JP2003528571A

JP2003528571A - 除草剤抵抗性植物

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Publication number: JP2003528571A
Application number: JP2000615770A
Authority: JP
Inventors: ホークス，ティモシー・ロバート; ワーナー，サイモン・アンソニー・ジェイムズ; アンドリューズ，クリストファー・ジョン; バチョー，サトヴィンダー; ピッケリル，アンドリュー・ポール
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 2000-04-20
Publication date: 2003-09-30
Also published as: HUP0300187A2; CN1360634A; EP1173582A1; PL357523A1; CZ20013860A3; ES2262514T3; AU4134000A; EP1173582B1; CA2365592A1; IL146062A0; AR070608A2; DK1173582T3; US20030077801A1; ATE330015T1; WO2000066748A1; CA2365592C; HUP0300187A3; US6867293B2; MXPA01010921A

Abstract

(57)【要約】本発明は、とりわけ、葉緑体輸送ペプチドおよび該ペプチドの３’のグリフォセート抵抗性５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする領域を含む単離ポリペプチドであって、前記領域が、植物機能可能プロモーターの発現調節下にあり、但し、前記プロモーターが、前記領域に関し、異種性でなく、そして葉緑体輸送ペプチドが、前記シンターゼに関し、異種性でない、前記ポリペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換えＤＮＡ技術、そして特に、非トランスジェニック様植物と比
較した際、除草剤に対する実質的な抵抗性または実質的な耐性を示すトランスジ
ェニック植物の産生に関する。本発明はまた、とりわけ、前記トランスジェニッ
ク植物の産生に用いられ、または前記トランスジェニック植物により産生される
ヌクレオチド配列（およびその発現産物）にも関する。

【０００２】除草剤にさらされた際、実質的に該除草剤に「耐性」である植物は、同様にさ
らされた非耐性様植物に提供されるものに比較した際、右にシフトした用量／反
応曲線を提供する。こうした用量／反応曲線は、ｘ軸にプロットされた「用量」
およびｙ軸にプロットされた「殺割合」、「除草効果」などを有する。耐性植物
は、典型的には、既定の除草効果を生じるため、非耐性様植物の少なくとも２倍
多い除草剤を必要とするであろう。除草剤に実質的に「抵抗性」である植物は、
作物を商業的な目的で成長させようとする野外で、雑草を殺すのに、農業界で典
型的に使用される濃度および割合の除草剤にさらされた際、あるとしても、わず
かしか、壊死、溶解、白化または他の損傷を示さない。

【０００３】Ｎ−ホスホノメチルグリシン（およびその多様な塩）が上位の例である、５−
エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（以後「ＥＰＳＰＳ」）を、その作
用部位として有する除草剤（以後「グリフォセート」）に、植物が実質的に抵抗
性または実質的に耐性であることが、特に好ましい。

【０００４】除草剤は、除草剤適用の通常の技術にしたがい、該除草剤に抵抗性を与えられ
ている作物を含む野外に、発生前または後いずれかに適用してもよい。本発明は
、とりわけ、こうした除草剤耐性または抵抗性植物の産生に有用なヌクレオチド
配列を提供する。

【０００５】本発明にしたがい、ＳＥＱＩＤＮｏ．４３に示される配列を含む単離ポリ
ヌクレオチドが提供される。本発明はまた、イネおよびトウモロコシＥＰＳＰＳ
をコードするｃＤＮＡを除き、ＥＰＳＰＳをコードするポリヌクレオチドであっ
て、０．１％ＳＤＳを含む０．１強度クエン酸緩衝生理食塩水中、６５および
７０℃の間の温度でインキュベーションし、その後、０．１％ＳＤＳを含む０
．１強度クエン酸緩衝生理食塩水で、同一温度でリンスした際、なおＳＥＱＩ
ＤＮｏ．４３に示される配列とハイブリダイズするものに相補的である、前記
ポリヌクレオチドも提供する。しかし、本発明にしたがった、ＥＰＳＰＳコード
ポリヌクレオチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．４３の配列内のイントロンを構成す
るヌクレオチドを用い、植物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするこ
とにより得てもよく、そして本発明はまた、このスクリーニングから得ることが
可能な配列も含む。

【０００６】本発明はまた、葉緑体輸送ペプチドおよび該ペプチドの３’のグリフォセート
抵抗性５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコード
する領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記領域が、植物機能可能プロ
モーターの発現調節下にあり、但し、前記プロモーターが、前記領域に関し異種
性でなく、そして葉緑体輸送ペプチドが、前記シンターゼに関し異種性でない、
前記単離ポリヌクレオチドも含む。

【０００７】「異種性」により、異なる供給源由来であることを意味し、そして対応して、
「非異種性」は、同一供給源由来であることを意味するが、これは、生物または
組織レベルより、遺伝子レベルである。例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは
、ペチュニア（ｐｅｔｕｎｉａ）ＥＰＳＰＳコード配列に関し、プロモーターが
ウイルスに由来し、そして該プロモーターがその発現を調節する配列が植物に由
来する限り、明らかに異種性である。しかし、用語「異種性」は、本発明にした
がい、さらに狭い意味を有する。例えば、本発明に関するように、「異種性」は
、ペチュニアＥＰＳＰＳコード配列が、例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を調節
するもの以外のやはりペチュニア由来のプロモーターに関して、「異種性」であ
る。この意味では、ペチュニアＥＰＳＰＳ遺伝子に由来し、その後、同様にペチ
ュニア由来のＥＰＳＰＳコード配列の発現の調節に用いられるペチュニアプロモ
ーターは、前記コード配列に関し「非異種性」である。しかし、「非異種性」は
、プロモーターおよびコード配列が、必ずしも１つおよび同一の（オリジナルま
たは子孫）ポリヌクレオチドから得られなければならないことを意味しない。輸
送ペプチドに関しても同様である。例えば、ヒマワリ由来のルビスコ葉緑体輸送
ペプチドは、同様にヒマワリ（同一植物、組織または細胞）由来のＥＰＳＰＳ遺
伝子のコード配列に関し、「異種性」である。ヒマワリ由来のルビスコ輸送ペプ
チドコード配列は、やはりヒマワリ由来のルビスコ酵素コード配列に関し、両配
列の起源が、異なる細胞、組織またはヒマワリ植物に存在していてもよい、異な
るポリヌクレオチドである場合でも、「非異種性」である。

【０００８】好ましい型のポリヌクレオチドは、転写の５’から３’方向に、以下の構成要
素：（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始より上流にある亢進領域であり、
そしてそれ自体、内因的に含まれている配列でも、または構築物の一部として異
種的に存在する際でも、プロモーターとして機能しない、少なくとも１つの転写
エンハンサー；（ｉｉ）イネＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；（ｉｉｉ）イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードするイネゲノム配列；（ｉｖ）イネＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；（ｖ）転写ターミネーター；ここで、イネＥＰＳＰＳコード配列は、第一の位が突然変異し、本位での残基が
、ＴｈｒよりもＩｌｅであるように、そして第二の位が突然変異し、本位での残
基が、ＰｒｏよりもＳｅｒであるように修飾し、野生型酵素で以下の保存領域Ｇ
ＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含むＥＰＳＰＳ配列に、修飾配列がＧＮＡＧＩＡ
ＭＲＳＬＴＡＡＶとなるように、突然変異を導入するを含む。

【０００９】亢進領域は、好ましくは、その３’端が、エンハンサーが得られる配列の最も
近い転写開始の少なくとも４０ヌクレオチド上流である配列を含む。ポリヌクレ
オチドのさらなる態様において、亢進領域は、その３’端が、前記最も近い開始
の少なくとも６０ヌクレオチド上流である領域を含み、そしてポリヌクレオチド
のさらなる態様において、前記亢進領域は、その３’端が、エンハンサーが得ら
れる配列のＴＡＴＡコンセンサスの最初のヌクレオチドから少なくとも１０ヌク
レオチド上流である配列を含む。

【００１０】本発明にしたがったポリヌクレオチドは、２つまたはそれ以上の転写エンハン
サーを含んでもよく、ポリヌクレオチドの特定の態様において、タンデムに存在
してもよい。

【００１１】本発明のポリヌクレオチドにおいて、エンハンサー、または１以上が存在する
場合、第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対
応するコドン、または５’非翻訳領域がイントロンを含む場合、前記領域のイン
トロンの第一のヌクレオチドの、約１００ないし約１０００ヌクレオチド上流で
あってもよい。ポリヌクレオチドのより好ましい態様において、エンハンサー、
または第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対
応するコドン、または５’非翻訳領域のイントロンの第一のヌクレオチドの、約
１５０ないし約１０００ヌクレオチド上流であり、そしてさらにより好ましい態
様において、エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ
輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域のイントロン
の第一のヌクレオチドの、約３００ないし約９５０ヌクレオチド上流であっても
よい。さらにより好ましい態様において、エンハンサー、または第一のエンハン
サーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または
５’非翻訳領域のイントロンの第一のヌクレオチドの、約７７０ないし約７９０
ヌクレオチド上流であってもよい。

【００１２】本発明の別のポリヌクレオチドにおいて、エンハンサー、または第一のエンハ
ンサーの３’端が、ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、また
は５’非翻訳領域のイントロンの第一のヌクレオチドの、約３００ないし約３８
０ヌクレオチド上流に位置してもよく、そして別のポリヌクレオチドの好ましい
態様において、エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、ＥＰＳＰ
Ｓ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域のイントロ
ンの第一のヌクレオチドの、約３２０ないし約３５０ヌクレオチド上流に位置す
る。

【００１３】本発明にしたがったポリヌクレオチドにおいて、イネＥＰＳＰＳ遺伝子由来の
プロモーターの上流の領域が、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーター
いずれかの転写開始から上流の配列由来の、少なくとも１つのエンハンサーを含
んでもよい。

【００１４】したがって、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＧＯＳ２プロモー
ターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー、
およびＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始から
上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含んでもよい。

【００１５】あるいは、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、イネ・アクチンプロモ
ーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー
、およびＦＭＶ３５ＳまたはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始か
ら上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含んでもよい。

【００１６】あるいは、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、オオムギ・プラストシ
アニンプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一の
エンハンサー、およびＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれか
の転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含ん
でもよい。

【００１７】あるいは、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、トウモロコシ・ポリユ
ビキチンプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一
のエンハンサー、およびＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれ
かの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含
んでもよい。

【００１８】あるいは、ポリヌクレオチドは、５’から３’方向に、ＦＭＶ３５Ｓプロモー
ターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー、
およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領
域を含む第二のエンハンサーを含んでもよい。

【００１９】ポリヌクレオチドに存在する多様なエンハンサーの同一性および並列がどのよ
うなものであっても、イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドの翻訳開始を構成する
コドンの５’のヌクレオチドが、コザックの好ましい配列であってもよい。これ
により意味されるものは、当業者に公知であり、そして以下の実施例からさらに
明らかであろう。

【００２０】本発明のポリヌクレオチドの特に好ましい態様は、イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送
ペプチドをコードするイネゲノム配列の５’に、イントロンとして機能する配列
を含む非翻訳領域を有する。非翻訳領域は、ＳＥＱＩＤＮｏ．５５に示され
る配列を含んでもよい。特に、非翻訳領域は、ＳＥＱＩＤＮｏ．５５の配列
を有するトウモロコシＡＤＨＩイントロンを含んでもよい。

【００２１】本発明のポリヌクレオチドは、イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードす
るイネゲノム配列の５’の非翻訳領域内に位置する、ウイルス由来翻訳エンハン
サーを含んでもよい。当業者は、こうした適切な翻訳エンハンサー−例えばＴＭ
Ｖ由来のオメガおよびオメガプライム配列、およびタバコ腐食ウイルス（ｔｏｂ
ａｃｃｏｅｔｃｈｖｉｒｕｓ）由来のものの同一性、並びにどのようにして
、望ましい結果を得るように、こうした翻訳エンハンサーをポリヌクレオチド内
に導入することが可能であるかを知っている。

【００２２】本発明にしたがったポリヌクレオチドは、さらに、それを含む植物素材に、少
なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線
虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパ
ク質をコードする領域を含んでもよい。こうしたポリヌクレオチドは、ＥＰＳＰ
Ｓ以外の除草剤抵抗性付与遺伝子、例えばグリフォセート−酸化−還元酵素（Ｇ
ＯＸ）を意図する一方、抵抗性付与遺伝子が、以下のタンパク質をコードする群
より選択される可能性がある場合、除草剤はグリフォセート以外であってもよい
：フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）、ヒドロキシフ
ェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、グルタチオンＳトランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）、チトクロムＰ４５０、アセチル−ＣＯＡカルボキシラーゼ（
ＡＣＣアーゼ）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、プロトポルフィリノ
ーゲン酸化酵素（ＰＰＯ）、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、ポリアミン輸送
タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ブロモキシニルニトリ
ラーゼ、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、アルカリゲネス・ユートロファ
ス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）から入手可能なｔｆｄＡ遺
伝子の産物、および前記タンパク質の既知の突然変異誘発または他の修飾変異体
。ポリヌクレオチドが、多数の除草剤抵抗性を提供する場合、こうした除草剤は
、ジニトロアニリン除草剤、トリアゾロ−ピリミジン類、ウラシル、フェニル尿
素、トリケトン、イソキサゾール、アセトアニリド、オキサジアゾール、トリア
ジノン、スルホンアニリド、アミド、アニリド、ＲＰ２０１７７２、フルロクロ
リドン、ノルフルラゾン、およびトリアゾリノン型除草剤からなる群より選択し
てもよく、そして出現後除草剤は、グリフォセートおよびその塩、グルフォシネ
ート、アシュラム、ベンタゾン、ビアラホス、ブロマシル、セトキシジムまたは
別のシクロヘキサンジオン、ジカンバ、フォサミン、フルポキサム、プロピオン
酸フェノキシ、キザロホップまたは別のアリールオキシ−フェノキシプロパノエ
ート、ピクロラム、フルオロメトロン、アトラジンまたは別のトリアジン、メト
リブジン、クロリムロン、クロロスルフロン、フルメトスラム、ハルスルフロン
、スルフォメトロン、イマザキン、イマゼタピル、イソキサベン、イマザモック
ス、メトシュラム、ピリトロバク、リムスルフロン、ベンスルフロン、ニコスル
フロン、フォメサフェン、フルログリコフェン、ＫＩＨ９２０１、ＥＴ７５１、
カルフェントラゾン、ＺＡ１２９６、スルコトリオン、パラコート、ジクワット
、ブロモキシニルおよびフェノキサプロプからなる群より選択してもよい。

【００２３】ポリヌクレオチドが殺虫タンパク質をコードする配列を含む場合、これらのタ
ンパク質は、分泌Ｂｔ毒素を含むＢｔ由来の結晶毒素；プロテアーゼ阻害剤、レ
クチン、キセンホラブドゥス／フォトラブドゥス毒素をコードし；真菌抵抗性付
与遺伝子は、既知のＡＦＰ、デフェンシン、キチナーゼ、グルカナーゼ、Ａｖｒ
−Ｃｆ９をコードするものからなる群より選択してもよい。特に好ましい殺虫タ
ンパク質は、ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＡｂ、ｃｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ１Ａ、Ｖｉｐ
１Ｂ、システインプロテアーゼ阻害剤、およびユキノハナレクチンである。ポ
リヌクレオチドが細菌抵抗性付与遺伝子を含む場合、これらは、セクロピンおよ
びテキプレシン並びにそれらの類似体をコードするものからなる群より選択して
もよい。ウイルス抵抗性付与遺伝子は、ウイルスコートタンパク質、移動タンパ
ク質、ウイルスレプリカーゼをコードするもの、並びにウイルス抵抗性を提供す
ることが知られるアンチセンスおよびリボザイム配列からなる群より選択しても
よく；一方、ストレス、塩、および干ばつ抵抗性付与遺伝子は、グルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼおよびペルオキシダーゼ、既知のＣＢＦ１制御配列を構
成する配列、並びにトレハロースの集積を提供することが知られる遺伝子をコー
ドするものからなる群より選択してもよい。

【００２４】本発明にしたがったポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび／
または望ましくないスプライシング領域が除去され、あるいは作物に好まれるコ
ドンが用いられ、植物において、こうして修飾されたポリヌクレオチドの発現が
、非修飾ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域が内因性である生物における
非修飾ポリヌクレオチドの発現により得られるのと、実質的に類似の活性／機能
を有する、実質的に類似のタンパク質を生じるように修飾し、含まれるタンパク
質コード配列の発現を亢進してもよい。修飾ポリヌクレオチドおよび前記植物に
内因的に含まれ、そして実質的に同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチ
ドの間の同一性の度合いは、修飾および内因性配列の間の共抑制を妨げるもので
あってもよい。この場合、配列間の同一性の度合いは、好ましくは、約７０％未
満であるべきである。

【００２５】本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む、生物学的または形質転換
ベクターを含む。したがって、「ベクター」により、とりわけ、以下の１つ：プ
ラスミド、ウイルス、コスミドまたはポリヌクレオチドを含むよう形質転換され
たまたはトランスフェクションされた細菌が意味される。

【００２６】本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換されている
、植物素材と共に、それを含む植物素材に、少なくとも１つの以下の農学的に望
ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草
剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパク質をコードする領域を含むポリ
ヌクレオチドで、さらに形質転換されている、またはされる、形質転換植物素材
を含む。

【００２７】本発明はさらに、直前の段落に開示される素材から再生されている、形態学的
に正常な稔性の全植物、それらの子孫、種子および部分を含み、子孫は、ゲノム
に安定して組み込まれ、そしてメンデル方式で遺伝可能な本発明のポリヌクレオ
チドまたはベクターを含む。

【００２８】本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含み、そして本発明のポリヌク
レオチドまたはベクターで形質転換された素材から再生されている植物を交雑す
ることから生じる形態学的に正常な稔性の全植物、および植物素材に、少なくと
も１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細菌、線虫、ス
トレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能なタンパク質を
コードする領域を含むポリヌクレオチドで形質転換されている植物、生じた植物
の子孫、その種子および部分を含む。

【００２９】本発明の植物は、穀物、果実および野菜、例えば、カノラ、ヒマワリ、タバコ
、テンサイ、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマト
、マンゴー、モモ、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイ
モ、ニンジン、レタス、キャベツ、タマネギ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウ
、農場マメ、ポプラ、ブドウ、柑橘類、ムラサキウマゴヤシ、ライムギ、オーツ
ムギ、芝生および飼い葉、アマおよびアブラナ、並びに、すでに特に言及されて
いない限り、ナッツ産生植物、それらの子孫、種子および部分からなる群より選
択してもよい。

【００３０】特に好ましいこうした植物には、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、テンサイおよ
びカノラが含まれる。本発明はさらに、雑草および本発明の植物または除草剤耐性のその子孫を含む
野外で、雑草を選択的に調節する方法であって、該植物に実質的に影響を与える
ことなく、雑草を調節するのに十分な量のグリフォセート型除草剤を該野外に適
用することを含む、前記方法を含む。本方法にしたがい、グリフォセート除草剤
の適用前または後いずれかに、１つまたはそれ以上の除草剤、殺虫剤、殺真菌剤
、殺線虫剤、殺細菌剤および抗ウイルス剤を、該野外（そしてしたがってそこに
含まれる植物）に適用してもよい。

【００３１】本発明はさらに、グリフォセート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性
である植物を産生する方法であって：（ｉ）植物素材を、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換し；（ｉｉ）こうして形質転換された素材を選択し；そして（ｉｉｉ）こうして選択された素材を、形態学的に正常な稔性の全植物に再生す
る工程を含む、前記方法を提供する。

【００３２】形質転換は、既知のいかなる手段による、素材へのポリヌクレオチドの導入を
伴ってもよいが、特に：（ｉ）ポリヌクレオチドで被覆された粒子での素材の微
粒子銃；または（ｉｉ）ポリヌクレオチドを含む溶液で被覆された炭化ケイ素フ
ァイバー上での素材の突き刺し；または（ｉｉｉ）アグロバクテリウムへのポリ
ヌクレオチドまたはベクターの導入およびこうして形質転換されたアグロバクテ
リウムと植物素材の共培養、該植物素材はこれにより形質転換され、そして続い
て再生される、による、導入を伴ってもよい。特定の植物種に関して、日常的な
修飾を必要とする可能性がある、植物形質転換、選択および再生技術は、当業者
に公知である。こうして形質転換された植物素材を、グリフォセートに対する抵
抗性により選択してもよい。

【００３３】本発明はさらに、グリフォセート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵抗性
である、植物組織および／または形態学的に正常な稔性の全植物の産生における
、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの使用を提供する。

【００３４】本発明はさらに、目的の遺伝子を発現するよう形質転換された生物学的素材を
選択する方法であって、形質転換素材が、本発明のポリヌクレオチドまたはベク
ターを含み、そして選択が、形質転換素材をグリフォセートまたはその塩に曝露
し、そして生存素材を選択することを含む、前記方法を含む。前記素材は植物起
源であってもよく、そして特に、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ、オー
ツムギ、ライムギ、モロコシ、パイナップル、サトウキビ、バナナ、タマネギ、
アスパラガス、リーキからなる群より選択される、単子葉植物由来であってもよ
い。

【００３５】本発明はさらに、異質のＤＮＡを含む稔性形質転換植物を再生するための方法
であって：（ａ）形質転換しようとする前記植物から再生可能組織を産生し；（ｂ）前記再生可能組織を前記の異質のＤＮＡで形質転換し、ここで前記の異質
のＤＮＡは選択可能ＤＮＡ配列を含み、前記配列は、選択装置として再生可能組
織中で機能する；（ｃ）工程（ｂ）後、約１日ないし約６０日の間に、工程（ｂ）の前記再生可能
組織を、前記組織から苗条を産生することが可能な培地中に置き、ここで前記培
地は、前記選択可能ＤＮＡ配列を含む再生可能組織を選択するのに用いられる化
合物をさらに含み、形質転換再生組織の同定または選択を可能にする；（ｄ）工程（ｃ）の選択された組織から少なくとも１つの苗条が形成された後、
前記苗条を、前記苗条から根を産生し、小植物を産生することが可能な第二の培
地に移し、ここで第二の培地は、所望により、前記化合物を含む；そして（ｅ）前記小植物を稔性トランスジェニック植物に成長させる、ここで、異質の
ＤＮＡは、メンデル方式で子孫植物に伝達され、異質のＤＮＡが、本発明のポリ
ヌクレオチドであり、または異質のＤＮＡにより含まれる選択可能ＤＮＡ配列が
、該ポリヌクレオチドを含むことで特徴付けられ、そして前記化合物がグリフォ
セートまたはその塩である、工程を含む、前記方法を含む。植物は、上に示されるような単子葉植物であって
もよく、より好ましくは、バナナ、コムギ、イネ、トウモロコシおよびオオムギ
からなる群より選択してもよく、そして前記再生可能組織は、胚発生カルス、体
細胞胚、未成熟胚などより選択してもよい。

【００３６】本発明は、関連する図および配列表と関連して行われる以下の説明からさらに
明らかになるであろう。配列リストＳＥＱＩＤＮｏ．１−４２、ＰＣＲプライマー。ＳＥＱＩＤＮｏ．４３、イネゲノムＥＰＳＰＳ配列（ＡＴＧから）。ＳＥＱＩＤＮｏ．４４、二重突然変異を含むイネゲノムＥＰＳＰＳ配列。ＳＥＱＩＤＮｏ．４５、ＦＭＶエンハンサー。ＳＥＱＩＤＮｏ．４６、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー１。ＳＥＱＩＤＮｏ．４７、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー２。ＳＥＱＩＤＮｏ．４８、トウモロコシ・ポリユビキチンエンハンサー。ＳＥＱＩＤＮｏ．４９、イネ・アクチンエンハンサー。ＳＥＱＩＤＮｏ．５０、イネＧＯＳ２エンハンサー。ＳＥＱＩＤＮｏ．５１、オオムギ・プラストシアニンエンハンサー。ＳＥＱＩＤＮｏ．５２、Ｇ１イネＥＰＳＰＳプロモーター＋５’上流領
域。ＳＥＱＩＤＮｏ．５３、Ｇ３イネＥＰＳＰＳプロモーター＋５’上流領
域。ＳＥＱＩＤＮｏ．５４、Ｇ２イネＥＰＳＰＳプロモーター＋５’上流領
域中のＡｄｈ１イントロン。ＳＥＱＩＤＮｏ．５５、トウモロコシＡｄｈ１イントロン。

【００３７】非異種性プロモーターの調節下の突然変異ＥＰＳＰＳの過剰発現を通じた、グリフォセート処理に抵抗性の植物の産生本明細書を通じて用いられる、用語「エンハンサー」は、プロモーター自体を
含まないが、プロモーターからの転写開始を亢進するまたは制御するよう作用す
る、プロモーター上流の配列を意味する。本明細書を通じて用いられる、用語「
ＥＰＳＰＳプロモーター欠失体」は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に天然であるエンハンサ
ー由来のヌクレオチド−すなわちプロモーターの上流（５’）のヌクレオチドと
一緒のＥＰＳＰＳプロモーターを指す。

【００３８】植物素材の形質転換に関し、当業者は、特定の種類の標的素材（例えば胚性細
胞懸濁培養物または脱分化未成熟胚）および特定の形質転換法（例えば、アグロ
バクテリウムまたは粒子銃を用いたもの）が、以下の実施例に明記されるが、本
発明は、これらの特定の態様に限定されず、そしてこうした標的素材および方法
は、交換可能に用いてもよいことを認識するであろう。さらに、本発明の本説明
を通じて用いられる用語、「植物細胞」は、懸濁培養を含む単離細胞と共に、胚
、胚盤、小胞子、小胞子由来胚または植物器官由来の体細胞などの、損なわれて
いない（ｉｎｔａｃｔ）または部分的に損なわれていない組織中の細胞を指す可
能性がある。同様に、特定の実施例は、トウモロコシ、コムギおよびイネに限定
されるが、本発明は、植物細胞形質転換の適切な方法を用い、形質転換すること
が可能な、広い範囲の農業作物およびアメニティー植物のいずれにも等しく適用
可能である。

【００３９】一般的な分子生物学的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，
第二版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂ．Ｐｒｅｓｓ．
にしたがって行う。

【００４０】

【実施例】実施例１．イネＥＰＳＰＳに対するｃＤＮＡプローブの生成イネＥＰＳＰＳをコードする部分長ｃＤＮＡは、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）を用いて得る。総ＲＮＡは、２週齢イネ植物（オリザ・サティバＬ．イン
ディカｖａｒ．コシヒカリ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．ｉｎｄｉｃａｖ
ａｒ．Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ））から、ＴＲＩ−ＺＯＬ^TM法（ＬｉｆｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、単離する。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い
、２００ｎｇのＥＰＳＰＳ縮重逆方向１０プライマー（ＳＥＱＩＤＮｏ．
１）および２μｇの総ＲＮＡで、供給されるプロトコルにしたがい、行う。第二
鎖合成およびＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅は、ＥＰＳＰＳ縮重プライマー１０およ
び４（ＳＥＱＩＤＮｏ．１およびＳＥＱＩＤＮｏ．２）並びにＰＣＲビ
ーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、製造者の指示にしたがい、行う。すべての
文字暗号は、標準的略語（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）１５
０：１５）である。ＳＥＱＩＤＮｏ．１ＥＰＳＰＳ縮重逆方向１０

【００４１】

【化１】

【００４２】ＳＥＱＩＤＮｏ．２ＥＰＳＰＳ縮重順方向４

【００４３】

【化２】

【００４４】産物を、供給者に推奨されるように、ＴＡクローニングキット^TMを用い、ベク
ターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする。選択されたコ
ロニーからプラスミドを回収し、そしてコンピューターに基づく相同性検索（Ｂ
ＬＡＳＴ）を伴う方法により、配列を解析し、クローニングされたＲＴ−ＰＣＲ
産物が、既知の植物ＥＰＳＰＳ配列に高い相同性を示すことを確認する。

【００４５】実施例２．イネＥＰＳＰＳゲノム配列の単離およびイネＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニング全長イネＥＰＳＰＳ遺伝子を含むゲノムＤＮＡの領域および５’上流領域は、
５日齢黄化（ｅｔｉｏｌａｔｅｄ）イネ苗条（オリザ・サティバＬ．インディカ
ｖａｒ．ＩＲ３６）から構築されたλＥＭＢＬＳＰ６／Ｔ７ゲノムライブラリー
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）より単離する。製造者に提供されるプロトコルを用い、³² Ｐ標識イネＥＰＳＰＳｃＤＮＡプローブ（実施例１）を用い、１ｘ１０⁶
プラーク形成単位（ｐｆｕ）をスクリーニングする。クロスハイブリダイズする
プラークが純粋になるまで、陽性プラークを続く周期のハイブリダイゼーション
スクリーニングに供する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載される方法にし
たがい、λ−ＤＮＡを、ファージの純粋ストックから調製する。同じ³²Ｐ標識イ
ネＥＰＳＰＳｃＤＮＡをプローブとして用い、制限消化およびサザンブロッテ
ィングにより、得られたＤＮＡを解析する。クロスハイブリダイズする制限断片
は、適用可能な場合、ＰｅｒｆｅｃｔｌｙＢｌｕｎｔ^TM（Ｎｏｖａｇｅｎ）な
どの方法を用い、平滑末端化し、そしてｐＳＴＢｌｕ（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの
適切なベクターにクローニングする。その後、ＡＢＩ３７７ＡＰＲＩＳＭ自
動化ＤＮＡ配列決定装置を用い、ＤＮＡを配列決定する。図１は、イネＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子の図式を示し、いくつかの制限部位を記す。

【００４６】コード領域、ＥＰＳＰＳプロモーター、５’上流領域の一部およびターミネー
ターを含む、イネＥＰＳＰＳ遺伝子の３．８６ｋｂ断片を、ＰＣＲにより得る
。オリゴヌクレオチドプライマーＯＳＧＲＡ１（ＳＥＱＩＤＮｏ．３）を、
ＯＳＥＰＳＰＳ３（ＳＥＱＩＤＮｏ．４）と組み合わせて用い、望ましい領
域を増幅する。ＯＳＥＰＳＰＳ３は、ベクター構築の後の工程中、遺伝子のサブ
クローニングを容易にするため、さらなるＳａｃ１およびＳｍａ１制限酵素
部位を含む。これらのプライマーの図式的位置を図１に示す。ＳＥＱＩＤＮｏ．３ＯＳＳＧＲＡ１

【００４７】

【化３】

【００４８】ＳＥＱＩＤＮｏ．４ＯＳＥＰＳＰＳ３

【００４９】

【化４】

【００５０】高忠実度（ｈｉｇｈｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰｆｕＴｕｒｂｏ^TMポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、増幅テンプレートとしてλ調製（上述）より
得られたＤＮＡを用い、ＰＣＲ反応を行う。期待される大きさのＰＣＲ産物をｐ
ＣＲｂｌｕｎｔ４−ＴＯＰＯ^TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、
そして配列決定し、完全性を確かめる。

【００５１】実施例３．イネＥＰＳＰＳにおけるＴからＩおよびＰからＳの突然変異ＴからＩおよびＰからＳの突然変異は、２つの点突然変異の導入により得る。
これらの突然変異は、望ましい突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを
用いたＰＣＲにより、イネゲノムＥＰＳＰＳ遺伝子に導入する。用いたプライマ
ーの結合部位を示す概要図を、図３に示す。２つの別個のＰＣＲ反応を行う（共
に、テンプレートとしてλ ＤＮＡを用いる）。１）ＥｃｏＲＶＥｎｄ（ＳＥＱＩＤＮｏ．５）＋ＯＳＭｕｔＢｏｔ（Ｓ
ＥＱＩＤＮｏ．６）２）ＯｓＭｕｔＴｏｐ（ＳＥＱＩＤＮｏ．７）＋ＳａｌＩＥｎｄ（ＳＥ
ＱＩＤＮｏ．８）ＳＥＱＩＤＮｏ．５ＥｃｏＲＶＥｎｄ

【００５２】

【化５】

【００５３】ＳＥＱＩＤＮｏ．６ＯＳＭｕｔＢｏｔ

【００５４】

【化６】

【００５５】ＳＥＱＩＤＮｏ．７ＯｓＭｕｔＴｏｐ

【００５６】

【化７】

【００５７】ＳＥＱＩＤＮｏ．８ＳａｌＩＥｎｄ

【００５８】

【化８】

【００５９】新たなＰＣＲ反応において、テンプレートとして等モル濃度の各ＰＣＲ産物を
、２つのオリゴ、ＳａｌＩＥｎｄおよびＥｃｏＲＶＥｎｄと共に用いることによ
り、生じたＰＣＲ産物を連結する。反応産物のアリコットを、アガロースゲル電
気泳動により解析し、そしてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ^TM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）にクローニングする。プラスミドＤＮＡを回収し、そして配列決定し、二重
突然変異取り込みの成功を検出する。

【００６０】二重突然変異を含むＤＮＡ断片を、以下のように、イネＥＰＳＰＳゲノムクロ
ーン（図１）に取り込む。二重突然変異体を含むクローンを、ＥｃｏＲＶおよ
びＳａｌＩで消化する。イネＥＰＳＰＳＤＮＡＰＣＲ産物を含むプラスミ
ドを同様に消化し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載される標準的ク
ローニング法を用い、二重突然変異体を含むＥｃｏＲＶ／ＳａｌＩ断片を、
ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ^TM中のイネＥＰＳＰＳ遺伝子内に連結し、そして
コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。生じたコロニーから
プラスミドを回収し、そしてさらなる改変なしに二重突然変異が存在することを
確認するため、配列決定する。本プラスミド、ｐＣＲ４−ＯＳＥＰＳＥＳを図２
に示す。

【００６１】二重突然変異を含むゲノムイネＥＰＳＰＳ遺伝子（図２）を、Ｐｓｔ１およ
びＮｏｔ１を用い、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ^TMから切除し、そしてｐ
ＴＣＶ１００１（図４）内に連結し、ｐＴＣＶ１００１ＯＳＥＰＳＰＳ（図５）
を生成し、そしてこれを、増幅のため大腸菌に形質転換する。次に、Ｐａｃ１
／ＥｃｏＲＶ制限断片をλ ＤＮＡ（図１）から切除し、そしてｐＴＶ１００
１ＯＳＥＰＳＰＳ（図５）内に挿入し、ｐＴＣＶ１００１ＥＰＳＰＳＰＡＣ（図
６）を生成する。ここでＰａｃ１からＳａｃ１の配列を含むイネＥＰＳＰＳ遺伝
子を、Ｅａｇ１／Ｓａｃ１断片としてｐＴＣＶ１００１ＥＰＳＰＳＰＡＣ（
図６）から切除し、そして同様に消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋内に
連結し、ｐＢｌｕＳＫ＋ＥＰＳＰＳ（図７）を作成する。さらなるイネＥＰＳＰ
Ｓ上流領域および望ましいエンハンサーを（以下に記載されるように）組み立て
、そしてＸｂａ１／Ｐａｃ１を用い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋ベク
ター内に連結する。

【００６２】実施例４．単一亢進：イネＥＰＳＰＳプロモーター融合体の生成図１は、イネＥＰＳＰＳ遺伝子の５’端での一連の欠失体を生成するのに用い
たプライマーＧ１およびＧ２の結合部位を示す。Ｇ１およびＧ２プライマーは、
供給者に提供されたプロトコルを用い、イネＥＰＳＰＳラムダＤＮＡテンプレー
トおよびＰｆｕＴｕｒｂｏ^TMポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、
ＲＱＣＲ１０プライマーと組み合わせて用いる。ＳＥＱＩＤＮｏ．９Ｇ１

【００６３】

【化９】

【００６４】ＳＥＱＩＤＮｏ．１０Ｇ２

【００６５】

【化１０】

【００６６】ＳＥＱＩＤＮｏ．１１ＲＱＣＲ１０

【００６７】

【化１１】

【００６８】得られた産物をアガロースゲル電気泳動により解析し、そしてｐＣＲ−Ｂｌｕ
ｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ^TMベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングする
。生じた産物の配列を決定し、イネゲノムＥＰＳＰＳクローンの配列にいかなる
改変もないことを確実にする。ＸｈｏＩ消化が、ベクターから全挿入物でなく
ポリリンカーのみを除去するか否かを確かめることにより、ベクター内の方向に
基づき、進展させるクローンを選択する。

【００６９】ＣａＭＶ３５ＳおよびＦＭＶ３５Ｓ遺伝子並びにその関連する５’上流領域の
配列は、ＥＭＢＬデータベース（例えば寄託番号ｖ００１４１およびｘ０６１６
６）に公表される。前記遺伝子の上流エンハンサー領域のみを増幅するよう、プ
ライマーを設計する。ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー１（ＳＥＱＩＤＮｏ．３
６）は、プライマーＳＥＱＩＤＮｏ．１２およびＳＥＱＩＤＮｏ．１３
を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ^TMポリメラーゼおよびテンプレートとしてのｐＭＪＢ１
ＤＮＡ（Ａ５９８７０）と組み合わせて用いるＰＣＲにより、こうして得られ
る。あるいは、同様の方法を用い、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーの異なる領域を
得る（ＳＥＱＩＤＮｏ．３７）。ＦＭＶ３５Ｓエンハンサーは化学的に合成
する（ＳＥＱＩＤＮｏ．３５）。

【００７０】以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。ＳＥＱＩＤＮｏ．１２３５Ｓ５

【００７１】

【化１２】

【００７２】ＳＥＱＩＤＮｏ．１３３５Ｓ３

【００７３】

【化１３】

【００７４】増幅されそしてクローニングされた分子の配列は、ＰＣＲＢｌｕｎｔ−ＩＩ
−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローニング後、確認する。
ＥＰＳＰＳ５’ＵＴＲ欠失体を含むｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯベク
ターを、Ｘｂａ１／Ｘｈｏ１で消化する。やはりＸｂａ１／Ｘｈｏ１消
化を用い、各ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯベクターからエンハンサーを
除去し、そしてＰＣＲにより生成されたＥＰＳＰＳプロモーター欠失体を含む第
一のベクター内に連結する。

【００７５】実施例５．二重亢進：イネＥＰＳＰＳプロモーター融合体の生成イネＥＰＳＰＳプロモーターからの発現をさらに増加させるため、３５Ｓまた
はＦＭＶエンハンサーいずれかと組み合わせ、さらなるエンハンサーを用いても
よい。これを達成するクローニング戦略の１つの例において、単一の（第一の）
エンハンサーを含む、エンハンサー／ＥＰＳＰＳ融合体を最初に作成する（実施
例４と同様）。こうした第一のエンハンサーは、イネＧＯＳ２、イネ・アクチン
１、トウモロコシ・ポリユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＦＭＶ３５Ｓおよび
オオムギ・プラストシアニン遺伝子のプロモーターの５’上流領域より選択する
。これらの領域のヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬデータベースに公表される（そ
れぞれ、寄託番号ｘ５１９１０、ｘ１５８６５、ｕ２９１５９、ｖ００１４１、
ｘ０６１６６およびｚ２８３４７）。これらの遺伝子の５’の望ましい転写エン
ハンサー領域のみを増幅するよう、プライマーを設計する（ＳＥＱＩＤＮｏ
．１５から２２）。ＳＥＱＩＤＮｏ．１５オオムギ５

【００７６】

【化１４】

【００７７】ＳＥＱＩＤＮｏ．１６オオムギ４

【００７８】

【化１５】

【００７９】ＳＥＱＩＤＮｏ．１７ＯＳＧＯＳ５

【００８０】

【化１６】

【００８１】ＳＥＱＩＤＮｏ．１８ＯＳＧＯＳ３

【００８２】

【化１７】

【００８３】ＳＥＱＩＤＮｏ．１９ＭＰＵ５

【００８４】

【化１８】

【００８５】ＳＥＱＩＤＮｏ．２０ＭＰＵ３

【００８６】

【化１９】

【００８７】ＳＥＱＩＤＮｏ．２１ＲＡ５

【００８８】

【化２０】

【００８９】ＳＥＱＩＤＮｏ．２２ＲＡ３

【００９０】

【化２１】

【００９１】温室栽培植物（トウモロコシ、オオムギまたはイネ）から、ＤＮＡｅａｓｙプ
ロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＤＮＡを単離し、そしてＰＣＲ増幅の出発テ
ンプレートとして用いる。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯに
クローニングし、そして配列決定し、信頼性を確かめる。エンハンサーＥＰＳＰ
Ｓ融合体は、イネ・アクチン１の場合、エンハンサーがＸｂａ１／Ｐｓｔ１
断片として挿入され（Ｘｈｏ１部位がイネ・アクチンエンハンサー中に存在す
るため、Ｘｈｏ１部位をＰｓｔ１部位に置き換える）、そしてトウモロコシ・
ポリユビキチンの場合、エンハンサーがＳｐｅ１／Ｘｈｏ１断片として挿入
される（Ｘｂａ１部位がトウモロコシ・ポリユビキチンエンハンサー中に存在
するため、Ｘｂａ１部位をＳｐｅ１部位に置き換える）以外は、実施例４（
Ｘｂａ／Ｘｈｏ１交換を用いる）に先に記載されるように行う。トウモロコシ
・ポリユビキチンエンハンサー領域に関しては、内部Ｘｈｏ１部位を用いること
に注目されたい。ＣａＭＶ３５ＳエンハンサーまたはＦＭＶエンハンサーいずれ
であってもよい第二のエンハンサーは、それぞれ、プライマー３５ＳＸｈｏおよ
び３５Ｓ３（ＳＥＱＩＤＮｏ．２３およびＳＥＱＩＤＮｏ．１３）（３
５Ｓ）またはＦＭＶＸｈｏおよびＦＭＶ３（ＳＥＱＩＤＮｏ．２５およびＳ
ＥＱＩＤＮｏ．２６）を用い、増幅する。これらのプライマーは、エンハン
サーの５’および３’末端でのＸｈｏ１部位（またはＰｓｔ１部位）の導入
を容易にする。あるいは、プライマー３５ＳＰａｃ（ＳＥＱＩＤＮｏ．２４
）またはＦＭＶＰＡＣ３（ＳＥＱＩＤＮｏ．２７）を用い、Ｘｈｏ１部位の
代わりに、３’端にＰａｃ１部位を導入する。ＳＥＱＩＤＮｏ．２３３５Ｓｘｈｏ

【００９２】

【化２２】

【００９３】ＳＥＱＩＤＮｏ．２４３５ＳＰＡＣ

【００９４】

【化２３】

【００９５】ＳＥＱＩＤＮｏ．２５ＦＭＶＸｈｏ１

【００９６】

【化２４】

【００９７】ＳＥＱＩＤＮｏ．２６ＦＭＶ３

【００９８】

【化２５】

【００９９】ＳＥＱＩＤＮｏ．２７ＦＭＶ３Ｐａｃ

【０１００】

【化２６】

【０１０１】配列決定したら、ＰＣＲ産物、Ｘｈｏ１：Ｘｈｏ１、Ｐｓｔ１／Ｐａｃ
１（イネ・アクチンが第一のエンハンサーである場合）、またはＸｈｏ１／
Ｐａｃ１いずれかを、必要に応じ、Ｘｈｏ１部位あるいはＸｈｏ１および
Ｐａｃ１またはＰｓｔ１およびＰａｃ１制限部位の間、いずれかで、第一
のエンハンサー：ＥＰＳＰＳ遺伝子融合体を含む構築物内に導入する。Ｘｈｏ
１部位での導入を用い、Ｇ１またはＧ２ＥＰＳＰＳプロモーター欠失体いずれ
かを含む二重エンハンサー融合構築物を構築する。Ｘｈｏ１／Ｐａｃ１およ
びＰｓｔ１／Ｐａｃ１断片を共に用い、Ｇ３ＥＰＳＰＳプロモーター欠失
体を含む二重エンハンサー融合体を構築する。第二のエンハンサーがＸｈｏ１
断片として導入される場合、エンハンサーの方向を、ＰＣＲにより決定する。

【０１０２】実施例６．イネＥＰＳＰＳ遺伝子の５’ＵＴＲへのＡｄｈ１イントロンの挿入単数または複数の望ましいエンハンサーを含む融合構築物の生成前に、トウモ
ロコシＡｄｈ１イントロン１の望ましいイネＥＰＳＰＳプロモーター欠失体（例
えば実施例４に記載されるように作成されたもの）への挿入を行う。この特定の
例では、Ａｄｈ１イントロンを、Ｇ２ＥＰＳＰＳプロモーター欠失体に導入す
る。当業者は、Ａｄｈ１イントロンを他のＥＰＳＰＳプロモーター欠失体に取り
込むのに、同様の方法論を採用してもよいことを理解するであろう。トウモロコ
シＡｄｈ１イントロンをＰＣＲにより、構築物に挿入する。プライマーＡｄｈ５
（ＳＥＱＩＤＮｏ．２８）およびＡｄｈ３（ＳＥＱＩＤＮｏ．２９）を
用い、適切な供給源、例えばトウモロコシゲノムＤＮＡまたはｐＰＡＣ１（図８
）などのベクターからＡｄｈ１イントロンを増幅する：ＳＥＱＩＤＮｏ．２８Ａｄｈ５

【０１０３】

【化２７】

【０１０４】ＳＥＱＩＤＮｏ．２９Ａｄｈ３

【０１０５】

【化２８】

【０１０６】生じたＰＣＲ産物を変性し、そしてＡｄｈ５Ｐａｃ（ＳＥＱＩＤＮｏ．３
０）と組み合わせて用い、テンプレートとしてベクターｐＴＣＶ１００１ＥＰＳ
ＰＳＰＡＣ（図６）を用い、望ましい産物を増幅する。ＳＥＱＩＤＮｏ．３０Ａｄｈ５Ｐａｃ

【０１０７】

【化２９】

【０１０８】生じたＰＣＲ産物をＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にク
ローニングする。Ｐａｃ１：ＨｉｎｄＩＩＩ断片をイネゲノムクローン（図１
）から切除し、そしてｐＴＣＶ１００１内に挿入し、ｐＴＣＶＥＰＳＰＳＰＨ（
図９）を生成する。次に、上で得た、そしてＡｄｈ１イントロンを含むＰａｃ
Ｉ／Ｎｃｏ１ＰＣＲ産物を、図式に示されるように、ｐＴＣＶＥＰＳＰＨ
内に挿入する（図９）。二重突然変異体を含むクローニングされたＥＰＳＰＳ遺
伝子に存在するＰａｃ１：ＥｃｏＲＶ断片（図１０）を切除し、そしてＡｄ
ｈ１イントロン配列を含むｐＴＣＶＥＰＳＰＳＰＨ由来のＰａｃ１／Ｅｃｏ
ＲＶ断片（図９）と置き換える。最後に、Ａｄｈ１配列を含む全長ＥＰＳＰ
Ｓ遺伝子を、Ｅａｇ１／Ｓａｃ１断片としてｐＴＣＶＥＰＳＰＳＡＤＨ（図
１０）から切除し、そしてｐＢｌｕＳＫ＋内にクローニングし、ｐＢｌｕＳＫＥ
ＰＳＰＳＡＤＨ（図１１）を生じる。

【０１０９】実施例７．トウモロコシＡｄｈ１イントロンを含む構築物のための部位特異的突然変異誘発を介した最適化プレＡＴＧコンセンサス配列（コザック）の導入所望により、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、Ａｄｈ１イントロン
を含む構築物に対し、部位特異的突然変異誘発を行う。これは、エンハンサー：
ＥＰＳＰＳプロモーター融合体との融合前に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋
中のＰａｃ１／Ｓａｃ１ＥＰＳＰＳ断片（図１１）に対し行う。供給されるプ
ロトコルにしたがい、以下のオリゴヌクレオチドを用い、コザック配列を最適化
する。ＳＥＱＩＤＮｏ．３１Ｏｓｋｏｚａｋ

【０１１０】

【化３０】

【０１１１】ＳＥＱＩＤＮｏ．３２ＯＳｋｏｚａｋｒｅｖ

【０１１２】

【化３１】

【０１１３】回収したプラスミドに対し、Ｋｐｎ１を用い、制限解析によりクローンを解
析する。正確に改変されたＤＮＡは、非改変ＤＮＡに比較し、さらなるＫｐｎ
１制限部位により、特徴付けられる。その後、自動化ＤＮＡ配列決定により、配
列を確認する。改変されたＤＮＡ配列を、各ベクターに適切なように、５’端の
Ｓｐｈ１またはＰａｃ１および３’端のＡｖｒＩＩまたはＥｃｏＲＶの
特有の制限酵素部位を用い、元来の構築物に移してもよい。

【０１１４】実施例８．５’から３’の方向に、単数または複数のエンハンサー領域、イネＥＰＳＰＳプロモーター上流領域、ＥＰＳＰＳプロモーター、ＥＰＳＰＳ５’ＵＴＲ＋（所望による）トウモロコシＡｄｈ１イントロン１、イネＥＰＳＰＳプラスチド輸送ペプチドコード領域、イネ成熟ＥＰＳＰＳコード領域およびイネＥＰＳＰＳ遺伝子ターミネーター領域を含む、ＥＰＳＰＳ発現カセットの完成ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯベクター内に含まれる単一および二重亢
進イネＥＰＳＰＳプロモーター融合体（実施例４および５）を、Ｘｂａ１およ
びＰａｃ１を用いて切除し、そしてイネＥＰＳＰＳ配列の残りを含む、同様に
消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋クローンに挿入する（図７／１１）
。しかし、トウモロコシ・ポリユビキチンエンハンサー：ＥＰＳＰＳ融合体を用
いようとする場合、これをまず、Ｓｐｅ１／Ｐａｃ１を用い、ｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔにクローニングする。その後、イネＥＰＳＰＳ配列の残りを、Ｐａｃ
１／Ｓａｃ１として挿入し、発現カセットを完成する。この最後のクローニン
グ工程は、必要な遺伝子構築物を生じる。上述の戦略を用いて得ることが可能な
構築物の例を、以下の表１に示す。図式的マップを、図１３−１５に示す。

【０１１５】

【表１】

【０１１６】実施例９．ｐＩＧＰＤ９へのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからのＥＰＳＰＳ発現カセットのサブクローニング望ましい場合そして直接ＤＮＡ法（ウィスカー、微粒子銃およびプロトプラス
ト）による植物の形質転換の場合は特に、Ｘｍａ１を用い、ＥＰＳＰＳ発現構
築物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切除し、そしてｐＩＧＰＤ９（図１２）にク
ローニングする。選択は、ＩＧＰＤ（ｈｉｓＢ産物）を発現する遺伝子を持つ
栄養要求ｈｉｓＢ大腸菌突然変異体の相補性に頼るため、形質転換のための本
ベクターの使用は、植物への抗生物質抵抗性遺伝子の転移を回避する。ｐＺＥＮ
９、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２３、２４および２５のＸｍ
ａ１断片の挿入物由来のｐＩＧＰＤ９由来プラスミドは、ｐＺｅｎ９ｉ、ｐＺ
ＥＮ１１ｉ、ｐＺＥＮ１２ｉなどと名づける。

【０１１７】植物形質転換に使用するための多量のＤＮＡ調製は、製造者に提供されるプロ
トコルを用い、Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ法（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得る。

【０１１８】実施例１０．植物形質転換のためのＤＮＡ調製上述の方法は、５’から３’方向に、単数または複数のエンハンサー配列、イ
ネ由来のＥＰＳＰＳプロモーター、イネＥＰＳＰＳ輸送ペプチドをコードする領
域、明記される位で、ＴからＩおよびＰからＳの変化を有することを通じ、グリ
フォセートに抵抗性である成熟イネＥＰＳＰＳ酵素をコードする領域およびイネ
ＥＰＳＰＳ遺伝子ターミネーターを含む、「ＥＰＳＰＳ発現カセット」の組み立
てを記載する。

【０１１９】所望により、望ましいカセットはさらに、薬剤選択マーカー遺伝子（例えばア
ンピシリン抵抗性、カナマイシン抵抗性など）、Ｔ−ＤＮＡ左または右境界領域
および（所望により）上述の構築物の５’および／または３’に付加された足場
（ｓｃａｆｆｏｌｄ）結合領域もまた含む。当業者は、上述のものと類似の方法
を用い、これらの付加構成要素を得て、そしてこれらを望ましい位にクローニン
グしてもよいことを認識するであろう。

【０１２０】実施例１１．Ｔ−ＤＮＡの右および左境界の間にＥＰＳＰＳ発現カセットを含む、スーパーバイナリベクターを含むアグロバクテリウム株を用いたトウモロコシ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生アグロバクテリウム株の構築ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡ（例えばＺＥＮ９、ＺＥＮ１１、ＺＥ
Ｎ１４、ＺＥＮ１５、ＺＥＮ１８、ＺＥＮ２０、ＺＥＮ１２、ＺＥＮ２３、ＺＥ
Ｎ２４またはＺＥＮ２５）を、Ｘｍａ１またはＸｂａ１／Ｓａｃ１いずれ
かで消化し、そしてこうして得られた（〜５−６．５ｋｂ）ＥＰＳＰＳコード
断片を、同様に制限消化されたｐＳＢ１の右および左Ｔ−ＤＮＡ境界の間に位置
するクローニング部位内の位に連結する。例えば、ｐＺＥＮ１８のＸｍａ１断
片を用いる場合、本連結は、プラスミドｐＺＥＮ１８ＳＢ１１（図１６）を生成
する。プラスミドｐＳＢ１１の構築およびその親、ｐＳＢ２１の構築は、Ｋｏｍ
ａｒｉら（１９９６，ＰｌａｎｔＪ．１０：１６５−１７４）に記載され
る。ｐＺＥＮ１８のＴ−ＤＮＡ領域を、相同的組換え法により（図１６）、スー
パーバイナリｐＳＢ１ベクター（Ｓａｉｔｏら、ＥＰ６７２７５２Ａ１）
に組み込み、プラスミド、ｐＳＢ１ＺＥＮ１８を生成する。これを達成するため
、プラスミドｐＺＥＮ１８ＳＢ１１を大腸菌株ＨＢ１０１に形質転換し、これを
その後、Ｄｉｔｔａら（１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ７７：７３４７−７３５１）の三重交配法にしたがい、ｐＳＢ
１を宿するアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４と交配し、アグロバクテリウムの
形質転換株、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１ＺＥＮ１８）を生成し、共組込みプラス
ミドｐＳＢ１ＺＥＮ１８の存在を、スペクチノマイシンに対する抵抗性に基づき
、選択する。ｐＳＢ１ＺＥＮ１８の同一性はまた、Ｓａｌ１制限解析に基づい
ても確認する（図１６）。直接類似構築物ｐＳＢ１ＺＥＮ９、ｐＳＢ１ＺＥＮ１
１、ｐＳＢ１ＺＥＮ１２、ｐＳＢ１ＺＥＮ１４などを含むＬＢＡ４４０４株は、
ｐＺＥＮ９、ＺＥＮ１１、ＺＥＮ１２，ＺＥＮ１４などのＸｍａ１断片から出発
し、同様に構築する。

【０１２１】あるいは、上述のものと類似の方法を用い、ｐＺＥＮ９、ＺＥＮ１１などの同
様の断片を、スーパーバイナリベクターｐＴＯＫ１６２（ＵＳ５５９１６１６
の図１）の右および左境界の間の位に相同的に組換え、カナマイシンおよびスペ
クチノマイシンに対する組み合わせた抵抗性に基づき、アグロバクテリウムにお
いて、選択された共組込みプラスミドの同様の組を生成する。

【０１２２】ヘルパープラスミドＰＡＬ４４０４（完全なｖｉｒ領域を有する）を有するア
グロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションより入手可能である（ＡＴＣＣ３７３４９）。別の有用な株は、強力
に有害な株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２８１由来のｖｉｒ領域
を有するヘルパープラスミドを有する、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１（１９
８６，Ｈｏｏｄら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８（３）：１２８
３−１２９０）である。

【０１２３】アグロバクテリウム懸濁物の調製アグロバクテリウム株、ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１ＺＥＮ９）、ＬＢＡ４４０
４（ｐＳＢ１ＺＥＮ１１）などを、各々、「ＰＨＩ−Ｌ」固形培地を含むプレー
ト上にストリークし、そして３ないし１０日間、暗所中、２８℃で培養する。

【０１２４】ＰＨＩ−Ｌ培地は、ＷＯ９８／３２３２６の２６ページ（実施例４）に記載
される。再蒸留水中に作成されるＰＨＩ−Ｌ培地は、２５ｍｌ／ｌのストック
溶液Ａ、２５ｍｌ／ｌのストック溶液Ｂ、４５０．９ｍｌ／ｌのストック溶
液Ｃおよび５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを含む。ストック溶液は、オー
トクレーブまたはろ過により、滅菌する。ストック溶液Ａは、ＫＯＨでｐＨ７
．０に調整された、６０ｇ／ｌＫ₂ＨＰＯ₄および２０ｇ／ｌＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄であり：ストック溶液Ｂは、６ｇ／ｌＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３ｇ／ｌ
ＫＣｌ、２０ｇ／ｌＮＨ₄Ｃｌ、０．２ｇ／ｌＣａＣｌ₂および５０
ｍｇ／ｌＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏであり：ストック溶液Ｃは、５．５６ｇ／ｌの
グルコースおよび１６．６７ｇ／ｌの寒天（Ａ−７０４９、ＳｉｇｍａＣｈ
ｅｍｉｃａｌｓ、米国ミズーリ州セントルイス）である。

【０１２５】あるいは、アグロバクテリウムは、Ｉｓｈｉｄａ（１９９６，Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，７４５−７５０）に記載されるような
ＹＰ培地（５ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌペプトン、５ｇ／ｌＮ
ａＣｌ、１５ｇ／ｌ寒天、ｐＨ６．８）を含むプレート上で、あるいはＨ
ｅｉらにＵＳ５５９１６１６（ＡＢ培地（ＤｒｌｉｃａおよびＫａｄｏ，１
９７４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７１：３６
７７−３６８１））に記載されるように、３−１０日間培養するが、各場合で、
適切な抗生物質選択を提供するよう修飾する（例えば、アグロバクテリウム株Ｌ
ＢＡ４４０４（ｐＳＢ１ＺＥＮ９）などの場合、５０ｍｇ／ｍｌスペクチノ
マイシンを含み、またはｐＴＯＫ１６２由来スーパーバイナリベクターを含む
アグロバクテリウムを用いる場合、５０ｍｇ／ｍｌスペクチノマイシンおよ
び５０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む）。

【０１２６】上述のように作成したアグロバクテリウムのプレートを、４℃で保存し、そし
て調製１ヶ月以内に用いる。懸濁物の調製のため、マスタープレートから単一の
コロニーを、ｐＨ６．８で、５ｇ／ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１０
ｇ／ｌペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／ｌＮａＣｌ、１５ｇ／ｌ寒天
（Ｄｉｆｃｏ）および５０ｍｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むプレート上
に（または特定のアグロバクテリウム株に適切であるように）ストリークする。
プレートを暗所中、２８℃で２日間インキュベーションする。

【０１２７】植物素材を形質転換するためのアグロバクテリウムの懸濁物は、ＵＳ５５９
１６１６に記載されるのと類似の方式で調製する（優れた微生物学的実施を行い
、無菌培養の汚染を回避する）。３Ｘ５ｍｍの白金耳にいっぱいのアグロ
バクテリウムをプレートから除去し、１４ｍｌＦａｌｃｏｎ試験管中の無菌
ＡＡ液体培地５ｍｌ中に移し、そして懸濁する。本明細書において、ｐＨ５
．２のＡＡ液体培地は、ＴｏｒｉｙａｍａおよびＨｉｎａｔａ（１９８５）（Ｐ
ｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ４１，１７９−１８３）に定義される主要無機塩
、アミン酸およびビタミン、ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ
１５，４７３−４９７中）の微量無機塩、０．５ｇ／ｌカザミノ酸（カ
ゼイン加水分解物）、１ｍｇ／ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４
−Ｄ）、０．２ｍｇ／ｌのカイネチン、０．１ｍｇ／ｌのジベレリン、０．
２Ｍグルコース、０．２Ｍスクロースおよび０．１ｍＭアセトシリン
ゴンを含む。

【０１２８】あるいは、植物素材を形質転換するためのアグロバクテリウムの懸濁物は、Ｗ
Ｏ９８／３２３２６に記載されるのと類似の方式で調製する。３Ｘ５ｍ
ｍの白金耳にいっぱいのアグロバクテリウムをプレートから除去し、ＷＯ９８
／３２３２６の２６ページの実施例４に記載されるように、無菌ＰＨＩ−Ａ基本
培地５ｍｌ中に移し、そして懸濁するか、あるいは、やはりＷＯ９８／３２
３２６の２６ページの実施例４に記載される、無菌ＰＨＩ−Ｉ組み合わせ培地５
ｍｌに懸濁する。どちらの場合でも、５ｍｌの１００ｍＭ３’−５’−
ジメトキシ−４’ヒドロキシアセトフェノンもまた添加する。ｐＨ５．２のＰ
ＨＩ−Ａ基本培地は、４ｇ／ｌのＣＨＵ（Ｎ６）基本塩（ＳｉｇｍａＣ−１
４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビタミンミックス（１０００Ｘ
、ＳｉｇｍａＥ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌチアミン．ＨＣｌ、１．５
ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、０．６９ｇ／ｌＬ−プロリン、６８．５ｇ／
ｌスクロースおよび６８．５ｇ／ｌグルコースを含む。やはりＫＯＨでｐ
Ｈ５．２に調整し、そしてろ過滅菌したＰＨＩ−Ｉ組合せ培地は、４．３ｇ
／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．
５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣ
ｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１ｇ／ｌビタミンアッセイカザ
ミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、１．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、０．６９ｇ／ｌ
Ｌ−プロリン、６８．５ｇ／ｌスクロースおよび３６ｇ／ｌグルコース
を含む。

【０１２９】あるいは、植物素材を形質転換するためのアグロバクテリウムの懸濁物は、Ｉ
ｓｈｉｄａら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４
，７４５−７５０に記載されるのと類似の方式で調製する。３ｘ５ｍｍ
の白金耳にいっぱいのアグロバクテリウムをプレートから除去し、ＬＳ−ｉｎｆ
培地５ｍｌ中に移し、そして懸濁する。ＫＯＨでｐＨ５．２に調整したＬＳ
−ｉｎｆ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ１８，１００−１２７）は、ＬＳ主要および微量無機
塩、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．Ｈ
Ｃｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノシ
トール、１ｇ／ｌビタミンアッセイカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、１．５ｍ
ｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、６８．５ｇ／ｌスクロースおよび３６ｇ／ｌグ
ルコースを含む。

【０１３０】どのように産生したものでも、アグロバクテリウムの懸濁物はボルテックスし
、均質な懸濁物を作成し、そして細胞集団を、０．５ｘ１０⁹および２ｘ
１０⁹ ｃｆｕ／ｍｌの間に（好ましくはより低く）調整する。１ｘ１０⁹ ｃｆｕ／ｍｌは、５５０ｎｍでの〜０．７２のＯＤ（１ｃｍ）に相当する
。

【０１３１】アグロバクテリウム懸濁物を、無菌２ｍｌ微量遠心管に１ｍｌロットでア
リコットし、そして可能な限り速やかに使う。

【０１３２】形質転換のための細胞株形質転換に適したトウモロコシ株には、限定されるわけではないが、Ａ１８８
、Ｆ１Ｐ３７３２、Ｆ１（Ａ１８８ｘＢ７３Ｈｔ）、Ｆ１（Ｂ７３Ｈｔｘ
Ａ１８８）、Ｆ１（Ａ１８８ｘＢＭＳ）が含まれる。変種Ａ１８８、ＢＭ
Ｓ（ブラックメキシカンスイート（ＢｌａｃｋＭｅｘｉｃａｎＳｗｅｅｔ）
）およびＢ７３Ｈｔは、当業者に公知の英国農林水産省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙｏ
ｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＦｉｓｈｅｒｉｅ
ｓ）より得る。Ｐ３７３２は、ＩＷＡＴＡＲＡＫＵＮＯＵＫＹＯＤＯＫＵＭ
ＩＡＩから得る。適切なトウモロコシ株にはまた、Ａ１８８ｘ近交系交雑の
変種（例えばＷＯ９８／３２３２６の表８のＰＨＪ９０ｘＡ１８８、ＰＨＮ
４６ｘＡ１８８、ＰＨＰＰ８ｘＡ１８８）と共に、異なる異種群由来の
選良近交系（例えばＷＯ９８／３２３２６の表９のＰＨＮ４６、ＰＨＰ２８およ
びＰＨＪ９０）も含まれる。

【０１３３】例えば、未成熟胚は、「Ｈｉ−ＩＩ」トウモロコシから産生される。「Ｈｉ−
ＩＩ」は、ＭａｉｚｅＧｅｎｅｔｉｃＣｏｏｐｅｒａｒｉｏｎＳｔｏｃｋ
Ｃｅｎｔｅｒ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｌｌｉｎｏｉｓａｔＣ
ｈａｍｐａｉｇｎ，イリノイ州アーバナより入手可能なＨｉ−ＩＩ親ＡおよびＨ
ｉ−ＩＩ親Ｂの間の相互交雑により生成される近交系（Ａ１８８ｘＢ７３）
間の雑種である。これらの交雑から得られる、「Ｈｉ−ＩＩ」種子と称される種
子を、温室または野外に植える。生じたＨｉ−ＩＩ植物は、自家受粉または姉妹
植物と他家受粉させる。

【０１３４】未成熟胚の調製、感染および共培養トウモロコシ未成熟胚の形質転換は、未成熟胚を上述のアグロバクテリウムの
適切な組換え株と接触させることにより、行う。未成熟胚は、受粉後、成熟段階
にある未成熟種子の胚を意味する。未成熟胚は、細胞分裂し、カルス細胞を生じ
ることが可能な損なわれていない組織であり、カルス細胞はその後、分化し、組
織および全植物の器官を産生することが可能である。形質転換に好ましい素材に
はまた、胚の胚盤も含まれ、これもまた、最初に形質転換されている、正常稔性
植物を再生する能力を持つ分化したカルスを誘導することが可能である。したが
って、形質転換に好ましい素材にはまた、こうした分化した未成熟接合胚または
胚盤由来のカルスも含まれる。

【０１３５】未成熟トウモロコシ胚は、ＧｒｅｅｎおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ（１９７６，
Ｃｒｏｐ．Ｓｃｉ．１５：４１７−４２１）に記載されるように、あるいは
、Ｎｅｕｆｆｅｒら（１９８２， “ＧｒｏｗｉｎｇＭａｉｚｅｆｏｒｇ
ｅｎｅｔｉｃｐｕｒｐｏｓｅｓ”，Ｍａｉｚｅｆｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌｒｅｓｅａｒｃｈ，中，Ｗ．Ｆ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ監修，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＮｏｒｔｈＤａ
ｋｏｔａ，米国ノースダコタ州グランドフォークス）の方法により、発生中の
穂から無菌的に単離する。例えば、無菌スパチュラを用い、受粉の９−１２（好
ましくは１１）日後、雌花穂から、長さ１−２ｍｍ（好ましくは１−１．２
ｍｍ）の間の未成熟トウモロコシ胚を、無菌的に単離する。典型的には、無菌脱
イオン水で洗浄する２０分前に、２．６３％次亜塩素酸ナトリウムで、穂を表
面滅菌し、そして未成熟胚を無菌的に除去する。未成熟胚（好ましくは〜１００
の数）は、アグロバクテリウムの懸濁物を調製するのに用いたのと同じ培地（そ
の代替物は上述のものである）を約２ｍｌ含む２ｍｌ微量遠心管に直接落
とす。遠心管のふたを閉め、そして数秒間ボルテックスすることにより、内容物
を混合する。培地をデカントし、２ｍｌの新鮮な培地を添加し、そしてボルテ
ックスを繰り返す。その後すべての培地を抜き取り、遠心管の底に洗浄未成熟胚
を残す。

【０１３６】未成熟トウモロコシ胚を調製したら、方法の次の段階、感染工程は、これらを
、アグロバクテリウムの形質転換株と接触させることである。本過程の１つの例において、感染工程は、ＷＯ９８／３２３２６の実施例４
に記載されるように、Ｎ６培地の主要無機塩およびビタミン（１９８７，Ｃｈ
ｕＣ．Ｃ．Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔ
ｕｒｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓＰｅｋｉｎｇ．ｐｐ４３−５０）を含
む液体培地中で行う。ＰＨＩ−Ａ培地中の、上述のように調製されたアグロバク
テリウムの懸濁物１．０ｍｌを、微量遠心管中の胚に添加し、そして約３０秒
間ボルテックスする。あるいは、ＰＨＩ−Ｉ培地またはＬＳ−ｉｎｆ培地いずれ
かの中の、やはり上述のように調製されたアグロバクテリウムの懸濁物１．０
ｍｌを添加する。

【０１３７】５分間放置した後、アグロバクテリウムおよび胚の懸濁物を、アグロバクテリ
ウムの元来の懸濁物が、それぞれＰＨＩ−Ａ培地、ＰＨＩ−Ｉ培地またはＬＳ−
ｉｎｆ培地中で調製されたかにしたがい、１）ＰＨＩ−Ｂ培地または２）ＰＨＩ
−Ｊ培地または３）ＬＳ−ＡＳ培地を含むペトリ皿に注ぐ。アグロバクテリウム
懸濁物をパスツールピペットを用いて抜き取り、胚が培地上で軸側を下にするよ
うに操作し、プレートをパラフィンで封印し、そして共培養３日間、暗所中、２
３−２５℃でインキュベーションする。ｐＨ５．８のＰＨＩ−Ｂ培地は、４
ｇ／ｌのＣＨＵ（Ｎ６）基本塩（ＳｉｇｍａＣ−１４１６）、１．０ｍｌ／
ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビタミンミックス（１０００Ｘ、ＳｉｇｍａＥ−１５１
１）、０．５ｍｇ／ｌチアミン．ＨＣｌ、１．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ
、０．６９ｇ／ｌＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ｌ硝酸銀、３０ｇ／
ｌスクロース、１００μＭアセトシリンゴンおよび３ｇ／ｌゲルライト
（Ｓｉｇｍａ）を含む。やはりｐＨ５．８に調整したＰＨＩ−Ｊ培地は、４．
３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸
、０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン
．ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１．５ｍｇ／ｍｌの２，４
−Ｄ、０．６９ｇ／ｌＬ−プロリン、２０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ
／ｌグルコース、０．５ｇ／ｌＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭア
セトシリンゴンおよび８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−７０４９）を含
む。ＫＯＨでｐＨ５・８に調整したＬＳ−ＡＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒおよ
びＳｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ１８，１００
−１２７）は、ＬＳ主要および微量無機塩、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、
０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン．
ＨＣｌ、７００ｍｇ／ｌＬ−プロリン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトー
ル、１．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、２０ｇ／ｌスクロース、１０ｇ／
ｌグルコース、０．５ｇ／ｌＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、１００ｍＭアセ
トシリンゴンおよび８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−７０４９）を含む
。

【０１３８】上述のような未成熟胚の調製後、形質転換を達成する代替法は、ＵＳ５５９
１６１６に記載されるような、脱分化の期間中または後にこれらを感染させるこ
とである。未成熟胚を、１００ｍｇ／ｍｌカザミノ酸、７００ｍｇ／ｌ
Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１．５ｍｇ／ｍｌの２
，４−Ｄ、２０ｇ／ｌスクロースおよび２．３ｇ／ｌのゲルライトと共に
、ＬＳ無機塩およびビタミンを含むＬＳＤ１．５固形培地上に置く。２５℃で
の３週間の後、胚盤から生じたカルスを２ｍｌ微量遠心管に収集し、そしてＡ
Ａ培地中の、上述のように調製されたアグロバクテリウム懸濁物１ｍｌに浸す
。５分間放置した後、生じたカルスを、１００ｍＭアセトシリンゴンを含む
２Ｎ６固形培地に移し、そして共培養の３日間、暗所中、２５℃でインキュベー
ションする。２Ｎ６固形培地は、Ｎ６培地の無機塩およびビタミン（ＣｈｕＣ
．Ｃ．，１９７８；Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓＰｅｋｉｎｇ．ｐｐ４３−
５０）を含み、１ｇ／ｌカザミノ酸、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、３０ｇ
／ｌスクロースおよび２ｇ／ｌのゲルライトを含む。

【０１３９】「形質転換体の休止および選択」共培養後、所望により、ＰＨＩ−Ｃ培地を含むプレートに胚を移し、パラフィ
ンで上を封印し、そして選択前に「休止工程」のため、暗所で３日間インキュベ
ーションする。ｐＨ５．８のＰＨＩ−Ｃ培地は、４ｇ／ｌのＣＨＵ（Ｎ６）
基本塩（ＳｉｇｍａＣ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビ
タミンミックス（１０００Ｘ、ＳｉｇｍａＥ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌ
チアミン．ＨＣｌ、１．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、０．６９ｇ／ｌＬ
−プロリン、０．８５ｍｇ／ｌ硝酸銀、３０ｇ／ｌスクロース、０．５
ｇ／ｌＭＥＳ、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンおよび８ｇ／ｌ精製
寒天（ＳｉｇｍａＡ−７０４９）を含む。ＷＯ９８／３２３２６に開示され
るように、全体の形質転換法中に本休止工程を含む望ましさは、トウモロコシ株
に応じて異なり、そして実験の問題である。

【０１４０】選択工程のため、約２０の胚を、各々、ＰＨＩ−Ｄ選択培地またはＬＳＤ１
．５選択培地を含む、いくつかの新鮮なプレートに移し、パラフィンで封印し、
そして暗所中、２８℃でインキュベーションする。ＫＯＨでｐＨ５．８に調整
したＰＨＩ−Ｄ選択培地は、４ｇ／ｌのＣＨＵ（Ｎ６）基本塩（Ｓｉｇｍａ
Ｃ−１４１６）、１．０ｍｌ／ｌのＥｒｉｋｓｓｏｎビタミンミックス（１０
００Ｘ、ＳｉｇｍａＥ−１５１１）、０．５ｍｇ／ｌチアミン．ＨＣｌ、
１．５ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、０．６９ｇ／ｌＬ−プロリン、０．８５
ｍｇ／ｌ硝酸銀、３０ｇ／ｌスクロース、０．５ｇ／ｌＭＥＳ、１
００ｍｇ／ｌカルベニシリン、８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−７
０４９）、並びに０．１ｍＭおよび２０ｍＭの間の組織培養等級Ｎ−（ホス
ホノメチル）−グリシン（ＳｉｇｍａＰ−９５５６）を含む。ＫＯＨでｐＨ
５．８に調整したＬＳＤ１．５選択培地は、ＬＳ主要および微量無機塩（Ｌｉ
ｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎ
ｔ１８，１００−１２７）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．５ｍ
ｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣｌ、７
００ｍｇ／ｌＬ−プロリン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、１．５
ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、２０ｇ／ｌスクロース、０．５ｇ／ｌＭＥ
Ｓ、２５０ｍＭセフォタキシム、８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−
７０４９）、並びに０．１ｍＭおよび２０ｍＭの間の組織培養等級Ｎ−（ホ
スホノメチル）−グリシン（ＳｉｇｍａＰ−９５５６）を含む。

【０１４１】あるいは、選択のための出発素材が、ＷＯ５５９１６１６に開示されるよう
な未成熟胚由来のカルスである場合、こうしたカルスをＬＳＤ１．５選択培地
上で培養する前に、２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄する
。

【０１４２】未成熟胚から増殖する胚または細胞集団を、全部で約２ヶ月の期間に渡り、２
週間間隔で新鮮な選択培地を含むプレートに（必要な場合、滅菌メスで）移す。
その後、選択したカルスの直径が約１．５ｃｍを越えるまで、同一培地上で増
殖を続けることにより、除草剤抵抗性カルスを大きくする。

【０１４３】選択培地中のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度は、望ましい数の真の
形質転換体を選択するのに適切なように選択し、そして好ましくは、０．３−５
ｍＭの範囲内である。好ましくは、選択培地中で用いられるＮ−（ホスホノメ
チル）−グリシンの濃度は、選択の最初の２週間は約１ｍＭであり、そしてそ
の後は約３ｍＭである。

【０１４４】形質転換体の再生／形質転換植物素材の増殖および解析選択したカルスを、例えばＤｕｎｃａｎら（１９８５，Ｐｌａｎｔａ，１
６５，３２２−３３２）、Ｋａｍｏら（１９８５，Ｂｏｔ．Ｇａｚ．１
４６（３），３２７−３３４）および／またはＷｅｓｔら（１９９３，Ｔｈ
ｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５，１３６１−１３６９）および／またはＳｈ
ｉｌｌｉｔｏら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１−５８７
に記載される方法にしたがい、正常稔性植物に再生する。

【０１４５】例えば、直径１．５−２ｃｍの選択されたカルスを、再生／成熟培地に移し
、そして暗所で約１−３週間インキュベーションし、体細胞胚が成熟するのを可
能にする。適切な再生培地ＰＨＩ−Ｅ培地（ＷＯ９８／３２３２６）は、ＫＯ
ＨでｐＨ５．６に調整し、そして４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．
ＨＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノ
シトール、２ｍｇ／ｌグリシン、０．５ｍｇ／ｌゼアチン、１．０ｍ
ｇ／ｍｌのインドール酢酸、０．１ｍＭアブシジン酸、１００ｍｇ／ｌ
カルベニシリン、６０ｇ／ｌスクロース、８ｇ／ｌ精製寒天（Ｓｉｇｍ
ａＡ−７０４９）、並びに所望により、０．０２ｍＭおよび１ｍＭの間の
組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチル）−グリシン（ＳｉｇｍａＰ−９５５６）
を含む。

【０１４６】その後、カルスを、発根／再生培地に移し、そして苗条および根が発生するま
で、１６時間明期（２７０ｍＥｍ^-2ｓ^-1）および８時間暗期の計画下または連
続照明（〜２５０ｍＥｍ^-2ｓ^-1）下で、２５℃で成長させた。適切な発根／再
生培地は、以下の段落に記載されるような（所望によりホスホノメチルグリシン
を含まない）ＬＳＺ培地、または４．３ｇ／ｌのＭＳ塩（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．Ｈ
Ｃｌ、０．１ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノシ
トール、２ｍｇ／ｌグリシン、４０ｇ／ｌスクロースおよび１．５ｇ
／ｌゲルライトを含む、ｐＨ５．６のＰＨＩ−Ｆ培地いずれかである。

【０１４７】あるいは、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整し、そしてＬＳ主要および微量無機塩
（ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐ
ｌａｎｔ１８，１００−１２７）、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸、０．
５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン．ＨＣ
ｌ、７００ｍｇ／ｌＬ−プロリン、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、
５ｍｇ／ｍｌゼアチン、２０ｇ／ｌスクロース、０．５ｇ／ｌＭＥ
Ｓ、２５０ｍＭセフォタキシム、８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−
７０４９）を含むＬＳＺ再生培地に、選択したカルスを直接移し、そして所望に
より、０．０２ｍＭおよび１ｍＭの間の組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチル
）−グリシン（ＳｉｇｍａＰ−９５５６）を用いる。暗所で一定期間インキュ
ベーションした後、プレートを照明（上述のような連続または光／日）にさらし
、そして小植物を再生する。

【０１４８】ＰＨＩ−Ｆ培地、またはｐＨ５．８で、半分の強度のＬＳ主要塩（Ｌｉｎｓ
ｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ，１９６５，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ
１８，１００−１２７）、ＬＳ微量無機塩、０．５ｍｇ／ｍｌニコチン酸
、０．５ｍｇ／ｍｌピリドキシン．ＨＣｌ、１．０ｍｇ／ｍｌチアミン
．ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、２０ｇ／ｌスクロース、
０．５ｇ／ｌＭＥＳ、８ｇ／ｌ精製寒天（ＳｉｇｍａＡ−７０４９）
を含む、半分の強度のＬＳＦ培地いずれかを含む、個々のガラス試験管に、小さ
い小植物を移し、そしてさらに約１週間、成長させる。その後、小植物を植木鉢
の土に移し、成長チャンバー（８５％相対湿度、６００ｐｐｍＣＯ₂およ
び２５０ｍＥｍ^-2ｓ^-1）中で環境に慣らし、そして温室において、土混合物中
で、成熟するまで成長させる。

【０１４９】上述のように得た植物の第一（Ｔ０）世代を自家受精させ、第二世代（Ｔ１）
の種子を得る。あるいは（そして好ましくは）植物の第一世代は、第二世代の種
子を得るため、別の非トランスジェニックトウモロコシ近交系株と相互交雑する
。これらの交雑の子孫（Ｔ１）は、その後、除草剤抵抗性形質に関し、１：１に
分かれると期待される。Ｔ１種子を蒔き、温室または野外で成長させ、そしてこ
の世代および続く世代を通じ、２５および２０００ｇ／ｈａの率の範囲で、そ
してＶ２およびＶ８を含み、その間の成長段階の範囲（あるいは、発芽後７−２
１日）で、（適切に処方され、そして所望により塩としての）グリフォセートで
のスプレー処理後の、除草剤グリフォセートに対する抵抗性のレベル、抵抗性の
遺伝および抵抗性の分離を、示差的植物生存、稔性、および組織中の壊死症状の
観察により、評価する。これらの評価は、感受性の分離体に比較し、そしてグリ
フォセートに対する抵抗性を与えることが可能な本発明の遺伝子または配列前の
配列を含まない、トウモロコシの類似の非形質転換株に比較し、行われる。グリ
フォセートに対する抵抗性を示すトランスジェニック株を選択し、そして再び、
自家交雑するか非トランスジェニック近交系と戻し交雑する。

【０１５０】上述の方法のすべての工程で、形質転換カルス、小植物、Ｔ０およびＴ１植物
素材の組織試料を所望により採取し、そして１）導入遺伝子の存在、コピー数お
よび完全性を示すため、サザンおよびＰＣＲで、２）導入遺伝子からのｍＲＮＡ
の発現を測定するため、ノーザン（または類似の）解析で、３）ＥＰＳＰＳの発
現レベルを測定するため、ＳＤＳゲルの定量的ウェスタン解析で、そして４）発
現されたＥＰＳＰＳのどのくらいが、導入遺伝子に由来するか、より正確に評価
するため、グリフォセートの存在下および非存在下での、ＥＰＳＰＳ酵素活性レ
ベルの測定で、解析することが可能である。

【０１５１】こうした解析法は当業者に公知である。ＰＣＲにより導入遺伝子の存在、完全
性および発現を試験するのに適した方法、サザン解析を行う方法、大腸菌におい
て、成熟イネＥＰＳＰＳをクローニングし、そして発現する方法、イネＥＰＳＰ
Ｓの精製法、精製イネＥＰＳＰＳに対するポリクローナル抗体の生成法、カルス
および植物組織におけるＥＰＳＰＳレベルのウェスタン解析法、並びに内因性グ
リフォセート−感受性ＥＰＳＰＳおよびＥＰＳＰＳコード導入遺伝子のグリフォ
セート耐性産物を区別する、グリフォセート濃度での植物由来抽出物におけるＥ
ＰＳＰＳ活性レベルの測定法は、以下の実施例１７−２０に、より詳細に記載さ
れる。

【０１５２】表２．Ｔ−ＤＮＡ境界内にブルースクリプトベクター（ｐＺＥＮ１１、１２、１４または１５）のＥＰＳＰＳ発現カセットを持つスーパーバイナリベクターを含む、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４での、Ａ１８８ｘＢ７３（Ｈｉ −ＩＩ）トウモロコシの未成熟胚の形質転換から発生したカルスにおける導入遺伝子発現表は、ｐＺＥＮ１１、ＺＥＮ１２、ＺＥＮ１４またはＺＥＮ１５Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔプラスミドのＥＰＳＰＳ発現カセットを持つスーパーバイナリベクタ
ーを含むアグロバクテリウムを用いて形質転換した、Ａ１８８ｘＢ７３再生
可能トウモロコシの安定に形質転換したカルスの抽出物の酵素アッセイに基づく
、ＥＰＳＰＳ酵素アッセイ（１００μＭＰＥＰで＋／−１００μＭグリフォ
セート）結果を示す。各カルス株は、単一事象に相当し、これを二つ組でアッセ
イする。内因性感受性活性（＞９８％阻害＋グリフォセート）に対する、導入遺
伝子に発現される本当の（〜８％の阻害を可能にする）耐性酵素活性の比を計算
する。突然変異ＥＰＳＰＳは、いくつかの株、特に株５および１２では比較的強
く発現され、ここでは、ｗ／ｔに比較し、耐性酵素の減少したＶｍａｘ（約３分
の１）が可能であり、耐性酵素が、内因性ＥＰＳＰＳの正常レベルの２−６Ｘ
で発現されると概算することが可能である（本計算は、いくつかの選択されたカ
ルスでは、導入遺伝子の発現は、感受性内因性酵素のバックグラウンド発現の、
見かけ上〜２−２．５Ｘの増加と共に起こるという事実により、複雑になる）。

【０１５３】

【表２】

【０１５４】実施例１２．ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むＤＮＡで被覆された粒子の微粒子銃による、トウモロコシ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生さらなる実施例において、未成熟トウモロコシ胚由来のもろい胚発生カルスを
、固形培地上で開始し、そして微粒子銃で形質転換する。実施例１１に記載され
る方法と同様に、その後、形質転換カルスを、濃度範囲のグリフォセートを含む
媒地中の示差的増殖率に基づき、選択する。抵抗性カルスを選択し、そして再生
し、Ｔ０小植物を提供し、これを鉢に移し、温室中で成熟するまで成長させ、そ
して自己または交雑増殖させる。その後、子孫種子（Ｔ１）を成長させ、さらな
る世代の植物を提供し、これを、実施例１１に記載されるように、グリフォセー
トに対する抵抗性に関し評価し、そして導入遺伝子の存在、完全性および発現に
関し解析する。

【０１５５】未成熟胚からのカルスの開始形質転換に適したもろい胚発生ＩＩ型カルスは、例えばＡ１８８ＸＢ７３
トウモロコシの未成熟胚に由来する。別の近交系、例えばＢ７３由来および雑種
株のトウモロコシもまた、用いてもよく、例えば、実施例１１に列挙されるもの
が含まれる。実施例１１に示される方法を用い、典型的には、受粉の１１日後、
雌花穂から、長さ１−２ｍｍの間の未成熟トウモロコシ胚を、無菌的に単離す
る。

【０１５６】未成熟胚を、例えば、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した、１ｍｇ／ｌ２，
４−Ｄ、２．９ｇ／ｌＬ−プロリン、２ｍｇ／ｌＬ−グリシン、１００
ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、Ｎ６主要塩、Ｎ６微量塩、Ｎ６ビタミン、２
．５ｇ／ｌゲルライト（または２ｇ／ｌ「Ｇｅｌｇｒｏ」）および２０
ｇ／ｌスクロースを含む、Ｎ６に基づく培地（Ｃｈｕら，１９７５，Ｓｃ
ｉｅｎｔｉａＳｉｎｉｃａ，１８，６５９−６６８）上に蒔く。別の適切
な培地には、例えば、同様であるが、Ｎ６塩の代わりにＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉ
ｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５
，４７３−４９７）を含む培地が含まれる。あるいは、培地は、２，４−Ｄの
代わりに〜１０ｍｇ／ｌジカンバを含んでもよい。

【０１５７】カルスを開始するため、未成熟胚を〜２５℃で、培地上、暗所でインキュベー
ションする。ＩＩ型カルス素材は、当業者に知られ、そして例えばＷＯ９８／
４４１４０に記載されるような方法により、迅速に増殖するもろい胚発生性細胞
を視覚的に選択することにより、選択する。例えば、適切なレシピエント細胞は
、細胞集団表面にあり、そして分化の欠如、小さいサイズおよび高核／細胞質体
積比によりさらに同定可能である、好ましい細胞を選択することにより、手で選
択する。懸濁培養は、最も分化しておらず、最もやわらかくそして最ももろく見
えるカルス内の組織から開始する。本形態の組織を、未成熟胚の最初のプレーテ
ィングの約８−１６日後、新鮮な培地のプレートに移す。その後、およそ１グラ
ムに達した片の〜１０％を取ることにより、１４−２１日ごとに、組織を日常的
に継代培養する。各段階で、望ましいＩＩ型またはＩＩＩ型形態の素材のみを継
代培養する。

【０１５８】細胞懸濁培養の調製好ましくは、上述のカルス開始の６ヶ月以内に、例えばＵＳ５５５０３１８
の実施例１および２に記載されるような遅延放出ホルモンカプセル処理の形で所
望により供給される、２，４−ＤおよびＮＡＡなどの適切なホルモンを含む液体
培地中で、分散懸濁培養を開始する。所望により、培養内のホルモンレベルは、
新鮮なホルモン供給で時々増加させることにより、維持する。懸濁培養は、例え
ば、およそ０．５ｇのカルス組織を、１０ｍｌの懸濁培地を含む１００ｍ
ｌフラスコに添加することにより、開始する。７日ごとに、無菌広端ピペットを
使用することにより、１ｍｌの定着細胞および４ｍｌの馴化培地を、新鮮な
培地を含む新鮮なフラスコに移すことにより、培養をさらに継代培養する。ピペ
ット先端を通過することが出来ない大きな細胞凝集物は、各継代培養段階で排除
する。所望により、懸濁培養は、各継代培養段階で、適切なふるい（例えば〜０
．５−１．０ｍｍメッシュ）を通過させる。６−１２週間後、培養は分散し始
める。適切な細胞懸濁培地には、例えば、ｐＨ６．０に調整した、Ｍｕｒａｓ
ｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ（１９６２）主要および微量塩（所望により、減少し
たレベル、１．５５ｇ／ｌの硝酸アンモニウムを含むよう修飾されたもの）、
３０ｇ／ｌスクロース、０．２５ｍｇ／ｌチアミン、１０ｍｇ／ｌ
ジカンバ、２５ｍＭＬ−プロリン、２００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物
、１００ｍｇ／ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／ｌ硫酸カリウムおよ
び４００ｍｇ／ｌリン酸水素カリウムを含む培地が含まれる。あるいは、ジ
カンバの代わりに、細胞懸濁培地は、２，４−Ｄおよび／またはＮＡＡを含む。

【０１５９】細胞懸濁培養の凍結保存所望により、上述のように得た懸濁培養は、凍結保護剤および例えばＵＳ５
５５０３１８の実施例２に記載される方法を用い、凍結保存する。凍結保存は、
あらかじめ氷温に冷却した細胞に、やはり氷温で、１ないし２時間の期間に渡り
段階的な方式で、凍結保護剤を添加することを含む。混合物を氷温に維持し、そ
して凍結保護剤の最終的な体積は、細胞懸濁物の体積に等しい。凍結保護剤の最
終濃度は、例えば、１０％ジメチルスルホキシド、１０％ポリエチレングリ
コール（６０００Ｍｗ）、０．２３ＭＬ−プロリンおよび０．２３Ｍ
グルコースである。氷温での３０分間の平衡化の後、混合物を〜０．５ｍｌア
リコットに分け、２ｍｌの微量遠心管に移し、そして−８℃の温度まで、０．
５℃／分の速度で、ゆっくりと冷却する。氷核発生期間後、試料をさらに−３５
℃までゆっくりと冷却し、そしてその後、液体窒素に浸す。使用のため必要にな
ったら、まず、容器中で、水中で〜４０℃に２分間浸し、そしてその後、ゆっく
りと完全に融解させることにより、凍結試料を融解する。細胞混合物および凍結
保護剤を、２５℃でＢＭＳ「フィーダー」細胞の層上に置かれたフィルター上に
ピペッティングする。融解した組織が増殖し始めたら、新鮮な固形培地に戻し、
そして、確立されたら（１ないし２週間以内）細胞懸濁培地にさらに移す。液体
懸濁培養中の増殖が再確立されたら、細胞を形質転換に使用する。

【０１６０】粒子仲介形質転換Ｘｍａ１ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むプラスミドｐＩＧＰＤ９由来ＤＮＡ
（図１２）（すなわちｐＺＥＮ９ｉ、ＺＥＮ１１ｉ、ＺＥＮ１２ｉ、ＺＥＮ１４
ｉなど）を精製し、増やし（例えば、最小５ｘＡ培地（１ｌ当たり、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ５２．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２２．５ｇ、（ＮＨ₄）２ＳＯ₄ ５
ｇおよびクエン酸ナトリウム．２Ｈ₂Ｏ２．５ｇ）中で安定期まで増殖させ
た後、適切なＨｉｓＢ−、ＲｅｃＡ大腸菌宿主株（例えばＤＨ５α：ｈｉｓＢ−
）の細胞から、プラスミドＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーまたはＣｓ
Ｃｌ₂勾配濃度で単離することにより）、そして滅菌水中の濃縮溶液（好ましく
は〜１ｍｇ／ｍｌ）として提供する。ＤＮＡは環状プラスミドＤＮＡとして提
供し、あるいは、Ｘｍａ１で制限処理し、直線ＥＰＳＰＳ−発現カセット−含
有断片を提供し、そしてアガロースゲル電気泳動および電気溶出により精製した
後、用いる。

【０１６１】微粒子銃の適切な装置は、例えば、ＢｉｏｒａｄＰＤＳ１０００ヘリウム銃
である。プレートは、カプトン（ｃａｐｔｏｎ）マクロ発射体を停止するのに用
いる停止スクリーンの５−６ｃｍ下に置く。Ｋｌｅｉｎら，１９８７，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３に記載されるものと同様の方式で、ＤＮＡ
構築物を、平均直径〜１．０μｍのタングステンまたは金粒子上に沈殿させる。
例えば、１．２５ｍｇのタングステンまたは金粒子（６５℃で１２時間、エタ
ノール中で前洗浄したもの）を、連続して、〜２０−３０ｍｇのＤＮＡ、１．
１ＭＣａＣｌ₂および８．７ｍＭスペルミジンと、最終体積〜０．６
ｍｌに混合する。混合物を、０−４℃で１０分間、ボルテックスし、低速遠心分
離（〜５００ｇ）に５分間供し、そして上清をデカントし、最終体積〜３０
ｍｌに懸濁されたタングステン粒子を残す。１−１０μｌアリコットを、粒子銃
のマクロ発射体上にピペッティングする。

【０１６２】ＩＩ型および／またはＩＩＩ型カルス由来の懸濁培養を、３−５ヶ月、培養中
に維持し（あるいは、凍結保存から回収し）、新鮮に継代培養し、そしてその後
、〜０．５−１．０ｍｍステンレス鋼メッシュを通じてふるう。ろ過物から回
収したおよそ０．５ｍｌの充填細胞を、その後、５ｃｍの紙フィルター上に
ピペッティングし、そして懸濁培地で湿らせ積み重ねた３つの７ｃｍ紙フィル
ターを含むペトリ皿に移す前に、真空乾燥する。懸濁細胞の各プレートを、試料
プレートトレーの中央にし、ペトリ皿のふたを除去し、そして２８水銀柱インチ
の真空で、２回衝撃を与える。衝撃を受けた組織の損傷を改善するため、停止プ
レートの約２．５ｃｍ下に、０．１または１．０ｍｍスクリーンを置く。衝
撃後、植物細胞をフィルターから除去し、細胞懸濁培地に再懸濁し、そして２−
２１日間培養する。あるいは、衝撃を受けたカルスを、プレートからプレートに
、同様の固形培地を含む（例えば８ｇ／ｌの精製寒天を含む）プレート上に移
し、そして暗所中、２５℃で、同様に培養する。

【０１６３】形質転換体の選択形質転換後、液体または固体培養中、増殖する未選択細胞を、フィルターに写
し、そして組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン（Ｓｉｇｍａ）の選択
濃度範囲（０．１−２０ｍＭ）を含む固形培地上に上層する。適切な固形選択
培地には、ＫＯＨでｐＨ５．８または６．０に調整した、ＭＳまたはＮ６塩い
ずれか（例えば、カルス開始に関し上述されたもの、または適切な寒天を添加し
た、液体懸濁中の細胞増殖に関し上述されたもの）およびＮ−（ホスホノメチル
）グリシンを含む培地が含まれる。適切な選択培地はまた、例えば、実施例１１
に記載される選択培地が含まれるが、この場合、抗生物質を欠くよう、修飾する
。未形質転換細胞の同様の調製に対し阻害性である濃度で増殖することに基づき
、抵抗性ＥＰＳＰシンターゼ酵素を発現する形質転換カルスを選択する。増殖塊
を新鮮な選択培地上に継代培養する。好ましくは、選択培地中に用いられるＮ−
（ホスホノメチル）−グリシンの濃度は、選択の最初の２週間は約１ｍＭであ
り、そしてその後は約３ｍＭである。６−１８週間後、推定上の抵抗性カルス
を同定し、そして選択する。

【０１６４】形質転換体の再生／形質転換植物素材の増殖および解析選択したカルスを、例えばＤｕｎｃａｎら（１９８５，Ｐｌａｎｔａ，１
６５，３２２−３３２）、Ｋａｍｏら（１９８５，Ｂｏｔ．Ｇａｚ．１
４６（３），３２７−３３４）および／またはＷｅｓｔら（１９９３，Ｔｈ
ｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５，１３６１−１３６９）および／またはＳｈ
ｉｌｌｉｔｏら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１−５８７
に記載される方法にしたがい、正常稔性植物に再生する。

【０１６５】例えば、胚発生カルスを、ｐＨ６．０に調整し、０．２５ｍｇ／ｌ２，
４−Ｄ、１０ｍｇ／ｌ６−ベンジル−アミノプリン、および所望により０．
０２ないし１ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシンを含む、Ｍｕｒａｓｈｉｇ
ｅおよびＳｋｏｏｇ培地に移すことにより、効率的に再生する。〜２週間後、組
織を、同様であるが、ホルモンを欠く培地に移す。所望により、ホルモンレベル
は、さらなる転移を通じ、そして６−８週間までのより長い期間に渡り、段階的
に減少させる。２−４週間後に発生する苗条を、１％スクロースを含むＭＳ培
地に移し、そして２ｇ／ｌＧｅｌｇｒｏで固め、この中にその後、根を生え
させる。

【０１６６】あるいは、再生に用いられる方法および培地は、用いられる培地が抗生物質を
含まないことを除き、実施例１における通りである。植物を成熟するまで成長させる方法、世代を通じ植物をさらに増殖させる方法
、グリフォセートに対する抵抗性の遺伝の解析法およびＥＰＳＰＳ導入遺伝子の
存在、完全性および発現の解析法は、実施例１１に記載される通りである。

【０１６７】実施例１３．炭化ケイ素ウィスカー上に被覆された、ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むＤＮＡでのトウモロコシ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生さらなる実施例において、例えば、遺伝子型Ａ１８８ｘＢ７３を有する雑
種株を含むトウモロコシ株を、細胞懸濁物として調製し、そして本質的にＦｒａ
ｍｅら（１９９４，ＰｌａｎｔＪ．６，９４１−９４８）に記載される
ような方法を用い、ＤＮＡで被覆した炭化ケイ素ウィスカーと細胞を接触させる
ことにより、形質転換する。先の実施例に記載されるように、こうして生成され
た形質転換カルスは、濃度範囲のグリフォセートを含む培地中での示差的増殖速
度に基づき選択し、小植物（Ｔ０）に再生し、これを成熟するまで成長させ、そ
して自己または交雑増殖させ、さらなる育種のため、子孫種子（Ｔ１）を提供す
る。植物および植物素材は、先の実施例に記載されるように、グリフォセートに
対する抵抗性に関し評価し、そして導入遺伝子の存在、完全性および発現に関し
解析する。

【０１６８】未成熟胚からのカルスの開始、細胞懸濁培養の調製形質転換に適したトウモロコシ細胞懸濁物は、実施例１２に記載されるのと同
じ方式で、所望により凍結保存し、そして提供する。

【０１６９】形質転換Ｘｍａ１ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むプラスミドｐＩＧＰＤ９由来ＤＮＡ
（図１２）（すなわちｐＺＥＮ９ｉ、ＺＥＮ１１ｉ、ＺＥＮ１２ｉ、ＺＥＮ１４
ｉなど）を精製し、増やし（例えば、最小５ｘＡ培地（１ｌ当たり、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ５２．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２２．５ｇ、（ＮＨ₄）２ＳＯ₄ ５
ｇおよびクエン酸ナトリウム．２Ｈ₂Ｏ２．５ｇ）中で定着期まで増殖させ
た後、適切なＨｉｓＢ−、ＲｅｃＡ大腸菌宿主株（例えばＤＨ５α：ｈｉｓＢ−
）の細胞から、プラスミドＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーまたはＣｓ
Ｃｌ₂勾配濃度で単離することにより）、そして滅菌水中の濃縮溶液（好ましく
は〜１ｍｇ／ｍｌ）として提供する。ＤＮＡは環状プラスミドＤＮＡとして提
供し、あるいは、Ｘｍａ１で制限処理し、直線ＥＰＳＰＳ−発現カセット−含
有断片を提供し、そしてアガロースゲル電気泳動および電気溶出により精製した
後、用いる。

【０１７０】形質転換は、Ｆｒａｍｅら、１９９４に記載されるように、正確に行う。ある
いは、以下に記載されるように、該方法をいくぶん修飾する。継代培養１日後の細胞懸濁培地中の液体培養で増殖させた細胞を、震蘯フラス
コ中で定着させる。消耗した培地をデカントし、そして抜き取り、そして６ｍ
ＭＬ−プロリン、２０ｇ／ｌスクロース、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、０
．２５Ｍソルビトールおよび０．２５Ｍマンニトールを含むよう修飾さ
れた、ｐＨ６．０のＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５）１２ｍｌを、充填細胞体
積４ｍｌ当たり、添加する。フラスコを震蘯装置に４５分間戻す（１２５ｒ
ｐｍで回転震蘯させ、そして２６−２８℃で培養する）。この期間の終了時、広
穴ピペットを用い、細胞懸濁物の１ｍｌアリコットを除去し、一連の無菌微量
遠心管中に入れる。各試験管中の細胞を定着させた後、０．６ｍｌの消耗培地
上清を除去し、残った内容物の大部分を定着細胞として残す。上述の修飾Ｎ６培
地１ｍｌ中で、ボルテックスすることにより、５０ｍｇの炭化ケイ素ウィス
カー（ＳｉｌａｒＳＣ−９ウィスカー、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｏｍｐｏｓｉｔ
ｅＭａｔｅｒｉａｌｓＣｏｒｐ．、米国サウスカロライナ州グリア）を懸濁
する。その後、４０ｍｌのこれらの懸濁ウィスカーおよび２５ｍｇのＥＰＳ
ＰＳ発現カセットを含むプラスミドまたは直線ＤＮＡを、定着細胞の各試験管に
添加する。試験管を指で２−３回ボルテックスし、１秒間ミクソメートし（Ｍｉ
ｘｏｍａｔ歯科アマルガム混合装置（カナダ・オンタリオ州デグーサ））、そし
てその後、０．３ｍｌのＮ６培地（上述のように修飾されたもの）を、各微量
遠心管中に添加する。その後、懸濁細胞を、固形Ｎ６培地（上述の修飾Ｎ６培地
と同じだが、ソルビトールを欠き、マンニトールを欠き、そして３０ｇ／ｌ
スクロースおよび３ｇ／ｌのゲルライトを含む）に上層したフィルターディス
ク上に蒔く（２００μｌ／プレート）。その後、各プレートをＵｒｇｏｐｏｒｅ
テープ（Ｓｔｅｌｒｉｃｏ、ブリュッセル）で巻き、そして暗所で１週間、２６
−２８℃でインキュベーションする。

【０１７１】形質転換体の選択形質転換カルスは、実施例１２に記載されるように、あるいは、Ｆｒａｍｅら
の刊行物に明記されるビアラホスの代わりに１および５ｍＭの間の濃度範囲で
、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを用いることを除き、Ｆｒａｍｅら、１９９
４に記載されるように、選択する。

【０１７２】形質転換体の再生／形質転換植物素材の増殖および解析植物は、実施例１２に記載されるように、再生し、増殖させ、そして育種する
。実施例１２に記載されるように、植物をグリフォセートに対する抵抗性に関し
解析し、そして植物素材を導入遺伝子の存在、完全性および発現に関し解析する
。

【０１７３】実施例１４．Ｔ−ＤＮＡの右および左境界の間にＥＰＳＰＳ発現カセットを含むスーパーバイナリベクターを含むアグロバクテリウム株を用いたイネ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生さらなる実施例において、イネの適切な株（例えば、変種コシヒカリ、ツキノ
ヒカリおよびアサノヒカリを含む）の成熟種子から、胚盤を単離し、脱分化し、
そしてこうして得たカルスを、アグロバクテリウムでの感染により、形質転換す
る。選択および再生後、トランスジェニック小植物（Ｔ０）を得て、これを成熟
するまで成長させ、そして自己または交雑増殖させ、さらなる育種のため、子孫
種子（Ｔ１）を提供する。植物および植物素材は、先の実施例に記載されるよう
に、グリフォセートに対する抵抗性に関し評価し、そして導入遺伝子の存在、完
全性および発現に関し解析する。以下に記載される方法の代替法として、選択の
ためハイグロマイシンよりグリフォセートを用いるよう、適切に適応させたＵＳ
５５９１６１６の実施例１に記載される方法を用いる。

【０１７４】アグロバクテリウム株の構築：アグロバクテリウム懸濁物の調製右および左境界の間に望ましいＥＰＳＰＳ発現カセットを有するスーパーバイ
ナリベクターを含むアグロバクテリウム株を、実施例１に記載されるように（プ
ラスミドＤＮＡでアグロバクテリウムを形質転換するのにエレクトロポレーショ
ンを用い）、構築する。懸濁物は、実施例１に記載される方法にしたがい、調製
する。あるいは、アグロバクテリウムの形質転換株を、適切な抗生物質選択（例
えばＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１ＺＥＮ１８など）の場合、５０ｍｇ／ｌスペ
クチノマイシン）を含む、ＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら，１９７４，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１，３６７２−３６
７６）上で、3日間増殖させ、そしてプレートから白金耳で取り、１−５ｘ
１０⁹細胞／ｍｌの密度で、ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら，１９９４，Ｔｈｅ
ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，６（２），２７１−２８２）中の懸濁物を形
成する。

【０１７５】イネ栽培変種（ｃｕｌｔｉｖａｒ）、胚盤からのカルスの調製イネ栽培変種は、例えば、オリザ・サティバＬ．ツキノヒカリ、アサノヒカリ
およびコシヒカリである。

【０１７６】成熟種子を脱穀し、７０％エタノール中で洗浄し、そしてその後、１．５％
ＮａＯＣｌ中に３０分間浸すことにより滅菌する。滅菌水中でリンスした後、Ｎ
６培地（Ｃｈｕ，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．ＰｌａｎｔＴｉｓ
ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ．，Ｐｅｋｉｎｇ：中，ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓ
ｓ，ｐｐ４３−５０）の主要塩、微量塩およびビタミン、３０ｇ／ｌス
クロース、１ｇ／ｌカゼイン加水分解物、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄおよび
２ｇ／ｌゲルライトを含む、ｐＨ５．８の２Ｎ６培地上で３週間、暗所中
３０℃で培養する。種子胚盤由来の増殖カルスを、新鮮な２Ｎ６培地上で、３−
７日間、継代培養する。増殖中のカルス（直径１−２ｍｍ）を選択し、２Ｎ６
液体培地（ゲルライトを含まない）に懸濁し、そいて暗所中、１２５ｒｐｍの
回転震蘯装置上で、２５℃で、フラスコ中、培養する。培地を７日ごとに交換す
る。３−４回の形質転換後、対数期の増殖している細胞を、形質転換に用いる。

【０１７７】感染、形質転換および選択懸濁イネカルス細胞を、懸濁外に定着させ、そしてその後、アグロバクテリウ
ム懸濁物中に再懸濁し、数分間接触させ放置し、そしてその後、再び、定着させ
、そしてリンスせずに、２Ｎ６−ＡＳ培地（ｐＨ５．に調整し、そして１０
ｇ／ｌＤ−グルコースおよび１００ｍＭアセトシリンゴンを含む２Ｎ６培
地）上に蒔き、そして暗所中、２５℃で３−５日間、インキュベーションする。
滅菌水中の２５０ｍｇ／ｌセフォタキシムで、増殖中の素材を完全にリンス
し、そしてその後、２Ｎ６−ＣＨ培地（ｐＨ５．８に調整した２５０ｍｇ／
ｌセフォタキシムおよび０．５−５ｍＭ組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチ
ル）グリシンを含む２Ｎ６培地）あるいは、２Ｎ６Ｋ−ＣＨ培地（Ｈｉｅｉら、
１９９４に記載されるように修飾されるが、ハイグロマイシンの代わりに、０．
５−５ｍＭ組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含む、２Ｎ６培
地）上に移し、そして暗所中、２５℃で、３週間培養する。増殖するコロニーを
、さらに７−１４日間の期間、選択培地の第二のプレート上に継代培養する。

【０１７８】植物の再生および解析増殖中のコロニーを、半分の強度のＮ６主要塩、Ｎ６微量塩、Ｎ６アミノ酸、
ＡＡ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４）のビタミン、１ｇ／ｌカゼイン加
水分解物、２０ｇ／ｌスクロース、０．２ｍｇ／ｌナフタレン酢酸、１
ｍｇ／ｌカイネチン、３ｇ／ｌゲルライトおよび所望により、０．０４
−０．１ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシンを含む、ｐＨ５．８の再生
培地上に蒔く。これらのプレートを２５℃でインキュベーションし、そして連続
照明（〜２０００ルクス）下に保持する。実施例１１に記載されるように、再生
植物を最終的に植木鉢中の土に移し、そして温室で成熟させる。

【０１７９】本質的に実施例１１に記載されるように、植物を増殖させ、そして育種する（
例えばトランスジェニック植物を自殖させる）。本質的に実施例１１に記載され
るように、植物を、グリフォセートに対する抵抗性に関し解析し、そして植物素
材を、導入遺伝子の存在、完全性および発現に関し解析する。

【０１８０】実施例１５．微粒子銃の使用による、ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むＤＮＡでのコムギ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生さらなる実施例において、コムギの適切な株（例えば春コムギｃｖボブホワイ
ト（ＢｏｂＷｈｉｔｅ）またはジャガー（Ｊａｇｇａｒ）を含む）から未成熟胚
を単離し、ホルモン（２，４−Ｄ）含有培地上で2日間インキュベーションし、
そしてＤＮＡ被覆粒子で衝撃を与えることにより、形質転換する。回復およびカ
ルスの連続増殖期間に続き、体細胞胚発生を誘導するように、固定レベルのグリ
フォセートおよび（連続希釈した）減少するレベルの２，４−Ｄを含む、一連の
培地を通じ、カルス化胚を継代培養する。選択した素材を再生し、やはりグリフ
ォセートを含む培地上で苗条を形成し、発根培地に移し、そして先のトウモロコ
シに関連する実施例におけるように、小植物（Ｔ０）に再生し、これを成熟する
まで成長させ、そして自己または交雑増殖させ、さらなる育種のため、子孫種子
（Ｔ１）を提供する。先の実施例に記載されるように、植物および植物素材を、
グリフォセートに対する抵抗性に関し評価し、そして導入遺伝子の存在、完全性
および発現に関し解析する。以下に記載される方法の代替法として、ＵＳ５６
３１１５２の実施例１に記載される方法を用いる。

【０１８１】未成熟胚の調製コムギ植物株（例えば春コムギ、トリティクム・エスティブム（Ｔｒｉｔｉｃ
ｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）ｃｖボブホワイト）を、温室で成熟するまで成長させ
、そして開花１１−１５後、頴果を単離する。５％ＮａＯＣｌ中で１５分間処
理することにより、頴果を表面滅菌し、そしてその後、繰り返し滅菌水中で洗浄
する。未成熟胚を、Ａ２培地に上層した３ｃｍ平方のナイロン網（メッシュサ
イズ１．５ｍｍ）上に、無菌的に単離する。ｐＨ５．８に調整したＡ２培地
は、４．３２ｇ／ｌＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ塩、２０ｇ／ｌ
スクロース、０．５ｇ／ｌＬ−グルタミン、２ｍｇ／ｌ２，４−Ｄ、
１００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物、２ｍｇ／ｌグリシン、１００ｍｇ
／ｌミオイノシトール、０．５ｍｇ／ｌニコチン酸、０．１ｍｇ／ｌ
チアミン．ＨＣｌおよび２．５ｇ／ｌゲルライトである。およそ５０の胚を
、固形２．５ｃｍディスク中に配置する。プレートをｌｅｕｋｏｐｏｒｅテー
プで封印し、そして暗所中、２５℃で２日間インキュベーションする。衝撃４時
間前、３６．４４ｇ／ｌＤ−ソルビトールおよび３６．４４ｇ／ｌＤ−
マンニトールを補った新鮮なＡ２培地を含むプレート上に、胚を移す。胚は、胚
が上に乗ったナイロンネットにより、プレートからプレートに移す。胚は、衝撃
前に、暗所中、２５℃で４時間、この増加した浸透圧強度の培地上に置く。

【０１８２】粒子仲介形質転換Ｘｍａ１ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むプラスミドｐＩＧＰＤ９由来ＤＮＡ
（図１２）（すなわちｐＺＥＮ９ｉ、ＺＥＮ１１ｉ、ＺＥＮ１２ｉ、ＺＥＮ１４
ｉなど）を精製し、増やし（例えば、最小５ｘＡ培地（１ｌ当たり、Ｋ₂
ＨＰＯ₄ ５２．５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ２２．５ｇ、（ＮＨ₄）２ＳＯ₄ ５
ｇおよびクエン酸ナトリウム．２Ｈ₂Ｏ２．５ｇ）中で定着期まで増殖させ
た後、適切なＨｉｓＢ−、ＲｅｃＡ大腸菌宿主株（例えばＤＨ５α：ｈｉｓＢ−
）の細胞から、プラスミドＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーまたはＣｓ
Ｃｌ₂勾配濃度で単離することにより）、そして滅菌水中の濃縮溶液（好ましく
は〜１ｍｇ／ｍｌ）として提供する。ＤＮＡは環状プラスミドＤＮＡとして提
供し、あるいは、Ｘｍａ１で制限処理し、直線ＥＰＳＰＳ−発現カセット−含
有断片を提供し、そしてアガロースゲル電気泳動および電気溶出により精製した
後、用いる。

【０１８３】Ｋｌｅｉｎら，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３に記載
されるものと類似の方式で、粒子を調製し、そしてＤＮＡで被覆する。ＤＮＡ被
覆粒子の調整および粒子銃の操作は、実施例２に記載される通りである。あるい
は、詳細は、以下の通りである。例えば、微量遠心管中の６０ｍｇの金または
タングステン粒子（〜１．０μｍ）を、ＨＰＬＣ等級のエタノール中で繰り返し
、そしてその後、滅菌水中で繰り返し洗浄する。粒子を微量遠心管中で、１ｍ
ｌの滅菌水に再懸濁し、そして５０μｌアリコットに分ける。金粒子は４℃で、
タングステン粒子は−２０℃で保存する。３ｍｇのＤＮＡを（解凍）粒子の各
アリコットに添加し、そして遠心管を最大速度でボルテックスする。ほぼ連続し
たボルテックスを維持しながら、５０μｌの２．５ＭＣａＣｌ₂および２０
μｌの０．１Ｍスペルミジンを添加する。１０分間さらにボルテックスした
後、試料をエッペンドルフ微量遠心管中で５秒間遠心分離し、上清を抜き取り、
そしてＨＰＬＣ等級エタノールを連続して添加し、粒子を洗浄する。粒子を６０
μｌのエタノールに完全に再懸濁し、そしてその後、ＰＤＳ１００粒子銃に用い
る各マクロキャリアーの表面上に、１０μｌアリコットとして分配する。

【０１８４】ＰＤＳ１０００粒子銃の構成要素を、７０％エタノールに浸すことにより表
面滅菌し、そして空気乾燥する。〜５０の胚を〜２．５ｃｍディスクに配置し
た標的プレートを、上述のように調製し、そして停止スクリーンから６ｃｍの
ところに置く。その後、１１００ｐｓｉ破裂ディスクを衝撃に用いる。各プレ
ートに、１回または２回、衝撃を与える。

【０１８５】衝撃を受けたプレートを孔テープで封印し、そして暗所中、２５℃で１６時間
維持する。ヘリウムショック波により、培地表面から取り除かれた胚を回収し、
そしてまた、マンニトールおよびソルビトールを補った同じＡ２培地の新鮮なプ
レート上で、一晩インキュベーションする。その後、衝撃を受けた胚をＡ２培地
の新鮮なプレートに移し、そして選択前に、暗所中、２５℃で１週間インキュベ
ーションする。

【０１８６】形質転換体の選択本回収期間後、カルス化胚をネットから除去し、そして２０外植体／プレート
の密度で、Ａ２２Ｐ培地（ｐＨ５．８に調整し、２ｍＭＮ−（ホスホノ
メチル）グリシンを含むＡ２培地）に移す。Ａ２２Ｐ培地上で１週間置いた後
、カルスを除去し、Ａ１２Ｐ培地（１．０ｍｇ／ｌのみの２，４−Ｄおよび
２ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシンを含むＡ２培地）に２週間、そして
そこからＡ０．５２Ｐ培地（０．５ｍｇ／ｌのみの２，４−Ｄおよび２
ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシンを含むＡ２培地）にさらに２週間、置く
。所望により、２週間のインキュベーション期間を１週間に減少させおよび／ま
たはＡ１２Ｐ培地上の中間工程のインキュベーションを省く。所望により、Ｎ
−ホスホノメチルグリシンの選択濃度は、０．５および１０ｍＭの間であるが
、２ｍＭが好ましい。培地中の下降レベルの２，４−Ｄでのこのカルス誘導期
間の総期間は、２−１０週間、好ましくは３−６週間、そして最も好ましくは〜
４週間である。

【０１８７】最大苗条成長を促進し、そして根発生を抑えるため、カルスをその後、Ｚ培地
に移す。Ｚ培地は、Ａ２培地であるが、２，４−Ｄの代わりに１０ｍｇ／ｌ
ゼアチンを含み、そしてまた、０．１ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシン
も含む。所望により、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンは、０．０４−０．２５
ｍＭの範囲である。再生カルスは、継代培養前に、３週間の期間、本培地上に
維持し、この時点で、よく発達した苗条を切除する。単一のカルス上では、１つ
の事象のみが生じる可能性がある（単一胚に相当する）ため、カルス全体を新鮮
なプレートに除去し、そして同一カルスから生じる多数のクローンが、別個の事
象として数えられることがないように、単数または複数の苗条を切除し、維持す
る。部分的に発生したカルスのみを持つカルスまたは再生領域を持たないカルス
は、さらに３週間、Ｚ培地に戻す。この期間の終了時、非再生カルスを廃棄する
。

【０１８８】苗条は、４またはそれ以上のよく発達した葉（長さ〜２ｃｍに伸長したもの
）が形成されるまで、Ｚ培地上に維持する。その後、再生植物素材を、０．５Ｍ
Ｓ培地を含むプラスチックおけに注意深く移す。ｐＨ５．８の０．５ＭＳ培
地は、２．１６ｇ／ｌのＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ塩、１５ｇ／
ｌスクロース、２．５ｇ活性炭、２．５ｇ／ｌゲルライト、１ｍｇ
／ｌグリシン、５０ｍｇ／ｌミオイノシトール、０．２５ｍｇ／ｌニ
コチン酸、０．２５ｍｇ／ｌピリドキシン．ＨＣｌ、０．０５ｍｇ／ｌ
チアミン．ＨＣｌおよび０．１ｍＭＮ−（ホスホノメチル）グリシン（所望
により０．０−０．２５ｍＭ）である。

【０１８９】植物に根が生えたら、これらを土中に植え、そして引き離し（ｗｅａｎ）、ま
たは０．５ＭＳ（Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンを含まない）および２．５
ｇ／ｌ木炭を含む、個々のガラス沸騰試験管に除去する。いかなる残存ＰＧＲ
も吸収させるため、発根培地に木炭が存在すること、または小植物と共に選択化
学薬品が移されること、および暗い発根環境を提供し、それにより生理学的に異
常な緑の根を回避することが好ましい。

【０１９０】カルス誘導および再生の最初の１週間は、暗所中、２５℃で行う。再生の第２
週は、低光で、２５℃で行い、その後、続く週は、およそ２５００ルクスの１６
時間光期で行う。

【０１９１】形質転換植物素材の増殖、育種および解析Ｔ１およびさらなる子孫を産生する方法は、当該技術分野に公知であり、そし
て、本質的に先の実施例に記載される通りである。グリフォセートに対する抵抗
性の遺伝、並びに導入遺伝子の存在、完全性および発現の解析法は、先の実施例
における通りである。

【０１９２】実施例１６．ＥＰＳＰＳ発現カセットを含むＤＮＡでの、プロトプラストのエレクトロポレーションによるコムギ株の形質転換；グリフォセートに抵抗性である植物細胞および植物の選択および再生さらなる実施例において、ＥＰＳＰＳ発現カセットを含む、そして実施例１２
、１３および１５で用いられるものと同一のプラスミドまたは直線ＤＮＡを、稔
性植物に再生することが可能なコムギ株のプロトプラストの直接形質転換に用い
る（ｃｆＵＳ５２３１０１９）。好ましくは葉組織または培養中の細胞（ｃ
ｆＧａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．およびＷｅｔｔｅｒ，Ｌ．Ｒ．，Ｐｌａｎ
ｔＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ，１９７５，１１−２
１）由来の、コムギの単離プロトプラストを、ｐＨ５．８の０．４Ｍマン
ニトール中で、およそ〜２Ｘ１０⁶プロトプラスト／ｍｌで調製する。本懸
濁物に、まず、ｐＨ５．８の修飾Ｆ培地（Ｎａｔｕｒｅ（１９８２），２９
６，７２−７４）中の分子量６０００の４０％ｗ／ｖポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）０．５ｍｌ、そして次に、望ましいプラスミドまたは直線ＤＮ
Ａ１５ｍｇおよびウシ胸腺ＤＮＡ５０ｍｇを含む水６５ｍｌを添加す
る。混合物を共に、時々攪拌しながら２６℃で３０分間インキュベーションし、
そして続いてＦ培地（Ｎａｔｕｒｅ（１９８２），２９６，７２−７４）中
に希釈する。低速遠心分離により、プロトプラストを単離し、ＣＣ培地（Ｐｏｔ
ｒｙｋｕｓ，Ｈａｒｍｓ，Ｌｏｒｚ，（１９７９）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ
．Ｇｅｎｅｔ．，５４，２０９−２１４）４ｍｌに取り、そして暗所中
、２４℃でインキュベーションする。

【０１９３】あるいは、そしてＰＥＧでの処理に加え、穀物プロトプラストの形質転換は、
熱ショックおよび／またはエレクトロポレーションのさらなる工程を用いて行う
（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら（１９８２），ｔｈｅＥＭＢＯＪ．，７，
８４１−８４５）。したがって、例えば、コムギプロトプラストをＤＮＡおよ
びマンニトールの水性溶液中でインキュベーションし、４５℃で５分間加熱し、
そしてその後、１０秒間の期間に渡り、０℃に冷却する。その後、最終濃度〜８
％ｗ／ｖまでポリエチレングリコール（Ｍｒ３Ｋ−８Ｋ）を添加する。穏や
かだが完全な混合後、エレクトロポレーション装置中で、処理を行う。Ｄｉａｌ
ｏｇ「Ｐｏｒａｔｏｒ」（Ｄｉａｌｏｇ、ドイツ・デュッセルドルフ）のチャン
バーを、７０％エタノールで洗浄することにより滅菌し、そしてその後、滅菌
空気中で乾燥する。プロトプラストの懸濁物（０．４Ｍマンニトール中のお
よそ〜２Ｘ１０⁶プロトプラスト／ｍｌ＋ＤＮＡ）を塩化マンガンで調
整し、測定電気抵抗を〜１．４ｋオームとする。体積〜０．４ｍｌの試料を
、１０秒間隔で、１０００および２０００Ｖの間の適用電圧の３回のパルスに
さらす。その後、こうして形質転換されたプロトプラストを収集し、そしてＣＣ
培地中に希釈しなおす。

【０１９４】当業者は、これらの形質転換法の多くの変更および変動が可能であり、そして
例えば、形質転換はまた、ｐＨを９．５に上昇させることにより、および／また
は形質転換を行う溶液中のカルシウムイオン濃度を増加させることにより、改善
することも可能であることを認識するであろう。

【０１９５】３−１４日後、発生細胞培養のアリコットを、１および５ｍＭの間（好まし
くは２ｍＭ）の組織培養等級Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン（Ｓｉｇｍａ）
の別の選択濃度を含む培地に移す。こうして同定された抵抗性細胞コロニー（非
形質転換コントロールに許容されるより、少なくとも２倍高い濃度のグリフォセ
ート上で増殖を示すもの）を、やはり選択濃度範囲のグリフォセートを含む新鮮
な寒天培地に移し、そして実施例１５に記載されるように、連続して減少する濃
度の２，４−Ｄを含むプレート間で継代培養する。増殖する抵抗性コロニーを、
組換えＤＮＡの存在に関し（ＰＣＲなどにより）解析してもよい。カルス段階で
多くの選択を達成するのは可能である可能性も可能でない可能性もある。いかな
る場合でも、すべての増殖カルスを先の工程に進める。

【０１９６】その後、増殖カルスを、ゼアチンおよびＮ−（ホスホノメチル）グリシンを含
む苗条再生培地に移し、そしてそこから、正確に実施例１５に記載されるような
発根培地に移す。その後、当該技術分野に知られ、そして実施例１５に記載され
るように、そして実施例１１に記載される解析法を用い、グリフォセート−抵抗
性ＥＰＳＰシンターゼを発現する稔性トランスジェニック植物を再生し、選択し
、そして試験する。

【０１９７】実施例１７．ＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、そして動力学的定数を決定する方法。未精製（ｃｒｕｄｅ）植物素材においてＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、そしてグリフォセートに抵抗性である全比率を識別するための方法ＥＰＳＰＳ酵素アッセイアッセイは、一般的に、Ｋ＋イオンを陽イオン性対イオンの主要な種とし、Ｐ
ａｄｇｅｔｔｅら、１９８７（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２５８（２）５６４−５７３）の放射
化学法にしたがい、行う。２５℃でｐＨ７．０の５０ｍＭＨｅｐｅｓ（Ｋ
ＯＨ）中の総体積５０μｌのアッセイは、示されるように、１０％グリセロー
ル、および５ｍＭＤＴＴ、多様な基質としての（動力学的測定のため）ある
いは１００または２５０μＭで固定された¹⁴ＣＰＥＰおよび２または０．７５
ｍＭのシキミ酸３リン酸（Ｋ＋塩）を含むＨｅｐｅｓｐＨ７．０中に適切
に希釈された精製酵素または植物抽出物（以下を参照されたい）を含む。所望に
より、未精製植物抽出物のアッセイでは、アッセイはまた、５ｍＭＫＦおよ
び／または０．１ｍＭモリブデン酸アンモニウムも含む。アッセイは、¹⁴Ｃ
ホスホエノールピルビン酸（シクロヘキシルアンモニウム＋塩）の添加で開始
し、そして２−１０分後（２分が好ましい）、１部分の１Ｍ酢酸および９部分
のエタノールの溶液５０μｌの添加で停止する。停止後、２０μｌを、シンクロ
パック（ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）ＡＸ１００（２５ｃｍｘ４．６ｍ
ｍ）カラム上に装填し、そして移動相が３５分間に渡り０．５ｍｌ／分で流れ
る、０．２８Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．５を用いたアイソクラチック溶
出を用い、クロマトグラフィーする。これらの条件下では、ＰＥＰおよびＥＰＳ
Ｐの保持時間は、それぞれ、〜１９および２５分である。ＣＰ５２５ＴＲシン
チレーションカウンターを、ＡＸ１００カラムの末端につなぐ。０．５ｍｌ
フローセルを取り付け、そしてシンチレーション物（ＵｌｔｉｍａＦｌｏ
ＡＰ）の流速を１ｍｌ／分に設定する。ＰＥＰおよびＥＰＳＰの相対ピーク面
積を統合し、標識ＰＥＰのＥＰＳＰへの変換の割合を決定する。見かけのＫ_mお
よびＶｍａｘ値は、ＥｒｉｔｈａｃｕｓＳｏｆｔｗａｒｅＬｔｄ．のＧｒａ
ｆｉｔ３．０９ｂを用いた単純加重で双曲線に適合する最小二乗により決定す
る。Ｋｍ値は、一般的に、Ｋ_m／２−１０Ｋ_mの範囲の８−９の多様な基質濃度
および３つ組点を用い、確認する。特に明記される場合を除き、データ点は、基
質のＥＰＳＰへの変換が＜３０％である解析にのみ含まれる。

【０１９８】シキミ酸−３−Ｐｉ（Ｓ３Ｐ）は以下のように調製する。０．０５Ｍシキ
ミ酸、０．０６６５ＭＡＴＰ（Ｎａ塩）、１０ｍＭＫＦ、５ｍＭＤＴ
Ｔ、および０．０５ＭＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを含む０．３ＭＴＡＰＳ、ｐ
Ｈ８．５の７ｍｌに、７５μｌの７７単位（μｍｏｌ分^-1）ｍｌ^-1溶液の
シキミ酸キナーゼを添加する。室温で２４時間置いた後、９５℃に簡単に加熱す
ることにより、反応を停止する。反応溶液を、０．０１ＭＴｒｉｓＨＣｌ
ｐＨ９中で５０倍に希釈し、そして０−０．３４ＭＬｉＣｌ₂勾配を用
い、Ｄｏｗｅｘ１Ｘ８−４００上での陰イオン交換により、クロマトグラ
フィーする。Ｓ３Ｐ分画を合わせ、凍結乾燥し、そしてその後、７ｍｌの再蒸
留Ｈ₂Ｏに再溶解する。その後、２８ｍｌの０．１ＭＢａ（ＣＨ₃ＣＯＯＨ
）₂および１８９ｍｌの無水エタノールを添加する。本溶液を４℃で一晩攪拌
する。三−バリウムＳ３Ｐの生じた沈殿物を収集し、そして３０ｍｌの６７％
エタノール中で洗浄する。その後、洗浄沈殿物を、〜３０ｍｌの再蒸留Ｈ₂
Ｏに溶解する。Ｋ₂ＳＯ₄を添加することにより、必要に応じ、Ｓ３ＰのＫ⁺また
はＴＭＡ⁺塩が産生される。過剰な硫酸の添加を最小限にするよう、非常に注意
する。ＢａＳＯ₄沈殿物を除去し、そしてＳ３Ｐの必要な塩を含む上清を凍結乾
燥する。各塩を重量測定し、そしてプロトンＮＭＲにより解析する。こうして調
製されたＳ３Ｐ調製は、プロトンＮＭＲによると、＞９０％純粋であり、そして
（その重量および３１ＰＮＭＲの統合によると）硫酸カリウムの少量の残渣し
か含まない。

【０１９９】ＥＰＳＰＳアッセイに適した植物素材抽出物の調製カルスまたは小植物素材（０．５−１．０ｇ）を、液体窒素で冷却した乳鉢
および乳棒で、細かい凍結粉末にすり砕く。この粉末を、等体積の適切な冷却抽
出緩衝液（例えば、１ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭＤＴＴ、１．７ｍＭ「ｐ
ｅｆａｂｌｏｃ」（セリンプロテアーゼ阻害剤）、１．５ｍＭロイペプチン
、１．５ｍＭペプスタチンＡ、１０％ｖ／ｖグリセロールおよび１％
ポリビニルピロリドンを含む、ｐＨ７．５の５０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩
衝液）に取り、再懸濁し、混合し、そして冷却遠心分離装置中で遠心分離し、破
片を落とす。上清を、１ｍＭＥＤＴＡ、３ｍＭＤＴＴおよび１０％ｖ／
ｖグリセロールを含む、ｐＨ７．５の２５ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝
液中で、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５の冷却ＰＤ１０カラムで交換する。タンパク
質は、ウシ血清アルブミンを用いて規準化したブラッドフォード法により、概算
する。抽出物の一部を液体窒素で凍結し；一部は直ちにアッセイする。

【０２００】植物抽出物のＥＰＳＰＳアッセイは、０．１ｍＭＮ−（ホスホノメチル）
グリシンの非存在下または存在下いずれかで、０．１ｍＭ ¹⁴Ｃ−ＰＥＰおよ
び０．７５ｍＭシキミ酸−３−Ｐｉを用い、上述のように標準的に行う。こ
れらのアッセイ条件下で、ＥＰＳＰＳの抵抗型（以下を参照されたい）は、＜８
．５％阻害されると概算され、一方、感受性ｗ／ｔ型は、本質的に完全に阻害さ
れる（＞９８％）。したがって、グリフォセートの存在下で観察される活性レベ
ル（Ａ）は、導入遺伝子発現由来の抵抗性酵素のレベルの〜９２％に相当すると
みなされ、一方、感受性ｗ／ｔＥＰＳＰＳのレベルは、グリフォセートの非存
在下に観察されるＥＰＳＰＳ活性の総レベルからＡｘ〜１．０８を引いたも
のとみなされる。突然変異酵素のＶｍａｘは、ｗ／ｔ酵素のＶｍａｘの約３分の
１でしかないと概算されるため（そしてｗ／ｔおよび突然変異型両方のＰＥＰの
Ｋｍは、約２０μＭまたはそれ未満であると概算されるため）、内因性ｗ／ｔ
ＥＰＳＰＳの発現レベルに比較した突然変異酵素ポリペプチドの発現レベルは、
その相対観察活性の比に基づいて計算された比より、約３倍高いとみなされる。
ＥＰＳＰＳポリペプチド発現の総レベル（突然変異体＋ｗ／ｔ）もまた、ウ
ェスタンを用いて概算する（以下を参照されたい）。

【０２０１】実施例１８．大腸菌における、成熟イネＥＰＳＰＳをコードするｗ／ｔおよび突然変異ｃＤＮＡのクローニングおよび発現。ｗ／ｔおよび突然変異イネＥＰＳＰＳの精製および性質決定ｗ／ｔ成熟イネＥＰＳＰＳの発現、精製および性質決定イネＥＰＳＰＳｃＤＮＡは、製造者に供給される推奨にしたがい、ＢＲＬの
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＲＴを用い、イネ変種コシガリ（Ｋｏｓｈｉｇａｒｉ
）より単離されたＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用い、増幅する。ＰＣＲは、製造
者に供給される方法にしたがい、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕターボポリメラ
ーゼを用い、行う。増幅反応および逆転写工程に、以下のオリゴヌクレオチドを
用いる。ＳＥＱＩＤＮｏ．３３イネ３’オリゴ

【０２０２】

【化３２】

【０２０３】ＳＥＱＩＤＮｏ．３４イネ５’オリゴ

【０２０４】

【化３３】

【０２０５】ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓのＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯキットを用い、Ｐ
ＣＲ産物をｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩにクローニングする。挿入物の配列は、配列
決定により確認し、そして予測されるオープンリーディングフレームが、開始Ｍ
ｅｔの存在を例外とし、予測される成熟葉緑体イネＥＰＳＰＳタンパク質のもの
に対応することを確認する。クローニングされそして確認されたイネＥＰＳＰＳ
配列を、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１を用いて切除し、そして精製断片を、同様
に消化されたｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。組換えクロ
ーンを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに供給される大腸菌のコドン最適化ＲＰ株、ＢＬ
２１（ＤＥ３）に導入する。ＥＰＳＰＳタンパク質は、発酵培地（１００μｇ／
ｍｌカナマイシンを補ったＬＢ）に１ｍＭＩＰＴＧを添加した後、本株で
発現させる。正しい予測質量の組換えタンパク質は、ｉ）細胞抽出物のＳＤＳゲ
ルのクーマシーブルー染色および空のｐＥＴ２４ａベクターで形質転換された同
様の大腸菌細胞の抽出物のクーマシー染色ゲルとの並べた比較に基づき、そして
ｉｉ）あらかじめ精製された植物ＥＰＳＰＳタンパク質に対して作成されたポリ
クローナル抗体を用いたウェスタン解析により、同定する。成熟イネＥＰＳＰＳ
タンパク質は、〜４℃で以下のように精製する。２５ｇの細胞湿重量を、５
ｍＭＤＴＴ、２ｍＭＥＤＴＡおよび２０％ｖ／ｖグリセロールを含む
、ｐＨ７．５の０．１ＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ緩衝液５０ｍｌ中で洗浄す
る。低速遠心分離後、細胞ペレットを、同一であるが２ｍＭの「Ｐｅｆａｂｌ
ｏｃ」セリンプロテアーゼ阻害剤も含む緩衝液５０ｍｌに再懸濁する。細胞は
、ガラスホモジナイザーを用い、均質に懸濁し、そしてその後、Ｃｏｎｓｔａｎ
ｔＳｙｓｔｅｍｓ（ＢｕｄｂｒｏｏｋｅＲｄ，Ｗａｒｗｉｃｋ，Ｕ．Ｋ
．）ＢａｓｉｃＺ細胞破壊装置を用い、１００００ｐｓｉで破壊する。未精
製抽出物を〜３０，０００ｇで１時間遠心分離し、そしてペレットを廃棄する
。硫酸プロタミン（サルミン）を、最終濃度０．２％まで添加し、混合し、そし
て溶液を３０分間放置する。沈殿素材を、〜３０，０００ｇで３０分間の遠心
分離により除去する。アリスター（Ａｒｉｓｔａｒ）等級の硫酸アンモニウムを
、飽和４０％の最終濃度まで添加し、３０分間攪拌し、そしてその後、〜２７，
０００ｇで３０分間遠心分離する。ペレットを細胞破壊に用いたのと同一の緩
衝液〜１０ｍｌ中に再懸濁し、さらに硫酸アンモニウムを添加し、溶液を飽和
〜７０％にし、溶液を３０分間攪拌し、そして再び遠心分離し、ペレットを得て
、これを、Ｓ２００緩衝液（１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡおよび２０
％ｖ／ｖグリセロールを含む１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．
８））〜１５ｍｌに再懸濁する。これをろ過（０．４５ミクロン）し、Ｓ２０
０緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を含むＫ２６／６０カラムに装
填し、そしてクロマトグラフィーする。ＥＰＳＰＳ酵素活性に基づき検出された
ＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そしてＳ２００緩衝液で平衡化したＨＰＱ−Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ２０ｍｌを含むｘｋ１６カラムに装填する。カラムをＳ２
００緩衝液で洗浄し、そしてその後、同一緩衝液中の０．０Ｍから０．２Ｍ
ＫＣｌで展開させた直線勾配内で、ＥＰＳＰＳを溶出させる。ＥＰＳＰＳは、
塩濃度０．１Ｍ以下に対応する単一ピーク内に溶出する。ＥＰＳＰＳ酵素活性
に基づき検出されたＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７
５緩衝液（２ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡおよび１０％ｖ／ｖグリ
セロールを含む、２５ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５））で平衡化
したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５のＨｉＬｏａｄｘｋ２６／６０カラムに装填する
。ＥＰＳＰＳはカラムから、より後に溶出し、これは、推定される二量体の分子
量に基づき予測することが可能である。これは、低イオン強度でのゲルマトリッ
クスとタンパク質の相互作用による可能性がある。ＥＰＳＰＳ酵素活性に基づき
同定されたＥＰＳＰＳ含有分画を合わせ、そして同じＳｕｐｅｒｄｅｘ７５緩
衝液で平衡化したＭｏｎｏＱの１ｍｌカラムに装填する。カラムを出発緩衝液
で洗浄し、そしてＥＰＳＰＳは、０．０および０．２ＭＫＣｌの間で展開さ
せる１５ｍｌ直線勾配の過程で、単一ピークとして溶出する。ＥＰＳＰＳは
、精製の本工程で、ほぼ（＞９０％）純粋で得られる。所望により、ＥＰＳＰＳ
を、１．０Ｍ（アリスター）硫酸アンモニウムを含むＳｕｐｅｒｄｅｘ７５緩
衝液中の交換および同一緩衝液で平衡化されたフェニルセファロースの１０ｍ
ｌカラムへの装填により、さらに精製する。ＥＰＳＰＳは、１．０および０．０
Ｍ硫酸アンモニウムの間で展開させた減少硫酸アンモニウム直線勾配の過程
中、初期に、単一ピークとして溶出する。

【０２０６】グリフォセート抵抗性突然変異イネＥＰＳＰＳのクローニング、発現、精製および性質決定ｐＣＲＢｌｕｎｔ中のイネＥＰＳＰＳｃＤＮＡを、特定の変化を導入するよ
う設計された以下のプライマー対を用い、さらに２回のＰＣＲのテンプレートと
して用いる。ＳＥＱＩＤＮｏ．３５イネ５’オリゴ

【０２０７】

【化３４】

【０２０８】ＳＥＱＩＤＮｏ．３６イネ突然変異逆方向からＲＶ

【０２０９】

【化３５】

【０２１０】ＳＥＱＩＤＮｏ．３７イネ３’オリゴ

【０２１１】

【化３６】

【０２１２】ＳＥＱＩＤＮｏ．３８イネ突然変異順方向からｓａｌ

【０２１３】

【化３７】

【０２１４】生じた産物をゲル精製し、そして等モル濃度で試験管に入れ、イネ５’および
３’オリゴを用いた別のＰＣＲ周期のテンプレートとして利用する。Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎｓのＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯキットを用い、ＰＣＲ産物をｐ
ＣＲＢｌｕｎｔＩＩにクローニングする。挿入物のＤＮＡ配列および予測され
るオープンリーディングフレームが、予測される成熟葉緑体イネＥＰＳＰＳタン
パク質に対応し（開始Ｍｅｔの存在を例外とする）、そしてまた望ましい変化（
ＥＰＳＰＳ配列中の特定の位でのＴからＩおよびＰからＳの特定の突然変異）が
コードされることも確認する。こうしてクローニングされそして確認されたイネ
ＥＰＳＰＳ配列を、Ｎｄｅ１およびＸｈｏ１を用いて切除し、そして精製断
片を、同様に消化されたｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする。
組換えクローンを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに供給される大腸菌のコドン最適化Ｒ
Ｐ株、ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入する。ＥＰＳＰＳタンパク質は、発酵培地（１
００μｇ／ｍｌカナマイシンを補ったＬＢ）に１ｍＭＩＰＴＧを添加した
後、本株で発現させる。正しい予測質量の組換えタンパク質は、ｉ）細胞抽出物
のＳＤＳゲルのクーマシーブルー染色および空のｐＥＴ２４ａベクターで形質転
換された同様の大腸菌細胞の抽出物のクーマシー染色ゲルとの並べた比較に基づ
き、そしてｉｉ）あらかじめ精製された植物ＥＰＳＰＳタンパク質に対して作成
されたポリクローナル抗体を用いたウェスタン解析により、同定する。イネＥＰ
ＳＰＳの本突然変異型は、ｗ／ｔイネＥＰＳＰＳに関し上述された方法と類似の
方式で、精製しそして性質決定する。

【０２１５】こうして得たイネＥＰＳＰＳの突然変異型を、２ｍＭシキミ酸−３−Ｐｉ
の存在下で上述のようにアッセイすると、〜１０μｍｏｌ／分／ｍｇの見かけの
Ｖｍａｘおよび２２μＭのＰＥＰに関するＫｍを有する。４０μＭＰＥＰでは
、グリフォセートのカリウム塩に関するＩＣ５０値は〜０．６ｍＭである。突
然変異ＥＰＳＰＳのグリフォセートカリウムに関する概算Ｋｉ値は、〜０．２
ｍＭである。

【０２１６】実施例１９．精製イネＥＰＳＰＳに対する抗体の調製およびウェスタン解析法ウサギにおいてポリクローナル抗血清を生成する標準法を用いる。ウサギは若
いメスニュージーランドホワイト（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅ）であ
る。免疫感作過程は、各々〜１００ｍｇで、１ヶ月間隔で投与される４用量か
らなる。リン酸緩衝生理食塩水中の各用量は、フロイントの完全アジュバント（
用量１）または不完全アジュバント（用量２−４）を用いたエマルジョンとして
投与し、そして４つの皮下部位に注射する。用量１を投与する前に前出血を採取
する。試験出血は、第二の用量の１４日後に採取し、免疫反応を確認する。期間
出血は、第四の用量の１４日後に採取し、そして実験に用いる。第五および最終
用量は、第四の用量から少なくとも６週間経過してから投与し、そして最終出血
（やはり実験に用いる）は、１４日後に採取する。抗体は、（ｉ）精製天然ｗ／
ｔイネＥＰＳＰＳ（実施例８）およびまた（ｉｉ）１２％ＳＤＳゲルのバンド
切り出しから溶出させたＳＤＳ−変性イネＥＰＳＰＳポリペプチド（タンパク質
の正しい位置は、バンドのクーマシーブルー染色と並べることにより、正確に印
をつける）両方に対し、作成する。

【０２１７】ＳＤＳゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングには、１２％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いる。１００Ｖの定電流で９０分間、電気泳動を行う。ゲルを
、ニトロセルロースシートに対し、一定の３０Ｖで、４℃で一晩、ブロッティン
グする。０．１％Ｔｗｅｅｎを含む５％Ｍａｒｖｅｌリン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ）中で、シートを１または２時間ブロッキングし、ＰＢＳ
−ｔｗｅｅｎ中で３回洗浄し、そして〜１．３ｍｇＩｇＧ／ｍｌ（通常、期
間出血の１：４０００ないし１：２０，０００希釈に同等）のイネＥＰＳＰＳ−
Ｒｂ１一次抗体中でインキュベーションする。これらの抗体希釈を、１％Ｍａ
ｒｖｅｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食
塩水）中に、２時間適用する。二次抗体、ヤギ抗ウサギＨＲＰ（ＳｉｇｍａＡ
６１５４）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎおよび１％Ｍａｒｖｅｌを含むＰＢＳ
中、１：１０，０００または１：２０，０００で適用する。二次抗体とのインキ
ュベーションは、１時間続け、ブロットをＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で
３回洗浄し、ＥＣＬ基質を、通常１分間適用し、そしてフィルムを１０−６０秒
間曝露する。陰性コントロールブロットは、（１）試験免疫血清と同じ［ＩｇＧ
］を生じるよう計算された希釈での免疫前血清（ＩｇＧは、各血清のアリコット
から日常的に精製し、そしてこれらの希釈を直接計算することが可能であるよう
に定量化する）およびまた（２）フロイントのアジュバントのみに対して作成さ
れた免疫血清でのブロットである。コントロール免疫血清のＩｇＧ濃度は、コン
トロールが適切な濃度のＩｇＧであるように、調整する。この計算を行うため、
０．４５μｍシリンジフィルターを通じたろ過および１ｍｌＨｉＴｒａｐ
プロテインＧカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａカタログ番号：１７−０４０４−０１
）の通過により、未精製抗血清からＩｇＧを精製する。結合ＩｇＧは、０．１
ＭグリシンＨＣｌｐＨ２．９でカラムから溶出させ、そしてＰＢＳに対
し、一晩透析する。ＩｇＧ濃度は、ＵＶ測定により、概算する。（純粋ＩｇＧの
１ｍｇｍｌ^-1溶液の１ｃｍ通過長は、２８０ｎｍ波長で１．３５の吸光
度を有する）。ＩｇＧ収量から、未精製抗血清中のＩｇＧ濃度の計算を行うこと
が可能であり、そしてしたがってウェスタンブロットの正確な希釈を計算するこ
とが可能である。

【０２１８】植物組織試料は、例えば実施例１７に記載されるように調製する。あるいは、
ウェスタン解析には、はるかにより単純な方法を用いる。１００−２００ｍｇ
の解析しようとする植物組織を、等体積の緩衝液（実施例７中と類似のもの）中
で迅速にホモジナイズし（例えばｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ、ビーズ混合装置ま
たはガラスホモジナイザーを用いる）、冷却エッペンドルフ微量遠心管中で５分
間遠心分離し、そして上清は、ａ）少量のアリコットを、タンパク質に関し、ブ
ラッドフォード法を用いて解析し、そしてｂ）大部分は、ＬａｅｍｌｉＳＤＳ
「試料緩衝液」と１：１で混合し、加熱し、そしてその後、ゲルに装填する準備
が出来た状態で保存する。典型的には、ＳＤＳスラブゲルには、１０ウェル中に
１０タンパク質試料を装填する。典型的には、これらは０および２０ｎｇの間
の純粋イネＥＰＳＰＳの標準曲線と並べた解析のための１ないし１０μｇの植物
素材の未精製抽出物である。いくつかの場合、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎ
ａｐｕｓ）由来の精製ｗ／ｔＥＰＳＰＳに対して作成した抗体（上述のものと
類似の方法を用い、発現させそして精製する）を用い、ウェスタンを行う。この
場合、抗体の交差反応強度は、イネＥＰＳＰＳに対して作成された抗体を用いた
場合より、イネＥＰＳＰＳ（または内因性植物コムギまたはトウモロコシＥＰＳ
ＰＳ）で弱いが、にもかかわらず推論される標準曲線に比較し、有用な定量的情
報に十分な反応を提供する。

【０２１９】実施例２０．トランスジェニック植物素材からのゲノムＤＮＡの単離。ＰＣＲ解析。ＤＮＡプローブ調製およびハイブリダイゼーション。導入遺伝子のコピー数および完全性ゲノムＤＮＡは、例えば、Ｄｅｌｌｐｏｒｔａら（１９８３）Ｃｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ：Ｉｍｐａｃｔｏ
ｆＮｅｗＣｏｎｃｅｐｔｓ，１８’ｔｈＳｔａｄｌｅｒＧｅｎｅｔｉ
ｃｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｊ．Ｐ．ＧｕｓｔａｆｓｏｎおよびＲ．Ａｐ
ｐｅｌｓ監修，ニューヨーク：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ中，ｐｐ２６３−
２８２の方法を用い、あるいはＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、
植物、小植物およびカルス素材から単離する。突然変異イネＥＰＳＰＳ導入遺伝
子を含むトランスジェニックカルスおよび植物分離体は、イネＥＰＳＰＳゲノム
配列内の突然変異に特異的なＳＥＱＩＤＮｏ．３９および４０のオリゴヌク
レオチドプライマーを用いた蛍光ＰＣＲを用い、同定する。二本鎖ＤＮＡに挿入
する蛍光色素ＳＹＢＲ緑をＰＣＲに含み、突然変異イネＥＰＳＰＳ遺伝子を含む
試料が、ＡＢＩ３３７７装置を用いて検出される、試料中の蛍光の増加により
、同定されるようにする。あるいは、当業者は、プライマーを蛍光標識してもよ
く、そして分子ビーコンおよび「スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）」などの
技術が利用可能であることを知るであろう。ＳＥＱＩＤＮｏ．３９イネＤＭＦｗｄ２−３Ａ

【０２２０】

【化３８】

【０２２１】ＳＥＱＩＤＮｏ．４０普遍的逆方向

【０２２２】

【化３９】

【０２２３】典型的ＰＣＲ反応は、９６ウェル光学プレートに調製されそして光学的ふた（
ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で封印され、以下の通りである：５．０μｌｇＤＮＡテンプレート（ＱｉａｇｅｎＤＮｅａｓｙｐｒｅｐ）
１２．５μｌ２ｘＳＹＢＲ緑プレミックス２．５μｌ５ｐｍｏｌ／μｌストック順方向プライマー２．５μｌ５ｐｍｏｌ／μｌストック逆方向プライマー２．５μｌｄｄＨ２Ｏ２５．０μｌ総体積以下の反復パラメーターにしたがう：工程１：５０℃ ｘ２０分工程２：９５℃ ｘ１０分工程３：５０周期の９５℃ ｘ１５秒間６０℃ ｘ４５秒間試料内の蛍光変化は、反応の工程３から７秒ごとに記録する。

【０２２４】サザンブロッティングには、およそ１０μｇのＤＮＡを各制限消化に用いる。
ゲノムＤＮＡは、製造者（例えばＰｒｏｍｅｇａ）の指示にしたがい、適切な制
限酵素（例えばＨｉｎｄＩＩＩ）で消化する。突然変異ＥＰＳＰＳ配列内およ
び外で切断する制限酵素両方を選択する。ＤＮＡは、ＴＡＥ（０．０４Ｍｔ
ｒｉｓ−酢酸、１ｍＭＥＤＴＡ）０．８％アガロースゲルを用いて分離す
る。サザンブロッティングは、ＨｙＢｏｎｄＮ＋ニトロセルロースブロッティ
ング膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９に提供される方法にしたがい、行う。ＵＶ照射に曝露することにより、
ＤＮＡを膜に架橋する。

【０２２５】特異的プローブを生成するのに用いたＤＮＡ断片は、プラスミドＤＮＡの制限
消化のゲル上で精製することにより単離し、またはＰＣＲにより生成する。例え
ば、イネＥＰＳＰＳ遺伝子のイントロン１を含む７００ｂｐ断片は、以下に示
されるようなプライマーを用いたＰＣＲにより、生成する。ＳＥＱＩＤＮｏ．４１ＩＮＴ１／５

【０２２６】

【化４０】

【０２２７】ＳＥＱＩＤＮｏ．４２ＩＮＴ１／３

【０２２８】

【化４１】

【０２２９】こうしたプローブを、ランダムプライミング法、例えばＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇ
ｏＤＮＡ標識ビーズ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用い、³²Ｐで
標識し、そして例えば、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＧ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用い、精製する。

【０２３０】ＤＮＡゲルのブロットを、５ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、２ｘデン
ハルト溶液、０．１５ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で、６５℃で少なく
とも１時間、プレハイブリダイズする。その後、ブロットを、新鮮なプレハイブ
リダイゼーション溶液中で、６５℃で１６−２４時間、変性プローブとハイブリ
ダイズさせる。膜をブロットして乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーを用
いて視覚化する。

【０２３１】サザンブロッティングが、単一の特定の大きさの制限断片でハイブリダイズす
るプローブにより示されるように、導入遺伝子の単一遺伝子座での単一組込みを
示す場合、別のプローブを用いたブロットの再ハイブリダイゼーションを通じ、
結果を確認する。コントロールのため、非形質転換素材を用いる。これに加え、
構築物の完全性を確認するため、ブロットを、導入遺伝子構築物の他の領域（例
えばプロモーター、５’ＵＴＲイントロンまたは上流エンハンサー配列）に特異
的なハイブリダイゼーションプローブでさらに探査してもよい。さらに、アグロ
バクテリウム形質転換を用いた場合、特異的プローブを用い、スーパーバイナリ
ベクターのＲＢおよびＬＢを越えて伸長するいかなるＤＮＡの存在または非存在
も示す。ＳＥＱＩＤＮｏ．４３イネＥＰＳＰＳゲノム（ＡＴＧから−ＷＴ配列）

【０２３２】

【化４２】

【０２３３】ＳＥＱＩＤＮｏ．４４イネＥＰＳＰＳゲノム（ＡＴＧから、二重突然変異
を含む）

【０２３４】

【化４３】

【０２３５】ＳＥＱＩＤＮｏ．４５ＦＭＶエンハンサー

【０２３６】

【化４４】

【０２３７】ＳＥＱＩＤＮｏ．４６ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー１

【０２３８】

【化４５】

【０２３９】ＳＥＱＩＤＮｏ．４７ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサー２

【０２４０】

【化４６】

【０２４１】ＳＥＱＩＤＮｏ．４８トウモロコシ・ポリユビキチンエンハンサー

【０２４２】

【化４７】

【０２４３】ＳＥＱＩＤＮｏ．４９イネ・アクチンエンハンサー

【０２４４】

【化４８】

【０２４５】ＳＥＱＩＤＮｏ．５０イネＧＯＳ２エンハンサー

【０２４６】

【化４９】

【０２４７】ＳＥＱＩＤＮｏ．５１オオムギ・プラストシアニンエンハンサー

【０２４８】

【化５０】

【０２４９】ＳＥＱＩＤＮｏ．５２イネゲノムＧ１ＥＰＳＰＳ（ＡＴＧまで）

【０２５０】

【化５１】

【０２５１】ＳＥＱＩＤＮｏ．５３イネゲノムＧ３ＥＰＳＰＳ（ＡＴＧまで）

【０２５２】

【化５２】

【０２５３】ＳＥＱＩＤＮｏ．５４イネゲノムＧ２ＥＰＳＰＳ＋トウモロコシＡ
ｄｈ１イントロン

【０２５４】

【化５３】

【０２５５】ＳＥＱＩＤＮｏ．５５トウモロコシＡｄｈ１イントロン

【０２５６】

【化５４】

【図面の簡単な説明】

【図１】イネＥＰＳＰＳゲノム図式的マップ。

【図２】ベクターｐＣＲ４−ＯＳＥＰＳＰＳ（ベクターｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ中のイネ
ｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子）

【図３】二重突然変異を導入するのに用いた戦略の図式的説明。

【図４】ベクターｐＴＣＶ１００１。

【図５】ベクターｐＴＣＶ１００１ＯＳＥＰＳＰＳ（ベクターｐＴＣＶ１００１中にイ
ネｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含む）。

【図６】ベクターｐＴＣＶ１００１ＥＰＳＰＳＰＡＣ（ベクターｐＴＣＶ１００１中に
イネｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含む）。

【図７】ベクターｐＢｌｕＳＫ＋ＥＰＳＰＳ（ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ＋中にイネｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子を含む）。

【図８】ベクターｐＰＡＣ１。

【図９】ベクターｐＴＣＶＥＰＳＰＳＰＨ。

【図１０】ベクターｐＴＣＶＥＰＳＰＳＡＤＨ。

【図１１】ベクターｐＢｌｕＳＫＥＰＳＰＳＡＤＨ（イネｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子およびＡ
ｄｈ１イントロンを含む）。

【図１２】ベクターｐＩＧＰＤ９。

【図１３】ベクターＺｅｎ９。

【図１４】ベクターＺｅｎ１２。

【図１５】ベクターＺｅｎ１８。

【図１６】スーパーバイナリベクターへのＺｅｎベクターの導入。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年４月１０日（２００１．４．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９９０９９６８．１ (32)優先日平成11年４月29日(1999．4．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９１７８３９．４ (32)優先日平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９１７８４０．２ (32)優先日平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９１７８４６．９ (32)優先日平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９１７８４７．７ (32)優先日平成11年７月29日(1999．7．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９３０２０４．４ (32)優先日平成11年12月21日(1999．12．21) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９３０２０９．３ (32)優先日平成11年12月21日(1999．12．21) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９３０２０７．７ (32)優先日平成11年12月21日(1999．12．21) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号９９３０２００．２ (32)優先日平成11年12月21日(1999．12．21) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ワーナー，サイモン・アンソニー・ジェイムズイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・インターナショナル・リサーチ・センター (72)発明者アンドリューズ，クリストファー・ジョンイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・インターナショナル・リサーチ・センター (72)発明者バチョー，サトヴィンダーイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・インターナショナル・リサーチ・センター (72)発明者ピッケリル，アンドリュー・ポールイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・インターナショナル・リサーチ・センターＦターム(参考） 2B030 AB04 AD05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 EA10 FA02 FA06 GA11 HA01 4B065 AA89X AA89Y AB01 AC20 BA02 CA53 4H011 AB01 BA01 BB17 BC18 BC19 DH10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳＥＱＩＤＮｏ．４３に示される配列を含む、単離ポ
リヌクレオチド。
【請求項２】イネ（ｒｉｃｅ）およびトウモロコシ（ｃｏｒｎ）ＥＰＳ
ＰＳをコードするｃＤＮＡを除くＥＰＳＰＳをコードするポリヌクレオチドであ
って、０．１％ＳＤＳを含む０．１強度クエン酸緩衝生理食塩水中、６５およ
び７０℃の間の温度でインキュベーションし、その後、０．１％ＳＤＳを含む
０．１強度クエン酸緩衝生理食塩水で、同一温度でリンスした際、なおＳＥＱ
ＩＤＮｏ．４３に示される配列とハイブリダイズするものに相補的である、前
記ポリヌクレオチド。
【請求項３】ＳＥＱＩＤＮｏ．４３の配列内のイントロンを構成す
るポリヌクレオチドを用い、植物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
ることにより得ることが可能なＥＰＳＰＳをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】葉緑体輸送ペプチドおよび該ペプチドの３’のグリフォセ
ート抵抗性５−エノールピルビルシキミ酸リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコ
ードする領域を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記領域が、植物機能可能
プロモーターの発現調節下にあり、但し、前記プロモーターが、前記領域に関し
異種性でなく、そして葉緑体輸送ペプチドが、前記シンターゼに関し異種性でな
い、前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】請求項１−４のいずれかに記載のポリヌクレオチドであっ
て、転写の５’から３’方向に、以下の構成要素：（ｉ）エンハンサーが得られる配列の転写開始より上流にある亢進領域であり、
そしてそれ自体、内因的に含まれている配列でも、または構築物の一部として異
種的に存在する際でも、プロモーターとして機能しない、少なくとも１つの転写
エンハンサー；（ｉｉ）イネＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーター；（ｉｉｉ）イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードするイネゲノム配列；（ｉｖ）イネＥＰＳＰＳをコードするゲノム配列；（ｖ）転写ターミネーター；ここで、イネＥＰＳＰＳコード配列は、第一の位が突然変異し、本位での残基が
、ＴｈｒよりもＩｌｅであるように、そして第二の位が突然変異し、本位での残
基が、ＰｒｏよりもＳｅｒであるように修飾し、野生型酵素で以下の保存領域Ｇ
ＮＡＧＴＡＭＲＰＬＴＡＡＶを含むＥＰＳＰＳ配列に、修飾配列がＧＮＡＧＩＡ
ＭＲＳＬＴＡＡＶとなるように、突然変異を導入するを含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６】前記亢進領域が、その３’端が、エンハンサーが得られる
配列の最近転写開始の少なくとも４０ヌクレオチド上流である配列を含む、請求
項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】亢進領域が、その３’端が、前記最近開始の少なくとも６
０ヌクレオチド上流である領域を含む、請求項５または６いずれか記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項８】前記亢進領域が、その３’端が、エンハンサーが得られる
配列のＴＡＴＡコンセンサスの最初のヌクレオチドから少なくとも１０ヌクレオ
チド上流である配列を含む、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】第一および第二の転写エンハンサーを含む、請求項５−８
のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】第一および第二のエンハンサーがポリヌクレオチド中、
タンデムに存在する、請求項９記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約１００ないし約１０００ヌクレオチド上
流である、請求項５−１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約１５０ないし約１０００ヌクレオチド上
流である、請求項５−１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約３００ないし約９５０ヌクレオチド上流
である、請求項５−１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約７７０ないし約７９０ヌクレオチド上流
である、請求項２−１３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約３００ないし約３８０ヌクレオチド上流
である、請求項２−１３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】エンハンサー、または第一のエンハンサーの３’端が、
ＥＰＳＰＳ輸送ペプチドの翻訳開始に対応するコドン、または５’非翻訳領域の
イントロンの第一のヌクレオチドの、約３２０ないし約３５０ヌクレオチド上流
である、請求項２−１３および１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】イネＥＰＳＰＳ遺伝子由来のプロモーターの上流の領域
が、ＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始から上
流の配列由来の、少なくとも１つのエンハンサーを含む、請求項５−１６のいず
れかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】５’から３’方向に、ＧＯＳ２プロモーターの転写開
始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー、およびＣａＭ
Ｖ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始から上流の配列由
来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含む、請求項１７記載のポリヌク
レオチド。
【請求項１９】５’から３’方向に、イネ・アクチンプロモーターの転
写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー、およびＦ
ＭＶ３５ＳまたはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターいずれかの転写開始から上流の配
列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを含む、請求項１８記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項２０】５’から３’方向に、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）プラス
トシアニンプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第
一のエンハンサー、およびＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいず
れかの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを
含む、請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】５’から３’方向に、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ポリ
ユビキチンプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第
一のエンハンサー、およびＣａＭＶ３５ＳまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターいず
れかの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第二のエンハンサーを
含む、請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】５’から３’方向に、ＦＭＶ３５Ｓプロモーターの転写
開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第一のエンハンサー、およびＣａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターの転写開始から上流の配列由来の転写亢進領域を含む第
二のエンハンサーを含む、請求項１７記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドの翻訳開始を構成す
るコドンの５’のヌクレオチドが、コザックの好ましい配列である、請求項１−
２２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをそこにコードする
イネゲノム配列の５’に、イントロンとして機能する配列を含む非翻訳領域が位
置する、請求項５−２３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】非翻訳領域がイントロンを含み、該イントロンがトウモ
ロコシＡＤＨＩイントロンである、請求項２４記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】イントロンがＳＥＱＩＤＮｏ．５５に示される配列
を含む、請求項２４または２５いずれか記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】イネＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチドをコードするイネゲ
ノム配列の５’の非翻訳領域内に位置する、ウイルス由来翻訳エンハンサーまた
は他の非ウイルス翻訳エンハンサーを含む、請求項５−２６のいずれかに記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項２８】さらに、それを含む植物素材（ｍａｔｅｒｉａｌ）に、
少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質（ｔｒａｉｔ）：昆虫、真菌、ウ
イルス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えるこ
とが可能なタンパク質をコードする領域を含む、請求項５−２７のいずれかに記
載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】除草剤がグリフォセート以外である、請求項２８記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項３０】昆虫抵抗性付与領域が、分泌Ｂｔ毒素を含むＢｔ由来の
結晶毒素；プロテアーゼ阻害剤、レクチン、キセンホラブドゥス（Ｘｅｎｈｏｒ
ａｂｄｕｓ）／フォトラブドゥス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）毒素をコードし
；真菌抵抗性付与領域が、既知のＡＦＰ、デフェンシン、キチナーゼ、グルカナ
ーゼ、Ａｖｒ−Ｃｆ９をコードするものからなる群より選択され；細菌抵抗性付
与領域が、セクロピンおよびテキプレシン（ｔｅｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）並びにそ
れらの類似体をコードするものからなる群より選択され；ウイルス抵抗性領域が
、ウイルスコートタンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅ
ｉｎ）、ウイルスレプリカーゼをコードする遺伝子、並びにウイルス抵抗性を提
供することが知られるアンチセンスおよびリボザイム配列からなる群より選択さ
れ；ストレス、塩、および干ばつ抵抗性付与領域が、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼおよびペルオキシダーゼ、既知のＣＢＦ１制御配列を構成する配列
、並びにトレハロースの集積を提供することが知られる遺伝子をコードするもの
より選択される、請求項２８または２９いずれか記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】昆虫抵抗性付与領域が、ｃｒｙＩＡｃ、ｃｒｙＩＡｂ、
ｃｒｙ３Ａ、Ｖｉｐ１Ａ、Ｖｉｐ１Ｂ、システインプロテアーゼ阻害剤、お
よびユキノハナ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）レクチン遺伝子からなる群より選択される
、請求項３０記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび／または望ましくない
スプライシング領域が除去され、あるいは作物に好まれるコドンが用いられ、植
物において、こうして修飾されたポリヌクレオチドの発現が、これらが内因性で
ある生物における非修飾ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の発現により
得られるのと、実質的に類似の活性／機能を有する、実質的に類似のタンパク質
を生じるように修飾されている、いずれでもよい先行する請求項に記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項３３】修飾ポリヌクレオチドおよび前記植物に内因的に含まれ
、そして実質的に同一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間の同一性
の度合いが、修飾および内因性配列の間の共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）を妨げるようなものである、先行する請求項記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】前記度合いが約７０％未満である、先行する請求項記載
のポリヌクレオチド。
【請求項３５】いずれでもよい先行する請求項のポリヌクレオチドを含
むベクター。
【請求項３６】請求項１−３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチ
ド、または請求項３５のベクターで形質転換されている、植物素材。
【請求項３７】請求項１−３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチ
ド、または請求項３５のベクターで形質転換されており、そして、それを含む植
物素材に、少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイル
ス、細菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが
可能なタンパク質をコードする領域を含むポリヌクレオチドで、さらに形質転換
されている、またはされる、植物素材。
【請求項３８】請求項３６または３７いずれか記載の素材から再生され
ている、形態学的に正常な稔性の全植物、それらの子孫、種子および部分。
【請求項３９】請求項１−３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチ
ドを含み、そして請求項１−３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチドまた
は請求項３５のベクターで形質転換された素材から再生されている植物を交雑す
ることから生じる、形態学的に正常な稔性の全植物、そしてそれを含む植物素材
に、少なくとも１つの以下の農学的に望ましい形質：昆虫、真菌、ウイルス、細
菌、線虫、ストレス、乾燥、および除草剤に対する抵抗性を与えることが可能な
タンパク質をコードする領域を含むポリヌクレオチドで形質転換されている植物
、生じた植物の子孫、その種子および部分。
【請求項４０】穀物（ｆｉｅｌｄｃｒｏｐｓ）、果実および野菜、例
えば、カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）、タバコ（ｔ
ｏｂａｃｃｏ）、テンサイ（ｓｕｇａｒｂｅｅｔ）、ワタ（ｃｏｔｔｏｎ）、
トウモロコシ、コムギ（ｗｈｅａｔ）、オオムギ、イネ、モロコシ（ｓｏｒｇｈ
ｕｍ）、トマト（ｔｏｍａｔｏ）、マンゴー（ｍａｎｇｏ）、モモ（ｐｅａｃｈ
）、リンゴ（ａｐｐｌｅ）、セイヨウナシ（ｐｅａｒ）、イチゴ（ｓｔｒａｗｂ
ｅｒｒｙ）、バナナ（ｂａｎａｎａ）、メロン（ｍｅｌｏｎ）、ジャガイモ（ｐ
ｏｔａｔｏ）、ニンジン（ｃａｒｒｏｔ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、キャベ
ツ（ｃａｂｂａｇｅ）、タマネギ（ｏｎｉｏｎ）、ダイズ種（ｓｏｙａｓｐｐ
）、サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ）、エンドウ（ｐｅａ）、農場マメ（ｆ
ｉｅｌｄｂｅａｎｓ）、ポプラ（ｐｏｐｕｌａｒ）、ブドウ（ｇｒａｐｅ）、
柑橘類、ムラサキウマゴヤシ（ａｌｆａｌｆａ）、ライムギ（ｒｙｅ）、オーツ
ムギ（ｏａｔ）、芝生（ｔｕｒｆ）および飼い葉（ｆｏｒａｇｅｇｒａｓｓｅ
ｓ）、アマ（ｆｌａｘ）およびアブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄｒａｐｅ）、並びに
、すでに特に言及されていない限り、ナッツ産生植物からなる群より選択される
、請求項３８または３９いずれか記載の植物、それらの子孫、種子および部分。
【請求項４１】請求項３８−４０のいずれかに記載のトウモロコシ、コ
ムギまたはイネ植物。
【請求項４２】雑草および請求項３８−４１のいずれかに記載の植物ま
たは子孫を含む野外で、雑草を選択的に調節する方法であって、該植物に実質的
に影響を与えることなく、雑草を調節するのに十分な量のグリフォセート型除草
剤を該野外に適用することを含む、前記方法。
【請求項４３】グリフォセート除草剤の適用前または後いずれかに、１
つまたはそれ以上の以下：除草剤、殺虫剤（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）、殺真菌
剤、殺線虫剤、殺細菌剤および抗ウイルス剤を、該野外に適用することをさらに
含む、先行する請求項記載の方法。
【請求項４４】グリフォセート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵
抗性である植物を産生する方法であって：（ｉ）植物素材を、請求項１ないし３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチ
ドまたは請求項３５のベクターで形質転換し；（ｉｉ）こうして形質転換された素材を選択し；そして（ｉｉｉ）こうして選択された素材を、形態学的に正常な稔性の全植物に再生す
る工程を含む、前記方法。
【請求項４５】形質転換が：（ｉ）ポリヌクレオチドで被覆された粒子
での素材の微粒子銃；または（ｉｉ）ポリヌクレオチドを含む溶液で被覆された
炭化ケイ素ファイバー上での素材の突き刺し（ｉｍｐａｌｅｍｅｎｔ）；または
（ｉｉｉ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）へのポリヌクレ
オチドまたはベクターの導入およびこうして形質転換されたアグロバクテリウム
と植物素材の共培養、該植物素材はこれにより形質転換され、そして続いて再生
される、による、素材へのポリヌクレオチドへの導入を伴う、先行する請求項記
載の方法。
【請求項４６】形質転換素材がグリフォセートに対する抵抗性により選
択される、先行する請求項記載の方法。
【請求項４７】グリフォセート除草剤に実質的に耐性または実質的に抵
抗性である、植物組織および／または形態学的に正常な稔性の全植物の産生にお
ける、請求項１ないし３４のいかなる１つでもよいポリヌクレオチド、または請
求項３５のベクターの使用。
【請求項４８】潜在的な除草剤の高処理ｉｎｖｉｔｒｏスクリーニン
グのための除草剤標的の産生における、請求項１ないし３４のいかなる１つでも
よいポリヌクレオチド、または請求項３５のベクターの使用。
【請求項４９】目的の遺伝子を発現するよう形質転換された生物学的素
材を選択する方法であって、形質転換素材が、請求項１ないし３４のいかなる１
つでもよいポリヌクレオチド、または請求項３５のベクターを含み、そして選択
が、形質転換素材をグリフォセートまたはその塩に曝露し、そして生存素材を選
択することを含む、前記方法。
【請求項５０】生物学的素材が植物起源である、先行する請求項記載の
方法。
【請求項５１】植物が単子葉植物である、先行する請求項記載の方法。
【請求項５２】単子葉植物が、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、イネ
、オーツムギ、ライムギ、モロコシ、パイナップル（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ）、サ
トウキビ、バナナ、タマネギ、アスパラガス（ａｓｐａｒａｇｕｓ）、リーキ（
ｌｅｅｋ）からなる群より選択される、先行する請求項記載の方法。
【請求項５３】異質の（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡを含む稔性形質転換植
物を再生するための方法であって：（ａ）形質転換しようとする前記植物から再生可能組織を産生し；（ｂ）前記再生可能組織を前記の異質のＤＮＡで形質転換し、ここで前記の異質
のＤＮＡは選択可能ＤＮＡ配列を含み、前記配列は、選択装置として再生可能組
織中で機能する；（ｃ）工程（ｂ）後、約１日ないし約６０日の間に、工程（ｂ）の前記再生可能
組織を、前記組織から苗条（ｓｈｏｏｔ）を産生することが可能な培地中に置き
、ここで前記培地は、前記選択可能ＤＮＡ配列を含む再生可能組織を選択するの
に用いられる化合物をさらに含み、形質転換再生組織の同定または選択を可能に
する；（ｄ）工程（ｃ）の選択された組織から少なくとも１つの苗条が形成された後、
前記苗条を、前記苗条から根を産生し、小植物（ｐｌａｎｔｌｅｔ）を産生する
ことが可能な第二の培地に移し、ここで第二の培地は、所望により、前記化合物
を含む；そして（ｅ）前記小植物を稔性トランスジェニック植物に成長させる、ここで、異質の
ＤＮＡは、メンデル方式で子孫植物に伝達され、工程（ｂ）および工程（ｃ）の
間に、形質転換素材をカルス誘導培地上に置く、所望による工程があり、異質の
ＤＮＡが、請求項１ないし３４のいずれかに記載のポリヌクレオチドであり、ま
たは異質のＤＮＡにより含まれる選択可能ＤＮＡ配列が、該ポリヌクレオチドを
含むことで特徴付けられ、そして前記化合物がグリフォセートまたはその塩であ
る、工程を含む、前記方法。
【請求項５４】植物が、バナナ、コムギ、イネ、トウモロコシおよびオ
オムギからなる群より選択される単子葉植物である、先行する請求項記載の方法
。
【請求項５５】前記再生可能組織が、胚発生カルス、体細胞胚、未成熟
胚などからなる群より選択される、請求項５３または５４いずれか記載の方法。