist und "P" Prolin ist.
186. Stabil transformierter Chloroplast nach Position 181, wobei die synthetische codierende Sequenz das synthetische Biopolymer-Gen EG121 ist und das exprimierte PBP das polymere Protein (GVGVP)_n ist.
187. Synthetisches Biopolymer (GVGVP)_n, welches von dem stabil transformierten Chloroplasten nach Position 182 exprimiert wird, wobei "n", "G", "V" und "P" wie dort definiert sind.
188. Synthetisches Biopolymer nach Position 183, welches (GVGVP)_n ist.

Claims

Universeller Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplastgenoms verschiedener Pflanzenspezies, welcher umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz befinden, um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplastgenom einer Ziel-Pflanze zu ermöglichen, umfasst, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacer-Region zwischen zwei Genen, die sich auf dem selben DNA-Strang befinden, insertiert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird.
Vektor nach Anspruch 1, welcher eine heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert.
Vektor nach Anspruch 2, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ale Genen des Choroplast-Genoms umfassen, wodurch eine doppelte homologe Rekombination mit der konservierten Spacer 2 Region in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird.
Vektor nach Anspruch 3, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils zusätzlich zu dem Abschnitt der Spacerregion teilweise oder vollständig die tRNA^Ile bzw. tRNA^Ala Gene umfassen.
Vektor nach Anspruch 4, wobei die flankierenden Sequenzen jeweils zusätzlich zu dem Abschnitt der Spacerregion teilweise oder vollständig die 16S und/oder 23S rRNA Gensequenzen umfassen.
Vektor nach Anspruch 3, wobei sich die Spacerregion in einem umgekehrten Repeat des Chloroplastgenoms befindet.
Vektor nach Anspruch 3, wobei die DNA der flankierenden Sequenzen von einer anderen Pflanzenspezies als derjenigen der Ziel-Pflanze stammen.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle oder deren Abkömmling, welcher) einen Chloroplasten umfasst, der stabil transformiert ist mit dem Vektor von Anspruch 3.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 8, welche monocotyledon ist.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 8, welche dicotyledon ist.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 9, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen ist.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 10, welche Sojabohne, Erdnuss, Traube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Canola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
Verfahren zum stabilen Transformieren einer Ziel-Pflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies, und Wachsenlassen der transformierten Pflanze, wobei der Vektor geeignet ist, um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, und wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert und Kontrollsequenzen die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz befinden, um eine Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Ziel-Pflanze zu ermöglichen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ala Genen des Choroplast-Genoms umfassen, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die transformierte Pflanze monocotyledon ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die transformierte Pflanze dicotyledon ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die transformierte Pflanze eine der folgenden monocotyledonen Pflanzen ist: Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer oder Weizen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die transformierte Pflanze eine der folgenden dicotyledonen Pflanzen ist: Sojabohne, Erdnuss, Traube, Süßkartoffel, Erbse, Canola, Tabak, Tomate oder Baumwolle.
Verfahren nach Anspruch 13, welches ferner das Isolieren des Peptids von Interesse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Peptid von Interesse ein synthetisches Polymer auf Proteinbasis (PBP) ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das PBP sich wiederholende Pentamer-Sequenzen (GVGVP)_n aufweist, worin „n" eine ganze Zahl von 1 bis 250 ist, „G" Glycin ist, „V" Valin ist und „P" Prolin ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Peptid von Interesse Insulin ist.
Verfahren nach Anspruch 21, welches weiterhin Isolieren des Insulins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Insulin in Form von Pro-Insulin vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Pro-Insulin an ein PBP gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die transformierte Pflanze Tabak ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Peptid von Interesse humanes Serum-Albumin (HSA) ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die transformierte Pflanze Tabak ist.
Vektor nach Anspruch 3, wobei das Peptid von Interesse ein biologisch aktives Molekül ist.
Stabil transformierte Pflanze oder Pflanzenzelle, welche ein Chloroplastgenom umfasst, das stabil transformiert ist mit dem Vektor von Anspruch 28, welcher ein biologisch aktives Molekül umfasst.
Stabil transformierte herbizidresistente Ziel-Pflanze oder Pflanzenzelle oder deren Abkömmling, welcher) einen Chloroplasten umfasst, der stabil transformiert ist mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist, um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche ein heterologes Protein von Interesse, das durch eine heterologe DNA-Sequenz in dem Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies exprimiert wird, umfasst, einen anderen selektierbaren Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ala Genen des Choroplast-Genoms umfassen, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wurde.
Herbizidresistente Ziel-Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 30, wobei das Herbizid Glyphosat ist.
Herbizidresistente Ziel-Pflanze oder Pflanzenzelle nach Anspruch 30, welche Mais, Reis, Gras, Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, Sojabohne, Erdnuss, Traube, Kartoffel, Süßkartoffel, Erbse, Canola, Tabak, Tomate oder Baumwolle ist.
Verfahren, um einer Ziel-Pflanzenspezies Herbizidresitenz zu verleihen, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in die Pflanze, um das Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, welches Resistenz gegenüber einem Herbizid verleiht, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz in dem Chloroplast der Ziel-Pflanze befinden, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen anderen selektierbaren Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid kodiert, und flankierende Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ala Genen des Ziel-Choroplast-Genoms umfassen, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird, und Anbau der transformierten Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die DNA-Sequenz für eine mutierte Form eines Enzyms kodiert, welches eine gegenüber dem natürlich vorkommenden Enzym verringerte Affinität für das Herbizid aufweist.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das Enzym EPSP-Synthase ist und das Herbizid Glyphosat ist.
Verfahren nach Anspruch 33, zum stabilen Transformieren des Phänotyps einer Ziel-Pflanzenspezies, wobei die gewachsene transformierte Pflanze den selektierbaren Phänotyp und zusätzlich zu der Expression des Phänotyps ein weiteres Merkmal exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei der ausgewählte Phänotyp durch Expression des Hygromycin-β-Phosphotransferase Gens vermittelt wird und das zusätzliche Merkmal Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat ist.
Verfahren zur Bestimmung der Chloroplast-Transformation und Expression eines Ziel-Merkmals auf Basis des Erwerbs von Resistenz gegenüber einem ausgewählten Herbizid einer Ziel-Pflanzenspezies, durch die Transformation der Pflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies in die Pflanze, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für das gewünschte Ziel-Merkmal kodiert, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz in dem Chloroplast der Ziel-Pflanze befinden, um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten einer Ziel-Pflanze zu ermöglichen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ala Genen des Choroplast-Genoms umfassen, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird, Exponieren der Pflanzen, in welche der Vektor eingebracht wurde gegenüber einer lethalen Konzentration des Herbizids, und Selektieren der Pflanzen, die bei der Exposition gegenüber dieser Konzentration nicht absterben, wodurch diejenigen transformierten Pflanzen ausgewählt worden sind, die das gewünschte Ziel-Merkmal exprimieren.
Stabil transformierte insektenresistente Ziel-Pflanzenspezies oder deren Abkömmling, welcher) ein Chloroplastgenom umfasst, das stabil transformiert wurde mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der zur stabilen Transformation des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies geeignet ist, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche umfasst: eine heterologe DNA-Sequenz, welche ein Ziel-Protein exprimiert, das Resistenz gegenüber einem Ziel-Insekt verleiht, in dem Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies, einen anderen ausgewählten Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Ziel-Insekt, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche jeweils einen Abschnitt der intergenen Spacer 2 Region zwischen den tRNA^Ile und den tRNA^Ala Genen des Choroplast-Genoms umfassen, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wurde, wobei das heterologe Protein das durch das cryIIA-Gen exprimierte CryIIA-Protein Toxin ist, welches Resistenz gegenüber Insekten verleiht.
Stabil transformieres transkriptions/translations-aktives Chloroplastgenom einer Ziel-Pflanze, wobei das Chloroplastgenom mit einer Expressionskassette transformiert worden ist, welche ein heterologes Molekül von Interesse umfasst, das von einer heterologen DNA-Sequenz kodiert wird, reguliert von Kontrollsequenzen, um Expression der kodierten DNA-Sequenz in dem Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze zu ermöglichen und pflanzliche DNA, die jede Seite der Expressionskassette flankiert, durch welche die stabile Integration der DNA in das Ziel-Chloroplastgenom durch homologe Rekombination erleichtert wurde, wobei die DNA durch Organell-Replikation in Tochterzellen vererbt wurde, wobei die Expresisonskassette in eine transkriptionell aktive Spacerregion zwischen zwei Gene insertiert ist, die sich auf dem selben DNA-Strang des Chloroplastgenoms der Zielpflanze befinden.
Verfahren zum stabilen Transformieren einer Ziel-Pflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies und die transformierte Pflanze wachsen lassen, wobei der Vektor geeignet ist, um die Expressionskassette stabil zu transformieren, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz befinden, um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten der Ziel-Pflanze zu ermöglichen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacerregion in dem Chloroplastgenom insertiert wird, die sich zwischen zwei auf dem selben DNA-Strang angeordneten Genen befindet, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird.
Stabil transformierte herbizidresistente Ziel-Pflanze oder Pflanzenzelle oder deren Abkömmling, welcher) einen Chloroplasten umfasst, der stabil transformiert ist mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der geeignet ist, um den Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche ein heterologes Protein von Interesse, das durch eine heterologe DNA-Sequenz in dem Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies exprimiert wird, umfasst, einen anderen ausgewählten Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacerregion in dem Chloroplastgenom insertiert ist, die sich zwischen zwei auf dem selben DNA-Strang angeordneten Genen befindet, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wurde.
Verfahren, um einer Ziel-Pflanzenspezies Herbizidresitenz zu verleihen, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors in die Pflanze, um das Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies stabil zu transformieren, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für ein Protein von Interesse kodiert, welches Resistenz gegenüber einem Herbizid verleiht, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz in dem Chloroplast der Ziel-Pflanze befinden, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen anderen selektierbaren Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Herbizid kodiert, und flankierende Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacerregion in dem Chloroplastgenom insertiert ist, die sich zwischen zwei auf dem selben DNA-Strang angeordneten Genen befindet, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird, und Anbau der transformierten Pflanze.
Verfahren zur Bestimmung der Chloroplast-Transformation und Expression eines Ziel-Merkmals auf Basis des Erwerbs von Resistenz gegenüber einem ausgewählten Herbizid einer Ziel-Pflanzenspezies, durch die Transformation der Pflanzenspezies, welches umfasst: Einbringen eines universellen Integrations- und Expressionsvektors, der geeignet ist zum stabilen Transformieren des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies in die Pflanze, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette welche eine funktionsfähig verbundene heterologe DNA-Sequenz, die für das gewünschte Ziel-Merkmal kodiert, und Kontrollsequenzen, die sich stromaufwärts des 5' und stromabwärts des 3' Endes der kodierenden Sequenz befinden, um Expression der kodierenden Sequenz in dem Chloroplasten einer Ziel-Pflanze zu ermöglichen, umfasst, eine heterologe Nukleotidsequenz, die für einen selektierbaren Phänotyp kodiert, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacerregion in dem Chloroplastgenom insertiert ist, die sich zwischen zwei auf dem selben DNA-Strang angeordneten Genen befindet, wodurch eine stabile Integration der heterologen kodierenden Sequenz in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit der homologen Sequenz in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wird, Exponieren der Pflanzen, in welche der Vektor eingebracht wurde gegenüber einer lethalen Konzentration des Herbizids, und Selektieren der Pflanzen, die an der Exposition gegenüber dieser Konzentration nicht absterben, wodurch diejenigen transformierten Pflanzen ausgewählt worden sind, die das gewünschte Ziel-Merkmal exprimieren.
Stabil transformierte insektenresistente Ziel-Pflanzenspezies oder deren Abkömmling, welcher) ein Chloroplastgenom umfasst, das stabil transformiert wurde mit einem universellen Integrations- und Expressionsvektor, der zur stabilen Transformation des Chloroplasten verschiedener Pflanzenspezies geeignet ist, wobei der Vektor umfasst: eine Expressionskassette, welche umfasst: eine heterologe DNA-Sequenz, welche ein Ziel-Protein, das Resistenz gegenüber einem Ziel-Insekt verleiht, in dem Chloroplastgenom der Ziel-Pflanzenspezies exprimiert, einen anderen ausgewählten Phänotyp als Toleranz gegenüber dem Ziel-Insekt, und flankierende DNA-Sequenzen, die jede Seite der Expressionskassette flankieren, welche homolog zu einer Spacer-Sequenz des Ziel-Chloroplastgenoms sind, wobei die Sequenz in dem Chloroplastgenom verschiedener Pflanzenspezies konserviert ist, und wobei die Sequenz in eine transkriptionell aktive Spacerregion in dem Chloroplastgenom insertiert ist, die sich zwischen zwei auf dem selben DNA-Strang angeordneten Genen befindet, wodurch eine stabile Integration des heterologen Proteins in das Chloroplastgenom der Ziel-Pflanze durch homologe Rekombination der flankierenden Sequenzen mit den homologen Sequenzen in dem Ziel-Chloroplastgenom erleichtert wurde, wobei das heterologe Protein das durch das cryIIA-Gen exprimierte CryIIA-Protein Toxin ist, welches Resistenz gegenüber Insekten verleiht.