ES2262514T3 - Plantas resistentes a herbicidas. - Google Patents

Plantas resistentes a herbicidas.

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ES2262514T3 ES00920929T ES00920929T ES2262514T3 ES 2262514 T3 ES2262514 T3 ES 2262514T3 ES 00920929 T ES00920929 T ES 00920929T ES 00920929 T ES00920929 T ES 00920929T ES 2262514 T3 ES2262514 T3 ES 2262514T3
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Satvinder Bachoo
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Abstract

Un polinucleótido que comprende los siguientes componentes en la dirección de transcripción 5¿ a 3¿: (i) Al menos un potenciador (¿enhancer¿) transcripcional siendo esa región potenciadora la que está antes del extremo 5¿ (¿upstream¿) a partir del inicio transcripcional de la secuencia de la cual se obtiene el potenciador y dicho potenciador de por sí no funciona como promotor o bien en la secuencia en la que está comprendido de manera endógena o cuando está presente de manera heteróloga como parte de una construcción; (ii)El promotor del gen EPSPS de arroz; (iii) La secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz; (iv)La secuencia genómica que codifica la EPSPS de arroz; (v) Un terminador (¿terminator¿) transcripcional; en la que la secuencia codificadora de EPSPS de arroz se modifica en el sentido de que se muta una primera posición para que el residuo en esta posición sea Ile en lugar de Thr y se muta una segunda posición para que el residuo en esta posición sea Ser en lugar de Pro, siendo introducidas las mutaciones en secuencias de EPSPS las cuales comprenden la siguiente región conservada en la enzima de tipo natural de modo que la secuencia modificada lea

Description

Plantas resistentes a herbicidas.
La presente invención se refiere a tecnología de ADN recombinante, y en concreto a la producción de plantas transgénicas las cuales presentan una sustancial resistencia o una sustancial tolerancia a herbicidas en comparación con plantas no transgénicas. La invención también se refiere, entre otros, a las secuencias de nucleótidos (y sus productos de expresión) las cuales se usan en la producción de, o se producen mediante, dichas plantas transgénicas.
Las plantas que son sustancialmente "tolerantes" a un herbicida cuando se someten a él proporcionan una curva de dosis/respuesta que se mueve a la derecha en comparación con la proporcionada por las plantas no tolerantes sometidas de manera similar. Dichas curvas de dosis/respuesta tienen la "dosis" trazada sobre el eje x y el "porcentaje de muerte", "efecto de herbicida", etc. trazado sobre el eje y. Las plantas tolerantes generalmente requerirán al menos dos veces más herbicida que las plantas no tolerantes para producir un efecto dado de herbicida. Las plantas que son sustancialmente "resistentes" al herbicida presentan pocas, o ningunas, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras cuando se someten al herbicida a concentraciones e índices los cuales generalmente son empleados por la comunidad agrícola para matar malas hierbas en el campo en el cual los cultivos se cultivan con propósitos comerciales.
Particularmente se prefiere que las plantas sean sustancialmente resistentes o sustancialmente tolerantes a herbicidas (más adelante "glifosato") que tienen 5-enolpiruvil siquimato fosfato sintetasa (más adelante "EPSPS", del Inglés "5-enol pyruvyl shikimate phosphate synthetase") como su sitio de acción, de los cuales la N-(fosfonometil)glicina (y sus diversas sales) es el ejemplo preeminente.
El herbicida se puede aplicar o bien pre o post emergencia de acuerdo con las técnicas habituales para la aplicación de herbicida a campos que comprenden cultivos que han dado resistencia al herbicida. La presente invención proporciona, entre otros, secuencias de nucleótidos útiles en la producción de dichas plantas tolerantes o resistentes a herbicida.
De acuerdo con la presente invención se ha proporcionado un polinucleótido aislado que comprende la secuencia descrita en SEC. ID. Nº 43. La invención también proporciona un polinucleótido, excluyendo el ADNc que codifica la EPSPS de arroz y maíz, que codifica una EPSPS y que es complementario a uno el cual, si se incuba a una temperatura de entre 65 y 70ºC en una disolución salina tamponada con citrato de 0,1 de fuerza conteniendo SDS al 0,1% seguido de aclarado a la misma temperatura con disolución salina tamponada con citrato de 0,1 de fuerza conteniendo SDS al 0,1%, híbrida aún con la secuencia descrita en SEC. ID. Nº 43. Sin embargo, se puede obtener un polinucleótido codificador de EPSPS de acuerdo con la invención seleccionando genotecas de ADN vegetal con un nucleótido que constituye un intrón dentro de la secuencia SEC. ID. Nº 43, y la invención también incluye dicha secuencia obtenible a partir de esa selección.
La invención también incluye un polinucleótido aislado que comprende una región codificadora de un péptido de tránsito de cloroplasto y una 5-enolpiruvil siquimato fosfato sintetasa (EPSPS) 3' del péptido resistente a glifosato, estando dicha región bajo control de expresión de un promotor operable vegetal, con las salvedades de que dicho promotor no es heterólogo con respecto a dicha región, y el péptido de tránsito de cloroplasto no es heterólogo con respecto a dicha sintasa.
Por "heterólogo" se quiere decir de una fuente diferente, y por consiguiente "no heterólogo" quiere decir derivado de la misma fuente (pero a un nivel de gen en lugar de organismo o tejido). Por ejemplo el promotor CaMV35S es claramente heterólogo con respecto a una secuencia codificadora de EPSPS de petunia en la medida en que el promotor se deriva de un virus y la secuencia (cuya expresión controla) de una planta. Sin embargo, el término "heterólogo" de acuerdo con la presente invención tiene un significado incluso más limitado. Por ejemplo, "heterólogo" tal como se refiere en la presente invención quiere decir que la secuencia codificadora de EPSPS de petunia es "heteróloga" con respecto a, por ejemplo, un promotor también derivado de petunia (distinto al que controla la expresión del gen EPSPS). En este sentido el promotor de petunia derivado del gen EPSPS de petunia a continuación usado para controlar la expresión de una secuencia codificadora de EPSPS derivada igualmente de petunia es "no heterólogo" con respecto a dicha secuencia codificadora. Sin embargo, "no heterólogo" no quiere decir que el promotor y la secuencia codificadora deban necesariamente haber sido obtenidos a partir de uno y el mismo (original o progenitor) polinucleótido. Igualmente con respecto a los péptidos de tránsito. Por ejemplo, un péptido de tránsito de cloroplasto de rubisco derivado de girasol es "heterólogo" con respecto a la secuencia codificadora de un gen EPSPS igualmente derivado de girasol (la misma planta, tejido o célula). Una secuencia codificadora de péptido de tránsito de rubisco derivada de girasol es "no heteróloga" con respecto a una secuencia codificadora de enzima de rubisco también derivada de girasol incluso si los orígenes de ambas secuencias son polinucleótidos diferentes los cuales pueden haber estado presentes en células, tejidos o plantas de girasol diferentes.
Una forma preferida del polinucleótido comprende los siguientes componentes en la dirección 5' a 3' de transcripción:
(i)
Al menos un potenciador ("enhancer") transcripcional siendo esa región potenciadora la que está antes del extremo 5' ("upstream") a partir del inicio transcripcional de la secuencia de la cual se obtiene el potenciador y dicho potenciador de por sí no funciona como promotor o bien en la secuencia en la que está comprendido de manera endógena o cuando está presente de manera heteróloga como parte de una construcción;
(ii)
El promotor del gen EPSPS de arroz;
(iii)
La secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz;
(iv)
La secuencia genómica que codifica la EPSPS de arroz;
(v)
Un terminador ("terminator") transcripcional;
en la que la secuencia codificadora de EPSPS de arroz se modifica en el sentido de que se muta una primera posición para que el residuo en esta posición sea Ile en lugar de Thr y se muta una segunda posición para que el residuo en esta posición sea Ser en lugar de Pro, siendo introducidas las mutaciones en secuencias EPSPS las cuales comprenden la siguiente región conservada GNAGTAMRPLTAAV en la enzima tipo natural de modo que la secuencia modificada lea GNAGIAMRSLTAAV.
La región potenciadora preferiblemente comprende una secuencia cuyo extremo 3' está al menos 40 nucleótidos antes del extremo 5' del inicio transcripcional más cercano de la secuencia a partir de la cual se obtiene el potenciador. En una realización adicional del polinucleótido, la región potenciadora comprende una región cuyo extremo 3' está al menos 60 nucleótidos antes del extremo 5' de dicho inicio más cercano, y en una realización aún adicional del polinucleótido dicha región potenciadora comprende una secuencia cuyo 3' está al menos 10 nucléotidos antes del extremo 5' a partir del primer nucleótido del consenso TATA de la secuencia a partir de la cual se obtiene el potenciador.
El polinucleótido de acuerdo con la invención puede comprender dos o más potenciadores transcripcionales, los cuales en una realización concreta del polinucleótido pueden estar conjuntamente presentes.
En el polinucleótido de la presente invención el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador si hay más de uno presente, puede estar entre 100 y 1.000 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS o el primer nucleótido de un intrón en la región no traducida 5' en el caso de que dicha región contenga un intrón. En una realización más preferida del polinucleótido, el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, está entre 150 y 1.000 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS o el primer nucleótido de un intrón en la región no traducida 5', y en una realización aún más preferida el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, puede estar entre aproximadamente 300 y aproximadamente 950 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS o el primer nucleótido de un intrón en la región no traducida 5'. En una realización incluso más preferida, el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, puede estar localizado entre aproximadamente 770 y aproximadamente 790 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS o al primer nucleótido de un intrón en la región no
traducida 5'.
En un polinucleótido inventivo alternativo, el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, puede estar localizado entre aproximadamente 300 y aproximadamente 380 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS o al primer nucleótido de un intrón en una región no traducida 5', y en una realización preferida de este polinucleótido alternativo el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, está localizado entre aproximadamente 320 y aproximadamente 350 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS, o al primer nucleótido de un intrón en la región no traducida 5'.
En el polinucleótido de acuerdo con la invención, la región antes del extremo 5' del promotor del gen EPSPS de arroz puede comprender al menos un potenciador derivado de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional de o bien los promotores CaMV35S o FMV35S.
Por consiguiente, el polinucleótido puede comprender en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional del promotor GOS 2 y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional de o bien los promotores CaMV35S o FMV35S.
Si no, el polinucleótido puede comprender en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir de un inicio transcripcional del promotor de actina de arroz y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional de o bien los promotores FMV35S o CaMV35S.
Si no, el polinucleótido puede comprender en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir de un inicio transcripcional del promotor de plastocianina de cebada y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional de o bien los promotores CaMV35S o FMV35S.
Si no, el polinucleótido puede comprender en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional del promotor de poliubiquitina de maíz y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional de o bien los promotores CaMV35S o FMV35S.
Si no, el polinucleótido puede comprender en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional del promotor FMV35S y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio transcripcional del promotor CaMV35S.
Sea cual sea la identidad y la yuxtaposición de los diversos potenciadores presentes en el polinucleótido, los nucleótidos 5' del codón que constituye el inicio de traducción del péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz puede ser la secuencia Kozack como preferida. Lo que se quiere decir mediante esto es muy conocido por los expertos en la técnica y además será aparente a partir de los siguientes ejemplos.
Las realizaciones particularmente preferidas del polinucleótido de la presente invención tienen una región no traducida la cual comprende una secuencia que funciona como un intrón localizado 5' de la secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz. La región no traducida puede comprender la secuencia descrita en SEC. ID. Nº 55. En concreto, la región no traducida puede comprender el intrón Adh1 de maíz el cual tiene la secuencia SEC. ID. Nº 55.
El polinucleótido de la invención puede comprender un potenciador de traducción víricamente derivado localizado dentro de la región 5' no traducida de la secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz. El experto en la técnica es consciente de la identidad de tales potenciadores de traducción adecuados, tales como las secuencias Omega y Omega prima derivadas de TMV y la derivada del virus del grabado del tabaco ("tobacco etch virus"), y como se pueden introducir tales potenciadores de traducción en el polinucleótido para asegurar el resultado deseado.
El polinucleótido de acuerdo con la invención además puede comprender regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos uno de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas. Mientras que tal polinucleótido contempla el gen que confiere resistencia a herbicida siendo distinto de una EPSPS, tal como glifosato oxidoreductasa (GOX) por ejemplo, el herbicida puede ser distinto a glifosato en cuyo caso los genes que confieren resistencia se pueden seleccionar entre el grupo que codifica las siguientes proteínas: fosfinotricin acetil transferasa (PAT, del Inglés "Phosphinothricin Acetyl Transferasa"), hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD, del Inglés "Hydroxyphenyl Pyruvate Dioxygenase"), glutationa S transferasa (GST), citocromo P450, Acetil-CoA carboxilasa (ACCasa), Acetolactato sintasa (ALS), protoporfirinogen oxidasa (PPO, del Inglés "Protorporphyrinogen oxidase"), dihidropteroato sintasa, proteínas transportadoras de poliamina, superóxido dismutasa (SOD), bromoxinil nitrilasa, fitoeno desaturasa (PDS), el producto del gen tfdA obtenible de Alcaligenes eutrophus, y variantes sometidas a mutación conocidas o si no modificadas de dichas proteínas. En el caso de que el polinucleótido asegure la resistencia a múltiples herbicidas tales herbicidas se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en: un herbicida de dinitroanilina, triazolopirimidinas, uracilo, un herbicida tipo fenilurea, tricetona, isoxazola, acetanilida, oxadiazola, triazinona, sulfonanilida, amida, anilida, RP201772, fluorocloridona, norflurazona y triazolinona y el herbicida post emergencia se selecciona entre el grupo que consiste en: glifosato y sus sales, glufosinato, asulam, bentazona, bialaphos, bromacilo, setoxidim u otra ciclohexanodiona, dicamba, fosamina, flupoxam, fenoxi propionato, quizalofop u otro ariloxifenoxipropanoato, picloram, fluorometrona, atrazina u otra triazina, metribuzina, clorimuron, clorosulfuron, flumetsulam, halosulfuron, sulfometron, imazaquin, imazetapir, isoxaben, imazamox, metosulam, piritiobac, rimsulfurona, bensulfurona, nicosulfurona, fomesafen, fluoroglicofen, KIH9201, ET751, carfentrazona, ZA1296, sulcotriona, paraquat, diquat, bromoxinilo y fenoxaprop.
En el caso de que el polinucleótido comprenda secuencias codificadoras de proteínas de insecticida, estas proteínas se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en toxinas en forma de cristal derivadas de Bt, incluyendo toxinas Bt secretadas; inhibidores de proteasa, lectinas, toxinas de Xenhorabdus/Photorhabdus; los genes que confieren resistencia a hongo se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en las codificadoras de AFPs conocidas, defensinas, quitinasas, glucanasas, Avr-Cf9. Las proteínas de insecticida particularmente preferidas son: cryIAc, cryIAb, cry3A, Vip 1A, Vip 1B, inhibidores de cistein proteasa y lecitina de "campanilla de invierno". En el caso de que el polinucleótido comprenda los genes que confieren resistencia bacteriana estos se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en los codificadores de cecropinas y tequiplesina y sus análogos. Los genes que confieren resistencia a virus se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en los que codifican proteínas de la cubierta de virus, proteínas de movimiento, replicasas víricas, y secuencias antisentido y de ribozima las cuales se sabe que aseguran la resistencia a virus; mientras que los genes que confieren resistencia al estrés, la sal y la sequía se puede seleccionar entre los que codifican Glutationa-S-transferasa y peroxidasa, la secuencia que constituye la secuencia reguladora de CBF1 conocida y los genes que se sabe que aseguran la acumulación de trealosa.
El polinucleótido de acuerdo con la invención se puede modificar para potenciar la expresión de las secuencias codificadoras de proteína comprendidas por él, en el sentido de que se puedan eliminar los motivos de inastibilidad de ARNm y/o las regiones de corte y empalme ("splice") fortuitas, o se puedan usar los codones preferidos de cultivo para que la expresión del polinucleótido modificado así en una planta produzca una proteína sustancialmente similar que tenga una actividad/función sustancialmente similar a la obtenida mediante la expresión del polinucleótido no modificado en el organismo en el cual las regiones codificadoras de proteína del polinucleótido no modificado son endógenas. El grado de identidad entre el polinucleótido modificado y un polinucleótido contenido de manera endógena dentro de dicha planta y que codifica sustancialmente la misma proteína puede ser tal como para prevenir la cosupresión entre las secuencias modificadas y endógenas. En este caso el grado de identidad entre las secuencias debería ser preferiblemente menor que aproximadamente el 70%.
La invención incluye aún más un vector biológico o de transformación que comprende el polinucleótido de la presente invención. Por consiguiente, por "vector" se quiere decir, entre otros, uno de los siguientes: un plásmido, virus, cósmido o una bacteria transformada o transfectada para contener el polinucleótido.
La invención incluye aún más material vegetal que ha sido transformado con dicho polinucleótido o vector, así como dicho material vegetal transformado que ha sido, o es, transformado más con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos uno de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas.
La invención incluye aún más plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales que han sido regeneradas a partir del material descrito en el párrafo inmediatamente anterior, sus partes y semillas progenie, cuya progenie comprende el polinucleótido o vector de la invención incorporado de manera estable en su genoma y heredable de una manera Mendeliana.
La invención incluye aún más plantas enteras, fértiles y morforlógicamente normales que contienen el polinucleótido de la presente invención y que resultan del cruce de plantas que han sido regeneradas a partir de material transformado con el polinucleótido o vector de la presente invención, y plantas que han sido transformadas con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos uno de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación, y herbicidas, la progenie de las plantas resultantes, sus semillas y
partes.
Las plantas de la invención se pueden seleccionar entre el grupo que consiste en cultivos, frutas y vegetales tales como: canola, girasol, tabaco, remolacha, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, fresa, plátano, melón, patata, zanahoria, lechuga, repollo, cebolla, especies de soja, caña de azúcar, guisante, judías, chopo, uva, cítrico, alfalfa, centeno, avena, pasto de césped y forraje, lino y colza, y plantas productoras de nueces en la medida en que no están ya específicamente mencionadas, su progenie, semillas y
partes.
Las plantas particularmente preferidas incluyen maíz, soja, algodón, remolacha y canola.
La invención comprende aún más un método de control de manera selectiva de malas hierbas en un campo, comprendiendo el campo malas hierbas y plantas de la invención o su progenie resistente a herbicida, comprendiendo el método la aplicación al campo de un herbicida tipo glifosato en una cantidad suficiente para controlar las malas hierbas sin afectar sustancialmente a las plantas. De acuerdo con este método, se puede aplicar uno o más de un herbicida, insecticida, fungicida, mematicida, bacteriocida y un antivírico al campo (y así a las plantas contenidas en él) o bien antes o después de la aplicación del herbicida glifosato.
La invención proporciona aún más un método de producción de plantas las cuales son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a herbicida glifosato, que comprende las etapas de:
(i)
transformar el material vegetal con el polinucleótido o vector de la invención;
(ii)
seleccionar el material así transformado; y
(iii)
regenerar el material así seleccionado en plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales.
La transformación puede implicar la introducción del polinucleótido en el material mediante cualquier modo conocido, pero en concreto mediante: (i) bombardeo biolístico del material con partículas revestidas con el polinucleótido; (ii) empalamiento del material en fibras de carburo de silicio las cuales están revestidas con una disolución que comprende el polinucleótido; o (iii) la introducción del polinucleótido o vector en Agrobacterium y el cocultivo del Agrobacterium así transformado con el material vegetal el cual de ese modo se transforma y posteriormente se regenera. Las técnicas de transformación, selección y regeneración vegetal, las cuales pueden requerir la modificación rutinaria respecto a unas especies vegetales particulares, son muy conocidas por los expertos en la técnica. Se puede seleccionar el material vegetal así transformado mediante su resistencia a glifosato.
La invención proporciona aún más el uso del polinucleótido o vector de la presente invención en la producción de tejidos vegetales y/o plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a herbicida glifosato.
La invención incluye aún más un método de selección de material biológico transformado para expresar un gen de interés, en el cual el material transformado comprende el polinucleótido o vector de la invención, y en el cual la selección comprende la exposición del material transformado a glifosato o una sal del mismo, y la selección del material superviviente. Dicho material puede ser de origen vegetal y, en concreto, se puede derivar de una monocotiledónea seleccionada entre el grupo que consiste en: cebada, trigo, maíz, arroz, avena, centeno, sorgo, piña, caña de azúcar, plátano, cebolla, espárrago y puerro.
La invención incluye aún más un método para regenerar una planta transformada fértil para contener ADN exógeno que comprende las etapas de:
(a)
producir tejido capaz de regenerarse a partir de dicha planta a transformar;
(b)
transformar dicho tejido capaz de regenerarse con dicho ADN exógeno, en la que dicho ADN exógeno comprende una secuencia de ADN seleccionable, en la que dicha secuencia funciona en un tejido capaz de regenerarse como un dispositivo de selección:
(c)
entre aproximadamente un día y aproximadamente 60 días después de la etapa (b), colocar dicho tejido capaz de regenerarse de la etapa (b) en un medio capaz de producir brotes a partir de dicho tejido, en la que dicho medio contiene además un compuesto usado para seleccionar tejido capaz de regenerarse que contiene dicha secuencia de ADN seleccionable para permitir la identificación o selección del tejido regenerado transformado;
(d)
después de que se haya formado al menos un brote a partir del tejido seleccionado de la etapa (c), traspasar dicho brote a un segundo medio capaz de producir raíces a partir de dicho brote para producir una plántula, en la que el segundo medio contiene opcionalmente dicho compuesto; y
(e)
convertir dicha plántula en una planta transgénica fértil en la cual el ADN exógeno se transmite a plantas progenie de manera Mendeliana, caracterizada porque el ADN exógeno es, o la secuencia de ADN seleccionable comprendida por el ADN exógeno comprende, el polinucleótido de acuerdo con la invención, y dicho compuesto es glifosato o una sal del mismo. La planta puede ser una monocotiledónea tal como se ha indicado anteriormente, más preferiblemente seleccionada entre plátano, trigo, arroz, maíz y cebada y dicho tejido capaz de regenerarse puede consistir en callos embriogénicos, embriones somáticos, embriones inmaduros, etc.
La presente invención será más aparente a partir de la siguiente descripción tomada en conjunto con los dibujos y el listado de secuencias asociados.
Lista de secuencias
SEC. ID. Nº 1-42 Cebadores ("primer") de PCR
SEC. ID. Nº 43 Secuencia de EPSPS genómica de arroz (a partir de ATG).
SEC. ID. Nº 44 Secuencia de EPSPS genómica de arroz que contiene mutación doble.
SEC. ID. Nº 45 Potenciador de FMV.
SEC. ID. Nº 46 Potenciador 1 de CaMV35S.
SEC. ID. Nº 47 Potenciador 2 de CaMV35S.
SEC. ID. Nº 48 Potenciador de poliubiquitina de maíz.
SEC. ID. Nº 49 Potenciador de actina de arroz.
SEC. ID. Nº 50 Potenciador GOS2 de arroz.
SEC. ID. Nº 51 Potenciador de Plastocianina de cebada.
SEC. ID. Nº 52 Promotor de EPSPS de arroz G1 + región antes del extremo 5'.
SEC. ID. Nº 53 Promotor de EPSPS de arroz G3 + región antes del extremo 5'.
SEC. ID. Nº 54 Promotor de EPSPS de arroz G2 + intrón Adh1 en la región antes del extremo 5'.
SEC. ID. Nº 55 Intrón Adh1 de maíz.
Lista de figuras
Figura 1 Mapa esquemático de la secuencia genómica de EPSPS de arroz.
Figura 2 Vector pCR4-OSEPSPS (gen dmEPSPS de arroz en el vector pCR4-Blunt).
Figura 3 Representación esquemática de la estrategia usada para introducir la doble mutación.
Figura 4 Vector pTCV1001.
Figura 5 Vector pTCV1001OSEPSPS (comprende el gen dmEPSPS de arroz en el vector pTCV1001).
Figura 6 Vector pTCV1001EPSPSPAC (comprende el gen dmEPSPS de arroz en el vector pTCV1001).
Figura 7 Vector pBluSK+EPSPS (comprende el gen dmEPSPS de arroz en el vector pBluescript SK+).
Figura 8 Vector pPAC1.
Figura 9 Vector pTCVEPSPSPH.
Figura 10 Vector pTCVEPSPSADH.
Figura 11 Vector pBluSKEPSPSADH (comprende el gen dmEPSPS de arroz y el intrón Adh1).
Figura 12 Vector pIGPD9.
Figura 13 Vector Zen 9.
Figura 14 Vector Zen 12.
Figura 15 Vector Zen 18.
Figura 16 Introducción de los vectores Zen en vectores superbinarios.
Producción de plantas tolerantes a tratamiento con glifosato a través de sobreexpresión de una EPSPS mutada bajo el control de un promotor no heterólogo
El término "potenciador" tal como se usa por toda esta memoria quiere decir aquellas secuencias antes del extremo 5' del promotor que no comprenden el propio promotor pero que actúan para potenciar o regular la iniciación de la transcripción a partir del promotor. El término "deleción del promotor de EPSPS" tal como se usa por toda esta memoria se refiere al promotor de EPSPS junto con los nucleótidos del potenciador el cual es innato al gen EPSPS, es decir, los nucleótidos que están antes del extremo (5') del promotor.
Respecto a la transformación del material vegetal, los expertos en la técnica reconocerán que aunque en los ejemplos anteriores se especifican tipos concretos de material objetivo (por ejemplo, cultivo en suspensión de célula embriogénica o embriones inmaduros de desdiferenciación) y métodos concretos de transformación (por ejemplo, usando Agrobacterium o bombardeo de partícula), la presente invención no se limita a estas realizaciones concretas y dichos materiales objetivos y métodos se pueden usar de manera intercambiable. Además, el término "células vegetales" tal como se usa por toda esta descripción de la invención puede referirse a células aisladas, incluyendo cultivos en suspensión así como a células en un tejido intacto o parcialmente intacto tal como un embrión, escutelos, microspora, embrión derivado de microspora o células somáticas de órganos vegetales. De manera similar, aunque los ejemplos específicos se limitan a maíz, trigo y arroz, la invención es igualmente aplicable a cualquiera de un amplio rango de cultivos agrícolas y plantas recreativas las cuales se pueden transformar usando métodos adecuados de transformación celular vegetal.
Los métodos de biología molecular general se llevan a cabo de acuerdo con Sambrook et al., (1989), Molecular cloning: A laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbour Lab. Press.
Ejemplo 1 Generación de una sonda de ADNc para EPSPS de arroz
Se obtiene un ADNc de longitud parcial que codifica la EPSPS de arroz usando PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR, del Inglés "Reverse Transcriptase PCR"). Se aísla el ARN total de plantas de arroz de dos semanas de edad (Oryza sativa L.indica var. Koshihikari) usando el método TRI-ZOL^{TM} (Life Technologies). Se realiza la síntesis de la primera hebra de ADNc usando transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) con 200 ng de cebador 10 inverso degenerado de EPSPS (SEC. ID. Nº 1) y 2 \mug de ARN total de acuerdo con los protocolos proporcionados. La síntesis de la segunda hebra y la amplificación del ADNc mediante PCR se realiza usando los cebadores 10 y 4 degenerados de EPSPS (SEC. ID. Nº 1 y SEC. ID. Nº 2) y "PCR Beads" (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Todos los códigos de letras son abreviaciones estándar (Eur. J. Biochem. (1985) 150:15)
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SEC. ID. Nº 1
10 inverso degenerado de EPSPS
5' GCACARGCIGCAAGIGARAAIGCCATIGCCAT 3'
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SEC. ID. Nº 2
4 directo degenerado de EPSPS
5' GCWGGAACWGCMATGCGICCRYTIACIGC 3'
Los productos se clonan en el vector pCR2.1 (Invitrogen) usando un "TA Cloning Kit^{TM}" tal como lo recomienda el distribuidor. El plásmido se recupera de las colonias seleccionadas y la secuencia se analiza mediante un proceso que implica un ordenador basado en búsquedas de homología (BLAST) para confirmar que el producto de la RT-PCR clonado muestra alta homología con las secuencias de EPSPS vegetales conocidas.
Ejemplo 2 Aislamiento de la secuencia genómica de EPSPS de arroz y clonación del gen EPSPS de arroz
Se aísla una región de ADN genómico que contiene el gen EPSPS de arroz completo y la región antes del extremo 5' de una genoteca de \lambda EMBLSP6/T7 construida a partir de brotes de arroz decolorados de cinco días de edad (Oryza sativa L.Indica var. IR36)(Clontech). Se seleccionan 1x10^{6} unidades formadoras de placa (ufp) usando la sonda de ADNc de EPSPS de arroz marcada con ^{32}P (ejemplo 1) usando los protocolos proporcionados por el fabricante. Las plaquetas positivas se someten a rondas posteriores de selección por hibridación hasta que se obtiene la pureza de placa de una placa de hibridación cruzada. Se prepara ADN \lambda a partir de la reserva pura de fago, de acuerdo con el método descrito por Sambrook et al., 1989. Se analiza el ADN obtenido mediante digestión por restricción y transferencia tipo Southern, usando el mismo ADNc de EPSPS de arroz marcado con ^{32}P como sonda. Los fragmentos de restricción que hibridan de forma cruzada se termina en extremo romo, si es pertinente, usando un método tal como Perfectly Blunt^{TM} (Novagen), y se clonan en un vector adecuado tal como pSTBlue (Novagen). A continuación, se secuencia el ADN usando un secuenciador de ADN automatizado ABI 377A PRISM. La figura 1 muestra un esquema del gen EPSPS de arroz con algunos de los sitios de restricción marcados.
Se obtiene mediante PCR un fragmento de 3,86 kb del gen EPSPS de arroz, que contiene la región codificadora, el promotor de EPSPS, algo de la región antes del extremo 5' y el terminador. Se usa el cebador de OSGRA1 de oligonucleótidos (SEC. ID. Nº 3) junto con OSEPSPS3 (SEC. ID. Nº 4) para amplificar la región deseada. El OSEPSPS3 contiene sitios adicionales de enzima de restricción Sac 1 y Sam 1 para facilitar la subclonación del gen durante las fases posteriores de construcción de vector. En la Figura 1 se proporciona una localización esquemática de estos cebadores.
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SEC. ID. Nº 3
OSSGRA1
5' ATT TCT TCT TCT TCC TCC CTT CTC CGC CTC 3'
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SEC. ID. Nº 4
OSEPSPS3
5' GAG CTC CCC GGG CGA GTG TTG TTG TGT TCT GTC TAA TG 3'
Se usa la polimerasa de alta fidelidad Pfu Turbo^{TM} (Stratagene) para realizar la reacción PCR con ADN obtenido de la preparación de \lambda (descrita anteriormente) como molde de amplificación. Se clona el producto de la PCR de tamaño esperado en pCRblunt 4-TOPO^{TM} (Invitrogen) y se secuencia para comprobar la integridad.
Ejemplo 3 Mutación de T a I y de P a S en la EPSPS de arroz
La mutación de T a I y de P a S se obtiene mediante la introducción de dos mutaciones puntuales. Estas mutaciones se introducen en el gen EPSPS genómico de arroz mediante PCR usando cebadores de oligonucleótidos que contienen la mutación deseada. En la Figura 3 se muestra un diagrama esquemático, indicando los sitios de unión de los cebadores usados. Se realizan dos reacciones PCR separadas (usando ambas el ADN \lambda como molde).
1) EcoRVEnd (SEC. ID. Nº 5)+OSMutBot (SEC. ID. Nº 6)
2) OsMutTop (SEC. ID. Nº 7)+SalIEnd (SEC. ID. Nº 8)
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SEC. ID. Nº 5
EcoRVEnd
5' GCTTACGAAGGTATGATATCCTCCTACATGTCAGGC 3'
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SEC. ID. Nº 6
OSMutBot
5' GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3'
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SEC. ID. Nº 7
OsMutTop
5' GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3'
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SEC. ID. Nº 8
SalIEnd
5' GGTGGGCATTCAGTGCCAAGGAAACAGTCGACATCCGCACCAAGTTGTTTCAACC 3'
Los productos resultantes de la PCR se juntan usando concentraciones equimolares de cada producto de la PCR como molde con los dos oligos SalIEnd y EcoRVEnd en una nueva reacción PCR. Se analiza una alícuota del producto de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa y se clona en pCR-Blunt II^{TM} (Invitrogen). El ADN plásmido se recupera y se secuencia para detectar la incorporación exitosa de la doble mutación.
El fragmento de ADN que contiene la doble mutación se incorpora en el clon genómico de EPSPS de arroz (Figura 1) tal como sigue. El clon que contiene el doble mutante se digiere con Eco RV y Sal I. El plásmido que contiene el producto de la PCR de ADN de EPSPS de arroz se digiere de manera similar y el fragmento Eco RV/Sal I que contiene el doble mutante se liga en el gen EPSPS de arroz en pCR4Blunt-TOPO^{TM} usando métodos de clonación estándar descritos en Sambrook et al., 1989 y se transforma en E. coli competente. El plásmido se recupera de las colonias resultantes y se secuencia para confirmar la presencia de la doble mutación sin alteraciones adicionales. En la Figura 2 se muestra este plásmido, pCR4-OSEPSPS.
El gen EPSPS de arroz genómico que contiene el doble mutante (Figura 2) se extrae del pCR4-Blunt-TOPO^{TM} usando Pst 1 y Not 1 y se liga en pTCV1001 (Figura 4), para generar pTCV10010SEPSPS (Figura 5) y éste se transforma en E. coli para la amplificación. Después, se extrae el fragmento de restricción Pac 1/Eco RV del ADN \lambda (Figura 1) y se inserta en pTCV10010SEPSPS (Figura 5) para generar pTCV1001EPSPSPAC (Figura 6). El gen EPSPS de arroz, que contiene ahora la secuencia desde Pac 1 a Sac 1 (Figura 6), se extrae de pTCV1001EPSPSPAC (Figura 6) como un fragmento Eag 1/Sac 1 y se liga de manera similar en pBluescript SK+ digerido para preparar pBluSK+EPSPS (Figura 7). Se esamblan regiones antes del extremo 5' de EPSPS de arroz adicionales y potenciadores deseados (tal como se ha descrito anteriormente) y se ligan en el vector pBluescript SK+ usando
Xha 1/Pac 1.
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Ejemplo 4 Generación de fusiones de promotor de EPSPS de arroz: potenciado una vez
La Figura 1 indica los sitios de unión de los cebadores G1 y G2 usados para generar una serie de deleciones en el extremo 5' del gen EPSPS de arroz. Se usan los cebadores G1 y G2 en combinación con el cebador de RQCR10 usando el molde de ADN lambda de EPSPS de arroz y la polimerasa Pfu Turbo^{TM} (Stratagene) usando los protocolos proporcionados por el distribuidor.
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SEC. ID. Nº 9
G1
5' CGCCTGCAGCTCGAGGTTGGTTGGTGAGAGTGAGACACC 3'
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SEC. ID. Nº 10
G2
5' CGCCTGCAGCTCGAGGCCACACCAATCCAGCTGGTGTGG 3'
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SEC. ID. Nº 11
RQCR10
5' GAACCTCAGTTATATCTCATCG 3'
Los productos obtenidos se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonan en el vector pCR-Blunt II-TOPO^{TM} (Invitrogen). Se determina la secuencia de los productos resultantes para asegurar que no hay alteración en la secuencia del clon de EPSPS genómico de arroz. Se seleccionan los clones a desarrollar en base a su orientación dentro del vector estableciendo si la digestión con Xho I elimina o no solamente la secuencia de unión múltiple ("polylinker") en lugar del inserto entero del vector.
Las secuencias de los genes CaMV35S y FMV35S y sus regiones antes del extremo 5' asociadas están publicadas en la base de datos EMBL (por ejemplo la entrada v00141 y x06166). Los cebadores están diseñados para amplificar solamente las regiones de potenciador antes del extremo 5' de dichos genes. Por tanto, el potenciador1 de CaMV35S (SEC. ID. Nº 36) se obtiene mediante PCR usando los cebadores SEC. ID. Nº 12 y SEC. ID. Nº 13 junto con la polimerasa Pfu Turbo^{TM} y el ADN de pMJB1 (A59870) como molde. Si no, se obtiene una región diferente del potenciador de CaMV35S usando métodos similares (SEC. ID. Nº 37). El potenciador de FMV35S se sintetiza químicamente (SEC. ID. Nº 35).
Se usan los siguientes cebadores de oligonucleótido.
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SEC. ID. Nº 12
35S5
5' CGCTCTAGAGGCCGGCCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTAC 3'
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SEC. ID. Nº 13
35S3
5' CGCTGCAGCTCGAGCATCAATCCACTTGCTTTGAAGACG 3'
La secuencia de las moléculas amplificadas y clonadas se confirman después de la clonación en el vector pCR Blunt-II-TOPO (Invitrogen). El vector pCR Blunt-II-TOPO, que contiene la deleción 5'UTR de EPSPS se digiere con Xba 1/Xho 1. Se extrae el potenciador de su respectivo vector pCR-Blunt-II-TOPO usando también la digestión con Xba 1/Xho 1 y se liga en los primeros vectores que contienen las deleciones del promotor de EPSPS generadas por PCR.
Ejemplo 5 Generación de fusiones de promotor de EPSPS de arroz: doblemente potenciado
Para incrementar más la expresión a partir del promotor de EPSPS de arroz se puede usar un potenciador adicional junto con o bien el potenciador de 35S o FMV. En un ejemplo de una estrategia de clonación para alcanzar esto, inicialmente se preparan fusiones de potenciador/EPSPS (similar al ejemplo 4) que comprenden un único potenciador (primero). Dichos primeros potenciadores se seleccionan de las regiones antes del extremo 5' de los promotores de los genes GOS2 de arroz, actina 1 de arroz (RA, del Inglés "Rice Actin"), poliubiquitina de maíz (MPU del Inglés "Maize Polyubiquitin"), CaMV35S, FMV35S y plastocianina de cebada. Las secuencias de nucleótidos de estas regiones están publicadas en la base de datos EMBL (número de entrada x51910, x15865, u29159, v00141, x06166 y z28347 respectivamente). Los cebadores están diseñados para amplificar solamente las regiones 5' del potenciador transcripcional deseadas a estos genes (SEC. ID. Nº 15 a 22).
SEC. ID. Nº 15
Cebada5
5' CGCTCTAGAGGCCGGCCCAAAATCTCCCATGAGGAGCACC 3'
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SEC. ID. Nº 16
Cebada3
5' CGCTGCAGCTCGAGCCGCCTCTCCATCCGGATGAGG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. Nº 17
OSGOS5
5' CGCTCTAGAGGCCGGCCGAATCCGAAAAGTTTCTGCACCGTTTTCACC 3'
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SEC. ID. Nº 18
OSGOS3
5' CGCTGCAGCTCGAGGCTGTCCTCCGTTAGATCATCG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. Nº 19
MPU5
5' GAC TAG TGG CCG GCC ATC AGC GGC CAG CTT TTG TTC 3'
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SEC. ID. Nº 20
MPU3
5' TTA ACT AGT GAG GAG GCC GCC TGC CGT GC 3'
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SEC. ID. Nº 21
RA5
5' CGCCTCTAGAGGCCGGCCGATATCCCTCAGCCGCCTTTCACTATC 3'
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SEC. ID. Nº 22
RA3
5' CGCTGCAGTGCTCGCGATCCTCCTCGCTTTTCC 3' pst?
Se aísla el ADN de plantas cultivadas en invernadero (maíz, cebada o arroz) usando el protocolo de DNAeasy (Qiagen) y se usa como molde de inicio para la amplificación por PCR. Los productos de la PCR se clonan en pCRBlunt II-TOPO y se secuencian para comprobar la autenticidad. La fusión de potenciador/EPSPS se prepara tal como se ha descrito previamente en el Ejemplo 4 (usando intercambio Xba/Xho 1) excepto en el caso de la actina 1 de arroz, en la que el potenciador se inserta como un fragmento Xba 1/Pst 1 (un sitio Xho 1 es sustituido por un sitio Pst 1 debido a la presencia de un sitio Xho 1 en el potenciador de actina de arroz) y la poliubiquitina de maíz, en la que el potenciador se inserta como un fragmento Spe 1/Xho 1 (el sitio Xba 1 es sustituido por un sitio Spe 1 debido a la presencia de un sitio Xba 1 en el potenciador de poliubiquitina de maíz). Indicar que se usa un sitio Xho 1 interno con respecto a la región de potenciador de poliubiquitina de maíz. El segundo potenciador, el cual puede ser o bien el potenciador de CaMV35S o el potenciador de FMV, se amplifica usando los cebadores 35SXho y 35S3 (SEC. ID. Nº 23 y SEC. ID. Nº 13)(35S) o FMVXho y FMV3 (SEC. ID. Nº 25 y SEC. ID. Nº 26) respectivamente. Estos cebadores facilitan la introducción de un sitio Xho 1 (o sitio Pst 1) en los terminales 5' y 3' del potenciador. Si no, se introduce un sitio Pac 1 en
el extremo 3' en el lugar del sitio Xho 1 usando cebadores 35SPac (SEC. ID. Nº 24) o FMVPAC3 (SEC. ID. Nº 27).
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SEC. ID. Nº 23
35SXho
5' CTGCAGCTCGAGAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTAC 3'
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SEC. ID. Nº 24
35SPAC
5' TTAATTAACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACG 3'
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SEC. ID. Nº 25
FMVXho1
5' CTCGAGGGCCGGCCGCAGCTGGCTTG 3'
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SEC. ID. Nº 26
FMV3
5' CTCGAGTTTTGTGGTCGTCACTGCGTTCG 3'
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SEC. ID. Nº 27
FMV3Pac
5' TTAATTAATTTTGTGGTCGTCACTGCGTTCG 3'
Una vez secuenciado, el producto de la PCR, o bien Xho 1:Xho 1, Pst 1/Pac 1 (cuando la actina de arroz es el primer potenciador) o Xho 1/Pac 1, se introduce en la construcción que comprende la primera fusión potenciador:gen EPSPS o bien en el sitio Xho 1 o entre los sitios de restricción Xho 1 y Pac 1 o Pst 1 y Pac 1 tal como se requiera. La introducción en el sitio Xho 1 se usa para construir las construcciones de fusión de potenciador doble que comprenden o bien las deleciones del promotor de EPSPS G2 o G1. Ambos fragmentos Xho 1/Pac 1 y Pst 1/Pac 1 se usan para construir las fusiones de potenciador doble que comprenden la deleción del promotor de EPSPS G3. Cuando se introduce el segundo potenciador como un fragmento Xho 1 se determina la orientación del potenciador mediante PCR.
Ejemplo 6 Inserción del intrón Adh1 en el 5'UTR del gen EPSPS de arroz
La inserción del intrón Adh1 de maíz en la deleción del promotor de EPSPS de arroz deseada (por ejemplo, preparada tal como se ha descrito en el Ejemplo 4) se realiza antes de la generación de la construcción de fusión con
el(los) potenciador(es) deseado(s). En este ejemplo concreto el intrón Adh1 se introduce en la deleción del promotor de EPSPS G2. El experto en la técnica apreciará que se puede adoptar esa metodología similar para incorporar el intrón Adh1 en otras deleciones del promotor de EPSPS. El intrón de Adh1 de maíz se inserta en las construcciones mediante PCR. El intrón Adh1 se amplifica a partir de una fuente adecuada, tal como ADN genómico de maíz o un vector tal como pPAC1 (Figura 8) usando cebadores de Adh5 (SEC. ID. Nº 28) y Adh3 (SEC. ID. Nº 29):
SEC. ID. Nº 28
Adh5
CCCATCCTCCCGACCTCCACGCCGCCGGCAGGATCAAGTGCAAAGGTCCGCCTTGTTTCTCCTCTG
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SEC. ID. Nº 29
Adh3
GACGCCATGGTCGCCGCCATCCGCAGCTGCACGGGTCCAGGAAAGCAATC
El producto resultante de la PCR se desnaturaliza y se usa como un cebador junto con Adh5Pac (SEC. ID. Nº 30) para amplificar el producto deseado usando el vector pTCV1001EPSPSPAC (Figura 6) como molde.
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SEC. ID. Nº 30
Adh5Pac
CGAGTTCTTATAGTAGATTTCACCTTAATTAAAAC
El producto resultante de la PCR se clona en pCR-Blunt II (Invitrogen). El fragmento Pac 1:Hind III se extrae del clon genómico de arroz (Figura 1) y se inserta en pTCV1001 para generar pTCVEPSPSPH (Figura 9). Después, se inserta el producto de la PCR Pac 1/Nco 1 anteriormente obtenido y que comprende el intrón Adh1 en pTCVEPSPH tal como se muestra mediante el esquema (Figura 9). Se extrae el fragmento Pac 1:Eco RV presente en el gen EPSPS clonado que contiene el mutante doble (Figura 10) y se sustituye por el fragmento Pac 1/Eco RV de pTCVEPSPSPH que comprende la secuencia de intrón Adh1 (Figura 9). Finalmente se extrae de pTCVEPSPSADH (Figura 10) el gen EPSPS completo que comprende la secuencia Adh1 como un fragmento Eag 1/Sac 1 y se clona en pBluescript SK+ para dar pBluSKEPSPSADH (Figura 11).
Ejemplo 7 Introducción de la secuencia consenso anterior a ATG (Kozak) optimizada por mutagénesis dirigida a sitio para construcciones que comprenden el intrón Adh1 de maíz
Opcionalmente, la mutagénesis dirigida a sitio se realiza sobre construcciones que contienen el intrón Adh1 usando el Kit de Mutagénesis Dirigida a sitio QuickChange (Stratagene). Esto se realiza sobre el fragmento de EPSPS Pac 1/Sac 1 en pBluescript SK+ (Figura 11) antes de la fusión con las fusiones de potenciador:promotor de EPSPS. Los siguientes oligonucleótidos se usan de acuerdo con los protocolos suministrados para optimizar la secuencia
KOZAK.
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SEC. ID. Nº 31
Oskozak
5' GGACCCGTGCAGCTGCGGTACCATGGCGACCATGGC 3'
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SEC. ID. Nº 32
Oskozakrev
5' GCCATGGTCGCCGCCATGGTACCGCAGCTGCACGGGTCC 3'
Se analizan los clones mediante análisis de restricción, usando Kpn 1, sobre el plásmido recuperado. El ADN correctamente alterado se caracteriza por un sitio de restricción Kpn 1 adicional en comparación con el ADN no alterado. A continuación, se verifica la secuencia mediante secuenciación de ADN automatizada. La secuencia de ADN alterado puede ser construcciones originales transferidas usando los sitios de enzima de restricción únicos de Sph 1 o Pac 1 en el extremo 5' y Avr II o Eco RV en el extremo 3' tal como sea apropiado para cada vector.
Ejemplo 8 Finalización de los casetes de expresión de EPSPS que comprenden, en la dirección 5' a 3', región(es) de potenciador, región antes del extremo 5' del promotor de EPSPS de arroz, promotor de EPSPS, 5'UTR de EPSPS+(opcional) intrón 1 Adh1 de maíz, región codificadora de péptido de tránsito de plástido de EPSPS de arroz, región codificadora de EPSPS madura de arroz y región terminador del gen EPSPS de arroz
Se extraen las fusiones de promotor de EPSPS de arroz potenciado doblemente y una vez (Ejemplos 4 y 5) contenidas en los vectores pCR Blunt-II-TOPO usando Xba 1 y Pac 1 y se insertan en el clon de pBluescript SK+ digerido de manera similar que contiene el resto de la secuencia de EPSPS de arroz (Figuras 7/11). Sin embargo, cuando la fusión de potenciador de poliubiquitina de maíz:EPSPS es para usarse ésta primeramente se clona en pBluescript usando Spe 1/Pac 1. A continuación, se inserta el resto de la secuencia de EPSPS de arroz como Pac 1/Sac 1 para completar el casete de expresión. Esta etapa de clonación final da como resultado las construcciones genéticas requeridas. A continuación, en la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de construcciones obtenibles usando las anteriores estrategias En las Figuras 13-15 se proporcionan los mapas esquemáticos.
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Clon Primer Segundo Deleción de Promotor Intrón Región codificadora Terminador
potenciador potenciador de EPSPS Adh1 genómica de EPSPS de EPSPS
ZEN9 CaMV35S Ninguno G1 No Sí Sí
ZEN11 RA 35S G1 No Sí Sí
ZEN14 RA 35S G3 No Sí Sí
ZEN15 MPU 35S G3 No Sí Sí
ZEN20 BPC 35S G2 Sí Sí Sí
ZEN18 GOS2 35S G2 Sí Sí Sí
ZEN12 GOS2 35S G3 No Sí Sí
ZEN23 FMV Ninguno G2 Sí Sí Sí
ZEN24 FMV 35S G2 Sí Sí Sí
ZEN25 35S FMV G2 Sí Sí Sí
Ejemplo 9 Subclonación de casetes de expresión de EPSPS a partir de Bluescript en pIGPD9
Cuando se desea y especialmente para la transformación de plantas mediante métodos directos de ADN (pelos, bombardeo y protoplastos), se extraen las construcciones de expresión de EPSPS de pBluescript usando Xma 1 y se clonan en pIGPD9 (Figura 12). El uso de este vector para la transformación evita las transferencias de genes de resistencia a antibióticos a la planta ya que la selección depende de la complementación de un mutante de E. coli his B auxotrófico con el gen que expresa IGPD (el producto de his B). Los plásmidos derivados de pIGPD9 que derivan de la inserción de los fragmentos Xma 1 de pZEN9, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 23, 24 y 25 se denominan pZEN9i, pZEN11i, pZEN12i...etc.
Las preparaciones de ADN extenso para usar en la transformación vegetal se obtienen usando el procedimiento de Maxi-prep (Qiagen) usando los protocolos proporcionados por el fabricante.
Ejemplo 10 Preparación de ADN para la transformación vegetal
El procedimiento anterior describe el esamblaje de los "casetes de expresión de EPSPS" que comprenden, en una dirección 5' a 3', una(s) secuencia(s) de potenciador, un promotor de EPSPS de arroz, una región codificadora de un péptido de tránsito de EPSPS de arroz, una región codificadora de una enzima EPSPS de arroz madura la cual es resistente a glifosato teniendo los cambios de T a I y de P a S en las posiciones especificadas y un terminador del gen EPSPS de arroz.
Opcionalmente los casetes deseados además también comprenden un gen marcador de selección de fármaco (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a canamicina, etc.), una región Borde Izquierdo o Derecho de ADN-T y (opcionalmente) una región armazón proteínico adjunta añadida 5' y/o 3' a la construcción anteriormente descrita. El experto en la técnica reconocerá que se pueden usar métodos similares a los anteriormente descritos para obtener estos componentes añadidos y clonarlos en las posiciones deseadas.
Ejemplo 11 Transformación de líneas de maíz usando una cepa de Agrobacterium que contiene un vector superbinario el cual incluye un casete de expresión de EPSPS entre los bordes derecho e izquierdo del ADN-T; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato Construcción de la cepa de Agrobacterium
Se digiere el ADN del plásmido Bluescript (por ejemplo, ZEN9, ZEN11, ZEN14, ZEN15, ZEN18, ZEN20; ZEN12, ZEN23, ZEN24 o ZEN25) o bien con Xma 1 o con Xba 1/Sac 1 y el fragmento codificador de EPSPS (aproximadamente 5-6,5 kb) así obtenido se liga en una posición en el sitio de clonación localizado entre los bordes de ADN-T derecho e izquierdo de pSB1 limitado de manera similar. En el caso, por ejemplo, de usar el fragmento Xma 1 de pZEN18 esta ligación crea el plásmido pZEN18SB11 (Figura 16). La construcción del plásmido pSB11 y la construcción de su parental, pSB21, están descritas por Komari et al. (1996, Plant J. 10:165-174). La región de ADN-T de pZEN18 se integra en el vector pSB1 superbinario (Saito et al. EP 672 752 A1) mediante un proceso de recombinación homóloga (Figura 16) para crear el plásmido, pSB1ZEN18. Para alcanzar éste el plásmido pZEN18SB11 se transforma en la cepa de E. coli HB101 la cual, a continuación, de acuerdo con el método de triple cruzamiento de Ditta et al. (1980, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77:7.347-7.351), se une con un Agrobacterium LBA4404 que guarda pSB1 para crear la cepa transformada de Agrobacterium, LBA4404 (pSB1ZEN18) en la cual la presencia del plásmido pSB1ZEN18 cointegrado se selecciona en base a la resistencia a espectinomicina. También se confirma la identidad de pSB1ZEN18 en base al análisis de restricción de Sal 1 (Figura 16). Las cepas LBA4404 que contienen las construcciones directamente análogas pSB1ZEN9, pSB1ZEN11, pSB1ZEN12, pSB1ZEN14 etc. se construyen de manera similar empezando a partir de los fragmentos Xma 1 de pZEN9, ZEN11, ZEN12, ZEN14, etc.
Si no, usando métodos similares a los anteriormente descritos, se recombina de manera homóloga un fragmento similar de pZEN9, ZEN11 etc. en una posición entre los bordes derecho e izquierdo del vector superbinario pTOK162 (Figura 1 en el documento US 5591616) para generar un conjunto similar de plásmidos cointegrados seleccionados en Agrobacterium en base a la resistencia combinada a canamicina y espectinomicina.
La cepa LBA4404 de Agrobacterium que tiene un plásmido PAL4404 auxiliar (que tiene una región vir completa) está disponible en la "American Type Culture Collection" (ATCC 37349). Una cepa útil alternativa es Agrobacterium EHA101 (1986, Hood et al., J. Bacteriol., 168(3):1.283-1.290) la cual tiene un plásmido auxiliar que tiene la región vir de la cepa fuertemente virulenta Agrobacterium tumefaciens A281.
Preparación de suspensiones de Agrobacterium
Las cepas de Agrobacterium LBA4404(pSB1ZEN9), LBA4404(pSB1ZEN11), etc. se siembran en estrías cada una en placas que contienen medio sólido "PHI-L" y se cultivan a 28ºC en oscuridad durante 3 a 10 días.
El medio PHI-L es tal como se describe en la página 26 (Ejemplo 4) del documento WO 98/32326. El medio PHI-L preparado en agua destilada doble comprende 25 ml/l de disolución patrón A, 25 ml/l de disolución patrón B, 450,9 ml/l de disolución patrón C y 50 mg/l de espectinomicina. Las disoluciones patrón están esterilizadas por autoclave o filtración. La disolución patrón A es 60 g/l de K_{2}HPO_{4} y 20 g/l de NaH_{2}PO_{4} ajustada a pH 7,0 con KOH; la disolución patrón B es 6 g/l de MgSO_{4} 7H_{2}O, 3 g/l de KCl, 20 g/l de NH_{4}Cl, 0,2 g/l de CaCl_{2} y 50 mg/l de FeSO_{4} 7H_{2}O; la disolución patrón C es 5,56 g/l de glucosa y 16,67 g/l de agar (A-7049, Sigma Chemicals, St Louis, Mo, USA).
Si no, las Agrobacterias se cultivan durante 3-10 días en una placa que contiene medio YP (5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar a pH 6,8) tal como se describe por Ishida et al. (1996, Nature Biotechnology, 14, 745-750) o, si no, tal como se describe por Hei et al. en el documento US 5591616 (medio AB (Drlica y Kado, 1974; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:3.677-3.681)), pero, en cada caso, se modifica para proporcionar la selección adecuada antibiótica (por ejemplo, conteniendo 50 mg/ml de espectinomicina en el caso de la cepa de Agrobacterium LBA4404(pSB1ZEN9) etc. o conteniendo tanto 50 mg/ml de espectinomicina como 50 mg/ml de canamicina en el caso de que se use el Agrobacterium que contiene un vector superbinario derivado de
pTOK 162).
Las placas de Agrobacterium preparadas tal como se ha descrito anteriormente se almacenan a 4ºC y se usan dentro de un mes de la preparación. Para la preparación de suspensiones se siembra en estrías una colonia única de la placa maestra en una placa que contiene, a pH 6,8, 5 g/l de extracto de levadura (Difco), 10 g/l de peptona (Difco), 5 g/l de NaCl, 15 g/l de agar (Difco) y 50 mg/l de espectinomicina (o según corresponda para la cepa concreta de Agrobacterium). Las placas se incuban a 28ºC, en oscuridad durante 2 días.
Las suspensiones de Agrobacterium para la transformación de material vegetal se preparan de una manera similar a la descrita en el documento US 5591616. (Usando buena práctica microbiológica para evitar la contaminación de cultivos asépticos) se extraen de las placas asas de 3x5 mm de Agrobacterium, se traspasan y se colocan en suspensión en 5 ml de medio líquido AA estéril en un tubo Falcon de 14 ml. Tal como se usa en la presente memoria, el medio líquido AA a pH 5,2 contiene la sales inorgánicas mayores, los aminoácidos y las vitaminas definidas por Toriyama y Hinata (1985) en Plant Science 41, 179-183), las sales inorgánicas menores del medio de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962 en Physiol. Plant 15, 473-497), 0,5 g/l de ácidos casamino (hidrosilato de caseina), 1 mg/l del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0,2 mg/l de cinetina, 0,1 mg/l de giberelina, glucosa 0,2 M, sucrosa 0,2 M y acetosiringona 0,1 mM.
Si no, las suspensiones de Agrobacterium para la transformación de material vegetal se preparan de una manera similar a la descrita en el documento WO 98/32326. Se extraen de las placas asas de 3x5 mm de Agrobacterium, se traspasan y se colocan en suspensión en 5 ml del medio básico PHI-A estéril tal como se describe en el Ejemplo 4 en la página 26 del documento WO 98/32326 o, si no, se colocan en suspensión en 5 ml del medio combinado PHI-I estéril también descrito en el Ejemplo 4 en la página 26 del documento WO 98/32326. En otro caso también se añade 5 ml de 3'-5'-Dimetoxi-4'hidroxiacetofenona 100 mM. El medio básico PHI-A a pH 5,2 comprende 4 g/l de sales básicas CHU(N6) (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 68,5 g/l de sucrosa y 68,5 g/l de glucosa. El medio combinado PHI-I, también ajustado a pH 5,2 con KOH y esterilizado con filtro, comprende 4,3 g/l de sales de MS (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/l de mioinositol, 1 g/l de ácidos casamino de ensayo de vitamina (Difco), 1,5 mg/ml de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 68,5 g/l de sucrosa y 36 g/l de glucosa.
Si no, las suspensiones de Agrobacterium para la transformación de material vegetal se preparan de una manera similar a la descrita por Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology, 14, 745-750. Se extraen de las placas asas de 3x5 mm de Agrobacterium, se traspasan y se colocan en suspensión en 5 ml de medio LS-inf. El medio LS-inf (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) ajustado a pH 5,2 con KOH contiene sales inorgánicas mayores y menores de LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/ml de mioinositol, 1 g/l de ácidos casamino de ensayo de vitamina (Difco), 1,5 mg/ml de 2,4-D, 68,5 g/l de sucrosa y 36 g/l de glucosa.
Se produzca como se produzca, la suspensión de Agrobacterium se agita en vortex para preparar una suspensión regular y la población celular se ajusta a entre 0,5x10^{9} y 2x10^{9} ufc/ml (preferiblemente la más baja). 1x10^{9} ufc/ml corresponde a una DO(1 cm) de aproximadamente 0,72 a 550 nm.
Las suspensiones de Agrobacterium se colocan en alícuotas en lotes de 1 ml en tubos de microcentrífuga de 2 ml estériles y se usan tan pronto como sea posible.
Líneas de maíz para la transformación
Las líneas de maíz adecuadas para la transformación incluyen pero no se limitan a: A188, F1 P3732, F1(A188 x B73Ht), F1(B73Ht x A188), F1(A188 x BMS). Las variedades de A188, BMS (del Inglés "Black Mexican Sweet") y B73 Ht se obtienen del "Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries", el cual es muy conocido por los expertos en la técnica. La P3732 se obtiene de "IWATA RAKUNOU KYODOKUMIAI". Las líneas de maíz adecuadas también incluyen una diversidad de A188 x cruces consanguíneos (por ejemplo, PHJ90 x A188, PHN46 x A188, PHPP8 x A188 en la Tabla 8 del documento WO 98/32326) así como consanguíneos exclusivos de grupos heteróticos diferentes (por ejemplo, PHN46, PHP28 y PHJ90 en la Tabla 9 del documento WO 98/32326).
Por ejemplo, los embriones inmaduros se producen del maíz "Hi-II", el "Hi-II" es un híbrido entre consanguíneos (A188 x B73) generado por cruces recíprocos entre el parental A de Hi-II y el parental B de Hi-II disponible del "Maize Genetic Cooperation Stock Center", Universidad de Illinois en Champaign, Urbana, Illinois). Las semillas, denominadas semillas "Hi-II", obtenidas de estos cruces se plantan en un invernadero o en el campo. Las plantas Hi-II resultantes se autopolinizan o se polinizan de manera cruzada con plantas hermanas.
Preparación de embriones inmaduros, infección y cocultivo
La transformación de embriones inmaduros de maíz se lleva a cabo poniendo en contacto los embriones inmaduros con las cepas recombinantes adecuadas de Agrobacterium anteriormente descritas. Un embrión inmaduro quiere decir el embrión de una semilla inmadura que está en la fase de maduración después de la polinización. Los embriones inmaduros son un tejido intacto que es capaz de la división celular para dar origen a células callo que, a continuación, se pueden diferenciar para producir los tejidos y órganos de una planta completa. El material preferido para la transformación también incluye escutelos de embriones los cuales también son capaces de inducir callos desdiferenciados con la capacidad de regenerar plantas fértiles normales que inicialmente han sido transformadas. Por tanto, el material preferido para la transformación también incluye callo derivado de tales escutelos o embriones cigóticos inmaduros y desdiferenciados.
Los embriones de maíz inmaduros se aíslan de manera aséptica de espigas en desarrollo tal como se ha descrito por Green y Phillips (1976, Crop. Sci. 15:417-421) o, si no, mediante los métodos de Neuffer et al. (1982, "Growing Maize for genetic purposes" en Maize for biological research, W.F. Sheridan ed., University Press, Universidad de Dakota del Norte, Grand Forks, Dakota del Norte, USA). Por ejemplo, se aíslan de manera aséptica embriones de maíz inmaduros entre 1-2 mm (preferiblemente 1-1,2 mm) de longitud de espigas hembra en 9-12 (preferiblemente 11) días después de la polinización usando una espátula estéril. Generalmente las espigas se esterilizan en superficie con hipoclorito de sodio al 2,63% durante 20 minutos antes de lavar con agua desionizada estéril y la extracción aséptica de los embriones inmaduros. Los embriones inmaduros (preferiblemente en numero de aproximadamente 100) se echan gota a gota directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene aproximadamente 2 ml del mismo medio que el usado para preparar la suspensión de Agrobacterium (cuyas alternativas se han descrito anteriormente). Se cierra la tapa del tubo y los contenidos se mezclan mediante agitación en vortex durante unos pocos segundos. El medio se decanta fuera, se añade 2 ml de medio fresco y se repite la agitación en vortex. Se vacía todo el medio para dejar los embriones inmaduros lavados en el fondo del tubo.
Al tener preparados los embriones de maíz inmaduros la próxima fase del proceso, la etapa de infección, es ponerlos en contacto con la cepa transformada de Agrobacterium.
En un ejemplo de este proceso, la etapa de infección tiene lugar en un medio líquido que incluye las sales inorgánicas mayores y las vitaminas del medio N6 (1987, Chu C.C. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking. pp 43-50) tal como se describe en el Ejemplo 4 del documento WO 98/32326. Se añade 1,0 ml de suspensión de Agrobacterium, preparada tal como se ha descrito anteriormente en el medio PHI-A, a los embriones en el tubo de microcentrífuga y se agita en vortex durante aproximadamente 30 segundos. Si no, se añade 1,0 ml de suspensión de Agro- bacterium preparada, también tal como se ha descrito anteriormente, en o bien el medio PHI-I o en el medio LS-inf.
Después de dejar reposar durante 5 minutos la suspensión de Agrobacterium y embriones se suelta en una placa Petri que contiene o bien 1)medio PHI-B o 2)medio PHI-J o 3)medio LS-AS de acuerdo si la suspensión original de Agrobacterium ha sido preparada en medio PHI-A, medio PHI-I o medio LS-inf, respectivamente. Se vacía la suspensión de Agrobacterium usando una pipeta Pasteur, los embriones se manipulan para que se sitúen en el lado descendente del eje sobre el medio, la placa se sella con parafilm y se incuba en oscuridad a 23-25ºC durante 3 días de cocultivo. El medio PHI-B a pH 5,8 comprende 4 g/l de sales básicas de CHU(N6) (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/ml de tiamina HCl, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 0,85 mg/l de nitrato de plata, 30 g/l de sucrosa, acetosiringona 100 \muM y 3 g/l de gelrite (Sigma). El medio PHI-J, ajustado también a pH 5,8 comprende 4,3 g/l de sales de MS (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/l de mioinositol, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 20 g/l de sucrosa, 10 g/l de glucosa, 0,5 g/l de MES (Sigma), acetosiringona 100 mM y 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049). El medio LS-AS (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) ajustado a pH 5,8 con KOH contiene sales inorgánicas mayores y menores de LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 700 mg/l de L-prolina, 100 mg/l de mioinositol, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 20 g/l de sucrosa, 10 g/l de glucosa, 0,5 g/l de MES, acetosiringona 100 mM y 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049).
Después de la preparación de los embriones inmaduros, tal como se ha descrito anteriormente, un método alternativo para alcanzar la transformación es infectarlos durante y después de un periodo de desdiferenciación tal como se describe en el documento US 5591616. Los embriones inmaduros se colocan en un medio sólido LSD 1,5 que contiene sales inorgánicas de LS y vitaminas junto con 100 mg/ml de ácidos casamino, 700 mg/l de L-prolina, 100 mg/l de mioinositol, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 20 g/l de sucrosa y 2,3 g/l de gelrite. Después de 3 semanas a 25ºC, se recogen los callos originados a partir de los escutelos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y se sumergen en 1 ml de una suspensión de Agrobacterium preparada, tal como se ha descrito anteriormente, en medio AA. Después de dejar reposar durante 5 minutos, se traspasan los callos resultantes a un medio sólido 2N6 que contiene acetosiringona 100 mM y se incuban en oscuridad a 25ºC durante un periodo de 3 días de cocultivo. El medio sólido 2N6 comprende las sales inorgánicas y las vitaminas del medio N6 (Chu C.C., 1978; Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, pp 43-50) que contiene 1 g/l de ácidos casamino, 2 mg/l de 2,4-D, 30 g/l de sucrosa y 2 g/l de gelrite.
"Reposo y selección de los transformantes"
Después del cocultivo, los embriones, opcionalmente, se traspasan a una placa que contiene medio PHI-C, se sella con parafilm y se incuba en oscuridad durante 3 días para una "etapa de reposo" antes de la selección. El medio PHI-C a pH 5,8 comprende 4 g/l de sales básicas de CHU(N6)(Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/l de tiamina HCl, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 0,85 mg/l de nitrato de plata, 30 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de MES, 100 mg/l de carbenicilina y 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049). Tal como se describe en el documento WO 98/32326, la conveniencia de incluir esta etapa de reposo en el proceso de transformación total varía de acuerdo con la línea de maíz y es cuestión de experimentar.
Para la etapa de selección, se traspasan aproximadamente 20 embriones a cada una de un número de placas frescas que contienen medio de selección PHI-D o medio de selección LSD 1,5, se sellan con parafilm y se incuban en oscuridad a 28ºC. El medio de selección PHI-D, ajustado a pH 5,8 con KOH, comprende 4 g/l de sales básicas de CHU(N6) (Sigma C-1416), 1,0 ml/l de mezcla de vitamina de Eriksson (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/ml de tiamina HCl, 1,5 mg/l de 2,4-D, 0,69 g/l de L-prolina, 0,85 mg/l de nitrato de plata, 30 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de MES, 100 mg/l de carbenicilina, 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049) y entre 0,1 mM y 20 mM de N-(Fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido (Sigma P-9556). El medio de selección LSD 1,5, ajustado a pH 5,8 con KOH, comprende sales inorgánicas mayores y menores de LSD (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 700 mg/l de L-prolina, 100 mg/l de mioinositol, 1,5 mg/ml de 2,4-D, 20 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de MES, 250 mg/l de cefotaxima, 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049) y entre 0,1 mM y 20 mM de N-(Fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido(Sigma P-9556).
Si no, en el caso de que el material de partida para la selección sean callos derivados de embriones inmaduros tal como se describe en el documento WO 5591616, entonces, tales callos se lavan con agua esterilizada que contiene 250 mg/l de cefotaxima antes de cultivar en el medio de selección LDS 1,5.
Los embriones o las agregaciones de células que proliferan a partir de los embriones inmaduros se traspasan (si es necesario usando un escalpelo estéril) a placas que contienen medio de selección fresco en intervalos de 2 veces a la semana durante un periodo total de aproximadamente 2 meses. A continuación, se aumentan los callos resistentes a herbicidas mediante un crecimiento continuado en el mismo medio hasta que el diámetro del callo seleccionado exceda aproximadamente 1,5 cm.
Se elige la concentración de N-(Fosfonometil)glicina en el medio de selección apropiadamente para seleccionar un número conveniente de transformantes genuinos y preferiblemente está dentro del intervalo de 0,3-5 mM. Preferiblemente la concentración de N-(Fosfonometil)glicina usada en el medio de selección es aproximadamente de 1 mM para las dos primeras semanas de selección y de aproximadamente 3 mM más adelante.
Regeneración de transformantes/propagación y análisis de material vegetal transformado
Los callos seleccionados se regeneran en plantas fértiles normales de acuerdo, por ejemplo, con los métodos descritos por Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332) por Kamo et al. (1985, Bot. Gaz. 146(3), 327-334) y/o por West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1.361-1.369) y/o por Shillito et al. (1989) Bio/Technol. 7, 581-587.
Por ejemplo, los callos seleccionados de 1,5-2 cm de diámetro se traspasan a un medio de regeneración/maduración y se incuban en oscuridad durante aproximadamente 1-3 semanas para dejar madurar a los embriones somáticos. Un medio de regeneración adecuado, el medio PHI-E (WO 98/32326) está ajustado a pH 5,6 con KOH y comprende 4,3 g/l de sales de MS (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 0,1 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/l de mioinositol, 2 mg/l de glicina, 0,5 mg/l de ceatina, 1,0 mg/ml de ácido indolacético, ácido abscísico 0,1 mM, 100 mg/ml de carbenicilina, 60 g/l de sucrosa, 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049) y, opcionalmente, entre 0,02 mM y 1 mM de N-(Fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido (Sigma P-9556).
A continuación, los callos se traspasan a un medio de enraizamiento/regeneración y se cultivan a 25ºC o bien bajo un programa de 16 horas de luz diurna (270 mE m^{-2} s^{-1}) y 8 horas de oscuridad o bajo iluminación continua (aproximadamente 250 mE m^{-2} s^{-1}) hasta que se desarrollen brotes y raíces. Los medios de enraizamiento/regeneración adecuados son o bien el medio LSZ tal como se describe en el siguiente párrafo (opcionalmente sin contener fosfonometilglicina) o el medio PHI-F a pH 5,6 que comprende 4,3 g/l de sales de MS (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 0,1 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/l de mioinositol, 2 mg/l de glicina, 40 g/l de sucrosa y 1,5 g/l de gelrite.
Si no, los callos seleccionados se traspasan directamente al medio de regeneración LSZ ajustado a pH 5,8 con KOH y que comprende sales inorgánicas mayores y menores de LS (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 700 mg/l de L-prolina, 100 mg/l de mioinositol, 5 mg/ml de ceatina, 20 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de MES, 250 mg/l de cefotaxima, 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049) y, opcionalmente, se usa entre 0,02 mM y 1 mM de N-(Fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido (Sigma P-9556). Después de un periodo de incubación en oscuridad las placas se someten a iluminación (continua o luz/día tal como anteriormente) y se regeneran las plántulas.
Las plántulas pequeñas se traspasan a tubos de cristal individuales que contienen o bien medio PHI-F o medio LSF a media fuerza a pH 5,8 que comprende sales mayores de LS (Linsmaier y Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) a media fuerza, sales menores de LS, 0,5 mg/ml de ácido nicotínico, 0,5 mg/ml de piridoxina HCl, 1,0 mg/ml de tiamina HCl, 100 mg/l de mioinositol, 20 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de MES, 8 g/l de agar purificado (Sigma A-7049), y se cultivan durante aproximadamente otra semana. A continuación, las plántulas se traspasan a macetas de tierra, se estabilizan en una cámara de crecimiento (humedad relativa al 85%, 600 ppm de CO_{2} y 250 mE m^{-2} s^{-1}) y se cultivan hasta la madurez en una mezcla de tierra en un invernadero.
La primera generación (T0) de plantas obtenidas tal como anteriormente se auto fertiliza para obtener las semillas de la segunda generación (T1). Si no, (y preferiblemente), la primera generación de plantas se cruzan de manera recíproca con otra línea consanguínea de maíz no transgénica para obtener las semillas de la segunda generación. A continuación, se espera que la progenie de estos cruces (T1) se segregue 1:1 por el rasgo de resistencia a herbicida. Las semillas T1 se siembran, se cultivan en el invernadero o en el campo y se valora el nivel de resistencia, herencia de la resistencia y segregación de la resistencia al herbicida glifosato por toda esta y las siguientes generaciones mediante la observación de la supervivencia vegetal diferencial, la fertilidad y los síntomas de necrosis en el tejido después del tratamiento de pulverización con glifosato (formulado adecuadamente y, opcionalmente, como una sal) en un intervalo de índices entre 25 y 2.000 g/ha y en un intervalo de fases de crecimiento entre V2 y V8 inclusivas (o, si no, a 7-21 días después de la germinación). Estas valoraciones se realizan en relación a segregantes susceptibles y en relación a líneas similares y no transformadas de maíz las cuales no comprenden los genes de la presente invención o previos a secuencias capaces de conferir resistencia a glifosato. Las líneas transgénicas que presentan resistencia a glifosato se seleccionan y se auto cruzan o se retrocruzan de nuevo a un consanguíneo no
transgénico.
En todas las fases en las muestras de tejido del anterior proceso de callo transformado, plántulas, material vegetal T0 y T1 opcionalmente se toman y se analizan por 1) análisis tipo Southern y PCR para indicar la presencia, el número de copia y la integridad de los transgenes, 2) análisis tipo Northern (o similares) para medir la expresión de ARNm a partir de los transgenes, 3) análisis tipo Western cuantitativo de geles con SDS para medir los niveles de expresión de EPSPS y 4) la medida de los niveles de actividad enzimática de EPSPS en presencia y ausencia de glifosato para valorar más exactamente cuánto de la EPSPS que se expresa deriva del transgen.
Tales métodos de análisis son muy conocidos en la técnica. A continuación, en los Ejemplos 17-20 se describen a más detalle los métodos adecuados para ensayar la presencia, integridad y expresión del transgen mediante PCR, para llevar a cabo el análisis tipo Sourthern, para la clonación y expresión de la EPSPS de arroz maduro en E. coli, para la purificación de EPSPS de arroz, para la generación de anticuerpos policlonales a EPSPS de arroz purificada, para el análisis tipo Western de los niveles de EPSPS en callo y en los tejidos vegetales y para la medida de los niveles de actividad de EPSPS en extractos derivados de plantas a una concentración de glifosato que discrimina entre la EPSPS susceptible a glifosato endógena y el producto resistente a glifosato del transgen codificador de EPSPS.
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TABLA 2 Expresión de transgenes en callos que originan a partir de la transformación de embriones inmaduros de maíz A188 x B73 (Hi-II) con cepa de Agrobacterium LBA4404 que contiene un vector superbinario que lleva los casetes de expresión de EPSPS de vectores bluescript (pZEN 11, 12, 14 ó 15) dentro de los bordes del ADN-T
La tabla muestra los resultados del ensayo de la enzima EPSPS (+/- glifosato 100 \muM a PEP 100 \muM) basados en los ensayos enzimáticos de los extractos de callo establemente transformado de maíz capaz de regenerarse A188 x B73, transformado usando Agrobacterium que contiene un vector superbinario que lleva los casetes de expresión de EPSPS de los plásmidos Bluescript pZEN11, ZEN12, ZEN14 o ZEN15. Cada línea de callo representa un caso único el cual se ensaya por duplicado. Se calcula la relación entre la verdadera actividad enzimática tolerante (teniendo en cuenta aproximadamente una inhibición del 8%) expresada por el transgen y la actividad susceptible endógena (+glifosato inhibido al >98%). La EPSPS mutante se expresa relativamente de manera fuerte en algunas líneas, particularmente las líneas 5 y 12, en las que, teniendo en cuenta la Vmax reducida de la enzima tolerante relativa al w/t (del Inglés "Wild-type")(aproximadamente un tercio) se puede estimar que la enzima tolerante se expresa en 2-6x el nivel normal de la EPSPS endógena (este cálculo es complicado por el hecho de que, en algunos callos seleccionados, la expresión del transgen ocurre en colaboración con un aparente incremento de aproximadamente 2-2,5X en la expresión de fondo de la enzima endógena susceptible.
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Nº Línea Construcción Actividad Medida Actividad Total (nmol/min/ Relación de actividad
de Caso de ADN (nmol/min/mg) + glifosato mg) en ausencia de glifosato de EPSPS tolerante
100 \muM (verdadera actividad susceptible/verdadera
tolerante= medida x 1,08)
1 ZEN15 3,4 22,69 6:1
2,5 21,72
5 ZEN15 6,6 21,72 1,9:1
7,7 23,94
7 ZEN14 5,11 18,13 2,8:1
4,8 22,33
10 ZEN14 6,89 28,13 2,7:1
7,17 29,13
12 ZEN11 20,31 50,16 1,6:1
16,63 53,66
13 ZEN11 4,54 20,92 3:1
5,31 21,57
14 ZEN12 3,74 22,44 6:1
2,55 23,64
15 ZEN12 12,74 39,79 2:1
11,40 39,13
21 Control 0,0 11,85 -
0,1 12,29
22 Control -0,5 11,59 -
-0,02 11,97
Ejemplo 12 Transformación de líneas de maíz mediante bombardeo con partículas revestidas con ADN el cual incluye un casete de expresión de EPSPS; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato
En un ejemplo adicional, se inició el callo embriogénico friable derivado de embriones de maíz inmaduros en un medio sólido y se transformó de manera biolística. Similar al proceso descrito en el ejemplo 11, a continuación, se selecciona el callo transformado en base al índice de crecimiento diferencial en medio que contiene un intervalo de concentraciones de glifosato. Se selecciona el callo resistente y se regenera para proporcionar las plántulas T0 las cuales se traspasan a macetas, se cultivan hasta la madurez y se auto fertilizan o se fertilizan de manera cruzada en el invernadero. A continuación, las semillas progenie (T1) se cultivan para proporcionar más generaciones de plantas en las cuales se valora la resistencia a glifosato y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen tal como se ha descrito en el ejemplo 11.
Iniciación del callo a partir de embriones inmaduros
El callo Tipo II embriogénico friable adecuado para la transformación se deriva de los embriones inmaduros de, por ejemplo, maíz A188 x B73. También se puede usar un consanguíneo alternativo tal como las líneas híbridas y derivadas de B73 de maíz que incluyen, por ejemplo, las enumeradas en el ejemplo 11. Se aíslan de manera aséptica los embriones inmaduros de maíz de entre 1-2 mm de longitud a partir de espigas femeninas, generalmente, en aproximadamente 11 días después de la polinización usando los métodos indicados en el ejemplo 11.
Los embriones inmaduros se colocan en placa, por ejemplo, en un medio basado en N6 (Chu et al., 1975, Scientia Sinica, 18, 659-668) ajustado con KOH a pH 5,8 que contiene 1 mg/l de 2,4-D, 2,9 g/l de L-prolina, 2 mg/l de L-glicina, 100 mg/l de hidrolisato de caseina, sales mayores de N6, sales menores de N6, vitaminas de N6, 2,5 g/l de gelrite (ó 2 g/l de "Gelgro") y 20 g/l de sucrosa. Los medios adecuados alternativos incluyen, por ejemplo, un medio similar pero que contiene sales de MS (Murashige y Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497) en lugar de sales de N6. Si no, el medio puede contener aproximadamente 10 mg/l de dicamba en lugar de 2,4-D.
Los embriones inmaduros se incuban en oscuridad en el medio anterior a aproximadamente 25ºC para iniciar el callo. El material de callo Tipo II se selecciona mediante selección visual de las células embriogénicas friables de crecimiento rápido mediante métodos conocidos en la técnica y tal como se describen por ejemplo en el documento WO 98/44140. Por ejemplo, las células destinatarias adecuadas se seleccionan manualmente eligiendo las células preferidas las cuales pueden estar en la superficie de una agregación celular y ser más identificables por su falta de diferenciación, pequeño tamaño y alta relación de volumen de núcleo/citoplasma. Se inicia un cultivo en suspensión a partir de tejido dentro del callo que parece el menos diferenciado, el más suave y el más friable. El tejido con esta morfología se traspasa a placas frescas de medios aproximadamente 8-16 días después de la colocación en placa inicial de los embriones inmaduros. A continuación, el tejido se subcultiva de manera rutinaria cada 14-21 días recogiendo aproximadamente un 10% de los trozos que alcanzan aproximadamente un gramo. En cada etapa se subcultiva solamente el material con la morfología tipo II o tipo III deseada.
Preparación de cultivos celulares en suspensión
Preferiblemente en 6 meses de la iniciación de callo anteriormente descrita, se inician los cultivos en suspensión dispersa en medios líquidos que contienen hormonas adecuadas tales como 2,4-D y NAA suministradas opcionalmente en forma de tratamientos en cápsula de hormona de liberación lenta tal como se describe por ejemplo en los ejemplos 1 y 2 del documento US 5550318. Opcionalmente, los niveles hormonales dentro de los cultivos se mantienen añadiendo ocasionalmente un suplemento de hormona fresca. Los cultivos en suspensión se inician, por ejemplo, añadiendo aproximadamente 0,5 g de tejido de callo a un matraz de 100 ml que contiene 10 ml de medio de cultivo en suspensión. Cada 7 días, el cultivo se subcultiva más traspasando, mediante el uso de una pipeta de punta ancha estéril, 1 ml de células sedimentadas y 4 ml de medio condicionado a un matraz fresco que contiene medio fresco. Los agregados grandes de células incapaces de pasar por la punta de la pipeta se excluyen en cada etapa del subcultivo. Opcionalmente, los cultivos en suspensión se pasan por un tamiz adecuado (por ejemplo, aproximadamente 0,5-1,0 mm de malla) en cada etapa del subcultivo. Después de 6-12 semanas el cultivo llega a estar disperso. Los medios de cultivo celular en suspensión adecuados incluyen, por ejemplo, un medio ajustado a pH 6,0 que contiene sales mayores y menores de Murashige y Skoog (1962) (opcionalmente modificado para contener un nivel reducido, 1,55 g/l, de nitrato de amonio), 30 g/l de sucrosa, 0,25 mg/l de tiamina, 10 mg/l de dicamba, L-prolina 25 mM, 200 mg/l de hidrolisato de caseina, 100 mg/l de mioinositol, 500 mg/l de sulfato de potasio y 400 mg/l de hidrogen fosfato de potasio. Si no, en lugar de dicamba, el medio de suspensión celular contiene una 2,4-D y/o NAA.
Crioconservación de cultivos celulares en suspensión
Opcionalmente, los cultivos en suspensión obtenidos tal como se ha descrito anteriormente, se crioconservan usando un crioconservante y los métodos descritos, por ejemplo, en el ejemplo 2 del documento US 5550318. La crioconservación implica añadir crioconservantes a temperatura de congelación a células enfriadas previamente, también a temperatura de congelación, de una manera gradual durante un periodo de una a dos horas. La mezcla se mantiene a temperatura de congelación y el volumen final de crioconservante es igual al volumen de suspensión celular. Las concentraciones finales de los crioconservantes son, por ejemplo, dimetilsulfóxido al 10%, polietilénglicol al 10% (6.000 Mw), L-prolina 0,23 M y glucosa 0,23 M. Después de un periodo de 30 minutos de calibración a temperatura de congelación la mezcla se divide en alícuotas de aproximadamente 0,5 ml, se traspasan a tubos de microcentrífuga de 2 ml, y se enfrían lentamente a un índice de 0,5ºC/min hasta una temperatura de -8ºC. Después de un periodo para nucleación de hielo, la muestra se enfría más lentamente hasta -35ºC y, a continuación, se sumerge en nitrógeno líquido. Cuando se requieren para su uso, las muestras congeladas se descongelan bañándolas primero en sus recipientes en agua a aproximadamente 40ºC durante 2 minutos y, a continuación, se dejan descongelar lentamente por completo. A continuación, se pipetea la mezcla de células y crioconservantes sobre un filtro depositado sobre una capa de células nodriza ("feeder") BMS a 25ºC. Una vez que el tejido descongelado comienza a crecer se traspasa de vuelta al medio de cultivo sólido y fresco y, una vez establecido (en 1 a 2 semanas) se traspasa más al medio de cultivo celular en suspensión. Una vez que se reestablece el crecimiento en el cultivo en suspensión líquido las células se usan para la transformación.
Transformación mediada por partícula
Se purifica el ADN derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene casetes de expresión de EPSPS Xma 1 (es decir, pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), se aumenta (por ejemplo, por cromatografía de intercambio aniónico o por aislamiento densitométrico en gradiente de CsCl_{2} del ADN plásmido de células de una cepa huésped de E. coli HisB-, Rec A- adecuada (por ejemplo, DH5\alpha:hisB-) después del crecimiento hasta la fase estacionaria en un medio 5xA mínimo (52,5 g de K_{2}HPO_{4}, 22,5 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de (NH_{4})2SO_{4} y 2,5 g por litro de citrato de sodio 2H_{2}O) y se proporciona como una disolución concentrada (preferiblemente aproximadamente 1 mg/ml) en agua estéril. El ADN se proporciona como un ADN plásmido circular o, si no, se limita con Xma 1 para proporcionar un fragmento lineal que contiene un casete de expresión de EPSPS y se usa después de la purificación mediante electroforesis en gel de agarosa y electroelución.
El aparato adecuado para el bombardeo es, por ejemplo, la pistola de Helio Biorad PDS1000. El plato se coloca 5-6 cm por debajo de la pantalla de parada usada para parar el macroproyectil de captón. La construcción de ADN se precipita sobre partículas de tungsteno u oro con un diámetro promedio de aproximadamente 1,0 \mum de una manera similar a la descrita por Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73. Por ejemplo, se mezclan 1,25 mg de partículas de tungsteno u oro (previamente lavadas en etanol a 65ºC durante 12 horas), en un orden sucesivo, con aproximadamente 20-30 mg de ADN, CaCl_{2} 1,1 M y espermidina 8,7 mM hasta un volumen final de aproximadamente 0,6 ml. La mezcla se agita en vortex durante 10 minutos a 0-4ºC, se somete a centrifugación de baja velocidad (aproximadamente 500 g) durante 5 minutos y la mayoría del sobrenadante se decanta para dejar las partículas de tungsteno en suspensión en un volumen final de aproximadamente 30 ml. Se pipetean alícuotas de 1-10 \mul sobre el macroproyectil de la pistola de partículas.
Los cultivos en suspensión derivados del callo tipo II y/o tipo III se mantienen en cultivo durante 3-5 meses (o, si no, se recuperan de la crioconservación), se subcultivan recién y, a continuación, se tamizan a través de una malla de acero inoxidable de aproximadamente 0,5-1,0 mm. A continuación, se pipetea un volumen celular empaquetado de aproximadamente 0,5 ml de células recuperadas del filtrado sobre filtros de papel de 5 cm y se seca al vacío antes de traspasarse a un plato petri que contiene una pila de tres filtros de papel de 7 cm humedecidos con el medio de cultivo en suspensión. Cada placa de células en suspensión se centra sobre la cubeta de placas de muestra, se retira la tapa del plato petri y se bombardea dos veces en un vacío de 94,55 Pa (28 pulgadas de mercurio). Las pantallas de 0,1 ó 1,0 mm se colocan aproximadamente 2,5 cm por debajo de la placa de parada para aliviar el daño al tejido bombardeado. Después del bombardeo se extraen las células vegetales del filtro, se resuspenden de nuevo en el medio de cultivo celular en suspensión y se cultivan durante 2-21 días. Si no, el callo bombardeado se traspasa, placa a placa, sobre una placa que contiene un medio sólido similar (por ejemplo que contiene 8 g/l de agar purificado) y se cultiva de manera similar a aproximadamente 25ºC en oscuridad.
Selección de transformantes
Después de la transformación, las células que crecen no seleccionadas en cultivo líquido o sólido se traspasan a filtros y se colocan cubriendo un medio sólido que contiene un intervalo (0,1-20 mM) de concentraciones de selección de N-(fosfonometil)glicina (Sigma) en gradiente de cultivo de tejido. Los medios de selección sólidos adecuados incluyen medios, ajustados a pH 5,8 ó 6,0 con KOH, que contienen o bien sales de MS o de N6 (tales como los descritos anteriormente para la iniciación de callo o, con adición adecuada de agar, los descritos anteriormente para el crecimiento de células en suspensión líquida) y N-(fosfonometil)glicina. Los medios de selección adecuados también incluyen, por ejemplo, los medios de selección descritos en el ejemplo 11 pero, en este caso, modificados para carecer de antibióticos. Los callos transformados que expresan la enzima EPSP sintasa resistente se seleccionan en base a su crecimiento a concentraciones inhibitorias para preparaciones similares de células no transformadas. Los grupos que crecen se subcultivan en medio selectivo fresco. Preferiblemente la concentración de N-(Fosfonometil)glicina usada en el medio de selección es aproximadamente 1 mM durante las dos primeras semanas de selección y aproximadamente 3 mM más adelante. Después de 6-18 semanas se identifican y se seleccionan los supuestos callos resistentes.
Regeneración de transformantes/Propagación y Análisis de material vegetal transformado
Los callos seleccionados se regeneran en plantas fértiles normales de acuerdo con, por ejemplo, los métodos descritos por Duncan et al. (1985, Planta, 165, 322-332) por Kamo et al. (1985, Bot. Gaz. 146(3), 327-334) y/o por West et al. (1993, The Plant Cell, 5, 1.361-1.369) y/o por Shillito et al. (1989) Bio/Technol. 7, 581-587.
Por ejemplo, se regeneran eficazmente las plantas traspasando el callo embriogénico a un medio de Murashige y Skoog ajustado a pH 6,0 que contiene 0,25 mg/l de 2,4-D, 10 mg/l de 6-bencilaminopurina y, opcionalmente, N-(fosfonometil)glicina de 0,02 a 1 mM. Después de aproximadamente 2 semanas el tejido se traspasa a un medio similar pero que carece de hormonas. Opcionalmente se disminuye gradualmente el nivel de hormona a través de más traspasos y durante un periodo de tiempo más largo hasta 6-8 semanas. Los brotes que se desarrollan después de 2-4 semanas se traspasan a un medio MS que contiene sucrosa al 1% y se solidifica con 2 g/l de Gelgro en el cual a continuación enraízan.
Si no, los métodos y los medios usados para la regeneración son como en el ejemplo 1 excepto que los medios usados no contienen antibióticos.
Los métodos para el cultivo de las plantas hasta la madurez, para la propagación adicional de las plantas a través de generaciones, para el análisis de la herencia de la resistencia a glifosato y para el análisis de la presencia, integridad y expresión del transgen EPSPS son tal como los descritos en el ejemplo 11.
Ejemplo 13 Transformación de las líneas de maíz con ADN el cual incluye un casete de expresión de EPSPS revestido sobre pelos de carburo de silicio; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato
En un ejemplo adicional, las líneas de maíz que incluyen, por ejemplo, líneas híbridas que tienen el genotipo A188 x B73 se preparan como suspensiones celulares y se transforman poniendo en contacto las células con pelos de carburo de silicio revestidos con ADN usando métodos esencialmente como los descritos por Frame et al. (1994, Plant J. 6, 941-948). Tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores, se selecciona el callo transformado regenerado así en base al índice de crecimiento diferencial en el medio que contiene un intervalo de concentraciones de glifosato, se regenera en plántulas (T0) las cuales se cultivan hasta la madurez y o bien se auto fertilizan o se fertilizan por cruce para proporcionar semilla progenie (T1) para sembrar más. Se valora la resistencia a glifosato de las plantas y el material vegetal y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores.
Iniciación de callo a partir de embriones inmaduros, preparación de cultivos celulares en suspensión
Las suspensiones celulares de maíz para la transformación se crioconservan opcionalmente y se proporcionan de la misma manera que la descrita en el ejemplo 12.
Transformación
Se purifica el ADN derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene casetes de expresión de EPSPS Xma l (es decir, pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), se aumenta (por ejemplo, por cromatografía de intercambio aniónico o aislamiento densitométrico en gradiente de CsCl_{2} del ADN plásmido de las células de una cepa huésped de E. coli HisB-, Rec A- adecuada (por ejemplo, DH5\alpha:hisB-) después del crecimiento hasta la fase estacionaria en un medio 5xA mínimo (52,5 g de K_{2}HPO_{4}, 22,5 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de (NH_{4})2SO_{4} y 2,5 g por litro de citrato de sodio 2H_{2}O) y se proporciona como una disolución concentrada (preferiblemente aproximadamente 1 mg/ml) en agua estéril. El ADN se proporciona como un ADN plásmido circular o, si no, se limita con Xma 1 para proporcionar un fragmento lineal que contiene un casete de expresión de EPSPS y se usa después de la purificación mediante electroforesis en gel de agarosa y electroelución.
La transformación se lleva a cabo exactamente tal como la descrita por Frame et al. 1994. Si no, se modifica algo el procedimiento tal como se ha descrito anteriormente.
Las células cultivadas en cultivo líquido en medio de suspensión celular un día después del subcultivo se dejan sedimentar en un matraz de agitación. El medio gastado se decanta y se vacía y se añade 12 ml de medio N6 a pH 6,0 (Chu et al., 1975) modificado para contener L-prolina 6 mM, 20 g/l de sucrosa, 2 mg/l de 2,4-D, sorbitol 0,25 M y manitol 0,25 M por 4 ml de volumen celular empaquetado. El matraz se devuelve al agitador (agitado por rotación a 125 rpm e incubado a 26-28ºC) durante 45 minutos. Al final de este periodo se extraen alícuotas de 1 ml de suspensión celular, usando una pipeta de punta ancha, en una serie de tubos de microcentrífuga estériles. Después de dejar sedimentar las células en cada tubo, a continuación, se extrae 0,6 ml del sobrenadante del medio gastado para dejar la mayoría del contenido restante como células sedimentadas. Se coloca en suspensión 50 mg de pelos de carburo de silicio (pelos Silar SC-9, Advanced Composite Materials Corp., Greer, SC. USA) agitando en vortex en 1 ml del medio N6 modificado anteriormente descrito. A continuación, se añaden 40 ml de estos pelos en suspensión y 25 mg del ADN plásmido o lineal que incluye el casete de expresión de EPSPS a cada tubo de células sedimentadas. Los tubos se agitan en vortex a dedo 2-3 veces, se mezcla (en un mezclador de amalgama dental Mixomat (Degussa, Ontario, Canadá)) durante 1 segundo y, a continuación, se añade 0,3 ml de medio N6 (modificado tal como se ha descrito anteriormente) a cada tubo de microcentrífuga. A continuación, las células en suspensión se colocan en placas (200 \mul/placa) sobre un disco de filtro que cubre el medio N6 sólido (igual que el medio N6 modificado descrito anteriormente pero careciendo de sorbitol, careciendo de manitol y conteniendo 30 g/l de sucrosa y 3 g/l de gelrite). A continuación, se envuelve cada placa con tapa de Urgopore (Stelrico, Bruselas) y se deja incubar en oscuridad durante 1 semana a 26-28ºC.
Selección de transformantes
Se selecciona el callo transformado tal como se ha descrito en el ejemplo 12 o, si no, tal como se describe en Frame et al., 1994 excepto que la N-(fosfonometil)glicina se usa, en un intervalo de concentraciones entre 1 y 5 mM en lugar del bialaphos especificado en la publicación de Frame et al.
Regeneración de transformantes/propagación y análisis del material vegetal transformado
Las plantas se regeneran, se propagan y se siembran tal como se ha descrito en el ejemplo 12. Se analiza la resistencia a glifosato de las plantas y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen en el material vegetal tal como se ha descrito en el ejemplo 12.
Ejemplo 14 Transformación de líneas de arroz usando una cepa de Agrobacterium que contiene un vector superbinario el cual incluye un casete de expresión de EPSPS entre los bordes derecho e izquierdo del ADN-T; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato
En un ejemplo adicional, se aíslan los escutelos de las semillas maduras de las líneas adecuadas de arroz (incluyendo, por ejemplo, las variedades de Koshihikari, Tsukinohikari y Asanohikari) desdiferenciadas y el callo así obtenido transformado por infección con Agrobacterium. Después de la selección y regeneración, se obtienen plántulas transgénicas (T0) las cuales se cultivan hasta la madurez y o bien se auto fertilizan o se fertilizan de manera cruzada para proporcionar semilla progenie (T1) para sembrar más. Se valora la resistencia a glifosato de las plantas y el material vegetal y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Como alternativa a los métodos anteriormente descritos se usan los métodos descritos en el ejemplo 1 del documento US 5591616, adecuadamente adaptados para que se use glifosato en lugar de higromicina para la
selección.
Construcción de la cepa de Agrobacterium; Preparación de la suspensión de Agrobacterium
Se construye una cepa de Agrobacterium que contiene vector superbinario que tiene el casete de expresión de EPSPS deseado entre los bordes derecho e izquierdo (usando electroporación para transformar Agrobacterium con ADN plásmido) tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Se preparan las suspensiones de acuerdo con los métodos descritos en el ejemplo 1. Si no, la cepa transformada de Agrobacterium se cultiva durante 3 días en un medio AB (Chilton et al., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 3.672-3.676) que contiene una selección antibiótica apropiada (por ejemplo, 50 mg/l de espectinomicina en el caso de LBA4404(pSB1ZEN18, etc)) y se coge con asa de la placa para formar una suspensión en medio AAM (Hiei et al., 1994, The Plant Journal, 6(2), 271-282) a una densidad de 1-5x10^{9} células/ml.
Variedades cultivadas de arroz, preparación de callo y escutelos
Las variedades cultivadas de arroz son, por ejemplo Oryza sativa L. Tsukinohikari, Asanohikari y Koshihikari.
Se retira la cáscara de las semillas maduras, se esterilizan en superficie lavando en etanol al 70% y, a continuación, se ponen en remojo durante 30 minutos en NaOCl al 1,5%. Después de aclarar en agua estéril se cultivan a 30ºC, en oscuridad durante 3 semanas en medio 2N6 a pH 5,8 el cual contiene sales mayores, sales menores y vitaminas de medio N6 (Chu 1978 en Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking:Science Press, pp. 43-50), 30 g/l de sucrosa, 1 g/l de hidrolisato de caseina, 2 mg/l de 2,4-D y 2 g/l de gelrite. Se subcultiva el callo proliferado derivado de los escutelos de semilla durante 3-7 días en medio 2N6 fresco. Se selecciona el callo que crece (1-2 mm en diámetro), se coloca en suspensión en medio líquido 2N6 (sin gelrite) y se cultiva en matraces, en oscuridad en un agitador rotatorio a 125 rpm y a 25ºC. El medio se cambia cada 7 días. Las células que crecen en fase logarítmica después de 3-4 transformaciones se usan para la transformación.
Infección, transformación y selección
Las células de callo de arroz en suspensión se dejan sedimentar de la suspensión y, a continuación, se resuspenden en la suspensión de Agrobacterium, se dejan en contacto durante varios minutos y, a continuación, de nuevo, se sedimentan y, sin aclarar, se colocan en una placa en un medio 2N6-AS (medio 2N6 ajustado a pH 5,2 y conteniendo 10 g/l de D-glucosa y acetosiringona 100 mM) y se incuba en oscuridad a 25ºC durante 3-5 días. El material que crece se aclara completamente con 250 mg/l de cefotaxima en agua estéril y, a continuación, se traspasa a medio 2N6-CH (medio 2N6 ajustado a pH 5,8 con KOH conteniendo 250 mg/l de cefotaxima y N-(fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido 0,5-5 mM) o, si no, a medio 2N6-CH (medio 2N6 modificado tal como el descrito por Hiei et al., 1994, pero, en lugar de higromicina, conteniendo N-(fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido 0,5-5 M y se cultiva durante 3 semanas en oscuridad a 25ºC. Las colonias que proliferan se subcultivan en una segunda placa de medio selectivo durante un periodo adicional de 7-14 días.
Regeneración y análisis de plantas
Las colonias que crecen se colocan en placas en un medio de regeneración a pH 5,8 que contiene sales mayores de N6 a media fuerza, sales menores de N6, aminoácidos de N6, vitaminas de medio AA (Chilton et al., 1974), 1 g/l de hidrolisato de caseina, 20 g/l de sucrosa, 0,2 mg/l de ácido naftalenoacético, 1 mg/l de cinetina, 3 g/l de gelrite y, opcionalmente, N-(fosfonometil)glicina 0,04-0,1 mM. Estas placas se incuban a 25ºC y se mantienen bajo iluminación continua (aproximadamente 2.000 lux). Tal como se ha descrito en el ejemplo 11 finalmente las plantas regeneradas se traspasan a tierra en macetas y maduran en un invernadero.
Las plantas se propagan y se siembran (por ejemplo, las plantas transgénicas son endógamas) esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 11. Se analiza la resistencia a glifosato de las plantas y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen del material vegetal esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 11.
Ejemplo 15 Transformación de líneas de trigo con ADN el cual incluye un casete de expresión de EPSPS mediante el uso de bombardeo de microproyectiles; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato
En un ejemplo adicional, se aíslan embriones inmaduros de las líneas adecuadas de trigo (incluyendo, por ejemplo, trigo tipo Spring, cv BobWhite o Jaggar) se incuban en un medio que contiene hormona(2,4-D) durante 2 días y se transforman mediante bombardeo con partículas revestidas de ADN. Después de un periodo de recuperación y crecimiento continuado del callo, se subcultivan los embriones que generan callo a través de una serie de medios que contienen un nivel fijo de glifosato y niveles decrecientes (diluidos en serie) de 2,4-D de modo que se induce la embriogénesis somática. El material seleccionado se regenera para formar brotes sobre un medio que también contiene glifosato, se traspasa a un medio de enraizamiento y, tal como en los ejemplos anteriores relacionados con el maíz, se regenera en plántulas (T0) las cuales se cultivan hasta la madurez y o bien se autofertilizan o se fertilizan de manera cruzada para proporcionar semilla progenie (T1) para sembrar más. Se valora la resistencia a glifosato de las plantas y el material vegetal y se analiza la presencia, integridad y expresión del transgen tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Como alternativa a los métodos anteriormente descritos se usan los métodos descritos en el ejemplo 1 del documento US 5631152.
Preparación de los embriones inmaduros
Las líneas vegetales de trigo (por ejemplo el trigo tipo Spring Triticum aestivum cv BobWhite) se cultivan hasta la madurez en el invernadero y se aíslan las cariopsis a 11-15 postantesis. Las cariopsis se esterilizan en superficie mediante tratamiento durante 15 minutos en NaOCl al 5% y, a continuación, se lava repetidamente en agua estéril. Los embriones inmaduros se aíslan asépticamente sobre cuadrados de 3 cm de una red de nailon (1,5 mm de tamaño de malla) que cubre el medio A2. El medio A2 ajustado a pH 5,8 es 4,32 g/l de sales de Murashige y Skoog, 20 g/l de sucrosa, 0,5 g/l de L-glutamina, 2 mg/l de 2,4-D, 100 mg/l de hidrolisato de caseina, 2 mg/l de glicina, 100 mg/l de mioinositol, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,1 mg/l de tiamina HCl y 2,5 g/l de gelrite. Los embriones se disponen en un disco sólido de 2,5 cm, que comprende aproximadamente 50 en número. Las placas se sellan con tapa de leukopore y se incuban a 25ºC en oscuridad durante 2 días. Cuatro horas antes del bombardeo se traspasan los embriones a placas que contienen medio A2 fresco complementado con 36,44 g/l de D-sorbitol y 36,44 g/l de D-manitol. Los embriones se traspasan de placa a placa por medio de la red de nailon sobre la cual se sitúan. Los embriones se sitúan sobre este medio de fuerza osmótica incrementada durante 4 horas a 25ºC en oscuridad antes de ser bombardeados.
Transformación mediada por partícula
Se purifica el ADN derivado del plásmido pIGPD9 (Figura 12) que contiene casetes de expresión de EPSPS Xma 1 (es decir, pZEN9i, ZEN11i, ZEN12i, ZEN14i, etc.), se aumenta (por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico o aislamiento densitométrico en gradiente de CsCl_{2} del ADN plásmido a partir de células de una cepa huésped de E. coli de HisB-, Rec A- adecuada (por ejemplo, DH5\alpha:hisB-) después de crecimiento hasta la fase estacionaria en un medio 5xA mínimo (52,5 g de K_{2}HPO_{4}, 22,5 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de (NH_{4})2SO_{4} y 2,5 g por litro de citrato de sodio 2H_{2}O) y se proporciona como una disolución concentrada (preferiblemente aproximadamente 1 mg/ml) en agua estéril. El ADN se proporciona como un ADN plásmido circular o, si no, se limita con Xma 1 para proporcionar un fragmento lineal que contiene el casete de expresión de EPSPS y se usa después de la purificación mediante electroforesis en gel de agarosa y electroelución.
Las partículas se preparan y se revisten con ADN de una manera similar a la descrita por Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73. La preparación de las partículas revestidas por ADN y la operación de la pistola de partículas es tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Si no, los detalles son como sigue. Por ejemplo, se lavan repetidamente 60 mg de partículas de oro o tungsteno (aproximadamente 1,0 \mum) en un tubo de microcentrífuga en etanol en gradiente de HPLC y, a continuación, repetidamente, en agua estéril. Las partículas se resuspenden en 1 ml de agua estéril y se dispensan en alícuotas de 50 \mul en tubos de microcentrífuga. Las partículas de oro se almacenan a 4ºC, las partículas de tungsteno a -20ºC. Se añaden 3 mg de ADN a cada alícuota de partículas (descongeladas) y los tubos se agitan en vortex a alta velocidad. Mientras que se mantiene la agitación en vortex casi continua, se añade 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M y 20 \mul de espermidina 0,1 M. Después de 10 minutos de agitación adicional en vortex, las muestras se centrifugan durante 5 segundos en una microcentrífuga de eppendorf, se vacía el sobrenadante y las partículas se lavan en adiciones sucesivas de etanol en gradiente de HPLC. Las partículas se resuspenden completamente en 60 \mul de etanol y, a continuación, se dispensan en alícuotas de 10 \mul sobre la superficie de cada macroportador a usar en la pistola de partículas PDS1000.
Los componentes de la pistola de partículas PDS1000 se esterilizan en superficie mediante inmersión en etanol al 70% y se secan al aire. Las placas objetivo preparadas, tal como se ha descrito anteriormente, con aproximadamente 50 embriones dispuestos en un disco de aproximadamente 2,5 cm se colocan 6 cm desde la pantalla de parada. A continuación, se usan discos de ruptura de 7,58 Pa(1.100 psi) para el bombardeo. Cada placa se bombardea una o dos veces.
Las placas bombardeadas se sellan con tapa de poro y se mantienen a 25ºC en oscuridad durante aproximadamente 16 horas. Se recuperan los embriones sacados de la superficie del medio mediante la onda de choque de helio y se incuban también durante la noche en placas frescas del mismo medio A2 complementado con manitol y sorbitol. A continuación, los embriones bombardeados se traspasan a placas frescas de medio A2 y se incuban durante 1 semana a 25ºC en oscuridad antes de la selección.
Selección y Regeneración de Transformantes
Después de este periodo de recuperación los embriones que generan callo se extraen de las redes y se traspasan a un medio A2 2P (medio A2, ajustado a pH 5,8 conteniendo N-(fosfonometil)glicina 2 mM), a una densidad de 20 explantes/placa. Después de una semana en el medio A2 2P, los callos se trasladaron a medio A1 2P (medio A2 conteniendo solamente 1,0 mg/l de 2,4-D y N-(fosfonometil)glicina 2 mM) durante 2 semanas y desde allí a medio A0,5 2P (medio A2 conteniendo solamente 0,5 mg/l de 2,4-D y N-(fosfonometil)glicina 2 mM durante unas dos semanas más. Opcionalmente, los periodos de incubación de 2 semanas se reducen a 1 semana y/o se omite la etapa media de incubación en el medio A1 2P. Opcionalmente, la concentración de selección de N-(fosfonometil)glicina está entre 0,5 y 10 mM aunque se prefiere 2 mM. El tiempo total para este periodo de inducción de callo con niveles descendentes de 2,4-D en el medio es de 2-10 semanas, preferiblemente de 3-6 semanas y más preferiblemente aproximadamente de 4 semanas.
Para estimular el máximo crecimiento de brote y desalentar el desarrollo de raíz, a continuación, los callos se traspasan a medio Z. El medio Z es el medio A2 pero conteniendo 10 mg/l de ceatina en lugar de 2,4-D y conteniendo también N-(fosfonometil)glicina 0,1 mM. Opcionalmente la N-(fosfonometil)glicina está en el intervalo de 0,04-0,25 mM. Los callos de regeneración se mantienen en este medio durante un periodo de 3 semanas antes de subcultivar, momento en el que se extraen los brotes bien desarrollados. Puesto que es probable que solamente se produzca un caso en un único callo (el cual representa un embrión único), se traslada el callo entero a una placa fresca y se mantiene con el(los) brote(s) extraído(s) para asegurar que múltiples clones que parten del mismo callo no se cuenten como casos separados. Los callos con solamente brotes parcialmente desarrollados o sin sectores de regeneración se devuelven al medio Z durante unas 3 semanas adicionales. Al final de este periodo se desechan los callos de no regeneración.
Los brotes se mantienen en el medio Z hasta que hayan formado 4 o más hojas bien desarrolladas (extendiéndose a aproximadamente 2 cm en longitud). A continuación, el material vegetal de regeneración se traspasa cuidadosamente a tubos de plástico que contienen medio 0,5MS. El medio 0,5MS a pH 5,8 es 2,16 g/l de sales de Murashige y Skoog, 15 g/l de sucrosa, 2,5 g de carbón vegetal activado, 2,5 g/l de gelrite, 1 mg/l de glicina, 50 mg/l de mioinositol, 0,25 mg/l de ácido nicotínico, 0,25 mg/l de piridoxina HCl, 0,05 mg/l de tiamina HCl y N-(fosfonometil)glicina 0,1 mM (opcionalmente 0,0-0,25 mM).
Una vez que las plantas han enraizado se pueden poner en macetas y separar, o se trasladan a tubos de hervir de cristal individuales que contienen 0,5MS (sin N-(fosfonometil)glicina) y 2,5 g/l de carbono vegetal. Es preferido tener carbono vegetal presente en el medio de enraizamiento para adsorber cualquier PGRs restante o la selección química transferida con la plántula, y crear un ambiente de enraizamiento oscuro mediante el cual se evita los brotes verdes fisiológicamente aberrantes.
La inducción de callo y la primera semana de regeneración ocurre a 25ºC en oscuridad. La segunda semana de regeneración ocurre a baja luz a 25ºC, a continuación las siguientes semanas a aproximadamente 2.500 lux en un fotoperiodo de 16 horas.
Propagación, siembra y análisis del material vegetal transformado
Los métodos de producción de T1 y más progenie son muy conocidos en la técnica y esencialmente son tal como se han descrito en los ejemplos anteriores. Los métodos para el análisis de la herencia de la resistencia a glifosato y la presencia, integridad y expresión de los transgenes son tal como en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 16 Transformación de líneas de trigo con ADN el cual incluye un casete de expresión de EPSPS mediante electroporación de protoplastos; selección y regeneración de células vegetales y plantas que son resistentes a glifosato
En un ejemplo adicional, se usa ADN plásmido o lineal que comprende un casete de expresión de EPSPS e idéntico al usado en los ejemplos 12, 13 y 15 para la transformación directa de protoplastos de una línea de trigo capaz de la regeneración en plantas fértiles (cf documento US 5231019). Se preparan protoplastos aislados de trigo, preferiblemente de células o tejido foliar en cultivo (cf Gamborg, O.L. y Wetter, L.R., Plant Tissue Culture Methods, 1975, 11-12) a aproximadamente ca 2x10^{6} protoplastos/ml en manitol 0,4 M a pH 5,8. Primero se añade a esta suspensión 0,5 ml de polietilénglicol (PEG) al 40 % p/v de 6.000 de peso molecular en medio F modificado (Nature (1982), 296, 72-74) a pH 5,8 y, segundo, 65 ml de agua que contiene 15 mg del ADN plásmido o lineal deseado y 50 mg de ADN de timo de ternera. La mezcla se incuba junta durante 30 minutos a 26ºC, ocasionalmente se agita y posteriormente se diluye en medio F (Nature (1982), 296, 72-74). Los protoplastos se aíslan mediante centrifugación a baja velocidad, se recogen en 4 ml de medio de cultivo CC (Potrykus, Harms, Lorz, (1979), Theor. Appl. Genet., 54, 209-214) y se incuba en oscuridad a 24ºC.
Si no, y además del tratamiento con PEG, la transformación de los protoplastos de cereal se lleva a cabo usando etapas adicionales de choque de calor y/o electroporación (Neumann, E. et al. (1982), the EMBO J., 7, 841-845). Por tanto, por ejemplo, los protoplastos de trigo se incuban en una disolución acuosa de ADN y manitol, se calienta hasta 45ºC durante 5 minutos y, a continuación, se enfría hasta 0ºC durante un periodo de 10 segundos. A continuación, se añade el polietilénglicol (Mr 3K-8K) hasta que la concentración final es aproximadamente de 8% p/v. Después de mezclar suave pero a fondo el tratamiento se lleva a cabo en un electroporador. La cámara de un "Porator" de Dialog (Dialog, Dusseldorf, Alemania) se esteriliza lavando con etanol al 70% y, a continuación, se seca en aire estéril. Las suspensiones de protoplastos (aproximadamente ca 2x10^{6} protoplastos/ml en manitol 0,4M + el ADN) se ajustan con cloruro de manganeso para una resistencia eléctrica medida de aproximadamente 1,4 kohm. Muestras de aproximadamente 0,4 ml de volumen se someten, a intervalos de 10 segundos, a tres pulsos de voltajes aplicados de entre 1.000 y 2.000 V. A continuación, se recogen los protoplastos así transformados y se diluyen de nuevo en medio de cultivo CC.
Los expertos en la técnica reconocerán que son posibles muchas permutaciones y variaciones de estos procedimientos de transformación y que, por ejemplo, también se puede mejorar la transformación aclarando el pH hasta 9,5 y/o incrementando la concentración de iones calcio en la disolución en la cual se lleva a cabo la transformación.
Después de 3-14 días se traspasan alícuotas de los cultivos celulares en desarrollo a un medio que contiene concentraciones de selección alternativas de N-(fosfonometil)glicina en gradiente de cultivo de tejido (Sigma) entre 1 y 5 mM (preferiblemente 2 mM). Las colonias celulares resistentes identificadas así (mostrando crecimiento en concentraciones de glifosato de al menos 2 veces mayores que la tolerada mediante controles no transformados) se traspasan a medio de agar fresco que también contiene un intervalo de concentraciones de selección de glifosato y, tal como se ha descrito, en el ejemplo 15, se subcultivan entre placas que contienen concentraciones sucesivamente en disminución de 2,4-D. Se puede analizar (mediante PCR, etc.) la presencia del ADN recombinante en las colonias resistentes que crecen. Puede o no ser posible efectuar más selección en la etapa de callo. En cualquier caso todos los callos que crecen se llevarán hacia delante.
A continuación, los callos que crecen se traspasan a medio de regeneración de brote que contiene ceatina y N-(fosfonometil)glicina y desde allí a medio de enraizamiento exactamente tal como se ha descrito en el ejemplo 15. A continuación, se regeneran las plantas transgénicas fértiles que expresan EPSP sintasa resistente a glifosato, se seleccionan y se ensayan tal como se conoce en la técnica y tal como se ha descrito en el ejemplo 15 y usando los métodos analíticos descritos en el ejemplo 11.
Ejemplo 17 Método para ensayar la actividad de EPSPS y la determinación de constantes cinéticas. Método para ensayar las actividades de EPSPS en materiales vegetales en bruto y para distinguir la proporción del total que es resistente a glifosato Ensayo de la enzima EPSPS
Los ensayos se llevan a cabo generalmente de acuerdo con el método radioquímico de Padgette et al., 1987 (Archives of Biochemistry and Biophysics, 258(2), 564-573) con iones K+ como especies mayores de contraión catiónico. Los ensayos en un volumen total de 50 \mul, en Hepes(KOH) 50 mM pH 7,0 a 25ºC, contienen enzima purificada o extracto de planta (véase a continuación) diluida de manera apropiada en Hepes pH 7,0 conteniendo glicerol al 10%, y DTT 5 mM, ^{14}C PEP o bien como sustrato variable (para determinaciones cinéticas) o fija a 100 ó 250 \muM y siquimato-3-Fosfato (sal de K+) a 2 ó 0,75 mM tal como se indica. Opcionalmente, para ensayos de extractos de planta en bruto, los ensayos también contienen KF 5 mM y/o molibdato de amonio 0,1 mM. Los ensayos se inician con la adición de ^{14}C fosfoenolpiruvato (sal de ciclohexilamonio+) y se paran después de 2-10 minutos (es preferible 2 minutos) con la adición de 50 \mul de una disolución de 1 parte de ácido acético 1M y 9 partes de etanol. Después de parar, se carga 20 \mul en una columna synchropak AX100 (25 cm x 4,6 mm) y se somete a cromatografía usando una elución isocrática con una fase móvil a pH 6,5 de fosfato de potasio 0,28 M que fluye a 0,5 ml/min durante 35 minutos. Bajo estas condiciones los tiempos de retención para PEP y EPSP son aproximadamente 19 y 25 minutos respectivamente. Se conecta un contador de centelleo CP 525TR al extremo de la columna AX100. Se encaja con una célula de flujo de 0,5 ml, y el índice de flujo del centelleo (Ultima Flo AP) se sitúa en 1 ml/min. Se integran las áreas pico relativas de PEP y EPSP para determinar la conversión de porcentaje de PEP marcado a EPSP. Los valores de K_{m} y Vmax aparentes se determinan mediante los mínimos cuadrados fijos a una hipérbola con ponderación simple usando el Gráfico 3,09b de Erithacus Software Ltd. Los valores de Km generalmente se establecen usando 8-9 concentraciones de sustrato variable que oscila entre K_{m}/2-10 K_{m} y puntos triplicados. Excepto cuando específicamente se indique, los puntos de datos se incluyen solamente en el análisis cuando hay una conversión de sustrato a EPSP del <30%.
El siquimato-3-Pi (S3P) se prepara tal como sigue: se añade a 7 ml de TAPS 0,3 M pH 8,5 que contiene Siquimato 0,05 M, ATP 0,0665 M (sal de Na), KF 10 mM, DTT 5 mM y MgCl_{2} 6H_{2}O 0,05 M, 75 \mul de una disolución de 77 unidades (\mumol min^{-1})ml^{-1} de siquimato quinasa. Después de 24 horas a temperatura ambiente, se para la reacción mediante un breve calentamiento a 95ºC. Se diluye la disolución de reacción 50 veces en Tris HCl 0,01 M pH 9, y se somete a cromatografía por intercambio aniónico en Dowex 1X8-400, usando un gradiente de LiCl_{2} de 0-0,34 M. Se combinan las fracciones de S3P, se liofilizan y, a continuación, se disuelven de nuevo en 7 ml de H_{2}O destilada. A continuación, se añade 28 ml de Ba(CH_{3}COOH)_{2} 0,1 M y 189 ml de etanol puro. Esta disolución se deja remover durante la noche a 4ºC. Se recoge el precipitado resultante de S3P de tri-Bario y se lava en 30 ml de etanol al 67%. A continuación, se disuelve el precipitado lavado en aproximadamente 30 ml de H_{2}O destilada. Al añadir K_{2}SO_{4} se produce o bien la sal de TMA^{+} o k+ de S3P cuando haga falta. Se toma gran cuidado para añadir un exceso mínimo de sulfato. Se extrae el precipitado de BaSO_{4} y se liofiliza el sobrenadante que contiene la sal requerida de S3P. Se pesa cada sal y se analiza mediante la NMR de protón. Las preparaciones de S3P preparadas así son puras al >90% de acuerdo con el NMR de protón
y (de acuerdo con sus pesos e integración de 31P NMR) contienen solamente residuos bajos de sulfato de potasio.
Preparación de extractos de material vegetal adecuado para el ensayo de EPSPS
Se muele el material de callo o plántula (0,5-1,0 g) hasta un polvo congelado fino en un mortero enfriado de nitrógeno líquido y mortero de mano. Este polvo se coge en un volumen igual de un tampón de extracción enfriado adecuado (por ejemplo, el tampón Hepes/KOH 50 mM a pH 7,5 que contiene EDTA 1mM, DTT 3 mM, "pefabloc" 1,7 mM (inhibidor de la serin proteasa), leupeptina 1,5 mM, pepstatina A 1,5 mM, glicerol al 10% v/v y polivinilpirolidona al 1%), se resuspende, se mezcla y se centrífuga en una centrífuga enfriada para sedimentar los restos. El sobrenadante se somete a intercambio por una columna PD10 enfriada de Sephadex G25 en tampón Hepes/KOH 25 mM a pH 7,5 que contiene EDTA 1 mM, DTT 3 mM y glicerol al 10% v/v. La proteína se estima mediante el método Bradford estandarizado usando albúmina de suero bovina. Una porción del extracto se congela en nitrógeno líquido; inmediatamente se ensaya una porción.
Los ensayos de EPSPS de los extractos de planta se llevan a cabo de manera estándar, tal como se ha descrito anteriormente, con ^{14}C-PEP 0,1 mM y siquimato-3-Pi 0,75 mM o bien en ausencia o en presencia de N-(fosfonometil)glicina 0,1 mM. Bajo estas condiciones de ensayo, se estima que la forma resistente de EPSPS (véase más adelante) se inhibe mediante <8,5% mientras que la forma w/t sensible se inhibe esencialmente de manera completa (>98%). Por tanto, el nivel de actividad observada en presencia de glifosato (A) se toma que representa aproximadamente el 92% del nivel de enzima resistente derivada de la expresión del transgen mientras que el nivel de EPSPS w/t susceptible se toma que es el nivel total de la actividad de EPSPS observada en ausencia de glifosato menos el valor de A x aproximadamente 1,08. Debido a la Vmax de la enzima mutante se estima que solamente es aproximadamente un tercio de la Vmax de la enzima w/t (y debido a los valores de Km para PEP de tanto las formas w/t como mutantes se estima que son aproximadamente 20 \muM o menos), el nivel de expresión del polipéptido de la enzima mutante relativo al nivel de expresión de la EPSPS w/t endógena se toma que es aproximadamente tres veces mayor que la proporción calculada en base a la proporción de sus actividades observadas relativas. El nivel total de la expresión del polipéptido de EPSPS (mutante+w/t) también se estima usando análisis tipo Western (véase más adelante).
Ejemplo 18 Clonación y expresión del ADNc w/t y mutado que codifica EPSPS de arroz maduro en E. coli. Purificación y caracterización de EPSPS de arroz w/t y mutante Expresión, purificación y caracterización de EPSPS de arroz maduro w/t
Se amplifica el ADNc de EPSPS de arroz usando RT-PCR a partir de ARN aislado de la variedad Koshigari de arroz usando la transcriptasa inversa Superscript de BRL de acuerdo con la recomendación suministrada por el fabricante. La PCR se realiza usando la polimerasa turbo Pfu de Stratagen de acuerdo con los métodos suministrados por el fabricante. Los oligonucleótidos de a continuación se usan en la reacción de amplificación y las etapas de transcripción inversa.
SEC. ID. Nº 33
Oligo 3' de arroz
GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG
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SEC. ID. Nº 34
Oligo 5' de arroz
GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC
El producto de la PCR se clona en pCRBlunt II usando el kit "Zero Blunt TOPO" de Invitrogens. La secuencia del inserto se confirma por secuenciación y se verifica que la pauta de lectura abierta prevista corresponde a la de la proteína EPSPS de arroz cloroplástica madura prevista con la excepción de la presencia de un Met de iniciación. Se extrae la secuencia de EPSPS de arroz clonada y verificada usando Nde 1 y Xho 1 y se clona el fragmento purificado en pET24a (Novagen) digerido de manera similar. Se introducen los clones recombinantes en BL21(DE3), una cepa RP optimizada con codón de E. coli suministrada por Stratagene. La proteína EPSPS se expresa en esta cepa después de la adición de IPTG 1 mM al medio fermentador (LB complementado con Canamicina 100 \mug/ml). La proteína recombinante de la masa prevista correcta se identifica i) en base a la tinción con Coomassie de geles con SDS de los extractos celulares y a la comparación al lado de los geles teñidos con Coomassie de los extractos de células de E. coli similares transformadas con un vector pET24a vacío y ii) mediante análisis tipo Western usando un anticuerpo policlonal enfrentado a proteína EPSPS vegetal previamente purificada. Se purifica la proteína EPSPS de arroz maduro a aproximadamente 4ºC tal como sigue. Se lavan 25 g de peso húmedo de células en 50 ml de tampón Hepes/KOH 0,1 M a pH 7,5 que contiene DTT 5 mM, EDTA 2 mM y glicerol al 20% v/v. Después de centrifugación a baja velocidad, se resuspende el precipitado celular en 50 ml del mismo tampón pero conteniendo también 2 mM de "Pefabloc" un inhibidor de la serin proteasa. Las células se colocan en suspensión de manera uniforme usando un homogeneizador de cristal y, a continuación, se someten a disrupción a 68,9 Pa(10.000 psi) usando un disruptor celular Z Básico de "Constant Systems" (Budbrooke Rd, Warwick, R.U.). Se centrífuga el extracto en bruto a aproximadamente 30.000 g durante 1 hora y se desecha el precipitado. Se añade sulfato de protamina (salmina) a una concentración final de 0,2%, se mezcla y la disolución se deja reposar durante 30 minutos. El material precipitado se separa mediante centrifugación durante 30 minutos a aproximadamente 30.000 g. Se añade sulfato de amonio en gradiente Aristar a una concentración final de 40% de saturación, se agita durante 30 minutos y, a continuación, se centrífuga a aproximadamente 27.000 g durante 30 minutos. Se resuspende el precipitado en aproximadamente 10 ml del mismo tampón como el usado para la disrupción celular, se añade más sulfato de amonio para llevar la disolución a aproximadamente 70% de saturación, se agita la disolución durante 30 minutos y se centrífuga de nuevo para producir un precipitado el cual se resuspende en aproximadamente 15 ml de tampón S200 (Hepes/KOH 10 mM (pH 7,8) conteniendo DTT 1 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 20% v/v). Esto se filtra (0,45 micras), se carga y se somete a cromatografía en una columna K26/60 que contiene Superdex 200 calibrada con tampón S200. Las fracciones que contienen EPSPS detectadas en base a la actividad enzimática de EPSPS se combinan y se cargan en una columna xk16 que contiene 20 ml de HP Q-Sefarosa calibrada con tampón S200. La columna se lava con tampón S200 y, a continuación, se eluye la EPSPS dentro de un gradiente lineal desarrollado desde KCl 0,0 M a 0,2 M en el mismo tampón. La EPSPS eluye dentro de un pico único correspondiente a una concentración de sal de o por debajo de 0,1 M. Las fracciones que contienen EPSPS detectadas en base a la actividad enzimática de EPSPS se combinan y se cargan en una columna HiLoad xk26/60 de Superdex 75 calibrada con tampón Superdex 75 (Hepes/KOH 25 mM (pH 7,5) conteniendo DTT 2 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 10% v/v). La EPSPS eluye de la columna después de lo que se podría esperar en base al peso molecular del dímero supuesto. Esto se puede deber a la interacción de la proteína con la matriz del gel a baja fuerza iónica. Las fracciones que contienen EPSPS identificadas en base a la actividad enzimática se combinan y se cargan en una columna de 1 ml de MonoQ calibrada con lo mismo, tampón Superdex 75. La columna se lava con tampón de inicio y se eluye la EPSPS como un pico único durante el curso de un gradiente lineal de 15 ml desarrollado entre KCl 0,0 y 0,2 M. La EPSPS se obtiene casi (>90% pura) en esta fase en la purificación. Opcionalmente, la EPSPS se purifica más mediante intercambio en tampón Superdex 75 que contiene sulfato de amonio (Aristar) 1,0 M y que se carga en una columna de 10 ml de fenil sefarosa calibrada en el mismo tampón. La EPSPS se eluye como un pico único tempranamente durante el curso de un gradiente lineal de sulfato de amonio en descenso entre sulfato de amonio 1,0 M y 0,0 M.
Clonación, expresión, purificación y caracterización de EPSPS de arroz mutante resistente a glifosato
Se usa el ADNc de EPSPS de arroz en pCRBlunt como molde para dos PCR adicionales usando los siguientes pares de cebadores diseñados para introducir cambios específicos.
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SEC. ID. Nº 35
Oligo 5' de arroz
GCGCATATGAAGGCGGAGGAGATCGTGC
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SEC. ID. Nº 36
Inverso mutante de arroz a RV
GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC
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SEC. ID. Nº 37
Oligo 3' de arroz
GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG
SEC. ID. Nº 38
Directo mutante de arroz a sal
GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC
Los productos resultantes se purifican en gel y se colocan en un tubo en concentraciones equimolares para servir como molde para otra ronda de PCRs con los oligos 5' y 3' de arroz. Los productos resultantes se clonan en pCRBlunt II usando el Kit "Zero Blunt TOPO" de Invitrogens. Se confirma que la secuencia de ADN del inserto y su pauta de lectura abierta prevista corresponden a la de la proteína EPSPS de arroz cloroplástica madura prevista (con la excepción de la presencia de un Met de iniciación) y también que se codifican los cambios deseados (la mutación específica de T a I y P a S en las posiciones específicas en la secuencia de EPSPS). La secuencia de EPSPS de arroz así clonada y verificada se extrae usando Nde 1 y Xho 1 y el fragmento purificado se clona en pET24a (Novagen) digerido de manera similar. Los clones recombinantes se introducen en BL21(DE3), una cepa RP optimizada con codón de E. coli suministrada por Stratagene. La proteína EPSPS se expresa en esta cepa después de la adición de IPTG 1 mM al medio fermentador (LB complementado con 100 \mug/ml de Canamicina). La proteína recombinante de la masa prevista correcta se identifica: i) en base a la tinción con Coomassie de geles con SDS de los extractos celulares y a la comparación al lado de geles con SDS teñidos con Coomassie de los extractos de células de E. coli similar transformadas con un vector pET24a vacío e ii) mediante análisis tipo Western usando un anticuerpo policlonal enfrentado a proteína EPSPS vegetal previamente purificada. Esta forma mutante de EPSPS de arroz se purifica y se caracteriza de una manera similar al método anteriormente descrito para la EPSPS de arroz w/t.
La forma mutante así obtenida de EPSPS de arroz, ensayada tal como se ha descrito anteriormente en presencia de siquimato-3-Pi 2 mM, tiene una Vmax aparente de aproximadamente 10 \mumol/min/mg y un Km para PEP de 22 \muM. A PEP 40 \muM, el valor de IC50 para la sal de potasio de glifosato es aproximadamente 0,6 mM. El valor de Ki estimado para glifosato de potasio de la EPSPS mutante es aproximadamente 0,2 mM.
Ejemplo 19 Preparación de anticuerpos para EPSPS de arroz purificada y métodos para el análisis tipo Western
Se usan los métodos estándar para la generación de antisueros policlonales en conejos. Los conejos son hembras jóvenes del tipo "White" de Nueva Zelanda. Los cursos de inmunización consisten en 4 dosis, cada una de aproximadamente 100 mg, administradas a intervalos mensuales. Cada dosis se administra en disolución salina tamponada con fosfato como una emulsión con adyuvante Completo de Freund (dosis 1) o adyuvante Incompleto (dosis 2-4) y se inyecta en cuatro sitios subcutáneos. Se toma una muestra de sangre previa antes de que se administre la dosis 1. Se toma una muestra de sangre de ensayo 14 días después de la segunda dosis para confirmar la respuesta inmune. Se toma una muestra de sangre temporal 14 días después de la cuarta dosis y se usa para experimentación. Se administra una quinta y última dosis cuando ha transcurrido al menos 6 semanas desde la cuarta dosis, y se toma la muestra de sangre final (también usada para experimentación) 14 días después. Los anticuerpos se enfrentan a tanto (i) la EPSPS de arroz w/t maduro innata purificada (ejemplo 8) como también (ii) al polipéptido de EPSPS de arroz desnaturalizado en SDS el cual se eluye de una banda cortada de un gel con SDS al 12% (estando marcada con exactitud la posición correcta de la proteína mediante la tinción con Coomassie una al lado de otro de la
banda).
Se usan geles de poliacrilamida al 12% para la electroforesis en gel con SDS y la transferencia tipo Western. La electroforesis se realiza en una corriente constante de 100 V durante 90 minutos. Los geles se trasfieren frente a láminas de nitrocelulosa durante la noche a 4ºC a unos 30 V constantes. Las láminas se bloquean en disolución salina tamponada con fosfato con Marvel al 5% que contiene Tween al 0,1% (PBS-tween) durante 1 ó 2 horas, se lavan tres veces en PBS-tween y se incuban en anticuerpo primario de EPSPS-Rb1 a aproximadamente 1,3 mg de IgG/ml (normalmente equivalente a una dilución 1:4.000 a 1:20.000 de muestra de sangre temporal). Estas diluciones de anticuerpo se aplican en PBS (del Inglés "Phosphate-Buffered Saline")) que contiene Marvel al 1% y Tween 20 al 0,05% durante 2 horas. El anticuerpo secundario, "Goat anti Rabbit HRP" (Sigma A6154), se aplica a 1:10.000 ó 1:20.000 en PBS que contiene Tween al 0,05% y Marvel al 1%. Se continúa la incubación con anticuerpo secundario durante 1 hora, la lámina de transferencia se lava tres veces en PBS (tween al 0,05%), se aplica sustrato ECL durante normalmente 1 minuto y la película se expone durante 10-60 segundos. Las manchas control negativas son manchas con (1) suero preinmune a una dilución calculada para producir el mismo [IgG] que en los sueros inmunes de ensayo (IgG se purifica de manera rutinaria a partir de una alícuota de cada suero y se cuantifica para que estas diluciones se puedan calcular directamente) y también con (2) suero inmune enfrentado a adyuvante de Freund solo. La concentración de IgG en los sueros inmunes control se ajustan para que los controles estén en una concentración apropiada de IgG. Para realizar este cálculo, se purifica la IgG a partir de un antisuero en bruto mediante filtración por un filtro de jeringuilla de 0,45 \mum y se pasa por una columna G de proteína HiTrap de 1 ml(Pharmacia cat nº:17-0404-01). La IgG unida se eluye de la columna con glicina HCl 0,1 M pH 2,9 y se somete a diálisis frente a PBS durante la noche. Se estima la concentración de IgG mediante determinación de UV (una longitud de trayectoria de 1 cm de una disolución de 1 mg ml^{-1} de IgG pura tiene una absorbancia a 280 nm de longitud de onda de 1,35). A partir de la IgG producida se puede realizar un cálculo de la concentración de IgG en el antisuero en bruto y, por consiguiente, las diluciones correctas en las manchas calculadas del análisis tipo Western.
Las muestras de tejido vegetal se preparan por ejemplo tal como se ha descrito en el ejemplo 17. Si no, para el análisis tipo Western, se usa un procedimiento mucho más simple. Se homogeniza rápidamente 100-200 mg de tejido vegetal a analizar (por ejemplo, usando un "ultra turrax", "bead beater" un homogenizador de cristal) en un volumen igual de tampón (similar al ejemplo 7), se centrífuga durante 5 minutos en una microcentrífuga de eppendorf enfriada y el sobrenadante a) se analiza la proteína de una pequeña alícuota usando el método Brandford y b) la mayor parte se mezcla 1:1 con "tampón de muestra" de SDS de Laemli, se calienta y, a continuación, se almacena preparada para ser cargada en geles. Generalmente los geles en lámina con SDS se cargan con 10 muestras de proteína en 10 pocillos. Generalmente estas son de 1 a 10 \mug de extractos en bruto de material vegetal para el análisis al lado de una curva patrón de entre 0 y 20 ng de EPSPS de arroz pura. En algunos casos los análisis tipo Western corren usando anticuerpos enfrentados a EPSPS w/t purificada de Brassica napus (expresados y purificados usando métodos similares a los anteriormente descritos). En este caso la fuerza de la reacción de cruce de los anticuerpos es menos fuerte con la EPSPS de arroz (o con EPSPS de maíz o trigo de planta endógena) que en el caso de los anticuerpos enfrentados a EPSPS de arroz a usar pero incluso, no obstante, proporcionan reacción suficiente para la información cuantitativa útil en relación a la curva patrón a ser obtenible.
Ejemplo 20 Aislamiento de ADN genómico a partir de material vegetal transgénico. Análisis PCR. Preparación de la sonda de ADN e hibridación. Número de copia e integridad del transgen
Se aísla el ADN genómico a partir de material de callo, plántulas y plantas usando, por ejemplo, el método de Dellporta et al. (1983) en Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Standler Genetics Symposium. J.P. Gustafson y R. Appels, eds., Nueva York:Plenum Press pp. 263-282 o, si no, usando un kit DNAeasy (Qiagen). El callo transgénico y los segregados vegetales que contienen el transgen EPSPS de arroz mutado se identifican usando PCR de fluorescencia que usa los cebadores de oligonucleótido SEC. ID. Nº 39 y 40 que son específicos a las mutaciones dentro de la secuencia genómica de EPSPS de arroz. El tinte fluorescente verde SYBR, el cual se intercala con el ADN de doble hélice, se incluye en la PCR para que las muestras que contienen el gen EPSPS de arroz mutado se identifiquen mediante un incremento en la fluorescencia en la muestra, lo cual se detecta usando una máquina ABI 3377. Si no, los expertos en la técnica sabrán que los cebadores se pueden marcar de manera fluorescente y que están disponibles tecnologías tales como "beacons molecular" y "Scorpions".
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SEC. ID. Nº 39
RiceDMFwd 2-3A
5'- gtg gaa cgc tgg aat tgc aat gca at -3'
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SEC. ID. Nº 40
Inverso universal
5'- gtt gca ttt cca cca gca gca gt -3'
Una reacción PCR típica consiste en, preparada en placas ópticas de 96 pocillos y selladas con tapas ópticas (PE Biosystems), es tal como sigue:
5,0 \mul molde de ADNg, (preparado de DNeasy de Qiagen)
12,5 \mul de premezcla de 2x Verde SYBR
2,5 \mul 5 pmol/\mul Cebador directo Patrón
2,5 \mul 5 pmol/\mul Cebador inverso Patrón
2,5 \mul ddH2O
25,0 \mul Volumen total
Se siguen los siguientes parámetros cíclicos:
Fase 1: 50ºC x 2 minutos
Fase 2: 95ºC x 10 minutos
Fase 3: 50 ciclos de 95ºC x 15 segundos
60ºC x 45 segundos
Se anotan los cambios en la fluorescencia dentro de las muestras cada siete segundos a partir de la fase 3 de la reacción.
Para la transferencia tipo Southern se usa aproximadamente 10 \mug de ADN para cada digestión de restricción. Se digiere el ADN genómico con enzimas de restricción adecuadas (por ejemplo, Hind III) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (por ejemplo, Promega). Las enzimas de restricción se eligen que corten tanto dentro como fuera de la secuencia de EPSPS mutante. El ADN se separa usando geles de agarosa al 0,8% con TAE (trisacetato 0,04 M, EDTA 1 mM). La transferencia tipo Southern se lleva a cabo de acuerdo con los métodos administrados por Sambrook et al., 1989 usando membrana de transferencia de nitrocelulosa N+ HyBlond (AmershamPharmacia). El ADN se entrelaza a la membrana mediante exposición a iluminación UV.
Los fragmentos de ADN usados para generar sondas específicas se aíslan mediante purificación en geles de digestiones de restricción de ADN plásmido o se generan mediante PCR. Por ejemplo, se genera un fragmento de 700 pb que contiene el intrón 1 del gen EPSPS de arroz mediante PCR usando cebadores tales como los mostrados a continuación.
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SEC. ID. Nº 41
INT1/5
5' cccttcctcttgcgtgaattccatttc 3'
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SEC. ID. Nº 42
INT1/3
5' gttgtgcccctaataaccagag 3'
Tales sondas se marcan con ^{32}P usando el método de preparación al azar, por ejemplo, collar de marcación
de ADN "Ready-to-Go" (AmershamPharmacia) y se purifican usando, por ejemplo, columnas MicroSpin G-25
(AmershamPharmacia).
Las manchas de los geles de ADN se hibridan previamente a 65ºC en 5xSSC, SDS al 0,5%, 2x disolución de Denhardt, 0,15 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado durante al menos una hora. A continuación, se híbrida la mancha con sonda desnaturalizada durante 16-24 horas a 65ºC en disolución de prehibridación fresca. Las membranas se someten a transferencia en seco y se visualizan usando autoradiografía.
Si la transferencia tipo Southern indica un único caso de integración única del transgen en un locus único, acusado por la sonda de hibridación con solamente un único fragmento de restricción de tamaño específico, entonces el resultado se confirma por una rehibridación de mancha usando una sonda alternativa. Para controles, se usa material no transformado. Además la mancha se puede someter más a sondas con sondas de hibridación específicas a otras regiones de la construcción transgénica (por ejemplo, el promotor, el intrón 5'UTR o las secuencias de potenciador antes del extremo 5') para verificar la integridad de la construcción. Además, en el caso de que se use la transformación de Agrobacterium, se usan sondas específicas para indicar la presencia o ausencia de cualquier ADN que se extiende más allá del RB (del Inglés "Right Border") y LB (del Inglés "Left Border") del vector super-
binario.
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(Secuencia pasa a página siguiente)
\newpage
SEC. ID. Nº 43 secuencia genómica de EPSPS de arroz (a partir de ATG-secuencia WT)
1 
\newpage
SEC. ID. Nº 44 secuencia genómica de EPSPS de arroz (a partir de ATG incluyendo el doble mutante-mostrado)
2 
\newpage
SEC. ID. Nº 45 Potenciador de FMV
3
SEC. ID. Nº 46 Potenciador1 de CaMV35S
4
SEC. ID. Nº 47 Potenciador2 de CaMV35S
5
SEC. ID. Nº 48 Potenciador de Poliubiquitina de Maíz
6
SEC. ID. Nº 49 Potenciador de Actina de Arroz
7
8
SEC. ID. Nº 50 Potenciador de GOS2 de Arroz
9
SEC. ID. Nº 51 Potenciador de Plastocianina de Cebada
10
SEC. ID. Nº 52 Secuencia Genómica de EPSPS G1 de arroz (a partir de ATG)
11
12
SEC. ID. Nº 53 Secuencia Genómica de EPSPS G3 de Arroz (hasta ATG)
13
SEC. ID. Nº 54 Secuencia Genómica de EPSPS G2 de arroz+ intrón Adh1 de Maíz
14
SEC. ID. Nº 55 Intrón Adh1 de maíz
15
<110> Zeneca Limited
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<120> Plantas Resistentes a Herbicida
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<130> ppd50490
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<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 55
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> 9,15,21,27
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<223> a es Inosina
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcacargcag caagagaraa agccatagcc at 
\hfill
32 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<220>
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<221> base modificada
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<222> 18,24,27
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<223> a es Inosina
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcwggaacwg cmatgcgacc rytaacagc 
\hfill
29 
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<210> 3
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
atttcttctt cttcctccct tctccgcctc 
\hfill
30 
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<210> 4
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<211> 38
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 4
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gagctccccg ggcgagtgtt gttgtgttct gtctaatg 
\hfill
38 
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<210> 5
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcttacgaag gtatgatatc ctcctacatg tcaggc 
\hfill
36 
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<210> 6
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 6
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gcagtcacgg ctgctgtcaa tgatcgcatt gcaattccag cgttcc 
\hfill
46 
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<210> 7
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 
\hfill
46 
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<210> 8
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<211> 55
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ggtgggcatt cagtgccaag gaaacagtcg acatccgcac caagttgttt caacc 
\hfill
55 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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39 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:Cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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cgctgcagct cgaggctgtc ctccgttaga tcatcg 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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36 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ttaactagtg aggaggccgc ctgccgtgc 
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29 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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cgcctctaga ggccggccga tatccctcag ccgcctttca ctatc 
\hfill
45 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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cgctgcagtg ctcgcgatcc tcctcgcttt tcc 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ctgcagctcg agaacatggt ggagcacgac acacttgtct ac 
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42 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ttaattaaca tcaatccact tgctttgaag acg 
\hfill
33 
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ctcgagggcc ggccgcagct ggcttg 
\hfill
26 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ctcgagtttt gtggtcgtca ctgcgttcg 
\hfill
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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ttaattaatt ttgtggtcgt cactgcgttc g 
\hfill
31 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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cccatcctcc cgacctccac gccgccggca ggatcaagtg caaaggtccg ccttgtttct 
\hfill
60 
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cctctg 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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gacgccatgg tcgccgccat ccgcagctgc acgggtccag gaaagcaatc 
\hfill
50 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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cgagttctta tagtagattt caccttaatt aaaac 
\hfill
35 
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggacccgtgc agctgcggta ccatggcggc gaccatggc 
\hfill
39 
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gccatggtcg ccgccatggt accgcagctg cacgggtcc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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gcgctcgagt cagttcctga cgaaagtgct tagaacgtcg 
\hfill
40 
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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gcgcatatga aggcggagga gatcgtgc 
\hfill
28 
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 35
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gcgcatatga aggcggagga gatcgtgc 
\hfill
28 
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<210> 36
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebadar
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcagtcacgg ctgctgtcaa tgatcgcatt gcaattccag cgttcc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 37
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgctcgagt cagttcctga cgaaagtgct tagaacgtcg 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
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<211> 46
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 38
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaacgctgg aattgcaatg cgatcattga cagcagccgt gactgc 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 39
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 39
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtggaacgct ggaattgcaa tgcaat 
\hfill
26 
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<210> 40
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 40
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttgcatttc caccagcagc agt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 41
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 41
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cccttcctct tgcgtgaatt ccatttc 
\hfill
27 
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<210> 42
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 42
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\hskip-.1em\dddseqskip
gttgtgcccc taataaccag ag 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 43
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<211> 3763
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<212> ADN
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<213> Oryza sp.
\newpage
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<400> 43
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16
17
18 
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<210> 44
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<211> 3763
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<212> ADN
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<213> Oryza sp.
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<400> 44
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19
20
21 
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<210> 45
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<211> 217
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<212> ADN
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<213> Virus de mosaico de "Figwort"
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<400> 45
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22 
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<210> 46
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<211> 323
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<212> ADN
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<213> Virus de mosaico de Coliflor
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 46
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23 
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<210> 47
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<211> 309
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<212> ADN
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<213> Virus de mosaico de Coliflor
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<400> 47
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24 
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<210> 48
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<211> 870
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<212> ADN
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<213> Zea mays 
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<400> 48
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25 
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<210> 49
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<211> 1501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Oryza sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
26
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 898
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Oryza sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 50
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28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 754
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Hordeum sp.
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<400> 51
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29
30 
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<210> 52
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<211> 982
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 435
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1343
\vskip0.400000\baselineskip
<212> SDN
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<213> Oryza sp.
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
33
34 
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<210> 55
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<211> 538
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<212> ADN
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<213> Zea sp.
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:cebador
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<400> 55
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35
36

Claims (16)

1. Un polinucleótido que comprende los siguientes componentes en la dirección de transcripción 5' a 3':
(i)
Al menos un potenciador ("enhancer") transcripcional siendo esa región potenciadora la que está antes del extremo 5' ("upstream") a partir del inicio transcripcional de la secuencia de la cual se obtiene el potenciador y dicho potenciador de por sí no funciona como promotor o bien en la secuencia en la que está comprendido de manera endógena o cuando está presente de manera heteróloga como parte de una construcción;
(ii)
El promotor del gen EPSPS de arroz;
(iii)
La secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz;
(iv)
La secuencia genómica que codifica la EPSPS de arroz;
(v)
Un terminador ("terminator") transcripcional;
en la que la secuencia codificadora de EPSPS de arroz se modifica en el sentido de que se muta una primera posición para que el residuo en esta posición sea Ile en lugar de Thr y se muta una segunda posición para que el residuo en esta posición sea Ser en lugar de Pro, siendo introducidas las mutaciones en secuencias de EPSPS las cuales comprenden la siguiente región conservada GNAGTAMRPLTAAV en la enzima de tipo natural de modo que la secuencia modificada lea GNAGIAMRSLTAAV.
2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha región potenciadora comprende una secuencia, cuyo extremo 3' está al menos 40 nucleótidos antes del extremo 5' del inicio transcripcional más cercano de la secuencia a partir de la cual se obtiene.
3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha región potenciadora comprende una secuencia, cuyo extremo 3' está al menos 10 nucleótidos antes del extremo 5' desde el primer nucleótido del consenso TATA de la secuencia a partir de la cual se obtiene el potenciador.
4. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo los primeros y segundos potenciadores transcripcionales.
5. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el extremo 3' del potenciador, o primer potenciador, está entre 100 a 1.000 nucleótidos antes del extremo 5' del codón correspondiente al inicio de traducción del péptido de tránsito de EPSPS, o en el que el polinucleótido de acuerdo con las reivindicaciones 1-4 comprende además un intrón en la región no traducida 5', el primer nucleótido del intrón en la región no traducida 5'.
6. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la región antes del extremo 5' del promotor del gen EPSPS de arroz comprende al menos un potenciador derivado de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio de transcripción de o bien los promotores CaMV35S o FMV35S.
7. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, comprendiendo en la dirección 5' a 3' un primer potenciador que comprende una región potenciadora transcripicional derivada de una secuencia que está antes del extremo 5' a partir del inicio de transcripción del promotor FMV35S y un segundo potenciador que comprende una región potenciadora transcripcional derivada de una secuencia que está en dirección 5' a partir del inicio transcripcional del promotor CaMV35S.
8. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en cuyo 5' de la secuencia genómica de arroz que codifica el péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de arroz hay localizado una región no traducida que comprende una secuencia que funciona como un intrón.
9. Un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, comprendiendo además regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos uno de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas.
10. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las anteriores reivindicaciones.
11. El material vegetal que ha sido transformado con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o el vector de la reivindicación 10 o el material vegetal que ha sido transformado con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el vector de la reivindicación 10, y el cual ha sido, o es, transformado más con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos uno de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas.
12. Plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales las cuales han sido regeneradas a partir del material de acuerdo con la reivindicación 11, sus semillas progenie y partes o plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales que comprenden el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y que resultan del cruce de las plantas que han sido regeneradas a partir de material transformado con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o el vector de la reivindicación 10, y plantas que han sido transformadas con un polinucleótido que comprende regiones codificadoras de proteínas capaces de conferir al material vegetal que lo contiene al menos una de los siguientes rasgos agrícolamente deseables: resistencia a insectos, hongos, virus, bacterias, nematodos, estrés, desecación y herbicidas, la progenie de las plantas resultantes, sus semillas y partes.
13. Un método de control de manera selectiva de malas hierbas en un campo, comprendiendo el campo malas hierbas y plantas o progenie de acuerdo con la reivindicación 12, comprendiendo el método la aplicación al campo de un herbicida glifosato en una cantidad suficiente para controlar las malas hierbas sin afectar sustancialmente a las plantas.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación anterior, comprendiendo además la aplicación al campo o bien antes o después de la aplicación del herbicida glifosato de uno o más de lo siguiente: un herbicida, insecticida, fungicida, nematicida, bacteriocida y un antivírico.
15. Un método de producción de plantas que son sustancialmente tolerantes o sustancialmente resistentes a herbicida glifosato, que comprende las etapas de:
(i)
transformar el material vegetal con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el vector de la reivindicación 10;
(ii)
seleccionar el material así transformado; y
(iii)
regenerar el material así seleccionado en plantas enteras, fértiles y morfológicamente normales.
16. Un método para regenerar una planta transformada fértil para contener ADN exógeno que comprende las etapas de:
(a)
producir tejido capaz de regenerarse a partir de dicha planta a transformar;
(b)
transformar dicho tejido capaz de regenerarse con dicho ADN exógeno, en la que el ADN exógeno comprende una secuencia de ADN seleccionable, en la que dicha secuencia funciona en un tejido capaz de regenerarse como un dispositivo de selección;
(c)
entre aproximadamente un día y aproximadamente 60 días después de la etapa (b), colocar dicho tejido capaz de regenerarse de la etapa (b) en un medio capaz de producir brotes a partir de dicho tejido, en la que dicho medio contiene además un compuesto usado para seleccionar tejido capaz de regenerarse que contiene dicha secuencia de ADN seleccionable para permitir la identificación o selección del tejido regenerado transformado;
(d)
después de que se haya formado al menos un brote a partir del tejido seleccionado de la etapa (c), traspasar dicho brote a un segundo medio capaz de producir raíces a partir de dicho brote para producir una plántula, en la que el segundo medio contiene opcionalmente dicho compuesto; y
(e)
convertir dicha plántula en una planta transgénica fértil en la cual el ADN exógeno se transmite a plantas progenie de manera Mendeliana, en la que entre la etapa (b) y la etapa (c) hay una etapa opcional de colocar el material transformado en un medio inductor de callo, caracterizada porque el ADN exógeno es, o la secuencia de ADN seleccionable comprendida por el ADN exógeno comprende, el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y dicho compuesto es glifosato o una sal del mismo.
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