CN104263650A - 一种单宁酶高产菌株及其制备方法 - Google Patents

一种单宁酶高产菌株及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种单宁酶高产菌株及其制备方法。在以单宁酸为唯一碳源的培养基中对接入的五倍子中的微生物进行筛选，共分离到15株产单宁酶的纯种菌株，经摇瓶培养，最终确定一株产单宁酶活力最高的菌株N5，酶活力为45.56U/mL。经菌种鉴定，确定菌株N5为黑曲霉( Aspergilluse niger )。该菌株保藏号为CCTCC NO：M2014051。

Description

一种单宁酶高产菌株及其制备方法
  
技术领域
    本发明涉及微生物技术领域，具体涉及微生物筛选、菌种鉴定及发酵产酶相关领域，特别是提供了一种单宁酶高产菌株及其制备方法。 
背景技术
    单宁酶(Tannase, E.C. 3.1.1.20)，是一种广泛存在于微生物及植物中的诱导酶，尤其是在丝状真菌中，以单宁酸、五倍子等作为诱导物时可大量产生，属于细胞膜结合酶，可分泌到胞外。单宁酶可专一性水解水解型单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸、葡萄糖及相应的醇类等物质。 
    单宁酶目前已应用于饮料、酿酒、食品、医药、化工、制革及化妆品等多个领域，尤其在制备没食子酸、没食子酸丙酯及处理茶汁“冷后浑”和啤酒沉淀等方面应用广泛。但目前单宁酶生产效率不高，且市场价格非常昂贵，这阻碍了单宁酶的进一步应用。 
    经文献查新得知，目前生产单宁酶的主要方法还是通过微生物发酵制备，尤其对曲霉属、青霉属、根霉属的真菌及乳杆菌等细菌发酵生产单宁酶的报道较多。但目前存在着这些微生物大多产酶不高，尤其是国内对单宁酶高产菌株缺乏自主知识产权等问题。 
发明内容
    本发明目的是针对以上存在的问题，提供一种单宁酶高产菌株及其制备方法，从而提高单宁酶发酵产量，解决当前单宁酶生产效率不高的问题。 
    本发明筛选出的一株单宁酶高产菌株命名为N5，经菌种鉴定为黑曲霉(Aspergilluse niger)，保藏号：CCTCC NO： M 2014051，保藏时间：2014年2月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。 
    本发明菌株的制备方法包括以下步骤： 
（1）用10 mL无菌水冲洗5 g五倍子，将冲洗液加入到含90 mL无菌水的锥形瓶中，摇匀，即为10-1的菌溶液，梯度稀释至10-10，各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 ℃培养48 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落(共15个，编号N1-N15)分别接于PDA（马铃薯琼脂培养基）斜面活化72 h。所述筛选培养基由以下组份配制而成：磷酸二氢钾4.38 g，硫酸铵8.76 g，硫酸镁0.88 g，氯化钙0.088 g，氯化锰0.018g，钼酸钠0.0088 g，硫酸铁0.12 g，琼脂30 g，单宁酸10 g，用蒸馏水水溶解后定容至1 L;
（2）活化72 h后的PDA（马铃薯琼脂培养基）斜面上的孢子，用蒸馏水配制成106 个/mL的孢子悬浮液，然后接种l mL于30 mL发酵培养基中，30 ℃，120 r/min振荡培养72 h，提取单宁酶并测其活力，通过酶活力比较确定最优产酶菌株。结果表明，菌株N5产单宁酶活力最高，为45.56 U/mL。所述发酵培养基由以下组份配制而成：单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g，硫酸镁0.5g，用蒸馏水溶解后定容至1 L。
步骤（2）中，所述单宁酶提取酶活力测定方法，包括以下步骤： 
a、发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中4 ℃预冷，将菌丝体、石英砂、柠檬酸缓冲液按体积比1:1:4混合，在冰浴下研磨成浆，4 ℃下10000 r/min离心30 min，取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，即得单宁酶酶液。
所述柠檬酸缓冲液配制方法为：准确称取柠檬酸21.01 g，加水定容至1000 mL，作为A液；准确称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000 mL，作为B液，将A液与B液按1:2比例混合，再用A液和B液调混合液的pH值至5.0，即得柠檬酸缓冲液。 
b、准备1支对照管、1支空白管和3支平行测定管，先在每支试管中各加入1 mL单宁酶酶液，45 ℃水浴预热10 min，然后在测定管中各加入1 mL没食子酸丙酯溶液，在空白管中加入1 mL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6 mL乙醇，反应20 min后，分别在测定管和空白管中加入4 mL乙醇终止反应，在对照管中加入1 mL没食子酸丙酯溶液。待反应液冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270 nm下吸光值。 
所述没食子酸丙酯溶液配制方法为：准确称取0.2122 g没食子酸丙酯，先加3滴无水乙醇促溶，再用柠檬酸缓冲液定容至500 mL。 
c、用柠檬酸缓冲液分别配制20、40、60、80、100 μmol/L的没食子酸丙酯溶液，测定其270 nm下的吸光值，绘制回归曲线，根据该曲线的回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为93.343A对-1.6626，测定管没食子酸丙酯浓度则为93.343A测 -1.6626，按下列公式计算酶活力： 
注：式中，A 对和A 测分别表示酶活力测定时对照管和测定管溶液的吸光度值。
酶活力定义：在反应温度45 ℃，pH值5.0的条件下，每小时水解减少0.01μmol底物没食子酸丙酯所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。 
    本发明菌株的鉴定方法包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。其中，形态学鉴定通过观察菌落特征和细胞形态进行初步鉴定；分子生物学鉴定通过提取菌株基因组DNA和菌种18SrDNA片段PCR扩增、测序及比较分析作出最终鉴定。 
本发明的菌株为一种具有单宁酶高产能力的黑曲霉。此菌株所产单宁酶，经分离纯化后其比活力高达6546.78 U/mg，远高于美国Sigma公司所产单宁酶比活力3185.25 U/mg。 
附图说明
    图1为没食子酸丙酯标准曲线。纵坐标为没食子酸丙酯浓度(μmol/L)，横坐标为吸光值A； 
    图2为各菌株产单宁酶活力图。纵坐标为酶活力(U/mL)，横坐标为菌株编号，1代表菌株N1，2代表菌株N2，以此类推；
    图3为PCR程序设置图；
    图4为菌落形态；
    图5为菌种显微镜观察图；
    图6为PCR产物电泳图。注：泳道1为DL2000 marker，泳道2为PCR扩增产物；
    图7为菌种18SrDNA测序结果图；
      图8为系统发育树。 
具体实施方式
    为使本领域技术人员进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，并结合说明书附图详细阐述本发明的技术方案。需要强调的是，实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。 
实施例
    1材料与方法 
    1.1材料与试剂
    1.1.1材料
五倍子，采集于湖南张家界。
    1.1.2试剂 
没食子酸，没食子酸丙酯，湖南省林产化工工程重点实验室提供，纯度≥99%；甲醇，色谱纯，美国Fisher公司；葡萄糖，单宁酸，蔗糖，硝酸钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾，硫酸铁，硫酸镁，硫酸铵，氯化钙，氯化锰，钼酸钠，柠檬酸，柠檬酸钠，苯酚，乳酸，甘油，棉蓝，溴酚蓝，琼脂均为国产分析纯，广州化学试剂厂；真菌基因组DNA提取试剂盒，Solarbio公司；D-2000 DNA分子量标准Marker，LA Taq DNA聚合酶，GCbuffer I增强型PCR buffer，dNTPs，Takara公司；扩增引物，上海吉美生物工程有限公司；琼脂糖凝胶，西班牙Biowest公司；II型 Gold view，北京优尼康生物科技有限公司。
    1.1.3培养基 
筛选培养基：磷酸二氢钾4.38 g，硫酸铵8.76 g，硫酸镁0.88 g，氯化钙0.088 g，氯化锰0.018 g，钼酸钠0.0088 g，硫酸铁0.12 g，琼脂30 g，单宁酸10 g，溶解后定容至1 L。
发酵培养基：单宁酸20 g，蔗糖10 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，硫酸镁0.5 g，溶解后定容至1 L。 
    马铃薯琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸汁1 L，葡萄糖20.0 g，琼脂20 g。马铃薯浸汁制备：马铃薯去皮、洗净、切片。称取200 g放入1 L水中用文火煮沸30 min，双层纱布过滤，滤液加水补至1 L。 
    察氏培养基：蔗糖30 g，硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，硫酸镁0.5 g，琼脂15 g，混匀后定容至1 L。 
    1.1.4主要溶液及配制 
    (1) 0.1 mol/L pH值5.0的柠檬酸缓冲液
    A液：准确称取柠檬酸21.01 g，定容至1000 mL；B液：准确称取柠檬酸钠29.41 g，定容至1000 mL。
将A液与B液大约按1:2的比例混合，再利用这两种溶液调pH值至5.0。 
(2) 2×10-3 mol/L没食子酸丙酯母液 
准确称取0.2122 g没食子酸丙酯，先加3滴无水乙醇促溶，再用上述柠檬酸缓冲液定容至500 mL。
(3) 棉蓝乳酚油染液 
10 g苯酚置于40 mL水中，加热溶解，再加入10 g乳酸(密度为1.21 kg/m3)和20 g甘油(密度1.21kg/m3)，再加入0.05 g棉蓝。
    1.2实验方法 
    1.2.1产单宁酶菌株的筛选
(1) 用10 mL无菌水冲洗5 g五倍子，将冲洗液加入到含90 mL无菌水的锥形瓶中，摇匀，即为10-1的菌溶液，梯度稀释至10-10，各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 ℃培养48 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落分别接于PDA斜面活化72 h。
(2) 活化72 h后的PDA斜面上的孢子，用蒸馏水配制成106 个/mL的孢子悬浮液，接种l mL于30 mL发酵培养基中，30 ℃，120 r/min振荡培养72 h，提取单宁酶并测其活力，通过酶活力比较确定最优产酶菌株。 
    1.2.2 单宁酶提取及酶活力测定 
    (1) 单宁酶提取
发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中4℃预冷。将菌丝体、石英砂、缓冲液按1:1:4比例在冰浴下研磨成浆，4 ℃下10000 r/min离心30 min。取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，即得单宁酶酶液。
(2) 单宁酶活力测定 
准备1支对照管、1支空白管和3支平行测定管。首先在每支试管中各加入1 mL酶液，45 ℃水浴预热10 min，然后在测定管中各加入1 mL没食子酸丙酯溶液，在空白管中加入1 mL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6 mL乙醇，准确反应20 min后，分别在测定管和空白管中加入4 mL乙醇终止反应，在对照管中加入1 mL没食子酸丙酯溶液。待反应液冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270 nm下吸光值。
(3) 没食子酸丙酯标准曲线的建立 
用柠檬酸缓冲液配制20、40、60、80、100 μmol/L的没食子酸丙酯溶液，测定其270 nm下的吸光值，绘制回归曲线，如图1所示。
(4) 酶活力定义 
在反应温度45 ℃，pH值5.0的条件下，每小时水解减少0.01 μmol底物没食子酸丙酯所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。
(5) 酶活力计算 
据图1中直线回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为93.343A对-1.6626，测定管没食子酸丙酯浓度则为93.343A测 -1.6626。按照酶活力定义，计算公式如下：
注：式中，A 对和A 测分别表示酶活力测定时对照管和测定管溶液的吸光度值。
    1.2.3菌种鉴定 
    1.2.3.1形态学鉴定
    (1) 菌落特征观察
制作察氏培养基平板若干，用接种环挑取PDA斜面孢子少许，点接于平板，30 ℃培养箱中倒置培养48 h，观察菌落形成过程和特征。
    (2) 细胞形态观察 
用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体少许，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察。观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗，并结合《真菌鉴定手册》(魏景超等, 1979)分析。
    1.2.3.2分子生物学鉴定 
    (1) 菌株基因组DNA提取
    ①将最优菌株30 ℃培养48 h后挑取菌体约50 mg，置于灭菌研钵中，加入溶液A(真菌提取试剂盒，下同)200 μL，再加入20 μL RNase A，并放入100 mg玻璃珠，于漩涡振荡器上振荡20 min。
②加入20 μL l0 mg/mL的蛋白酶K，充分混匀，55 ℃水浴消化30 min。消化期间颠倒离心管混匀数次，12000 r/min离心2 min，将上清转移至一个新离心管中。 
③在上清液中加入200 μL溶液B，充分混匀。55 ℃水浴5 min，加入200 μL乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2 min。 
④12000 r/min离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700 μL漂洗液，l2000 r/min离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 
⑤向吸附柱中加入500 μL漂洗液，l2000 rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中，l2000 r/min离心2 min，将吸附柱置于室温放置5 min。 
⑥将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100 μL经75 ℃水浴预热的洗脱液，室温放置5 min，l2000 r/min离心l min。 
⑦离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2 min，l2000 r/min离心2 min，即得到基因组DNA，同时进行电泳鉴定。 
(2) 菌种18SrDNA片段的扩增与鉴定 
按照表1所示配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，扩增程序如图2所示。
表1  菌种18SrDNA片段PCR扩增体系
名称 用量 名称 用量
模板DNA 1 μL GCbuffer I (2×) 15 μL
*上游引物NS1(10μm/mL) 1 μL LA Taq(5U/μL) 0.5 μL
*下游引物NS8(10μm/mL) 1 μL DDH2O 加至30 μL
注：上游引物NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC，下游引物NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA
    ①完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，Gold view染色，然后在凝胶成像系统下进行观察与拍摄。
②将PCR产物进行测序，得到测序结果后用Bioedit等软件进行拼接。 
③分析测序结果，将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。使用软件DNAMAN 6.4.0进行分析构建菌株同源进化关系树。 
    2结果与分析 
    2.1最优菌株的筛选
    (1) 按照1.2.1方法，得到纯菌株15株，编号N1-N15。
(2) 经摇瓶培养，各菌株产酶活力如图2所示。由图2知，菌株N5的产酶活力最高，为45.56 U/mL。 
    2.2菌种鉴定 
    2.2.1形态学鉴定
(1) 菌落特征观察结果。N5菌落呈球形，直径为38.0 mm，表面平坦具有同心轮，结合紧密，呈厚绒状，边缘为白色绒毛状气生菌丝，背面有放射性沟纹，略带褐色。在培养24 h内，菌落成白色菌丝，48 h后，菌落表面产生黑色孢子，菌落表面逐渐变为黑色(见图4)，该菌种疑似为黑曲霉。
(2) 细胞形态观察结果。N5由菌丝、分生孢子梗和顶囊组成，顶囊呈球形，分生孢子头褐黑色放射状，其上覆有一层梗基，小梗上长有串状分生孢子，孢子呈球形或近球形，有足细胞，分生孢子梗由足细胞垂直生出，分生孢子梗基无横隔，表面光滑，菌丝有隔(见图5)。参照《真菌鉴定手册》，鉴定此菌株属半知菌类(Fungi Imperfecti)，从梗抱目(Moniliales)，从梗抱科(Moniliaceae)，曲霉族(Aspergilleae)，曲霉属(Aspergillus Micheli ex Fr.)。 
    2.2.2分子生物学鉴定 
(1) 真菌基因组DNA提取及PCR扩增结果
由图6可见，菌种基因组DNA提取后经电泳鉴定为一条亮带，无任何杂带存在，表明基因组DNA提取非常成功，无分解，无污染。PCR扩增成功获得一条长度约1800 bp的亮带，参考其他文献，疑似所需条带，条带亮度较高，同时无其他杂带干扰，可将PCR产物送交生物技术公司纯化及测序。
(2) 测序及比对结果 
测序数据经软件拼接得到该菌种18SrDNA序列，长度为1230(见图7)。经NCBI序列比对，该序列与黑曲霉属具有高度同源性，与黑曲霉(Aspergilluse niger)等同源性在99%以上，属半知菌亚门真菌。
    (3) 系统发育树的构建 
    从GenBank数据库中收集整理一些已报道的代表不同种属的黑曲霉菌株的ITS序列，加上本实验得到的ITS序列，利用NJ法构建系统进化树(见图8)。从系统进化树上可看出，N5在分类地位上位于黑曲霉属的分支中，由此可确定N5为黑曲霉菌属中的不同种类。
综上，鉴定菌株N5为黑曲霉(Aspergilluse niger)，属半知菌亚门真菌。 

Claims (5)

1.一种单宁酶高产菌株，命名为N5，经菌种鉴定为黑曲霉，保藏号：CCTCC NO:M 2014051，保藏时间：2014年2月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
2.一种单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用10 mL无菌水冲洗5 g五倍子，将冲洗液加入到含90 mL无菌水的锥形瓶中，摇匀，即为10-1的菌溶液，梯度稀释至10-10，各梯度于筛选培养基上涂平板3个，30 ℃培养48 h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落，分别接于马铃薯琼脂培养基斜面活化72 h，所述筛选培养基由以下组份配制而成：磷酸二氢钾4.38 g，硫酸铵8.76 g，硫酸镁0.88 g，氯化钙0.088 g，氯化锰0.018g，钼酸钠0.0088 g，硫酸铁0.12 g，琼脂30 g和单宁酸10 g，用蒸馏水水溶解后定容至1 L；
（2）活化72 h后的马铃薯琼脂培养基斜面上的孢子，用蒸馏水配制成106 个/mL的孢子悬浮液，然后接种l mL于30 mL发酵培养基中，30 ℃，120 r/min振荡培养72 h，提取单宁酶并测其活力，通过酶活力比较确定最优产酶菌株，所述发酵培养基由以下组份配制而成：单宁酸20g，蔗糖10g，硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g和硫酸镁0.5g，用蒸馏水溶解后定容至1 L。
3.根据权利要求2所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述单宁酶提取酶活力测定方法，包括以下步骤：
a、发酵悬浮液经抽滤后得到菌丝体，蒸馏水洗至pH值中性，于冰箱中4 ℃预冷，将菌丝体、石英砂、柠檬酸缓冲液按体积比1:1:4混合，在冰浴下研磨成浆，4 ℃下10000 r/min离心30 min，取上清液，用柠檬酸缓冲液定容至10 mL，即得单宁酶酶液；
b、准备1支对照管、1支空白管和3支平行测定管，先在每支试管中各加入1 mL单宁酶酶液，45 ℃水浴预热10 min，然后在测定管中各加入1 mL没食子酸丙酯溶液，在空白管中加入1 mL柠檬酸缓冲液，在对照管中加入0.6 mL乙醇，反应20 min后，分别在测定管和空白管中加入4 mL乙醇终止反应，在对照管中加入1 mL没食子酸丙酯溶液，待反应液冷却后，用柠檬酸缓冲液稀释9倍，测定270 nm下吸光值；
c、用柠檬酸缓冲液分别配制20、40、60、80、100 μmol/L的没食子酸丙酯溶液，测定其270 nm下的吸光值，绘制回归曲线，根据该曲线回归方程，对照管没食子酸丙酯浓度应为93.343A对-1.6626，测定管没食子酸丙酯浓度则为93.343A测 -1.6626，按下列公式计算酶活力：
注：式中，A 对和A 测分别表示酶活力测定时对照管和测定管溶液的吸光度值。
4.根据权利要求3所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤a中，所述柠檬酸缓冲液配制方法为：准确称取柠檬酸21.01 g，加水定容至1000 mL，作为A液；准确称取柠檬酸钠29.41g，定容至1000 mL，作为B液，将A液与B液按1:2比例混合，再用A液和B液调混合液的pH值至5.0，即得柠檬酸缓冲液。
5.根据权利要求3所述的单宁酶高产菌株的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述没食子酸丙酯溶液配制方法为：准确称取0.2122 g没食子酸丙酯，先加3滴无水乙醇促溶，再用柠檬酸缓冲液定容至500 mL。
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