CN111944843B - 一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，属于植物基因工程技术领域。本发明的遗传转化方法包括：外植体选择及预培养、农杆菌侵染、诱导培养形成组培苗等过程，利用本发明的遗传转化方法可在短时间内培育出大量优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，不仅可以缩短转化时间，提高遗传转化效率，而且转化体系稳定，不受时间和季节的影响，可以大批量的为华北地区培育生产具有抗蛀干害虫性能的优良黑杨品系。

Description

一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。
背景技术
杨树是世界上中纬度平原地区栽培面积最大的速生用材树种之一，具有生长快、产量高和易于更新的特点，也是对碳固定贡献最大的林木树种。从栽培面积上，我国杨树人工林面积已达700万公顷，位居世界首位。
随着杨树造林面积的不断扩大，单一品系的过度利用导致杨树病虫害愈演愈烈。据统计，我国森林因病虫害年损失约1.4亿亩，直接经济损失达880亿元。尤其是，天牛等蛀干害虫，由于其幼虫在树干内隐蔽为害，世代长且不整齐，受环境影响小，天敌种类少，采用化学、物理、生物防治等手段难度较大，一旦发生为害，造成的损失惨重。因此，培育抗蛀干害虫杨树新品系是杨树产业化可持续发展亟待解决的重要问题。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种重要的杀虫微生物，具有高度特异的杀虫活性，不仅对人类和牲畜没有危害，且不污染环境。采用基因工程手段将Bt基因转入植物且在植物体中进行表达，从而赋予了转基因植物抗虫性。当前研究表明，对天牛等鞘翅目害虫具有特异杀虫活性的主要是Bt886Cry3A基因。但是，通过实验发现将Bt886Cry3A基因转化杨树后，对天牛的控制并没有达到预期的效果。因此，改造Bt886Cry3A同源基因，并在杨树中实现高效表达从而获得抗虫型窄冠黑杨成为控制天牛为害的关键。
窄冠黑杨11号是由山东农业大学庞金宣、李际红等通过杂交选育出的杨树优良新品种，该新品种树冠窄，冠幅比一般大冠杨树小1/2-1/3，生长快、材质好，耐盐碱能力较强，是华北地区主栽杨树品系。目前还未见有通过将抗虫基因转入窄冠黑杨11号以提高其抗蛀干害虫能力的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法。采用本发明的方法，可以在短时间内培育出优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，提高了遗传转化效率，而且转化体系稳定，外源抗虫基因转入杨树之后，能够持续高表达抗虫毒蛋白，杀虫效果显著。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，包括以下步骤：
(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；
(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；
(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；
(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗。
优选的，步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片。
优选的，步骤(1)中，所述预培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基。
优选的，步骤(1)中，暗培养的时间为24h。
优选的，步骤(3)中，农杆菌侵染液的OD600在0.3-0.5之间，侵染时间为8-10min。
优选的，步骤(3)中，所述窄冠黑杨11号叶盘分化培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基。
优选的，步骤(3)中，所述一号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基。
优选的，步骤(4)中，所述二号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L、cef300mg/L-500mg/L、和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基。
优选的，步骤(4)中，所述生根培养基为添加有25-30g/L、琼脂5-7g/L、NAA0.1mg/L-0.2mg/L、IBA 0.1mg/L-0.2mg/L和活性炭0.5mg/L-1.0mg/L的1/2MS培养基。
优选的，步骤(5)中，采用PCR和RT-PCR技术对生根的幼苗进行鉴定。
本发明的有益效果：
利用本发明的遗传转化方法可在短时间内培育出优质的抗蛀干害虫窄冠黑杨11号新品系，不仅可以缩短转化时间，提高遗传转化效率(转化效率可达20％)，而且转化体系稳定，不受时间和季节的影响，可以大批量的为华北地区培育生产具有抗蛀干害虫性能的优良黑杨品系。
附图说明
图1：携带有杨树抗蛀干害虫基因(P2-Bt886Cry3Aa-P1)的重组质粒的结构示意图。
图2：窄冠黑杨11号转抗虫基因实验流程图；其中，A为培养25天的生根苗，B为生根苗遗传转化中预培养阶段，C为生根苗遗传转化中共培养阶段，D为转基因植株生根培养基中长势，E为转基因植株移栽后情况。
图3：窄冠黑杨11号转基因植株的PCR鉴定；其中，M：Marker 2000；CK-：阴性对照；CK+：阳性对照；1-3：转基因植株。
图4：窄冠黑杨11号转基因植株的RT-PCR鉴定结果柱状图；1-6分别是转基因植株。
图5：天牛粪便(A)和中肠液(B)中毒蛋白含量的测定。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，窄冠黑杨11号是由山东农业大学庞金宣、李际红等通过杂交选育出的杨树优良品系，属于华北地区的主栽杨树品系类型，对其进行基因工程的抗虫改造具有重要的意义。
基于此，本发明考虑将抗虫基因转入窄冠黑杨11号以提高其抗蛀干害虫能力。研究表明，对天牛等鞘翅目害虫具有特异杀虫活性的主要是Bt886Cry3Aa基因。但是，将Bt886Cry3Aa基因转化杨树后，由于表达量低等因素的影响，并不能有效地控制天牛。
因此，选择何种抗虫基因是对窄冠黑杨11号进行抗虫改造所面临的技术难点之一。本发明基于Bt886Cry3Aa基因，从天牛的消化生理入手，通过采用噬菌体展示技术筛选出与天牛肠道内主要消化酶内切葡聚糖酶特异结合的活性短肽P1(LPPNPTK)和P2(TPHRSPL)。通过将该短肽与Bt886Cry3Aa毒蛋白融合，获得融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1，其序列如SEQ ID NO.1所示，提高了毒蛋白与天牛肠道的结合能力，从而延长了Bt毒蛋白在天牛肠道内的滞留时间，提高了毒蛋白杀死天牛的活性为有效控制天牛提供了一条新的途径。
在获得了融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1作为窄冠黑杨11号抗虫改造的基因之后，如何有效的将融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1转入至窄冠黑杨11号体内并高效表达，是本发明所面临的又一技术难点。
相对于其他杨树种类，目前对于窄冠黑杨11号的抗虫转基因研究未见报道，故需要通过分析影响其遗传转化的因素，比如取材类型、侵染时间、培养条件、培养基各激素配比等，从而来筛选出各个影响因素的最佳组合方式以提高杨树的遗传转化效率。
在本发明的转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法中，首先对取材类型进行了优选，本发明选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮、叶型平展的叶片，并去除叶柄和前端三分之一。本发明研究发现，叶片的前1/3处并不会分化形成小芽，去除叶片前端的1/3不仅可以在有限的培养皿里多放几片，而且还可以减少后期的污染。
本发明还对培养基的种类及组成进行了优选，通过设置一号选择培养基进行初次筛选，筛选出转基因植株，但可能存在一定数量的假阳性；因此，本发明进一步设置了二号选择培养基，二号选择培养基在一号选择培养基的基础上增加了头孢进行筛选；经两次筛选后，可以确定所筛选出的植株为转基因植株。
对于生根培养基，本发明在生根培养基中添加了一定量的活性炭，活性炭具有吸附作用，而且黑色的活性炭加入培养基以后，可以使得培养基是黑色的，会更像地下黑暗的环境，更加适宜根的生长。
现有报道的杨树的遗传转化效率(遗传转化效率＝检测为阳性的植株数/转化得到的全部植株数×100％)一般不到10％。而采用本发明优化后的方法对窄冠黑杨11号进行遗传转化，转化效率可达20％，与现有报道的杨树遗传转化效率相比有了极大的提高。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
预培养基：1/2MS+蔗糖25-30g/L+琼脂5-7g/L+6-BA0.2mg/L-0.3mg/L+NAA0.05mg/L-0.1mg/L。
窄冠黑杨11号叶盘分化培养基：1/2MS+蔗糖25-30g/L+琼脂5-7g/L+6-BA0.2mg/L-0.3mg/L+NAA0.05mg/L-0.1mg/L。
一号选择培养基：1/2MS+蔗糖25-30g/L+琼脂5-7g/L+6-BA0.2mg/L-0.3mg/L+NAA0.05mg/L-0.1mg/L+kan 30mg/L-50mg/L+GA30.05mg/L-0.15mg/L。
二号选择培养基：1/2MS+蔗糖25-30g/L+琼脂5-7g/L+6-BA0.2mg/L-0.3mg/L+NAA0.05mg/L-0.1mg/L+kan 30mg/L-50mg/L+cef 300mg/L-50mg/L+GA30.05mg/L-0.15mg/L。
生根培养基：1/2MS+蔗糖25-30g/L+琼脂5-7g/L+NAA 0.1mg/L-0.2mg/L+IBA0.1mg/L-0.2mg/L+活性炭0.5-1.0mg/L。
实施例1：转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法
(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗叶片，选取的无菌苗叶片应为从顶芽向下数第3-6片生长健壮、叶型平展的叶片。去除叶柄和前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，放在预培养培养基上，在24℃条件下进行24小时暗培养。
(2)采用冻融法将携带有杨树抗蛀干害虫基因(P2-Bt886Cry3Aa-P1)的重组质粒(图1)转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液；
杨树抗蛀干害虫基因P2-Bt886Cry3Aa-P1是融合基因。其中，Bt886Cry3Aa来源于苏云金芽孢杆菌Bt菌株，P1(LPPNPTK)和P2(TPHRSPL)是纤维素酶特异亲和短肽编码序列(7个氨基酸)，二者通过PCR扩增进行融合，得到P2-Bt886Cry3Aa-P1基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1的构建过程：
采用噬菌体展示技术筛选出能与天牛肠道内切葡聚糖酶特异亲合的短肽P1(LPPNPTK)和P2(TPHRSPL)。将编码P1和P2短肽的核苷酸序列添加到上下游引物的5’端，以携带Bt886Cry3Aa基因序列的pET-30a(+)-2K质粒为模板，通过PCR扩增的方法获得融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1。
获得农杆菌侵染液的具体方法如下：
①取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于冰水浴中或室温下融化。
②无菌条件下，向刚化冻的感受态细胞悬浮液中加入1微克(约10μl)需要转化的质粒DNA细胞，轻轻混匀，冰水浴中静置10min。
③将离心管置于液氮中速冻5min。
④然后快速将离心管置于37℃水浴中保持5min，不要晃动水面。
⑤将离心管放回冰水浴中再保持5min。
⑥无菌条件下加入800μl无抗生素的LB液体培养基或YT，于28℃振荡养2-3h，目的是使菌体复苏并表达抗生素抗性。
⑦5000rpm离心1min收菌，留100μl左右上清液，轻轻吸打重悬菌体，加到相应抗生素的LB固体平板上，用无菌的细菌涂布器将细菌均匀涂开，28℃培养48-72h，挑单菌落小摇。
农杆菌的振荡培养条件为：在28℃条件下振荡培养12～16h(200r/min)，使农杆菌生长至对数期，OD600在0.3-0.5之间。取活化好的农杆菌菌液150μl，倒入新培养液中(成分100mL LB+100μL利福平+100μL kan)28℃，180～210rmp摇过夜。
(3)将切好的叶片放入农杆菌侵染液中在室温条件下进行侵染，侵染时间为8-10min，期间不时摇晃。将侵染好的叶片置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并转移到光下进行培养，培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
(4)培养大约30天左右，切口处会形成不定芽，将生长到1-1.5cm的不定芽掰下，转移到二号选择培养基上进行培养，培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h，待3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中进行培养，培养温度为25±2℃，光照强度为2000-3000lx，光照时间为12h。
(5)对上述生根幼苗进行PCR和RT-PCR检测，将检测结果为阳性的植株进行移栽炼苗，从而得到转抗虫基因的的窄冠黑杨11号转基因植株。
通过两次筛选得到阳性植株。然后提取阳性转基因植株和野生型植株的基因组DNA进行PCR分子检测。PCR反应体系如下：primer 0.2pmol/μl，1×PCRbuffer，Mg2+1.5mM，dNTP 0.2mM，Taq DNA polymerase 0.05U/μl，0.001-0.01μg/μl植物DNA。
将反应管放入PCR仪中，按以下参数设计循环程序：94℃5min，94℃30s，72℃1min，循环30次，72℃10min，4℃恒温保存。
PCR分子检测，NPT II引物F：5'-ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CT-3'(SEQID NO.2)；R：5'-TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG-3'(SEQ ID NO.3)。
窄冠黑杨11号转基因植株的PCR鉴定结果如图3所示；窄冠黑杨11号转基因植株的RT-PCR鉴定结果如图4所示；因为叶片本身的生长发育情况有所差异，虽然尽量选取生长情况一致的叶片，但多少会存在一些差异，再者在侵染、晾干等操作的过程中，也会出现一定的差异，所以在外源基因转化的过程中也会出现表达量的差异。一般情况下，选用表达量在20以上的转基因植株进行后续的实验及新品系的筛选。
试验例1：
将P2-Bt886Cry3Aa-P1基因进行原核表达，对融合蛋白进行鉴定和纯化；并以桑天牛一龄幼虫为试虫，进行生物活性测定；以Bt886Cry3Aa毒蛋白作为对照。
结果显示，融合毒蛋白P2-Bt886Cry3Aa-P1对桑天牛幼虫的杀虫活性与Bt886Cry3Aa毒蛋白相比显著提高。通过分析天牛取食毒蛋白后不同时间点粪便中毒蛋白的含量，发现融合毒蛋白P2-Bt886Cry3Aa-P1排出高峰时间显著晚于Bt886Cry3Aa(图5A)。对天牛肠液中毒蛋白的浓度的分析结果表明，取食P2-Bt886Cry3Aa-P1的天牛肠道毒蛋白的含量，是取食Bt886Cry3Aa的天牛肠道毒蛋白含量的2倍左右(图5B)。这些结果表明，通过将天牛肠道内切葡聚糖酶特异亲合短肽P1和P2与Bt886Cry3Aa融合，显著延长了Bt毒蛋白在天牛肠道内的滞留时间，从而提高了杀死天牛的活性。
试验例2：
本试验在河北省河间市北石槽乡恒道村耘润农民专业合作社联合社大田进行，试验地周围以农田为主转基因杨树是杂种雄株，花期在5年左右，本试验转基因杨树种植2年甚至更长均不会结实(窄冠黑杨11号是杂种雄株)，基本杜绝转基因杨树向周围农田扩散的可能性。试验材料共包括2个转基因株系，分别是转Bt886Cry3Aa基因和转融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1；每个转基因材料种植30棵，共60棵。中间试验地内的苗木，株行距为2m×3m。转基因杨树试验的地不使用任何农药。中间试验期期限为2年，实验期间安排专业人员跟踪调查，并安排专人进行安全监控。试验结束后一年内，该地块不做杨树实验用，发现残留植株就地清除。
对转基因阳性植株进行了天牛抗性测定。采集当年生转Bt基因杨树枝条，将清洗干净的枝条剪成5mm左右的小段，用液氮冷冻后，迅速在粉粹机上进行粉碎。然后将粉碎后的木屑加入天牛人工饲料，配制成半人工饲料。采用管式饲虫法。将1.5ml离心管剪掉底部，塞上脱脂棉，装入适量半人工饲料，再将幼虫放入管中。1个离心管内饲养1头幼虫，该方法便于实验室内饲养并观察其生活史，且减少饲料的浪费。每个转基因无性系饲养18-20头光肩星天牛，相当于17个重复。每隔5天换一次饲料，记录死亡数，观察蜕皮情况，并测量天牛的体重、体长、头壳宽等数据。连续饲养48天。
使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，结果表明，与野生型和携带Bt886Cry3Aa的转基因植株相比，携带融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1的转基因株系的天牛的死亡率明显提高。与野生型相比，携带融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1的转基因株系的天牛的死亡率提高了27.22％；与携带Bt886Cry3Aa的转基因植株相比，携带融合基因P2-Bt886Cry3Aa-P1的转基因株系的天牛的死亡率提高了10％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60
accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120
gacgacaagg ccatggccac tccgcatcgt tctcctctga tgataagaaa gggaggaaga 180
aaaatgaatc cgaacaatcg aagtgaacat gatacaataa aaactactga aaataatgag 240
gtgccaacta accatgttca atatccttta gcggaaactc caaatccaac actagaagat 300
ttaaattata aagagttttt aagaatgact gcagataata atacggaagc actagatagc 360
tctacaacaa aagatgtcat tcaaaaaggc atttccgtag taggtgatct cctaggcgta 420
gtaggtttcc cgtttggtgg agcgcttgtt tcgttttata caaacttttt aaatactatt 480
tggccaagtg aagacccgtg gaaggctttt atggaacaag tagaagcatt gatggatcag 540
aaaatagctg attatgcaaa aaataaagct cttgcagagt tacagggcct tcaaaataat 600
gtcgaagatt atgtgagtgc attgagttca tggcaaaaaa atcctgtgag ttcacgaaat 660
ccacatagcc aggggcggat aagagagctg ttttctcaag cagaaagtca ttttcgtaat 720
tcaatgcctt cgtttgcaat ttctggatac gaggttctat ttctaacaac atatgcacaa 780
gctgccaaca cacatttatt tttactaaaa gacgctcaaa tttatggaga agaatgggga 840
tacgaaaaag aagatattgc tgaattttat aaaagacaac taaaacttac gcaagaatat 900
actgaccatt gtgtcaaatg gtataatgtt ggattagata aattaagagg ttcatcttat 960
gaatcttggg taaactttaa ccgttatcgc agagagatga cattaacagt attagattta 1020
attgcactat ttccattgta tgatgttcgg ctatacccaa aagaagttaa aaccgaatta 1080
acaagagacg ttttaacaga tccaattgtc ggagtcaaca accttagggg ctatggaaca 1140
accttctcta atatagaaaa ttatattcga aaaccacatc tatttgacta tctgcataga 1200
attcaatttc acacgcggtt ccaaccagga tattatggaa atgactcttt caattattgg 1260
tccggtaatt atgtttcaac tagaccaagc ataggatcaa atgatataat cacatctcca 1320
ttctatggaa ataaatccag tgaacctgta caaaatttag aatttaatgg agaaaaagtc 1380
tatagagccg tagcaaatac aaatcttgcg gtctggccgt ccgctgtata ttcaggtgtt 1440
acaaaagtgg aatttagcca atataatgat caaacagatg aagcaagtac acaaacgtac 1500
gactcaaaaa gaaatgttgg cgcggtcagc tgggattcta tcgatcaatt gcctccagaa 1560
acaacagatg aacctctaga aaagggatat agccatcaac tcaattatgt aatgtgcttt 1620
ttaatgcagg gtagtagagg aacaatccca gtgttaactt ggacacataa aagtgtagac 1680
ttttttaaca tgattgattc gaaaaaaatt acacaacttc cgttagtaaa ggcatataag 1740
ttacaatctg gtgcttccgt tgtcgcaggt cctaggttta caggaggaga tatcattcaa 1800
tgcacagaaa atggaagtgc ggcaactatt tacgttacac cggatgtgtc gtactctcaa 1860
aaatatcgag ctagaattca ttatgcttct acatctcaga taacatttac actcagttta 1920
gacggggcac catttaatca atactatttc gataaaacga taaataaagg agacacatta 1980
acgtataatt catttaattt agcaagtttc agcacaccat tcgaattatc agggaataac 2040
ttacaaatag gcgtcacagg attaagtgct ggagataaag tttatataga caaaattgaa 2100
tttattccag tgaatttgcc gcctaatccg acgaagtaag agctc 2145
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atctcctgtc atctcacctt gctcct 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcagaagaac tcgtcaagaa g 21

Claims (2)

1.一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取窄冠黑杨11号无菌苗的叶片，去除叶柄和叶片前端三分之一，保留的部分垂直于主叶脉割3-4刀，得到外植体，将外植体放在预培养基上进行暗培养；
(2)将携带有P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的重组质粒转入农杆菌中，获得农杆菌侵染液，所述P2-Bt886Cry3Aa-P1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(3)将步骤(1)中暗培养后的外植体放入农杆菌侵染液中进行侵染，将侵染好的外植体置于窄冠黑杨11号叶盘分化培养基上，暗培养48h后转移到一号选择培养基上，并移至光下进行培养；
(4)培养至外植体切口处形成的不定芽生长到1-1.5cm，取下不定芽，转移到二号选择培养基上，培养3-4天后，将生长健壮的不定芽接种到窄冠黑杨11号的生根培养基中继续进行培养；
(5)对生根的幼苗进行鉴定，获得转抗虫基因的窄冠黑杨11号阳性苗；
步骤(1)中，选取的无菌苗叶片为从顶芽向下数第3-6片生长健壮，叶型平展的叶片；
步骤(1)中，所述预培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基；
步骤(1)中，暗培养的时间为24h；
步骤(3)中，农杆菌侵染液的OD600在0.3-0.5之间，侵染时间为8-10min；
步骤(3)中，所述窄冠黑杨11号叶盘分化培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L和NAA 0.05mg/L-0.1mg/L的1/2MS培养基；
步骤(3)中，所述一号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基；
步骤(4)中，所述二号选择培养基为添加有蔗糖25-30g/L、琼脂5-7g/L、6-BA 0.2mg/L-0.3mg/L、NAA 0.05mg/L-0.1mg/L、kan 30mg/L-50mg/L、cef 300mg/L-500mg/L、和GA30.05mg/L-0.15mg/L的1/2MS培养基；
步骤(4)中，所述生根培养基为添加有25-30g/L、琼脂5-7g/L、NAA 0.1mg/L-0.2mg/L、IBA 0.1mg/L-0.2mg/L和活性炭0.5mg/L-1.0mg/L的1/2MS培养基。
2.根据权利要求1所述的遗传转化方法，其特征在于，步骤(5)中，采用PCR和RT-PCR技术对生根的幼苗进行鉴定。
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