CN101565724A - 极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法 - Google Patents

极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法 Download PDF

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一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的高产菌株极细枝孢霉，在优化的发酵培养基中pH为4.5－5.6、摇床转速为110－130r/min、温度为22－25℃的条件下恒温培养该菌株合成多酚氧化酶，取得多酚氧化酶粗酶液，并通入氧气进行体外模拟氧化儿茶素40－50分钟制备茶黄素。应用本发明可以获得茶黄素粗制品中茶黄素含量高于20.00％，且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。

Description

极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物胞外酶生产茶黄素的方法，尤指一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素粗提物的方法。
背景技术：
茶黄素为红茶的主要活性物质，具有多种药理与保健功效，某些方面甚至优于儿茶素，在天然药物、功能食品、日用化工、功能饮料开发等领域有着广泛的应用前景。目前所利用的茶黄素主要是从红茶中分离提取，红茶中茶黄素(TFs)总量含量低，约为0.2％-2.0％，但存在分离纯化技术难度大，成本高的缺点，这些技术障碍严重阻碍了其开发利用。获取高含量、低成本的茶黄素已成为茶学界、食品界和医药界研究的重要课题。体外模拟氧化(包括酶促氧化和化学氧化)一直作为研究儿茶素氧化机理及红茶发酵理论简单、有效的方法，已有学者用此方法研究制备了茶黄素，并获得了较好的效果。体外氧化制备茶黄素与从红茶中萃取制备比较，成本要明显降低。目前体外氧化制备茶黄素主要是通过化学方法或通过酶法制备，但化学方法具有终点难以掌握、反应副产物多等缺点；酶法因存在酶源缺乏、酶活性低等问题而未能广泛应用。因此，寻找理想的酶源已是体外模拟氧化制备茶黄素的首要任务。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素粗提物的方法，从茶黄素合成所需的多酚氧化酶酶源入手，利用微生物繁殖快、易培养、经济成本低等特点，筛选出高产多酚氧化酶的菌种应用于茶黄素的制备。
使用的微生物
本发明从合成茶黄素所需的多酚氧化酶(PolyphenolOxidase，PPO)入手，得到高产多酚氧化酶的菌株极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)，该菌株于2009年1月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.2891。
极细枝孢霉菌株具有下述性质：
1、形态学特征：
用显微镜观察菌丝的形态和孢子形态。结果表明：菌丝较细长，较少分枝，孢子从分生梗顶端成堆生长，分生孢子为椭圆形。
2、培养基上的特征：
MA琼脂培养基上，菌落形态为：菌落呈深橄榄色，短绒面，稍隆起。0.2％儿茶素-PDA平板上，生长3d后，出现橙红色变色圈；培养7d后菌落表面出现同心环纹。
将分离纯化的极细枝孢霉菌种采用BIOLOG-FF鉴定板(重复两次)及18S rDNA分子方法鉴定。此菌种为极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)，属于半知菌类(Fungi Imperfecti)丛梗孢目(Moniliales)暗梗孢科(Dematiaceae)双胞亚科(Didymosporoideae)芽枝霉属(Cladosporium)。
菌种的制备方法(筛选而得)
菌种的初筛：从茶园10-20cm深处取土，每克土样加入19ml的无菌水，并加入玻璃珠，振摇4-6min，稀释1000倍，取0.2ml接种于上层为PDA固体，下层为每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，静置培养3天；
菌种的复筛：将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体纯化培养基平板上进行培养，直至得到纯化的极细枝孢霉菌株。
再进一步利用纯化的极细枝孢霉菌株制备多酚氧化酶粗酶液和酶促氧化制备茶黄素：
多酚氧化酶粗酶液的制备
菌种的扩大培养：
将a2步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25℃下，以转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；
发酵培养基的配制：
配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO33g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的发酵液体培养基，培养液体积为容器总体积的50-65％，pH为4.5-5.6，于121℃条件下灭菌20min；
菌种的接种与发酵：
取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为4-7∶93-96，于22-25℃、转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；
制备粗酶液：
取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5℃下，以离心转速为7800-8200r/min离心25-35min后，取上清液作为粗酶液。
粗酶液的测定：取1.0mL粗酶液加3.0mL反应混合液(反应混合液按pH5.6柠檬酸-磷酸缓冲液∶0.1％脯氨酸∶1％邻苯二酚(10∶2∶3)于离心管中，37℃恒温水浴中反应10min，取出立即加3.0mL 1N偏磷酸摇均终止反应。离心4000rpm，10min，取上清液，用1cm比色皿，在波长460nm处测消光值。空白对照的反应混合液中的邻苯二酚用缓冲溶液代替，其它条件相同。酶活性以每毫升每分钟E460增加0.1为一活性单位。测得酶活力为315活性单位。由于酶的专一性很强，每种酶有特定底物(被催化反应的物质)，因此，每种酶的活力的测定均有固定的方法。而在此使用的便是多酚氧化酶的测定方法，其测定方法可参见黄意欢主编《茶学实验技术》(中国农业出版社，1997年出版)。因此，可以推断出该粗酶液即为多酚氧化酶粗酶液。
酶促氧化制备茶黄素
取上述多酚氧化酶粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于72％的儿茶素2.0g，于温度为22-25℃、pH为4.5-5.6的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。该茶黄素粗提物中主要含四种茶黄素单体：TF、TF3G、TF3’G及TFDG。
如此，本发明通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶的高产菌株极细枝孢霉，利用微生物天然酶源、安全、高效、低成本地制备茶黄素，茶黄素粗品中茶黄素总量高于20.00％；且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。
具体实施方式：
以下实施例中：
初筛培养基：上层为PDA固体；下层为每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体培养基。
纯化培养基：为每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体培养基。
扩大培养基：为每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基。
实施例1，从茶园10cm深处取土，称取土样5g放入盛有玻璃珠的95ml无菌水中，振摇5min，稀释1000倍，取0.2ml接种于初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，培养3天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上，直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培养基中，以110r/min的转速振摇，于23℃下恒温培养4天；将该菌株接种到含有马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度为70.08％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO40.1mmol/L的发酵液体培养基中，容器中培养液的装液量为50％，菌株的接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为4∶96，于pH为4.5，转速为110r/min，温度为23℃下恒温培养4天；取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4℃下经7800r/min离心30min后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多酚氧化酶的酶活力为310活性单位(测定方法参见黄意欢主编《茶学实验技术》，中国农业出版社，1997年出版。定义以1.0ml粗酶液1min OD值增加0.1为1个酶活性单位)。取此粗酶液1000ml加纯度为70.08％的大叶种茶儿茶素20.0g，于温度为22℃，pH为4.8条件下通入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化50分钟制得茶黄素粗提物，将茶黄素粗提物用膜过滤浓缩冷冻干燥后称重20.55g。用高效液相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量为20.17％，其中，TF、TF3G、TF3’G及TFDG单体含量分别为0.96％、2.65％、1.88％及14.68％。
实施例2，从茶园15cm深处取土，称取土样10g放入盛有玻璃珠的190ml无菌水中，振摇5min，稀释1000倍，取0.2ml接种于初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，培养3天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上，直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培养基中，以120r/min的转速振摇，于25℃下恒温培养4天；将该菌株接种到含有马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度为76.00％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO40.1mmol/L的发酵培养基中，容器中培养液的装液量为60％，菌株的接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为7∶93，于pH为5.0，转速为120r/min，温度为25℃下恒温培养4天；取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4℃下经8000r/min离心30min后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多酚氧化酶的酶活力为326活性单位。取此粗酶液1000ml加纯度为76.97％的大叶种茶儿茶素20.0g，于温度为25℃、pH为5.2条件下通入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化40分钟制得茶黄素粗提物，将茶黄素粗提物用膜过滤浓缩冷冻干燥后称重20.67g。用高效液相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量为20.37％，其中，TF、TF3G、TF3’G及TFDG单体含量分别为0.96％、2.79％、1.86％及14.76％。
实施例3，从茶园20cm深处取土，称取土样10g放入盛有玻璃珠的190ml无菌水中，振摇5min，稀释1000倍，取0.2ml接种于初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，培养3天；将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到纯化培养基上，直至得到极细枝孢霉菌株；再将纯化菌种转接入PDA液体扩大培养基中，以130r/min的转速振摇，于25℃下恒温培养4天；将该菌株接种到含有马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度为73.87％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO40.1mmol/L的发酵培养基中，容器中培养液的装液量为65％，菌株的接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为5∶95，于pH为5.3，转速为130r/min，温度为28℃下恒温培养4天；取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后4℃下经8200r/min离心30min后取上清液作为粗酶液。测得发酵液中多酚氧化酶的酶活力为305活性单位。取此粗酶液1000ml加纯度为73.87％的儿茶素20.0g，于温度为24℃、pH为5.0条件下通入氧气但不产生大量气泡，酶促氧化45分钟制得茶黄素粗提物，将茶黄素粗提物用膜过滤浓缩冷冻干燥后称重20.34g。用高效液相色谱测得茶黄素粗提物中茶黄素总量20.00％，其中，TF、TF3G、TF3’G及TFDG单体含量分别为0.96％、2.57％、1.84％及14.63％。

Claims (1)

1、一种极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)、多酚氧化酶粗酶液的制备：
a、先筛选出极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)CGMCCNO.2891；
b、菌种的扩大培养：
将a步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25℃下，以转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；
c、发酵培养基的配制：
配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的液体发酵培养基，培养液体积为容器总体积的50-65％，pH为4.5-5.6，于121℃条件下灭菌20min；
d、菌种的接种与发酵：
取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基：发酵培养基(体积比)为4-7∶93-96，于22-25℃、转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；
e、制备粗酶液：
取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5℃下，以离心转速为7800-8200r/min离心25-35min后，取上清液作为粗酶液；
(2)、酶促氧化儿茶素制备茶黄素：
取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于70％的儿茶素2.0g，于温度为22-25℃、pH为4.5-5.6的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。
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Granted publication date: 20110309

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