CN102276728A - 以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 - Google Patents
以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102276728A CN102276728A CN2011102271413A CN201110227141A CN102276728A CN 102276728 A CN102276728 A CN 102276728A CN 2011102271413 A CN2011102271413 A CN 2011102271413A CN 201110227141 A CN201110227141 A CN 201110227141A CN 102276728 A CN102276728 A CN 102276728A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cry3aa
- seq
- protein
- fusion
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Abstract
本发明以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途，属于生物技术领域。以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于：所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1；或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1且羧基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.2所示的短肽P2。该融合蛋白比野生Bt蛋白能够在害虫体内滞留更长时间，具有更高的杀虫活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列，截止目前为止已发现和克隆了四五百种ICPs基因。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。
1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1A基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加，给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白在植物保护领域的应用潜力巨大，有待人们去大力开发。
Bt886-cry3Aa是目前分离出的已知对对鞘翅目害虫有特异毒杀作用的苏云金芽孢杆菌分泌的毒力晶体蛋白，该毒力蛋白对桑天牛有特异毒力。
桑天牛，属鞘翅目天牛科沟胫天牛亚科。其寄主包括：桑、构、无花果、白杨、欧美杨、柳、榆、苹果、沙果、樱桃、梨、野海棠、柞、褚、刺槐、树豆、枫杨、批把、油桐、花红、柑桔等。其成虫食害寄主嫩枝皮和叶；幼虫于枝干的皮下和木质部内，向下蛀食，隧道内无粪屑，隔一定距离向外蛀1通气排粪屑孔，排出大量粪屑，削弱树势，重者枯死。
Bt蛋白或基因的应用将是防治天牛为害林木的有效突破口。筛选分离克隆新的、高毒力的Bt基因，提高现有Bt蛋白的毒力及杀虫活性，可以丰富杀虫基因资源，为转基因植物与工程菌株提供新的基因来源，可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明根据上述领域的需求，提供一种人工融合的Bt蛋白，本发明的实验数表明该融合蛋白比野生Bt蛋白能够在害虫体内滞留更长时间，从而具有更高的杀虫活性。
以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于：所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1；
或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1且羧基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.2所示的短肽P2。
所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq ID No.3所示的氨基酸序列；或者Seq ID No.3所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。
所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq ID No.4所示的氨基酸序列；或者Seq ID No.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。
所述融合蛋白的氨基酸序列是Seq ID No.5所示的氨基酸序列；或者Seq ID No.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。
编码上述任一融合蛋白的基因。
所述基因的核苷酸序列如Seq ID No.6、7或8所示。
含有上述基因的重组表达载体。
由所述重组表达载体转化而得的宿主细胞。
含有上述融合蛋白的杀虫剂。
所述基因或重组表达载体在制备转基因植物中的应用。
所述基因或重组表达载体在提高植物抗虫性中的应用。
所述融合蛋白的制备方法，其特征在于将权利要求7所述的重组表达载体转入到宿主细胞中，诱导宿主细胞表达融合蛋白，分离融合蛋白。
本发明在前人已分离出的对鞘翅目有特异毒杀作用的Bt886-cry3Aa基因以及筛选获得的天牛肠道内切葡聚糖酶特异结合活性短肽P1、P2的基础上，将编码P1、P2短肽的DNA序列与Bt886-cry3Aa基因通过PCR扩增进行基因重组获得多种连接方式Cry3Aa融合蛋白的基因，并将Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的基因分别构建到原核表达载体中得到融合蛋白的表达载体：pET-30b(+)-cry3Aa，pET-30b(+)-P1-cry3Aa，pET-30b(+)-P2-cry3Aa，pET-30b(+)-cry3Aa-P1，pET-30b(+)-cry3Aa-P2，pET-30b(+)-P1-cry3Aa-P2，pET-30b(+)-P2-cry3Aa-P1。将这些表达载体转化到大肠杆菌中进行高效表达，获得亲合短肽与杀虫晶体蛋白的融合蛋毒白。本发明以桑天牛幼虫为试虫，进行融合肽生物活性的分析测定，计算Cry3Aa融合蛋白和Cry3Aa蛋白的致死率和生长抑制率，比较了Cry3Aa融合蛋白与野生型Cry3Aa毒蛋白的毒性差异，将Cry3Aa融合蛋白与Cry3Aa毒蛋白饲喂桑天牛幼虫，比较Cry3Aa蛋白与融合Cry3Aa毒蛋白在昆虫消化道中的残留量和排泄物中的含量，分析毒蛋白在昆虫消化道内的滞留时间的差异，这些实验证明本发明获得的其中三种融合蛋白(P1-cry3Aa，cry3Aa-P1和P1-cry3Aa-P2)较野生型Cry3Aa蛋白具有更高的杀虫活性，能在害虫体内滞留更长时间，如表1及图5所示。
本领域技术人员可以根据本发明公开的融合蛋白的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代，缺失和/或增加一个或几个氨基酸得到与所述融合蛋白相同功能和活性的突变蛋白，应当理解为也在本发明的保护范围内。
编码本发明的融合蛋白的基因，除本发明提供的Seq ID No.6、7、8所示的核苷酸外，由于密码子的简并性以及不同物种对密码子的偏好性，本领域技术人员可以调整出多种编码本发明的融合蛋白的基因序列。也都在本发明的保护范围内。
将编码上述融合蛋白的基因作为外源基因克隆到适合不同宿主的骨架载体中得到多种重组表达载体，如本发明得到的pET-30b(+)-cry3Aa、pET-30b(+)-P1-cry3Aa、pET-30b(+)-P2-cry3Aa、pET-30b(+)-cry3Aa-P1、pET-30b(+)-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P1-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P2-cry3Aa-P1，然后将重组表达载体转入宿主细胞中，如本发明采用的大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，诱导表达出本发明所要求保护的融合蛋白。
这类重组表达载体，以及转化有该重组表达载体的宿主细胞也在本发明要求保护的范围内。这些表达载体用于制备具有抗虫性的转基因植物的用途也在本发明的保护范围内，这种用途能够降低杀虫剂的使用量，减少环境污染，具有重要的应用价值。
可以通过发酵转入融合蛋白基因的菌株，获得含有融合蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂。本领域技术人员，可以通过将转入上述重组表达载体的细菌或真菌进行大规模发酵得到本发明的融合蛋白。
附图说明
图1.SDS-PAGE凝胶检测
M：Western Blot蛋白质分子量标准；1：未用IPTG诱导的cry3Aa；2：加IPTG诱导的cry3Aa 3：未用IPTG诱导的P1-cry3Aa；4：加IPTG诱导的P1-cry3Aa；5：未用IPTG诱导的P2-cry3Aa；6：加IPTG诱导的P2-cry3Aa；7：未用IPTG诱导的cry3Aa-P1；8：加IPTG诱导的cry3Aa-P1；9：加IPTG诱导的pET-30b(+)空载对照；10：未用IPTG诱导的cry3Aa-P2；11：加IPTG诱导的cry3Aa-P2；12：未用IPTG诱导的P1-cry3Aa-P2；13：加IPTG诱导的P1-cry3Aa-P2；14：未用IPTG诱导的P2-cry3Aa-P1；15：加IPTG诱导的P2-cry3Aa-P1
图2.Western Blot检测目的蛋白
M：Western Blot蛋白质分子量标准；1：未用IPTG诱导的cry3Aa；2：加IPTG诱导的cry3Aa；3：未用IPTG诱导的P1-cry3Aa；4：加IPTG诱导的P1-cry3Aa；5：未用IPTG诱导的P2-cry3Aa；6：加IPTG诱导的P2-cry3Aa；7和16：加IPTG诱导的pET-30b(+)空载对照；8：未用IPTG诱导的cry3Aa-P1；9：加IPTG诱导的cry3Aa-P1；10：未用IPTG诱导的cry3Aa-P2；11：加IPTG诱导的cry3Aa-P2；12：未用IPTG诱导的P1-cry3Aa-P2；13：加IPTG诱导的P1-cry3Aa-P2；14：未用IPTG诱导的P2-cry3Aa-P1；15：加IPTG诱导的P2-cry3Aa-P1
图3.检测到的肽段在Cry3Aa氨基酸序列中的分布情况
图4.ELISA检测目的蛋白
图5.Cry3Aa蛋白和融合Cry3Aa蛋白对桑天牛幼虫的影响
图6.短肽融合Cry3Aa对桑天牛幼虫生长发育的影响
图7.桑天牛幼虫取食Cry3Aa和融合Cry3Aa蛋白后不同时间的排泄物重量
图8.取食Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa后桑天牛不同时间排泄物中Cry3Aa含量
图9.Cry3Aa和短肽融合Cry3Aa蛋白在桑天牛中肠内的滞留时间
具体实施方式
以下材料为已知材料，本实验室也有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于实验。
质粒：pET-30b(+)-2K。
桑天牛幼虫。
实施例1.构建融合基因的原核表达载体
以本实验室保存的携带有cry3Aa基因的pET-30b(+)-2K质粒为模板，以在引物5’端添加了纤维素酶亲合短肽P1，P2的引物(如下表)进行PCR扩增，得到cry3Aa融合蛋白基因。通过一系列分子克隆操作获得了7个pET-30b(+)原核表达载体：pET-30b(+)-cry3Aa、pET-30b(+)-P1-cry3Aa、pET-30b(+)-P2-cry3Aa、pET-30b(+)-cry3Aa-P1、pET-30b(+)-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P1-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P2-cry3Aa-P1。
步骤1.PCR扩增融合基因。
采用上表中的引物对分别pET-30b(+)-2K进行扩增，
PCR体系：为了保证扩增出的核苷酸序列的真实性，用TaKaRa公司的Pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增反应，在最后总延伸时加入TaKaRa公司普通DNA聚合酶进行加T反应。
PCR程序：94℃预变性4mm，(94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸2mm)共30个循环，最后72℃延伸15min
PCR产物在1～2％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，切下目的条带进行分离纯化得到融合蛋白基因。
步骤2.酶切构建重组表达载体
用用限制性内切酶Nco I和Sac I(购买来源：NEB公司)对步骤1制备得到的融合蛋白基因及质粒pET-30b(+)-2K进行酶切，用连接酶(购买来源：NEB公司)连接切产物得到7个原核表达载体。酶切连接操作及参数参照内切酶及连接酶说明书。
酶切体系：
| 反应成分 | 融合质粒酶切 | 表达质粒酶切 |
| 融合质粒DNA | 2μl | --- |
| pET-30b(+)质粒DNA | --- | 2μl |
| 10×酶切缓冲液buffer 4 | 2μl | 2μl |
| 100×BSA溶液 | 0.2μl | 0.2μl |
| Nco I(10u/ul) | 0.5μl | 0.5μl |
| Sac I(10u/ul) | 0.5μl | 0.5μl |
| ddH2O | 14.8μl | 14.8μl |
| 总体积 | 20μl | 20μl |
连接反应体系
| 反应成分 | 标准反应 | 阳性对照 | 背景对照 |
| 2×快速连接缓冲液 | 5μl | 5μl | 5μl |
| pET-30b(+)质粒 | 1μl | 1μl | 1μl |
| 酶切回收产物 | 2μl | - | - |
| 插入DNA对照 | - | 2μl | - |
| T4 DNA连接酶 | 1μl | 1μl | 1μl |
| ddH2O | 1μl | 1μl | 3μl |
| 总体积 | 10μl | 10μl | 10μl |
实施例2.融合毒蛋白获得及鉴定
将构建好的7个原核表达载体质粒进行测序(华大基因)，测序结果正确的质粒转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)感受态(北京天根生化科技有限公司)。
转化感受态：
(1)取BL21(DE3)感受态细胞100μl置于冰上，分别将2μl各载体加入感受态细胞中，冰浴静置30min；
(2)于42℃热激90s；
(3)立即移至冰上放置2min；
(4)加入500μl LB液体培养基，于37℃，180rpm振荡培养45min；
(5)取100μl菌液均匀涂布于含卡那霉素(50μg/ml)LB固体培养基上；
(6)将平板放入37℃恒温培养箱，倒置培养12-16h后，挑取单菌落进行PCR检测；
(7)挑取检测为阳性的单菌落在含卡那霉素的LB固体培养基上划板。
筛选阳性转化克隆：用构建载体时的引物和PCR反应程序筛选阳性克隆。
对阳性克隆进行诱导表达：取构建好的原核表达载体质粒pET-30b(+)-cry3Aa、pET-30b(+)-P1-cry3Aa、pET-30b(+)-P2-cry3Aa、pET-30b(+)-cry3Aa-P1、pET-30b(+)-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P1-cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P2-cry3Aa-P1各2.5μl以及空载体质粒pET-30b(+)转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)。挑单菌落经菌落PCR检测为阳性后接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、180rmp摇菌过夜，取过夜培养的菌液以1∶50二次接种于新鲜的LB液体培养基后于37℃、180rmp培养至OD600为0.6-0.8，以不同的温度和IPTG终浓度优化诱导的条件。添加IPTG至不同的终浓度(0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM)后于不同的温度条件下(20℃、25℃、30℃和37℃)以180rmp继续培养8h。最终确定培养温度25℃，IPTG终浓度为0.8mM诱导8h原核表达Bt-Cry3Aa获得蛋白较多，可在此条件下大量诱导收集目的蛋白。
收集表达产物：取2ml菌液于4℃、12000rpm离心15min收集菌体，于-20℃保存备用
鉴定步骤一
用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析，结果如图1。将收集的不同条件诱导的大肠杆菌细胞用1x的BugbusterMix蛋白上样缓冲液(购买来源：德国Novagen)悬浮，裂解、提取蛋白后，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离细胞中的总蛋白，与空载对照和未加IPTG诱导的蛋白对照进行对比，观察到如图1中箭头所示的一条蛋白分子量大约为75kDa的目的特异蛋白表达。这一条带只在添加IPTG诱导的融合载体其表达产物中存在，在pET-30b(+)空载和未添加IPTG诱导的融合载体其表达产物中没有清楚的条带，说明于25℃，IPTG终浓度为0.8mM诱导8h原核表达Bt-Cry3Aa获得成功，可在此条件下大量诱导收集目的蛋白。
鉴定步骤二
为了鉴定SDS-PAGE分离出的特异蛋白条带是否为目的蛋白Cry3Aa，用Western Blot技术以组氨酸融合标签抗体(His-Tag)(购买来源：德国Novagen)为抗体，对表达产物进行了分析。
操作步骤为：
(1)SDS-PAGE胶分离蛋白：取200μl 1x凝胶上样缓冲液加到收集的各大肠杆菌细胞中，用移液器重悬菌体，于沸水中煮沸10min，室温冷却后于12000rpm离心15min，取上清液待用。
先配置分离胶，加入各试剂混匀后缓慢注入两玻璃板之间(距离上边3cm)，慢慢加水注满玻璃板将分离胶压平，静置1h使之完全聚合；用吸水纸将水除干净，将浓缩胶注入两玻璃板之间并小心插入梳子，静置1h使之完全聚合；待聚合完全后小心拔出梳子，将玻璃板放于电泳槽中加入电泳缓冲液没过玻璃板上边沿，在每个上样孔中加入15μl制备好的各表达产物，以pET-30b(+)空载表达产物及各未添加IPTG的融合质粒表达产物作为阴性对照。采用恒压电泳，浓缩胶用65V电压，当指示剂进入分离胶后将电压调整为150V。当指示剂到达下边界时停止电泳。取出凝胶切除浓缩胶部分，在重蒸水中漂洗2min，
(2)转膜：电泳结束从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。取与凝胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95％乙醇浸泡5s后浸泡于转移缓冲液15min待用。按顺序在转移夹内放置预先经过转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，于4℃、220mA横流转移30min。
(3)封膜：把硝酸纤维素膜转入杂交管中，加适量5％脱脂奶粉，于杂交炉反应1h。以PBST漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。
(4)一抗反应：取适量用PBST稀释His-Tag单抗(1∶1000)，于杂交炉反应1h。以PBST漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。
(5)二抗反应：取适量辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶4000)，于杂交炉反应1h。以PBST漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。
(6)化学发光与曝光：将ECL化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1∶1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1min。用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光1min。曝光后的感光胶片在显影液中显影约30s，定影液中定影1min，用水冲洗后晾干。根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片扫描保存。
结果如图2所示，IPTG诱导后携带cry3Aa基因的融合质粒的表达产物都有明显的杂交信号，大小与目的蛋白相吻合；空载对照和未用IPTG诱导的样品没有杂交信号，即说明诱导表达产生了目的毒蛋白。
鉴定步骤三
为了进一步验证目的蛋白，用纳升高效液相结合串联质谱技术分析了4个目的蛋白条带。
操作如下：
按上述方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束用干净刀片将电泳分离的特异蛋白从胶上切下后用质谱级的胰蛋白酶(Promega)进行消化处理后用于纳升高效液相结合串联质谱(LC-MS/MS)分析。
(1)消化：将胶放于用50％(ACN)/0.1％(TFA)预洗过的0.5ml微离管中，尽量去除聚丙烯酰胺。用0.2ml 100mM NH4HCO3/50％ACN将凝胶于37℃脱色2次，每次45min以去除染料。加入100μl 50mM DTT于56℃孵育30min，弃液体。加入100μl 100mM碘乙酸胺于45℃孵育30min，暗处理，弃液体。加入100μl 100％ACN于室温将凝胶片脱水5min，这时凝胶片在外形上将会变小，发白并且不透明。室温干燥10-15min以除去ACN。用50mM乙酸重悬胰岛素，浓度为1μg/μl，之后用40mM NH4HCO3/10％ACN稀释成浓度20μg/ml(稀释50倍)。用胰岛素溶液于室温以最小体积(10-20μl)预孵凝胶片1h(不要超过30℃)，这时凝胶再次水化。加入足够的消化缓冲液(40mM NH4HCO3/10％ACN)完全盖住凝胶片。盖住盖子以防止蒸发，37℃孵育过夜。用150μl重蒸水消化孵育10min，期间频繁涡旋混匀，取出液体放于新的离心管。吸取凝胶片用50μl 50％ACN/5％TFA于室温消化2次，每次60min。收集所有提取液于室温干燥2-4h(不要超过30℃)，置于-20℃保存备用。
(2)肽段溶解：向含干燥肽段的离心管中添加10μl重悬液(2％乙腈/0.05％甲酸/97.95％水)，充分震荡涡旋并10000rpm离心，吸取上清转移至色谱上样瓶。
(3)色谱参数设置：预柱规格：300μm i.d.×5mm，C18，5μm，
(Dionex P/N160454)。反相色谱柱规格：75μm i.d.×15cm，C18，3μm，
(Dionex P/N 160321)。
流动相组成：上样缓冲液2％ACN/0.05％FA/97.95％H2O；流动相A：2％ACN/0.1％FA/97.9％H2O；流动相B：98％ACN/0.1％FA/1.9％H2O。上样泵流速0.02ml/min，柱流速300nl/min，上样体积1.4μl，进样方式为μlPickup；在90min内，ACN比例从0上升到50％；ACN比例升高到98％并维持10min；ACN比例下降至2％并维持20min，平衡反相色谱柱。纳喷喷雾电压为1.8kv；数据采集由XCalibur软件控制。样品离子化方式为正离子模式(Positive)。每个样品采集时间为120min，由1个扫描片段构成。扫描事件包括1个全扫描(Full scan，MS)和5个数据依赖型扫描(data-dependent scan，MS/MS)，扫描范围为m/z400-1700。
(4)数据库搜索：所获质谱数据集利用Turbo SEQUEST软件(Biowork 3.2)进行数据库比对。搜索数据库的质量类型为average precursor/monoisotopic fragment，允许的最多漏切位点(missed cleavage sites)、肽段容错率(peptide tolerance)以及片段离子容错率(fragmentions tolerance)为2、0.8AMU及0.8AMU。每个肽段所允许的翻译后修饰最多为3个。分别设置甲硫氨酸(methionine)的羟基化作用(hydroxylation)为动态修饰(differential modification)和半胱氨酸的羧基氨基甲基化(carboxyamidomethylation)为固定修饰(static modification)。
经过搜库所获得的.out文件采用BuildSummary(中国科学院上海蛋白质组研究分析中心)软件进行蛋白质水平的鉴定。其中假阳性发现率(false discovery rate，即源自反向数据库肽段数与源自正向数据库肽段数的比值)控制在5％以内。ΔCn(相邻两个匹配肽段的关联值变化)设为0.1。Xcorr:Charge≥1、Xcorr:Charge≥2和Xcorr:Charge≥3的值分别设为1.75、2.25和2.75(XCorr值为检测到的肽片段质谱与理论肽片段图谱之间的关联系数)。最终蛋白鉴定标准为含有至少两个不同的肽段。
蛋白鉴定标准为含有至少两个不同的肽段，而我们所检测的4个样品中最少能检测到8个短肽，这些肽段与数据库中的Bt-Cry3A匹配(Genbank登录号为A9Z9A1)，是苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种菌株Cry3A，分子量为73kDa，氨基酸序列长度为644AA
(http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GProtein？ac＝A9Z1A1)，图3为检测到的肽段在所预测到的蛋白中的分布情况，说明诱导表达产物中有目的蛋白，为下步毒蛋白的生活活性测定提供了实验证据。
鉴定步骤四
为了验证原核表达产物是否有活性，用Bt-Cry3A ELISAKit(购买来源：美国Agdia)对表达产物进行了检测。
检测步骤：Agdia公司的Bt-Cry3AELISA试剂盒能对表达产物中的Cry3A蛋白进行定性和定量分析，试剂盒自带的阳性对照为纯化后截短的Bt-Cry3A蛋白，其浓度为25ng/ml，可用此阳性标准品来制作标准曲线测定Cry3A蛋白含量。
a标准曲线制作：
将浓度为25ng/ml的阳性对照分别用MEB溶液稀释成浓度为12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml，0.78ng/ml，0.19ng/ml，0ng/ml，利用不同浓度梯度阳性标准品ELISA反应后于405nm处的吸光值来制作标准曲线，每个浓度设3个重复。
取各浓度梯度液40μl与360μl MEB溶液混匀后加入8联管中，每孔加100μl，放在湿盒中于室温下静置反应1h，阳性对照为试剂盒自带，阴性对照为空载体和未加IPTG诱导的融合蛋白表达产物。反应结束后开始洗板，用试剂盒自带的1x PBST漂洗液漂洗7次，用吸水纸吸干后每孔加入100μl酶液(酶液用ECM以1∶100稀释)室温放置1h。反应结束用1xPBST漂洗8次，每孔加入100μl反应底物(取1ml 5x PNP substrate beffer稀释成1x的反应缓冲液，加入1片PNP tablet配制成1mg/ml的PNP反应底物)，于室温避光放置1h。反应结束用酶标仪测定在405nm处的光吸收值，制作标准曲线。
b表达产物中Bt-Cry3A蛋白的检测：
表达产物中Bt-Cry3A蛋白的检测方法同上，可通过颜色变化来判断是否含有Cry3Aa蛋白，测出各表达产物于405nm处的光吸收值后用标准曲线可以计算出表达产物中Cry3Aa蛋白的含量，为虫试实验时确定在人工饲料中添加毒蛋白的量提供依据。结果如图4所示，加IPTG诱导后携带有cry3Aa基因的融合质粒表达出Cry3Aa蛋白(黄绿色)，阴性对照反应后为无色透明，说明添加IPTG诱导后携带有cry3Aa基因的融合质粒能表达出目的Cry3Aa蛋白。
实施例3.虫试
桑天牛幼虫孵化后于室温下饲养一周，挑生长状态一致的幼虫进行虫试。分别将Cry3Aa、P1-Cry3Aa、P2-Cry3Aa、Cry3Aa-P1、Cry3Aa-P2、P1-Cry3Aa-P2、P2-Cry3Aa-P1毒蛋白以200mg毒蛋白/10g人工饲料的比例混匀后喂食幼虫，以添加空载表达产物的蛋白提取液的饲料作为对照。每个处理号设3个重复，每个重复10头幼虫。于25℃，光照16h，黑暗8h条件培养。每周更换一次人工饲料，饲养4周统计死亡率、校正死亡率和幼虫的生长抑制率。计算见公式如下。
步骤1.各毒蛋白在幼虫体内滞留时间分析：
用两种途径分析：
(1)分析排泄物中各毒蛋白的含量。将幼虫饥饿处理40h，喂食各毒蛋白2h，喂食完毕将幼虫移入事先称量过重量的试管中放置2h收集排泄物，称量排泄物重量。每隔2h幼虫更换一次试管，称量排泄物重量。共收集10h。每种毒蛋白处理10头天牛幼虫。将收集的所有排泄物加入适量蛋白提取液提取蛋白后进行ELISA反应来测定排泄物中Bt-Cry3A蛋白的含量，观察各毒蛋白在幼虫体内滞留时间。ELISA反应试验方法同实施例2鉴定步骤四。
(2)将幼虫饥饿处理40h，喂食各毒蛋白4h，解剖幼虫，提取中肠的总蛋白，平衡到同一总蛋白浓度时用ELISA反应来测定中肠液中Bt-Cry3A蛋白的浓度。统计结果如表1及图5所示，Cry3Aa的杀虫死亡率为12.6％，P1-Cry3Aa的杀虫死亡率为33.3％，几乎是Cry3Aa的3倍；Cry3Aa-P1的杀虫死亡率超过了Cry3Aa的2倍，为26％；P1-Cry3Aa-P2的杀虫死亡率为22.2％，其它3种蛋白对Cry3Aa的杀虫效果没有变化。同时，P1-Cry3Aa-P2能明显的抑制桑天牛幼虫的生长，其生长抑制率(62.4％)超过了Cry3Aa(22.4％)的3倍(如图6)。
表1 虫试统计表
上述实验证明，融合纤维素酶亲合短肽能延长Cry3Aa毒蛋白在幼虫中肠内的滞留时间。
步骤2.桑天牛幼虫排泄物在不同时间的分布情况
将不同时间收集到的排泄物称量后发现排泄物在4h时达到最多，占总排泄物重量的37％；6h次之为30％；2h和8h的排泄物重量分别为总排泄物重量的21％和12％；10h后能收集到的排泄物很少，如图7所示：
步骤3.桑天牛幼虫排泄物中Cry3Aa毒蛋白含量：
桑天牛幼虫排泄物中的Cry3Aa毒蛋白含量在不同的时间呈现差异如图8所示，在2h时Cry3Aa蛋白与短肽融合Cry3Aa蛋白之间不存在太大的差异，在4h时Cry3Aa蛋白含量增加显著，达到其峰值，之后又呈现下降趋势。P1-Cry3Aa蛋白含量在6h时达到峰值，是Cry3Aa在6h时含量的2-4倍，之后又有所减少，但在8h时依然是其它3种毒蛋白的含量的3.5-30倍。Cry3Aa-P1和P1-Cry3Aa-P2蛋白含量在不同时间的变化与P1-Cry3Aa一致，都是在6h时达到峰值，之后逐渐减少。可以看出短肽融合Cry3Aa蛋白在天牛幼虫中肠内的滞留时间比Cry3Aa毒蛋白的时间长，所以与纤维素酶亲合短肽融合能延长Cry3Aa毒蛋白在中肠内的滞留时间。
步骤4.桑天牛幼虫中肠液中Cry3Aa毒蛋白浓度：
将桑天牛幼虫中肠提取的粗酶液平衡到同一蛋白浓度后测定其中Bt-Cry3A的浓度，如图9所示，短肽融合Cry3Aa蛋白在中肠内的浓度比Cry3Aa蛋白高(Cry3Aa为151ng/ml，P1-Cry3Aa为277ng/ml，Cry3Aa-P1为243ng/ml，P1-Cry3Aa-P2为320ng/ml)，并且P1-Cry3Aa和P1-Cry3Aa-P2均在p≤0.01水平差异显著，Cry3Aa-P1只在p≤0.05水平差异显著。进一步说明了用短肽改造Cry3Aa能延长其在天牛中肠内的滞留时间。
综上所述，本发明通过一系列分子克隆操作分别构建了7个原核表达载体：pET30a(+)-Cry3Aa、pET-30b(+)-P1-Cry3Aa、pET-30b(+)-P2-Cry3Aa、pET-30b(+)-Cry3Aa-P1、pET-30b(+)-Cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P1-Cry3Aa-P2、pET-30b(+)-P2-Cry3Aa-P1。原核表达后分别得到了7种融合基因的表达产物，经SDS-PAGE分离总蛋白、Western Blot分析、ELISA检测以及液相串联质谱方法鉴定后确定表达产物中确实含有目的蛋白。大规模诱导、收集7种毒蛋白，以桑天牛一龄幼虫为试虫进行毒蛋白的生物活性测定。虫试结果显示：P1-Cry3Aa、Cry3Aa-P1和P1-Cry3Aa-P2等3种毒蛋白对桑天牛幼虫的杀虫活性与Cry3Aa毒蛋白相比显著提高，其中P1-Cry3Aa的校正死亡率几乎是Cry3Aa的3倍，P1-Cry3Aa-P2对桑天牛幼虫的生长抑制率达到了62.4％，超过了Cry3Aa的3倍。用P1和P2短肽融合Cry3Aa能获得杀虫活性提高的融合Cry3Aa毒蛋白，这为增强Cry蛋白的毒性提供了一种新策略。
通过比较融合毒蛋白在桑天牛幼虫中肠内滞留的时间和对桑天牛中肠纤维素酶活性的影响，进一步分析了纤维素酶亲合短肽融合Cry3Aa蛋白对桑天牛杀虫活性提高的机理。收集喂食三种不同毒蛋白的桑天牛幼虫在不同时间的排泄物进行分析，发现Cry3Aa蛋白主要集中在4h收集的排泄物中，而短肽融合Cry3Aa蛋白主要集中在6h的排泄物中，说明短肽融合Cry3Aa蛋白在桑天牛幼虫中肠内滞留的时间长；同时分析了三种毒蛋白在桑天牛取食后4小时后中肠内的残留量，发现取食融合Cry3Aa蛋白的桑天牛幼虫中肠提取液中Cry3Aa的浓度显著高于取食Cry3Aa的中肠提取液。这一结果与相应时间段的排泄物中Cry3Aa的含量相一致，证实了短肽融合毒蛋白和中肠内的纤维素酶特异性的亲合延长了Cry3Aa毒蛋白在中肠内的时间，说明纤维素酶亲合短肽对Cry3Aa毒蛋白杀虫活性的提高与毒蛋白在中肠内滞留时间延长是相关联的。
Claims (10)
1.以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白，其特征在于：所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的至少一端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1；
或者所述Bt886-cry3Aa蛋白的肽链的氨基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.1的短肽P1且羧基端融合了氨基酸序列如Seq ID No.2所示的短肽P2。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其氨基酸序列是Seq ID No.3、Seq ID No.4或Seq IDNo.5所示的氨基酸序列；或者Seq ID No.3、Seq ID No.4或Seq ID No.5所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸且具有同等蛋白活性的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如Seq ID No.6、7或8所示。
5.含有权利要求3所述基因的重组表达载体。
6.由权利要求5所述重组表达载体转化而得的宿主细胞。
7.杀虫剂，含有权利要求1或2任一所述融合蛋白。
8.权利要求3所述基因或权利要求7所述重组表达载体在制备转基因植物中的应用。
9.权利要求3所述基因或权利要求7所述重组表达载体在提高植物抗虫性中的应用。
10.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于将权利要求7所述的重组表达载体转入到宿主细胞中，诱导宿主细胞表达融合蛋白，分离融合蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102271413A CN102276728A (zh) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | 以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102271413A CN102276728A (zh) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | 以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102276728A true CN102276728A (zh) | 2011-12-14 |
Family
ID=45102504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102271413A Pending CN102276728A (zh) | 2011-08-09 | 2011-08-09 | 以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102276728A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018028371A1 (en) * | 2016-08-10 | 2018-02-15 | The Chinese University Of Hong Kong | Fusion proteins with improved properties |
| CN111944843A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-17 | 山东农业大学 | 一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1556209A (zh) * | 2004-01-02 | 2004-12-22 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种抗天牛Bt基因及其应用 |
| CN101220087A (zh) * | 1997-12-18 | 2008-07-16 | 孟山都技术有限公司 | 抗昆虫的转基因植物以及用于改善δ-内毒素抵抗目标昆虫活性的方法 |
| CN101328484A (zh) * | 2003-02-20 | 2008-12-24 | 阿则耐克斯公司 | δ-内毒素基因及其使用方法 |
| WO2009052242A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Athenix Corporation | Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use |
-
2011
- 2011-08-09 CN CN2011102271413A patent/CN102276728A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101220087A (zh) * | 1997-12-18 | 2008-07-16 | 孟山都技术有限公司 | 抗昆虫的转基因植物以及用于改善δ-内毒素抵抗目标昆虫活性的方法 |
| CN101328484A (zh) * | 2003-02-20 | 2008-12-24 | 阿则耐克斯公司 | δ-内毒素基因及其使用方法 |
| CN1556209A (zh) * | 2004-01-02 | 2004-12-22 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种抗天牛Bt基因及其应用 |
| WO2009052242A2 (en) * | 2007-10-16 | 2009-04-23 | Athenix Corporation | Axmi-066 and axmi-076: delta-endotoxin proteins and methods for their use |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 陈敏 等: "具有光肩星天牛内切聚葡糖酶结合活性短肽的筛选", 《林业科学研究》 * |
| 陈敏: "光肩星天牛纤维素特性研究及结合短肽筛选", 《北京林业大学博士论文》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018028371A1 (en) * | 2016-08-10 | 2018-02-15 | The Chinese University Of Hong Kong | Fusion proteins with improved properties |
| US11807670B2 (en) | 2016-08-10 | 2023-11-07 | The Chinese University Of Hong Kong | Fusion proteins with improved properties |
| CN111944843A (zh) * | 2020-08-31 | 2020-11-17 | 山东农业大学 | 一种转抗虫基因窄冠黑杨11号的遗传转化方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102094030B (zh) | 编码杀虫蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表达载体及应用 | |
| CN103718895A (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN102584961B (zh) | 一种抗虫蛋白Cry1A.401、其表达载体及应用 | |
| CN110066322B (zh) | 一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用 | |
| CN106928329B (zh) | 一种新的杀虫蛋白及其核苷酸序列 | |
| CN102154127B (zh) | 具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌及其构建法和用途 | |
| CN102276728A (zh) | 以Bt蛋白Bt886-cry3Aa为基础的融合蛋白及其用途 | |
| CN104611260B (zh) | 苏云金芽胞杆菌LTS290、杀虫基因cry57Ab、表达蛋白及其应用 | |
| CN105367634B (zh) | 一种Bt蛋白Cry1Ie5、其编码基因及应用 | |
| CN105367633B (zh) | 一种BT蛋白CRY2Ab32、其编码基因及应用 | |
| CN1199569C (zh) | 一种双效工程菌生物杀虫剂及其生产方法 | |
| Hernández-Rodríguez et al. | Encapsulation of the Bacillus thuringiensis secretable toxins Vip3Aa and Cry1Ia in Pseudomonas fluorescens | |
| CN104744575B (zh) | 对东方粘虫有杀虫活性的Bt蛋白及其应用 | |
| Arrieta et al. | Characterization of a Bacillus thuringiensis strain collection isolated from diverse Costa Rican natural ecosystems | |
| CN102633868B (zh) | 一种抗虫蛋白Cry1A.301、其表达载体及应用 | |
| Pereira et al. | Comparative toxicity of Bacillus thuringiensis berliner strains to larvae of Simuliidae (Insecta: Diptera) | |
| CN105368733A (zh) | 一株苏云金芽孢杆菌新菌株及其应用 | |
| CN104845913B (zh) | 苏云金芽胞杆菌菌株，组合蛋白及其应用 | |
| CN102618467B (zh) | 一种苏云金芽孢杆菌及制备方法和应用 | |
| CN103570811B (zh) | 苏云金芽孢杆菌基因cry1Ah3及其应用 | |
| CN103525836B (zh) | 一种Bt Cry71Aa1操纵子基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN103421097B (zh) | 杀线虫晶体蛋白基因cry003-148及应用 | |
| Argôlo‐Filho et al. | Immunodetection of the toxic portion of Vip3A reveals differential temporal regulation of its secretion among Bacillus thuringiensis strains | |
| CN101532023A (zh) | 对鳞翅目昆虫有杀虫活性的Bt crylAc22基因及其应用 | |
| CN102408475A (zh) | 一种Bt蛋白Cyt1Da1、其编码基因及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111214 |