CN102154127B - 具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌及其构建法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌，菌株BbHV8的保藏名称为：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏编号：CGMCCNo.4438。本发明还同时公开了上述具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法。本发明也同时公开了上述具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的用途：用于肠毒杀虫。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及生物工程技术领域的DNA重组技术和应用，具体涉及一种利用转基因工程技术大幅增强生防真菌肠毒杀虫活性的方法。
背景技术
丝孢类昆虫病原真菌是重要的害虫生防真菌，一般通过体壁接触感染致死各类害虫，但通常不具有经口器摄入侵染的肠毒杀虫活性。真菌侵染过程包括分生孢子在昆虫体壁上的附着、萌发及体壁穿透，然后进入寄主血腔并在其中快速繁殖，终因耗尽寄主营养而导致寄主死亡。独特的侵染方式使丝孢类生防真菌成为防治刺吸式口器害虫的首选生防因子。丝孢类生防真菌的成员很多，如白僵菌Beauveria、绿僵菌Metarhizium、棒束孢属Isaria （=拟青霉Paecilomyces）和蜡蚧菌属Lecanicillium（=轮枝菌属Verticillium）等昆虫病原真菌的菌种菌株，是支撑无公害农业的害虫防治新技术及产品来源。目前全世界注册登记的丝孢类真菌杀虫剂近200种，其主要活性成份大都是极易低成本生产的分生孢子，用于多种农林害虫的防治。
丝孢类生防真菌防治害虫的持效性较好，但杀虫速度较为缓慢，成为影响真菌杀虫剂应用推广的限制因素，也是国际上的重大技术难题之一。作为丝孢类生防真菌的典型代表，球包白僵菌穿透害虫体壁通常发生在接种后的48小时左右，再经血腔内的繁殖，一般经历因虫体大小而异的数天潜伏期才能杀死害虫。由于生防真菌没有特异的肠道毒力因子，只能依赖分生孢子萌发后穿透体壁的方式感染寄主，被咀嚼式口器害虫摄入的大量孢子一般不能在肠道导致实质性的感染。真菌杀虫的时滞效应使其很难用于防治暴食性叶面害虫，限制着菌剂的应用范围。因此，有效提高球孢白僵菌对暴食性叶面害虫的快速毒杀能力是一重大技术挑战。Vip3A是一类由苏云金芽孢杆菌在营养生长期分泌的、具有信号肽的杀虫蛋白，直接作用于昆虫中肠上皮细胞(主要是柱状细胞)，诱发昆虫细胞凋亡和核溶解，导致昆虫死亡，对鳞翅目害虫具有较广谱的杀虫活性。然而，Vip3A杀虫蛋白在细胞培养物中的分泌量很低，加之非晶体结构的不稳定性，不能像苏云金芽孢杆菌的晶体内毒素那样开发成可直接用于田间的杀虫剂产品。迄今，全球Vip3A蛋白的应用仅限于转基因抗虫植物。新近的研究表明，利用害虫Vip3A肠毒蛋白改造杀虫真菌，使其不仅能够经昆虫体壁侵染，而且摄入肠道的真菌孢子可释放肠毒蛋白，从而加快低龄斜纹夜蛾幼虫的死亡（Qin et al., 2010）。虽然将Vip3Aa1蛋白基因置于构巢曲霉的通用组成型启动子PgpdA下导入球孢白僵菌能提高其对斜纹夜蛾低龄幼虫的毒杀效果，但重组菌株对三龄以上龄期幼虫的毒杀效果不佳（Qin et al., 2010），说明PgpdA不足以启动外源基因在生防真菌分生孢子中的高表达。因此，有必要寻找一种超强启动子来启动外源杀虫蛋白基因的高效表达，为提升真菌杀虫剂的质量和实用性提供新的技术途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种找到一种超强启动子、能建立生防真菌通常不具有的独特杀虫机制和杀虫活性显著增强的Vip3A杀虫蛋白超高表达的工程菌株构建方法，并获得相应的工程菌株。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌，该菌株BbHV8的保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏编号：CGMCC No. 4438。
本发明还同时提供了一种具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）获得内源强启动子：
利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列设计引物，克隆其N端启动子全长序列Phyd1（1798 bp）；不同长度或实施转录因子定点突变的启动子片段通过其启动外源报告基因（绿色荧光蛋白基因eGFP）的表达进行定量比较，找到启动绿色荧光蛋白表达量最大的启动子片段为球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段作为Phyd1优化后的强启动子核心序列，该片段携带3个缺一不可的转录因子；
（2）获得异源杀虫蛋白基因：
针对目标害虫选择适当的Vip3A杀虫蛋白基因，构建合适的酶切位点，用合成的方法获得目标蛋白基因Vip3Aa1（Vip3A杀虫蛋白家族成员之一）；
（3）构建携带Vip3A蛋白基因和选择标记基因的二元表达载体：
将步骤（2）所得的目标蛋白基因Vip3A置于步骤（1）所得的球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段以及构巢曲霉（Aspergillius nidulans）色氨酸基因的终止子TtrpC之间；然后与生防真菌筛选标记草丁膦抗性基因bar表达元件串联成二元表达载体；
（4）获得生防真菌的重组工程菌株：
将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入生防真菌，筛选后获得组成型超高表达Vip3A蛋白基因的重组工程菌株——保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana的菌株BbHV8。
作为本发明的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法的改进：步骤（4）中的生防真菌为白僵菌属Beauveria、绿僵菌属Metarhizium、棒束孢属Isaria（=拟青霉Paecilomyces）或蜡蚧菌属Lecanicillium（=轮枝菌属Verticillium）等昆虫病原真菌的菌种菌株。
作为本发明的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法的进一步改进：将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入生防真菌的方法为：原生质体转化、农杆菌介导转化、芽生孢子转化或电击转化。
本发明还同时提供了上述具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的用途：用于肠毒杀虫。
具体的说，本发明的工程菌株构建方法依次通过以下步骤实现：
1. 在大肠杆菌中扩增并提取真菌表达质粒pAN52-1N。
2. 筛选生防真菌的内源强启动子片段
根据已知的球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列，设计引物克隆其N端启动子全长序列Phyd1。在线分析序列结构之后，设计多对两端分别带酶切位点BglII和NcoI的引物，PCR扩增不同片段长度的启动子序列，形成截头启动子片段。用内切酶BglII和NcoI分别切开不同片段长度的PCR产物和携带构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA的pAN52-1N质粒（Ying and Feng, 2006），并将二者连接起来。由此，得到一组用不同长度hyd1启动子序列替换PgpdA的质粒PAN52-Phyd1-x，其中x代表不同长度的Phyd1启动子序列t0、t1、t2、t3及t4或3个转录因子分别定点突变的t1。将该组质粒分别用NcoI和BamHI酶切，并与相同酶切过的外源报告基因eGFP、构巢曲霉色氨酸基因终止子TtrpC和筛选标记草丁膦抗性基因bar串联，得PAN52-Phyd1-x-eGFP-TtrpC-bar二元表达载体，用于真菌转化。利用真菌芽生孢子转化技术（Ying and Feng, 2006），将构建的二元表达载体逐一转入球孢白僵菌，筛选阳性转化子，各启动子片段启动eGFP表达的强度作为衡量其功能强弱的依据，以表达强度最大的启动子片段作为Phyd1优化后的强启动子核心序列(Phyd1-t1)，用于目标基因的操作。
3. Vip3Aa1杀虫蛋白基因的获得
根据基因库中已知的Vip3Aa1蛋白基因序列设计带酶切位点NcoI和BamHI的引物，用PCR方法扩增目标基因。
4. 超高表达Vip3Aa1蛋白基因的重组菌株构建
用内切酶NcoI和BamHI分别切开vip3Aa1基因的PCR产物和质粒pAN52-Phyd1-t1，将vip3Aa1与质粒连接，使其置于优化启动子Phyd1-t1和构巢曲霉色氨酸基因终止子TtrpC（Punt et al., 1990）之间，再与筛选标记草丁膦抗性基因bar（Ying and Feng, 2006）串联，构成用于真菌转化的二元表达载体pAN52-Phyd1-t1-vip3Aa1-TtrpC-bar。运用真菌芽生孢子转化技术（Ying and Feng, 2006），将所构建的二元表达载体转入球孢白僵菌的目标野生菌株，筛选获得超高表达Vip3Aa1蛋白、杀虫效果大幅提高的重组工程菌株。
在发明过程中，发明人认为真菌疏水蛋白是一类具有强表面活性的分泌性小分子蛋白质，广泛存在于各类真菌的气生菌丝、分生孢子、侵染结构及子实体表面。球孢白僵菌疏水蛋白Hyd1（ABO38181.1）在其生长周期中均高效表达，尤其产生强疏水性的分生孢子（Cho et al., 2007）。因此发明人推测：该基因上游启动子序列极可能存在可特异性启动目标基因在分生孢子形成阶段表达的功能，因而在生防真菌的遗传改良中具有潜在利用价值。
在本发明中，内源强启动子为球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的启动子Phyd1（1798 bp）经截头和点变突优化处理后的片段，长度为1290 bp，能在分生孢子形成阶段启动外源目标基因的高表达；目标基因为苏云金芽孢杆菌营养期分泌的Vip3A杀虫蛋白家族基因及其经过修饰、融合或突变的基因。
该发明的显著技术特点在于，筛选具有超强启动力的虫生真菌内源启动子Phyd1的核心序列片段Phyd1-t1，再将Vip3Aa1蛋白的编码基因置于该强启动子之下构建二元真菌表达质粒。利用芽生孢子转化体系将真菌表达质粒转入生防真菌，筛选获得组成型超高表达Vip3Aa1蛋白的重组菌株，通过生物测定重组菌株的肠毒杀虫活性，证明其对暴食性叶面害虫的毒力得到大幅提高。
该发明利用内源强启动子特异性驱动外源Vip3A杀虫蛋白在生防真菌分生孢子形成阶段超高表达、从而大幅提高生防真菌工程菌株对暴食性叶面害虫的肠毒活性的的技术路线及其构建方法，均系首次报道。
主要参考文献如下：
1、Cho EM, Kirkland BH, Holder DJ, Keyhani NO (2007) Phage display cDNA cloning and expression analysis of hydrophobins from the entomopathogenic fungus Beauveria (Cordyceps) bassiana (球孢白僵菌疏水蛋白基因的cDNA克隆与表达分析). Microbiology-SGM 153: 3438-3447。
2、Punt PJ, Dingemanse MA, Kuyvenhoven A, Soede RDM, Pouwels PH, van den Hondel CAMJJ. (1990) Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子区域中的功能元件分析). Gene 93: 101-109。
3、Qin Y (秦毅),Ying SH (应盛华),Chen Y (陈颖),Shen ZC (沈志成),Feng MG (冯明光). (2010) Integration of insecticidal protein Vip3Aa1 into Beauveria bassiana enhances fungal virulence to Spodoptera litura larvae by cuticle and per os infection (杀虫蛋白Vip3Aa1植入球孢白僵菌能增强白僵菌对斜纹夜蛾幼虫经体表和摄入途径侵染的毒力). Applied and Environmental Microbiology 76: 4611-4618。
4、Ying SH (应盛华), Feng MG (冯明光). (2006) Novel blastospore-based transformation system for easy integration of phosphinothricin resistance and green fluorescenceprotein genes into Beauveria bassiana (基于芽生孢子的遗传转化新体系使草丁膦抗性基因和荧光蛋白基因易于转入球孢白僵菌中).Applied Microbiology and Biotechnology 72: 206-210。
具体实施方式
下面结合实验对利用本发明方法得到的重组工程菌株进行详细说明。
实施例1：特异性驱动外源基因在生防真菌分生孢子形成阶段超高表达的内源强启动子筛选：
根据已知的球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列(GenBank accession code: EF452344.2)设计引物，克隆获得其N端启动子的1798 bp的全长序列Phyd1 (GenBank accession code: GU936631.1)。根据对其特征进行在线分析的结果，设计多对两端分别带酶切位点BglII（t0-F: GGAAGATCTAATTAGTCAGGCACCCTTGACGC; t1-F: GGAAGATCT CGTGCCAGTTTCTCCAAGCAACTAC; t2-F: GGAAGATCTTGTCTCTCTTTTTTTATTGT ATCT; t3-F: GGAAGATCTCCTGAAAAGGTTTTATTGCGGC; t4-F: GGAAGATCTCAACA TCAGCAGTAGATGGGCGGCT）和NcoI（t-R: CATGCCATGGATGACGGTATTGTTTATT TGGTTG）的上下游扩增引物。50 μl指数扩增体系具体为：5 μl 10′ PCR缓冲液，4 μl 25 mM MgCl2，1 μl 20 mM dNTP，20 μM上下游引物各1 μl，球孢白僵菌野生菌株Bb2860（来自美国农业部ARSEF生防真菌菌种库）50 ng/μl基因组样品2 μl， 5 U/μl Taq酶0.5 μl，蒸馏水35.5 μl。扩增程序为94°C预变性5分钟后进入35个扩增循环（94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸1.5 分钟），最后72°C延伸7分钟。PCR产物用胶回收试剂盒回收，得到不同片段长度的启动子序列。
在大肠杆菌中扩增并提取携带构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的真菌通用启动子PgpdA的表达质粒pAN52-1N (Punt et al., 1990; Ying and Feng, 2006)。
用内切酶BglII和NcoI分别切开上述扩增的球孢白僵菌疏水蛋白基因启动子Phyd1不同片段长度的PCR产物和质粒pAN52-1N，并进行连接，得到一组新质粒pAN52-Phyd1-x，其中x代表不同序列长度的启动子片段t0（对应-1798 bp的全长片段）、t1（对应-1290 bp片段）、t2（对应-1179 bp片段）、t3（对应-988 bp片段）及t4（对应-799 bp片段）或t1所携带三个转录因子中任意一个定点突变后的片段（均为-1290 bp）。由此，质粒pAN52-1N中原有的真菌通用启动子PgpdA被逐一替换为hyd1基因的不同长度或定点突变的启动子序列Phyd1-x。
所获新质粒pAN52-Phyd1-x分别用NcoI和BamHI酶切，并与相同酶切的外源报告基因eGFP、构巢曲霉色氨酸基因终止子TtrpC和筛选标记草丁膦抗性基因bar串联连接，获得pAN52-Phyd1-x-eGFP-TtrpC-bar二元表达载体。利用真菌芽生孢子转化技术（Ying and Feng, 2006），将构建的二元表达载体转入球孢白僵菌野生菌株Bb2860，筛选出各启动子片段调控的阳性转化子于萨氏培养基（SDAY）上培养3天。所获菌落菌丝碾磨后提取蛋白质，其中eGFP蛋白的表达量通过专用仪器（荧光光谱仪JASCO FP-6500）测定荧光强度大小来定量评价启动子的强弱。由此找到驱动力最强的启动子片段Phyd1-t1作为Phyd1启动子优化后的强启动核心序列，其驱动效力是通用构巢曲霉gpdA基因启动子PgpdA（Punt et al., 1990）的15.6倍，荧光显微镜观察证明该核心启动子片段主要驱动外源目标基因在分生孢子形成阶段超表达，产生荧光最强的分生孢子。
实施例2：利用生防真菌内源强启动子超高表达Vip3A杀虫蛋白的工程菌株构建
在Vip3Aa1（Vip3A家族成员之一）杀虫蛋白基因 (GenBank accession code: AAC37036.1) 序列的首尾添加酶切位点NcoI和BamHI，用基因合成方法获得vip3Aa1基因。在大肠杆菌中扩增并提取新构建的真菌表达质粒pAN52-Phyd1-t1。用内切酶NcoI和BamHI分别切开vip3Aa1基因的扩增产物和pAN52-Phyd1-t1，并与该质粒连接成pAN52-Phyd1-t1-vip3Aal，再酶切后与终止子TtrpC和筛选标记草丁膦抗性基因bar串联连接，构建成pAN52-Phyd1-t1-vip3A-TtrpC-bar新的二元表达载体。将此质粒经芽生孢子转化体系介导转入球孢白僵菌野生菌株Bb2860的基因组中，在含200 μg/ml 草丁膦的筛选平板上随机挑取20个转化子进行PCR鉴定。首先，用PCR反应鉴定bar和vip3Aa1基因是否同时存在于转化子基因组中，扩增引物分别为：bar-F (AGAACGACGCCCGGCCG ACAT)及bar-R (CTGCCAGAAACCCACGTCATGC)与Vip3Aa1-F (CCTTCAGCAACCCGA ACTACGC)及Vip3Aa1-R (GCTCGCGCAGGTAGCTCTTACAG)。50 μl指数扩增体系具体为：5 μl 10′ PCR缓冲液，4 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 20 mM dNTP, 20 μM上下游引物各1 μl， 50 ng/μl的转化子菌株基因组2 μl，5 U/μl Taq酶0.5 μl，蒸馏水35.5 μl。扩增程序为94°C预变性5分钟后进入35个扩增循环（94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒），最后72°C延伸7分钟。抽取同时表达bar和vip3Aa1基因转化子的RNA并反转录成cDNA（按试剂盒说明书操作），在实时荧光定量PCR分析仪（Mastercycler ep realplex）上分析转化子中vip3Aa1基因的相对表达水平，筛选出Vip3Aa1蛋白组成型超高表达的转化子BbHV8 (保藏号：CGMCC No. 4438)，其在SDAY平板上培养4天的菌落中转录表达vip3Aa1基因的水平是外源PgpdA启动子（Punt et al., 1990）驱动的转化子BbV28 （Qin et al., 2010）的相同基因转录水平的111.7倍， Vip3Aa1杀虫蛋白在菌丝和成熟分生孢子中的表达量比PgpdA转化子分别高7.8倍和9.8倍。绿僵菌、棒束孢、蜡蚧菌等昆虫病原真菌与白僵菌同属丝孢类害虫生防真菌，具有相似的生物学特性，因而上述强启动子筛选、目标基因的真菌二元表达质粒构建和转化的技术路线以及获得超高表达Vip3A杀虫蛋白的工程菌株的方法原则上一致。
实施例3：超高表达Vip3Aa1球孢白僵菌转化子对斜纹夜蛾幼虫的毒力测定
将转化子BbHV8、BbV28及野生株Bb2860的分生孢子粉分别配制成4′106、2′107和1′108个孢子/ml的悬液。上述分生孢子粉的制备方法具体如下：各供试菌株分生孢子粉采用稻米为基质的固液双相法制备，即将各菌株接种于萨氏培养基SDAY（4%葡萄糖，1%蛋白胨，1%酵母粉和2%琼脂粉）斜面上，在25°C和光周期12L: 12D条件下培养7天至产孢，再将分生孢子转接到装有20 ml 萨氏培养液SDB（无琼脂的SDAY）的三角瓶中，25°C震荡（150 rpm/min）培养2天，然后将菌液按20% (v/v)的比列转接到 SDB培养液中放大培养。所得菌丝液按10% (v/w)的比例接入经蒸汽灭菌至适当熟度（约六成熟）的稻米上，混合后平摊于直径15 cm 的灭菌培养皿中（100 g米/皿），于25°C和12L: 12D条件下发酵产孢7天，然后去皿盖并用6层吸水纸封口在33°C下鼓风干燥3天，将米粒上生产的孢子粉用200 目标准筛振动收集后，常温真空干燥24 h，干燥后的孢子粉可立即用于生测实验或于-20°C冰箱中保存备用。
用全自动喷塔在0.7 kg/cm2的工作压力下各菌株不同浓度的1 ml孢子悬液分别自上而下地喷到载有40头斜纹夜蛾幼虫的新鲜荷叶圆片（直径12 cm），实际接种剂量用平放于叶片旁的盖玻片（20′20 mm）收集孢子，棉兰染色后在显微镜下镜检孢子数来确定叶片上沉降的孢子量/mm2。将喷过孢子并载有不同龄期斜纹夜蛾幼虫的荷叶圆片置于直径为15 cm的培养皿中，二至五龄各龄幼虫每浓度处理重复3次，以喷0.02%吐温80的处理作为空白对照。培养皿用PE保鲜膜封口后，在25°C和日光照12小时的培养箱中饲养8天，其间每隔1 (四、五龄)或2天(二、三龄)更换喷过孢子的新鲜叶片供幼虫取食，每日定时记录死亡虫数。所获生测数据拟合时间－剂量－死亡率模型，计算各菌株随处理时间而变化的剂量效应（LC50、LC50）和随孢子剂量而变化的时间效应（LT50、LT50）。
在生测中，分生孢子超高表达Vip3Aa1杀虫蛋白的BbHV8，高浓度处理后第3天杀死100%二龄幼虫，第4天杀死100%三龄幼虫，第8天杀四、五龄幼虫94%和93%。BbV28杀二、三龄幼虫的效果优于野生株Bb2860，远不如BbHV8。BbV28和Bb2860的高浓度处理第3天引起二龄幼虫的死亡率分别为40.9%和17.8%，第7天分别为97.3%和 87.9%，但到第8天才分别杀死三龄幼虫的62%和45%；杀四龄幼虫的效果更差，第8天分别仅杀20%和8%。
时间－剂量－死亡率模拟分析的结果表明，重组菌株BbHV8经孢子摄入对二龄幼虫第3、4、5天的LC50分别为116, 47和26个孢子/mm2，显示其肠毒杀虫活性在处理后第2~5天比野生株Bb2860提高32~129倍，比BbV28提高11~24倍。BbHV8对三龄幼虫第4、5、6天的LC50分别为615, 261和147个孢子/mm2，其肠毒杀虫活性在处理后3~8天比BbV28和Bb2860分别提高8~80倍和18~931倍。各菌株对二龄幼虫的LC50值相差显著，BbHV8对三龄幼虫的LC50显著低于BbV28和Bb2860，但后二者之间差异不显著。另外，BbHV8的LC90值随着虫龄而增大，随处理后时间的延长而降低，对二龄幼虫处理后3~5天的LC90为154-678孢子/mm2，对三龄幼虫处理后5~8天的LC90为422~1583孢子/mm2，对四、五龄幼虫处理6~8天的LC90分别为1032~2344和1389~3721孢子/mm2。
在相同处理剂量下，与BbV28和Bb2860相比，BbHV8对二龄幼虫的LT50分别缩短1.5~2.6天和2.9~4.2天，对三龄幼虫的LT50分别缩短2.1~3.8天和3.6~4.6天，说明BbHV8杀二龄和三龄幼虫比BbV28快63~100%，比Bb2860快1.1~1.6倍。在200~1400个孢子/mm2的喷雾剂量下，BbHV8对二到四龄幼虫的LT90值为4.6~8.0天，增至2000个孢子/mm2时降为2.8~7.3天。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQ ID NO：1
ggaagatcta attagtcagg cacccttgac gc 32
SEQ ID NO：2
ggaagatctc gtgccagttt ctccaagcaa ctac 34
SEQ ID NO：3
ggaagatctt gtctctcttt ttttattgta tct 33
SEQ ID NO：4
ggaagatctc ctgaaaaggt tttattgcgg c 31
SEQ ID NO：5
ggaagatctc aacatcagca gtagatgggc ggct 34
SEQ ID NO：6
catgccatgg atgacggtat tgtttatttg gttg 34
SEQ ID NO：7
agaacgacgc ccggccgaca t 21
SEQ ID NO：8
ctgccagaaa cccacgtcat gc 22
SEQ ID NO：9
ccttcagcaa cccgaactac gc 22
SEQ ID NO：10
gctcgcgcag gtagctctta cag 23
Claims (4)
1.具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌，其特征是：该菌株是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbHV8，其保藏编号为CGMCC No. 4438。
2.根据权利要求1所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，其特征是包括以下步骤：
（1）获得内源强启动子：
利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列设计引物，克隆其N端启动子全长序列Phyd1；不同长度或实施转录因子定点突变的启动子片段通过其启动外源报告基因的表达进行定量比较，找到启动绿色荧光蛋白表达量最大的启动子片段为球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段作为Phyd1优化后的强启动子核心序列Phyd1-t1，该片段携带3个缺一不可的转录因子；
（2）获得异源杀虫蛋白基因：
针对目标害虫选择适当的Vip3A杀虫蛋白基因，构建合适的酶切位点，用合成的方法获得目标蛋白基因vip3Aa1，所述Vip3A是一类由苏云金芽孢杆菌在营养生长期分泌的、具有信号肽的杀虫蛋白；
（3）构建携带Vip3A蛋白基因和选择标记基因的二元表达载体：
将步骤（2）所得的目标蛋白基因Vip3Aa1置于步骤（1）所得的球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段以及构巢曲霉（Aspergillius nidulans）色氨酸基因的终止子TtrpC之间；然后与生防真菌筛选标记草丁膦抗性基因bar表达元件串联成二元表达载体；
所述二元表达载体的制备方法如下：
在Vip3Aa1杀虫蛋白基因序列的首尾添加酶切位点NcoI和BamHI，用基因合成方法获得vip3Aa1基因；在大肠杆菌中扩增并提取新构建的真菌表达质粒pAN52-Phyd1-t1；用内切酶NcoI和BamHI分别切开vip3Aa1基因的扩增产物和pAN52-Phyd1-t1，并与该质粒连接成pAN52-Phyd1-t1-vip3Aal，再酶切后与终止子TtrpC和筛选标记草丁膦抗性基因bar串联连接，构建成pAN52-Phyd1-t1-vip3A-TtrpC-bar二元表达载体；
（4）获得生防真菌的重组工程菌株：
将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入球孢白僵菌(Beauveria bassiana)野生菌株Bb2860，筛选后获得组成型超高表达Vip3A蛋白基因的重组工程菌株，所述重组工程菌株的保藏名称为：球孢白僵菌(Beauveria bassiana) BbHV8菌株。
3.根据权利要求2所述的具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，其特征是：将步骤（3）构建所得的二元表达载体转入球孢白僵菌(Beauveria bassiana)野生菌株Bb2860的方法为：原生质体转化、农杆菌介导转化、芽生孢子转化或电击转化。
4.如权利要求1所述的具高肠毒杀虫活性的转基因球孢白僵菌的用途，其特征是：用于肠毒杀鳞翅目害虫。
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