CN104131028A - 利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：1)otef:GFP质粒载体的构建；2)球孢白僵菌DNA提取；3)球孢白僵菌原生质体的制备；4)PEG介导的遗传转化；5)PCR检测；6)转化子荧光观察。：本发明获得的原生质体再生率达70％以上。应用来otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化，其转化效率达到20个转化子/μgDNA。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。
背景技术
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种致病性与适应性很强，且寄主范围广的昆虫病原真菌，已被作为昆虫真菌制剂广泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育种过程中，启动子是外源或内源基因导入效率的重要因素之一。
目前，球孢白僵菌的遗传转化启动子主要采用来源于构巢曲霉的PgpdA启动子，长度为2000余bp，虽然具有良好的转化效率，但单一的启动子对不同类型基因进行转化时，会受到酶切位点而影响遗传转化载体的构建，其大小也会影响遗传转化载体的构建，并且影响转化效率，因此，开发一种新的高效启动子能够为球孢白僵菌遗传转化载体的构建提供更多的选择，为球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育种奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。其具体技术方案为：
一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：
1)otef:GFP质粒载体的构建
利用特异引物以质粒otef:CAR为模板扩增得otef全序列，克隆到pUCm-T载体上，形成pUC-otef，并测序验证；然后用XbaI和NcoI双酶切pUC-otef和PF质粒，回收otef片段，克隆到用相同酶切的PF载体上，形成otef：GFP载体；
2)球孢白僵菌DNA提取
100mg菌粉液氮研磨成粉末；
置于预先加入600μL提取液的1.5mlEP管静置2min；
加入100μL10％SDS，充分混合后加入300μL氯化苄，剧烈振荡混匀；50℃水浴1h，不用颠倒；
加入100μL3MNaAc，4℃放置十分钟后使用，，冰浴15min后12000r/min离心10min；
吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；
取上清加入RNA酶，65℃水浴30min；
加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；
取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，-20℃冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30min，12000r/min离心10min；
弃上清，留沉淀，以50-100μL的70％乙醇洗沉淀物，12000r/min离心3min，洗涤1-2次；
干燥后，加入50μLTE溶解DNA，保存于-20℃备用；
3)球孢白僵菌原生质体的制备
将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mLEP管中；
在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μLβ-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
28℃下100r/min培养20-25min；
将EP管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；
4)PEG介导的遗传转化
将得到的原生质体悬液吸取400μL到2个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照MIG：GFP；
对应管中分别加入10μLMIG：GFP质粒，冰浴20min；
每个管中各加入100μLPEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；
5)PCR检测
首先利用氯化苄法提取白僵菌基因组DNA,以MIG2-5特异性引物进行PCR及电泳检测；
6)转化子荧光观察
将转化子在PDA平板上划线26℃培养3天，挂下菌丝及孢子置于倒置荧光显微镜下观察。
优选地，步骤2)中所述提取液为1％SDS、0.5MNaCl、0.2MTris-Hcl、0.01MEDTA、ph＝8.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明获得的原生质体再生率达70％以上。应用来otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化，其转化效率达到20个转化子/μgDNA。
附图说明
图1是otef：GFP载体图谱；
图2是制备的原生质体；
图3是otef：GFP转化子及对照图片；图3a是转化子图片，图3b是对照图片；
图4是转化子PCR检测图片，M为分子量marker，泳道1为阴性对照，泳道2为阳性对照，泳道3为空白对照，泳道4-14转otef：GFP基因样品检测；
图5是转MIG：GFP质粒转化子荧光显微检测结果图，其中，图5(a)为荧光下；图5(b)为白光下；图5(c)为合成光下。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1实验方法：
1.1遗传转化载体的构建：将otef启动子构建到以抗草胺磷基因bar为筛选标记，绿色荧光蛋白GFP为标记基因，TtrpC为终止子的遗传转化载体上，构建otef：GFP转化载体。
1.2球孢白僵菌原生质体的制备及转化
原生质体的获得
(1)将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
(2)渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mLEP管中；
(3)在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μLβ-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
(4)28℃下100r/min培养20-25min；
(5)将小管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
(6)用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
(7)28℃下100r/min培养1h左右，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体。
PEG介导的遗传转化体系建立
(1)将得到的原生质体悬液吸取400μL到三个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照和otef：GFP质粒；
(2)对应管中分别加入10μLotef：GFP质粒(otef：GFP质粒浓度69.2ug/μL)冰浴20min；
(3)每个管中各加入100μLPEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
(4)各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
(5)加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
(6)吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
(7)将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打。吸出100μL均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察。
平均转化效率分析
(1)对otef：GFP载体进行球孢白僵菌原生质体遗传转化，每个载体转化5个平板；
(2)转化后对每个转化平板进行转化子数量的统计，取平均值，进行统计分析；1.3转化子的PCR检测及荧光观察
(1)利用灭菌环将查氏培养基上的转化子小心挑出，在提前准备的PDA平板上画多个“Z”字，分别标记为转otef：GFP和CK。
(2)将划好的平板置于26℃恒温培养箱恒温培养3d。
(3)此时得到转化子第一代，继续挑出孢子划线在新的PDA培养基上，培养3d得到第二代孢子；
(4)同上述过程，得到第三代转化子孢子，在超净工作台中挑出，置于SDY培养基中摇2-3d。
PCR检测：利用氯化苄法提取球孢白僵菌转化子基因组DNA，然后利用基因组做模版，利用GFP基因特异性引物，进行PCR及电泳检测。
荧光观察：菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，将实验控制在相同的培养条件及时间，在培养第48h置于倒置荧光显微镜下观察。
2研究结果：
2.1载体otef：GFP构建：如图1所示。
2.2转化子的获得及转化效率评价
(1)获得的原生质体再生率达70％以上。如图2所示。
(2)转化子的获得
利用PEG法将制得的otef：GFP质粒转入原生质体后均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，恒温培养后结果如图所示。图3a为转入otef：GFP质粒的球孢白僵菌培养基，相比于图3b的对照组，图3a可看到明显的球孢白僵菌菌落，证明原生质体转化得到阳性转化子。
(3)转化效率分析
每个转化后原生质体悬液均匀涂在5个查氏培养基上，筛选培养3-4d后，otef：GFP的转化子个数平均值分别为20个/μgDNA。
2.3PCR检测及荧光观察
(1)PCR检测
对经过三代继代培养后的转化子，提取总DNA后，利用otef特异性引物进行PCR检测。由图可知，转化子的PCR条带大小与otef大小相符。
(2)荧光观察
菌丝从PDA上刮下后置于SDAY培养基中摇三天，得到的菌丝体由于有GFP荧光基因的表达，所以得到的白僵菌菌丝及孢子中均有荧光出现。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)otef:GFP质粒载体的构建
利用特异引物以质粒otef:CAR为模板扩增得otef全序列，克隆到pUCm-T载体上，形成pUC-otef，并测序验证；然后用XbaI和NcoI双酶切pUC-otef和PF质粒，回收otef片段，克隆到用相同酶切的PF载体上，形成otef：GFP载体；
2)球孢白僵菌DNA提取
100mg菌粉液氮研磨成粉末；
置于预先加入600μL提取液的1.5mlEP管静置2min；
加入100μL10％SDS，充分混合后加入300μL氯化苄，剧烈振荡混匀；50℃水浴1h，不用颠倒；
加入100μL3MNaAc，4℃放置十分钟后使用，，冰浴15min后12000r/min离心10min；
吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；
取上清加入RNA酶，65℃水浴30min；
加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；
取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，-20℃冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30min，12000r/min离心10min；
弃上清，留沉淀，以50-100μL的70％乙醇洗沉淀物，12000r/min离心3min，洗涤1-2次；
干燥后，加入50μLTE溶解DNA，保存于-20℃备用；
3)球孢白僵菌原生质体的制备
将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；
渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mLEP管中；
在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μLβ-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；
28℃下100r/min培养20-25min；
将EP管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；
用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；
28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；
4)PEG介导的遗传转化
将得到的原生质体悬液吸取400μL到2个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照MIG：GFP；
对应管中分别加入10μLMIG：GFP质粒，冰浴20min；
每个管中各加入100μLPEG4000溶液，混匀，冰浴20min；
各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；
加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；
吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；
将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；
5)PCR检测
首先利用氯化苄法提取白僵菌基因组DNA,以MIG2-5特异性引物进行PCR及电泳检测；
6)转化子荧光观察
将转化子在PDA平板上划线26℃培养3天，挂下菌丝及孢子置于倒置荧光显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，其特征在于，步骤2)中所述提取液为1％SDS、0.5MNaCl、0.2MTris-Hcl、0.01MEDTA、ph＝8.0。
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| CN101392259A (zh) * | 2008-09-26 | 2009-03-25 | 浙江大学 | 一种抗逆能力增强的生防真菌的构建方法及抗逆能力增强的生防真菌 |
| CN102154127A (zh) * | 2011-01-12 | 2011-08-17 | 浙江大学 | 具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌及其构建法和用途 |
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