CN114107161B - 一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，属于生物技术领域。该方法包括如下步骤：a、制备酒曲菌悬液；b、以5‑20％接种量接入驯化培养基进行驯化，逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度，驯化5‑20代得到驯化菌群；c、将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，加入发酵培养基，将菌群按5‑20％接种量接入发酵培养基中发酵1‑6天生产得到鞣花酸。本发明不仅提供了一种新的利用驯化菌群高产单宁酶的技术方案，而且能有效生产鞣花酸，可提高石榴皮废弃物的利用率。

Description

一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法。
背景技术
鞣花酸是广泛存在于各种软果、坚果等植物组织中的一种天然多酚，具有多种生物活性功能,例如抗氧化功能、抗癌、抗突变性能、对人体免疫缺陷病毒的抑制作用。鞣花酸也是一种有效的凝血剂,对多种细菌、病毒都有很好地抑制作用。目前能够降解鞣花单宁的为单一菌株，单一菌株在降解鞣花单宁的过程中仍存在酶活低、降解效率低、转化时间长等问题。
微生物驯化是指驯化微生物的行为。在微生物培养过程，循序渐进地改变培养基浓度或者种类，不适应新环境的细胞会生长非常缓慢，适应环境的细胞可以逐步恢复至之前的生长速率，最终可以达到改善或改变环境中的有效成分。微生物驯化能够筛选并富集有利突变而获得高活性菌株。单宁酶是一种诱导酶，可由单宁酸诱导产生。提高单宁酸浓度的驯化，可以选育高产单宁酶的突变菌群，突变菌群保持一个共利共生、彼此协作的状态。可采用微生物法发酵生产鞣花酸，其原理是：利用单宁酶降解含鞣花单宁含量高的物质将其转化为鞣花酸。现有的微生物法生产技术多集中在菌株的选育、培养基或培养条件的控制这三个方面。传统的通过优化培养基配方操作复杂，易受菌种活力的影响，造成发酵结果不稳定、鞣花酸含量不高等；此外，菌种的传统诱变筛选方法工作量大、筛选工作盲目，筛得的菌种往往达不到预期的效果、遗传稳定性差。因此，新的菌种选育方法对提高菌株的鞣花酸产量具有重要意义。综上所述，我们选择驯化的混合菌群来降解单宁生成鞣花酸。
在降解石榴皮实验中，我们发现驯化后的菌群降解效果比驯化后的单一菌株要好，效率更高。混合菌群在驯化的过程中已经可以达到较高的酶活，我们所选择的两株菌在发酵过程中前期生产木质纤维素酶，后期共同生产单宁酶降解石榴皮。利用不同菌株分泌的不一样的酶，其在固态发酵中形成的互补协同效应,使鞣花酸转化效率更高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是现有微生物法发酵生产鞣花酸时菌种筛选工作量大，发酵结果不稳定等问题，有效提高降解效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，包括如下步骤：
a、制备酒曲菌悬液；
b、以5-20％接种量接入驯化培养基进行驯化，逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度，驯化5-20代得到驯化菌群；
c、将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，加入发酵培养基，将菌群按5-20％接种量接入发酵培养基中发酵1-6天生产得到鞣花酸。
其中，上述方法步骤b中，所述驯化培养基的制备方法如下：
A1：配制含10g/L单宁酸、10g/L硫酸铵培养基；驯化过程中逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度，每一代驯化3次，第二次含20g/L单宁酸、20g/L硫酸铵，第三次含30g/L单宁酸、30g/L硫酸铵；
A2：用0.1moL/L NaOH溶液调整培养基pH＝7.0-7.2，121℃灭菌20min。
进一步的，每次驯化在30℃、150rpm摇床培养4天，每次驯化接种量10％；驯化10-15代。
其中，上述方法还包括驯化菌群筛选培养的步骤：配置PDA培养基冷却后倒平板，取驯化菌群用无菌水分别稀释至10-5、10-6、10-7、10-8，吸取稀释液涂布于PDA琼脂平板上，30℃培养一周；选取生长良好的单菌株，连续3次划线于初筛平板，纯化并保存菌株；将保存的菌株按1×108CFU/mL鞣花单宁添加量接入步骤c发酵培养基中生产鞣花酸。
进一步的，PDA培养基的制备方法：按重量份数计，马铃薯浸粉6g/L,葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH＝5.4-5.8，115℃灭菌30min。
其中，上述方法所述保存的菌株为保藏编号是GDMCC No.61913和GDMCC No.61915的菌株。两株菌的的添加量相同。
保藏编号是GDMCC No.61913的菌株，保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏日期2021年9月2日，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼59号楼5楼，其分类学命名为极细枝孢霉Cladosporium tenuissimum。该菌株具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
SEQ ID NO：1极细枝孢霉核苷酸序列
GTGTCCTGCGTGACCGGTCTACACCGGGATGTTCATAACCCTTTGTTGTCCGACTCTGTTGCCTCCGGGGCGACCCTGCCTTCGGGCGGGGGCTCCGGGTGGACACTTCAAACTCTTGCGTAACTTTGCAGTCTGAGTAAACTTAATTAATAAATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCACTCAAGCCTCGCTTGGTATTGGGCAACGCGGTCCGCCGCGTGCCTCAAATCGACCGGCTGGGTCTTCTGTCCCCTAAGCGTTGTGGAAACTATTCGCTAAAGGGTGTTCGGGAGGCTACGCCGTAAAACAACCCCATTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGAATCTCCGGGATCGCGATCTACCTGATCCGAGGTCACCTTAGAAATGGGGTTGTTTTACGGCGTAGCCTCCCGAACACCCTTTAGCGAATAGTTTCCACAACGCTTAGGGGACAGAAGACCCAGCCGGTCGATTTGAGGCACGCGGCGGACCGCGTTGCCCAATACCAAGCGAGGCTTGAGTGGTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTAATTTATTAATTAAGTTTACTCAGACTGCAAAGTTACGCAAGAGTTTGAAGTGTCCACCCGGAGCCCCCGCCCGAAGGCAGGGTCGCCCCGGAGGCAACAGAGTCGGACAACAAAGGGTTATGAACATCCCGGTGGTTAGACCGGGGTCACTTGTAATGATCCCTCCGCAGTCCCCCCTTACGGAAGG
保藏编号是GDMCC No.61915的菌株，保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏日期2021年9月2日，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼59号楼5楼，其分类学命名为聚多曲霉Asperigillus sydowii。该菌株具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：
SEQ ID NO：2极细枝孢霉核苷酸序列
TGACGGTTTTGTTCTCGGATCGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACCCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCGGAGGAAGGTCCCGCTTCCGCCGGGAGCGCATGCTACCTGATCCGAGGTCACCTGAAGAAAAATGGTTGGAGACGTCGGCTGGCGCCCGGCCGGCCCTAGTCGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACACGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCAGTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACTGATTTTATATTCAGACTCAGACTGCATCACTCTCAGGCATGAAGTTCAGTAGTCCCCGGCGGCTCGCCCCCGAGGGGGTTCCCCGCCGAAGCAACAGTGTTAGGTATTCACGGGTGGGAGGTTGGGCGCCCGGAGGCAGCCCGCACTCAGTAATGATCCTTCCGCAG
其中，上述方法步骤a中，酒曲菌悬液是按照每克酒曲与9mL无菌水混匀制得。
其中，上述方法步骤c中，菌群接种量10％；步骤c中，每3mL发酵培养基加入1g鞣花单宁；步骤c中，30℃恒温发酵3-5天。
一种生产鞣花酸的方法，将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，加入发酵培养基，将保藏编号是GDMCC No.61913和GDMCC No.61915的两株菌株接入发酵培养基中发酵1-6天生产得到鞣花酸。
进一步的，将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，按照每3mL发酵培养基加入1g鞣花单宁加入发酵培养基，将保藏编号是GDMCC No.61913和GDMCC No.61915的两株菌株按1×108CFU/mL鞣花单宁添加量接入发酵培养基中30℃恒温发酵3-5天生产得到鞣花酸。
本发明的有益效果是：本发明通过微生物驯化的方式得到菌群有效降解石榴皮生产鞣花酸，菌种筛选工作量小，产率、效率高。进一步的，采用本发明筛选的两株菌可以进一步提供其降解效果。本发明不仅提供了一种新的利用驯化菌群高产单宁酶的技术方案，而且能有效生产鞣花酸，可提高石榴皮废弃物的利用率。
附图说明
图1为C.tenuissimum菌落形态图；
图2为A.sydowii菌落形态图；
图3为C.tenuissimum系统发育树；
图4为A.sydowii系统发育树。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明具体实施方式进行说明，但并不因此将本发明范围现行在实施例之中。下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量
实施例1
有效驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，包括下列步骤：
S1：用电子天平称取1g酒曲样品，加入9mL无菌水。旋涡10min保证混匀即为酒曲菌悬液。
S2：以10％接种量接入驯化培养基，30℃、150rpm摇床培养4d。4d后以10％接种量进行下一次转接，并逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度(2g单宁酸+2g硫酸铵，3g单宁酸+3g硫酸铵，4g单宁酸+4g硫酸铵)。每一代驯化稳定3次。在原始、第5代、第10代、第15代中分别检测驯化效果，检测其生物量、单宁酶酶活和木质纤维素酶酶活。
所述驯化培养基的制备方法，包括下列步骤：
A1：10g/L单宁酸，10g/L硫酸铵，pH＝7.0。驯化过程中逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度(例如：20g/L单宁酸，20g/L硫酸铵；30g/L单宁酸，30g/L硫酸铵)
A2：用0.1moL/L NaOH溶液调整培养基pH＝7.0-7.2。121℃灭菌20min。
S3：驯化结束后配置PDA培养基冷却后倒平板。取1mL驯化菌群用无菌水稀释至10-5、10-6、10-7、10-8；吸取稀释液200μL涂布于PDA琼脂平板上，30℃培养一周。每个梯度涂4个平板。选取生长良好的单菌株，连续3次划线于初筛平板，纯化并保存菌株。
所述PDA培养基的制备方法如下：
A1：按重量份数计，马铃薯浸粉6g/L,葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH＝5.4-5.8，115℃30min。
S4：将平板分离挑选出的两株菌株送测。在无菌条件下，称取5g石榴皮鞣花单宁作为发酵基质，加入15mL发酵培养基。两株菌株按1×108CFU/mL鞣花单宁添加量接入发酵培养基中。石榴皮鞣花单宁以70％含水量在摇床中30℃恒温发酵5d，分别在第1、2、3、4、5d取样检测鞣花酸含量。通过HPLC测定结果计算鞣花酸含量。
实施例2
有效驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，包括下列步骤：
S1：用电子天平称取1g酒曲样品，加入9mL无菌水。旋涡10min保证混匀即为酒曲菌悬液。
S2：以10％接种量接入驯化培养基，30℃、150rpm摇床培养4d。4d后以10％接种量进行下一次转接，并逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度(2g单宁酸+2g硫酸铵，3g单宁酸+3g硫酸铵，4g单宁酸+4g硫酸铵)。每一代驯化稳定3次。在原始、第5代、第10代、第15代中分别检测驯化效果，检测其生物量、单宁酶酶活和木质纤维素酶酶活。
所述驯化培养基的制备方法，包括下列步骤：
A1：10g/L单宁酸，10g/L硫酸铵，pH＝7.0。驯化过程中逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度(例如：20g/L单宁酸，20g/L硫酸铵；30g/L单宁酸，30g/L硫酸铵)
A2：用0.1moL/L NaOH溶液调整培养基pH＝7.0-7.2。121℃灭菌20min。
S3：驯化结束后在无菌条件下，称取5g石榴皮鞣花单宁作为发酵基质，加入15mL发酵培养基。按10％接种量将菌群接入发酵培养基中。石榴皮鞣花单宁以70％含水量在摇床中30℃恒温发酵5d，分别在第1、2、3、4、5d取样检测鞣花酸含量。通过HPLC测定结果计算鞣花酸含量。
实验案例及效果
1、菌群驯化
1)驯化产单宁酶菌群
菌群驯化过程中按照实施例方式逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度。每一代驯化稳定3次。在原始、第5代、第10代、第15代中分别检测驯化效果，检测其生物量、单宁酶酶活等。
如表1所示，在原始、第五代驯化、第十代驯化、第十五代的菌群驯化下单宁酶活性分别达到20.21U/mL、35.54U/mL、57.77U/mL、83.73U/mL。
如表2所示，在原始、第五代驯化、第十代驯化、第十五代的菌群驯化下木质纤维素酶酶活分别达到6.50U/mL、7.23U/mL、9.11U/mL、9.35U/mL。
如表3所示，在原始、第五代驯化、第十代驯化、第十五代的菌群驯化下鞣花酸产率分别达到8.02％、13.67％、15.35％、17.21％。
如表4所示，在原始、第五代驯化、第十代驯化、第十五代的菌群驯化下生物量分别达到12.74g/L、19.7g/L、29.04g/L、36.53g/L。
如表5所示，在本发明驯化菌群筛选培养的两株菌的鞣花酸产率在1-5天分别达到2.78％、6.85％、12.47％、16.54％、13.14％。
如表6所示，在本发明驯化菌群筛选培养的C.tenuissimum菌单独的鞣花酸产率1-5天分别达到1.12％、2.71％、5.92％、10.34％、7.1％。
如表7所示，在本发明驯化菌群筛选培养的单独A.sydoii菌单独的鞣花酸产率1-5天分别达到1.5％、2.25％、4.57％、8.35％、7.8％。
如表8所示，在原始、第五代驯化、第十代驯化、第十五代的菌群驯化下在1-5天鞣花酸产率。
表1驯化菌群产单宁酶酶活效果
原始 第五代驯化 第十代驯化 第十五代驯化
单宁酶活性(U/mL) 20.21 35.54 57.77 83.73
酶活提升效果 无 75.85％ 62.55％ 51.86％
表2驯化菌群产木质纤维素酶酶活效果
Figure BDA0003354096400000061
表3驯化菌群的鞣花酸产率
原始 第五代驯化 第十代驯化 第十五代驯化
鞣花酸产率(％) 8.02％ 10.67％ 15.35％ 17.21％
产率提升效果 无 33.04％ 43.86％ 12.12％
表4驯化菌群生物量
原始 第五代驯化 第十代驯化 第十五代驯化
生物量(g/L) 12.74 19.7 29.04 36.53
生物量提升效果 无 54.63％ 47.41％％ 25.79％
表5两株菌的鞣花酸产率
1d 2d 3d 4d 5d
混菌 2.78％ 6.85％ 12.47％ 16.54％ 13.14％
表6单独C.tenuissimum的鞣花酸产率
1d 2d 3d 4d 5d
单菌 1.12％ 2.71％ 5.92％ 10.34％ 7.1％
表7单独A.sydoii的鞣花酸产率
1d 2d 3d 4d 5d
单菌 1.5％ 2.25％ 4.57％ 8.35％ 7.8％
表8驯化菌群不同天数的鞣花酸产率
1d 2d 3d 4d 5d
原始 1.73％ 2.35％ 5.30％ 8.02％ 7.33％
第五代驯化 1.25％ 3.52％ 7.38％ 10.67％ 9.12％
第十代驯化 2.78％ 5.73％ 15.35％ 14.66％ 12.65％
第十五代驯化 3.99％ 8.92％ 13.52％ 17.21％ 14.92％
综上所述，驯化的菌群不仅可以有效生产单宁酶，还能协同木质纤维素酶，更好的降解石榴皮并生产鞣花酸。
2、菌株的鉴定
从第十五代驯化菌群样品中分离出的两株菌株。由南京擎科生物科技有限公司测序获得的菌株如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，在NCBI数据库中进行BLAST比对后发现，一株与C.tenuissimum基因序列同源性达到99.93％，可以确定其为极细枝孢霉,另一株与A.sydowii基因序列同源性达到100.00％，可以确定其为聚多曲霉。其系统发育树如图3、图4所示。
3、菌株的培养与形态特征
PDA培养基：马铃薯浸粉6g/L,葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH＝5.4-5.8
摇床培养条件：转速为200rpm，温度为30℃。
形态特征：C.tenuissimum菌落接种于PDA培养基上，然后放置在温度为30℃，转速为200rpm的摇床，30℃条件下培养7天。如图1所示菌落直径3cm，呈圆形，表面有沟纹，呈橄榄色，菌落表面无光泽，质地干燥，边缘整齐。
形态特征：A.sydowii菌落接种于PDA培养基上，然后放置在温度为30℃，转速为200rpm的摇床，30℃条件下培养7天，如图2所示，菌落直径6cm，质地丝绒状至厚絮状，边缘白色，边缘直径2-3mm，间或有淡褐色区域，有辐射形沟纹，渗出液深褐色，出现于中央的沟纹部分。

Claims (8)

1.一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
a、制备酒曲菌悬液；
b、以5-20％接种量接入驯化培养基进行驯化，逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度，驯化5-20代得到驯化菌群；
c、将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，加入发酵培养基，将菌群按5-20％接种量接入发酵培养基中发酵1-6天生产得到鞣花酸；
步骤b中，所述驯化培养基的制备方法如下：
A1：配制含10g/L单宁酸、10g/L硫酸铵培养基；驯化过程中逐步梯度提高驯化培养基中碳源和氮源的浓度，每一代驯化3次，第二次含20g/L单宁酸、20g/L硫酸铵，第三次含30g/L单宁酸、30g/L硫酸铵；
A2：用0.1moL/LNaOH溶液调整培养基pH＝7.0-7.2，121℃灭菌20min；
每次驯化在30℃、150rpm摇床培养4天。
2.根据权利要求1所述的一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于：每次驯化接种量10％；驯化10-15代。
3.根据权利要求1所述的一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于，还包括驯化菌群筛选培养的步骤：配置PDA培养基冷却后倒平板，取驯化菌群用无菌水分别稀释至10-5、10-6、10-7、10-8，吸取稀释液涂布于PDA琼脂平板上，30℃培养一周；选取生长良好的单菌株，连续3次划线于初筛平板，纯化并保存菌株；将保存的菌株按1×108CFU/mL鞣花单宁添加量接入步骤c发酵培养基中生产鞣花酸。
4.根据权利要求3所述的一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于，PDA培养基的制备方法：按重量份数计，马铃薯浸粉6g/L,葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH＝5.4-5.8，115℃灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于：步骤a中，酒曲菌悬液是按照每克酒曲与9mL无菌水混匀制得。
6.根据权利要求1所述的一种混合驯化菌株降解石榴皮生产鞣花酸的方法，其特征在于：步骤c中，菌群接种量10％；步骤c中，每3mL发酵培养基加入1g鞣花单宁；步骤c中，30℃恒温发酵3-5天。
7.一种生产鞣花酸的方法，其特征在于：将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，加入发酵培养基，将保藏编号是GDMCCNo.61913的极细枝孢霉(Cladosporiumtenuissimum)和GDMCCNo.61915的聚多曲霉(Asperigillussydowii)的两株菌株接入发酵培养基中发酵1-6天生产得到鞣花酸。
8.根据权利要求7所述的一种生产鞣花酸的方法，其特征在于：将石榴皮的鞣花单宁作为发酵基质，按照每3mL发酵培养基加入1g鞣花单宁加入发酵培养基，将保藏编号是GDMCCNo.61913和GDMCCNo.61915的两株菌株按1×108CFU/mL鞣花单宁添加量接入发酵培养基中30℃恒温发酵3-5天生产得到鞣花酸。
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