CN110669802A - 一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，包括下列各步骤：1）在发酵液中加入多酚氧化酶液、茶液；2）按0.5～2个单位/分钟的量，通入氧气，于20～40℃温度、60～150r/min转速下，发酵40～150min；3）在惰性气体、发酵液温度为20～35℃的环境中过滤；4）透过液经纯化、浓缩、干燥，得茶黄素；多酚氧化酶液返回步骤1）的发酵液中参与发酵，以回收、循环利用多酚氧化酶液。得高纯度茶黄素，回收、循环利用多酚氧化酶液，保持多酚氧化酶的活性，避免多酚氧化酶的浪费，大幅度降低茶黄素的生产成本，便于连续化生产，安全可靠。

Description

一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法

技术领域

本发明涉及一种制备茶黄素的方法，尤其是一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，属于生物技术领域。

技术背景

茶黄素(theaflavins，TFs)最早是由Roberts E.A.H(1957)发现的，是多酚类物质氧化形成的一种能溶于乙酸乙酯呈橙黄色、并具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称。现已明确结构的茶黄素组分有25种，其中的主要成分有：茶黄素 (theaflavin，TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯(theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黄素-3’-单没食子酸酯(theaflavin-3’- gallate，TF-3’-G)和茶黄素-3,3’-双没食子酸酯(theaflavin- 3,3’-gallate，TF-3,3’-G)和表茶黄棓灵-3-没食子（epitheaflagallin-3-gallate，TF4）等。红茶中的茶黄素含量一般为0.3%～1.5%，它们是红茶中的主要成分，对红茶的色香味及品质起着决定性的作用，能让红茶汤色“亮”，具有较强的滋味和鲜爽度，被誉为茶叶中的“软黄金”，且安全性高。茶黄素不仅是红茶的重要品质成分，而且具有多种与人体健康有关的潜在功效，如抗氧化、防癌抗癌、降血脂、预防心血管疾病、抗糖尿病、抗菌、抗病毒等，此外，茶黄素还是化妆品、食品的天然着色剂。因而受到国内外广泛关注，并成为研究热点。

目前，制备茶黄素的方法大致有三种：萃取法、化学氧化法、酶促氧化法。萃取法：由于茶黄素在红茶中含量低微，因而从红茶中直接提取、纯化茶黄素的难度大，且得率低；化学氧化法：需要使用大量的铁氰化钾、三氧化铁、氧化镁以及酸碱等化学试剂，环境污染严重，需要投入更多的污水处理费用，并且由于化学法缺乏底物专一性，副产品复杂，产品纯度、安全性受到限制；酶促氧化法反应条件温和、可控性强，能避免上述两种方法的弊端，体外酶促氧化是一种比较合适的方法。然而，在用酶促氧化法制备茶黄素的工业生产中，由于没有回收并重复利用多酚氧化酶，单次发酵完成后，为防止茶黄素在后续纯化、浓缩、干燥过程中继续被氧化，只能终止反应进行酶灭活钝化，这样就造成多酚氧化酶的浪费，致使生产成本提高30～50%，并且酶灭活钝化常常采用热灭活，而茶黄素又存在热稳定性差的问题，因而又造成提取率本来就低的茶黄素的氧化降解。

在采用酶促氧化法生产茶黄素的现有技术中，中国专利如CN1155717C、CN02071232A，虽然在固定化后，酶的稳定性较好，但利用固定化多酚氧化酶来发酵茶黄素的技术，目前尚存在以下不足：

、在提取纯化多酚氧化酶以及固定化阶段，酶的活性损失严重，尤其在酶固定化阶段，固定化后的酶的活性降到固定前的50%左右；、提取多酚氧化酶所使用的溶剂大多为有毒的丙酮，不仅污染环境，且会使产品中含有毒溶剂而影响其应用，从而限制了茶黄素的工业化发展。

发明内容

为解决现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种能够循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，为人们提供携带及饮用方便的茶黄素粉剂、液体饮料、片剂、胶囊等产品。

本发明通过下列技术方案实现：一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

1）、在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的茶鲜叶或含外源酶的植物质量浓度为10-40%，再加入茶液至发酵液中的茶多酚质量浓度为0.5～3.0%，调整发酵液pH值至3.5～6.5；

2）、按0.5～2个单位/分钟的量，向步骤1）的发酵液中通入氧气，于20～40℃温度、60～150r/min转速下，发酵40～150min，得发酵液；

3）、将步骤2）的发酵液送入拦截分子量为5～20万Da的分离膜，并在惰性气体、发酵液温度为20～35℃的环境中，过滤得透过液和截流液，当过滤至截流液固含物达到8-12%时，用适量的pH值为3.5～6.5的缓冲液清洗截流液2～3次，得多酚氧化酶液；

4）、将步骤3）的透过液经常规纯化、浓缩、干燥，得茶黄素；

5）、将步骤3）的多酚氧化酶液返回步骤1）的发酵液中参与发酵，以回收、循环利用多酚氧化酶液。

所述步骤3）的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

所述步骤2）的透过液经下列方法进行纯化、浓缩、干燥：

21）将透过液以0.5～2.0BV/h的流速送入层析柱，以1～3BV/h的洗脱流速，依次用纯净水、体积分数为15～35%的乙醇洗脱3～5个柱体积（BV），再用体积分数为60～80%的乙醇、以1～2BV/h的洗脱流速洗脱2～4个柱体积（BV），收集体积分数为60～80%的乙醇洗脱液，得纯化液；

22）按30～50mg/Kg的量，在步骤 21）的纯化液中加入食品级抗氧化剂后,经截流分子量为100～500Da的分离膜浓缩，或者经常规减压浓缩后，得浓缩液；

23）将步骤 22）的浓缩液经常规的真空冷冻干燥或真空干燥或喷雾干燥，得高纯度茶黄素。

所述步骤21）的层析柱填料为MCI树脂，或者为大孔树脂D130、AB-8、D101、NKA-9、HPD300、HPD10中的一种或几种。

所述步骤22）的抗氧化剂为抗坏血酸。

所述步骤1）的多酚氧化酶液通过下列方法制备：

11）将茶鲜叶或含外源酶的植物粉碎成泥，加入其质量的3-5倍量的pH值为3.5～6.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按茶鲜叶或含外源酶的植物∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.02-0.2的质量比，在步骤11）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化5-20 min，过滤，得多酚氧化酶液。

所述磷酸盐缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L纯净水中加入10-40g磷酸氢二钠，再加入11-33g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

所述步骤11）和步骤3）的磷酸盐缓冲液为含有20～40%体积分数乙醇的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L体积分数为20-40%的乙醇水溶液中，加入10-40g的磷酸氢二钠，再加入11-33g的一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

所述步骤11）的含外源酶的植物为：苹果、梨、葡萄、香蕉、蓝莓、枇杷、菠萝、西瓜、橘子、橙子、桃、芒果、猕猴桃、柿子中的一种或几种水果，且几种的配比是任意的；或者是茄子、西红柿、莲藕、马铃薯、红薯、菠菜、南瓜、山药、胡萝卜、芋头中的一种或几种蔬菜，且几种的配比是任意的；或者是四季豆、大豆中的一种豆类；或者是小米、玉米、小麦、大麦、荞麦中的一种或几种谷物；或者是木犀科连翘属落叶灌木金钟叶片。

所述茶液为绿茶提取液或者市购的茶多酚溶液，其中绿茶提取液经过下列方法制备：

茶叶粉碎至过20～50目筛，按1∶10～20的料液质量比加入纯净水，于70～95℃温度下，提取30～90min，提取液降温至25～45℃，用分子量为30万Da的澄清膜进行澄清后，再经反渗透浓缩,得绿茶提取液。

为方便携带及饮用，可将茶黄素产品制成粉剂、液剂、片剂、胶囊、丸剂、混悬剂等制剂；其中液剂中的茶黄素含量为0.3～1.2g/L，选0.40～0.8g/L，茶黄素浓度太高，涩味太重，绝大多数人难以接受；太低，达不到保健效果；液剂的溶液为纯净水，或者为适量浓度的果汁、牛乳或羊乳汁、或含有二氧化碳气体的碳酸饮料。

可在本发明制得的茶黄素中添加适量的常规食品学辅料或/和药剂学辅料，按常规方法制成含茶黄素的食品、保健品或方便携带及饮用的粉剂、溶液剂、片剂、胶囊、丸剂；所述辅料为麦芽糊精、蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、微晶纤维素、微粉硅胶、羧甲基纤维素等作为载体或赋形剂。

为使制剂中的茶黄素更稳定，可添加适量食品级抗氧化剂。

可在茶黄素中添加适量的食品级亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、维生素C等。

本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，不仅可制得高纯度茶黄素，而且可最大限度地对多酚氧化酶液进行回收、循环利用，并保持多酚氧化酶的活性及安全性，避免多酚氧化酶的浪费，大幅度降低茶黄素的生产成本，便于连续化生产，通过回收发酵液中的多酚氧化酶,省去了热灭活钝化工序，不再使用有毒溶剂，安全可靠，简化工艺，同时降低了因热灭活钝化工序引起的茶黄素热降解，多酚氧化酶可连续回收利用至少10次，酶活性依然保持原有水平的85%以上，为茶黄素的工业化生产进程提供可靠的技术支持。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并不仅仅局限于以下实例。凡基于上述发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

一种循环使用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

一、多酚氧化酶液的制备：

11）将茶鲜叶粉碎成泥，加入其质量的3倍量的pH值为3.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按茶鲜叶∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.02的质量比，在步骤11）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化5 min，过滤，得多酚氧化酶液；

二、茶液的制备：

茶叶粉碎至过20目筛，按1∶10的料液质量比加入纯净水，于70℃温度下，提取90min，提取液降温至25℃，用分子量为30万Da的澄清膜对提取液进行澄清后，再进行常规的反渗透浓缩,得茶液；

三、茶黄素的制备：

31）在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的茶鲜叶质量浓度为10%，再加入茶液至发酵液中的茶多酚质量浓度为0.5%，用磷酸盐缓冲液调整发酵液pH值至3.5；

32）按0.5个单位/分钟的量，向步骤1的发酵液中通入氧气，于20℃温度、60r/min转速下，发酵150min，得发酵液；

33）将发酵液送入拦截分子量为5万Da的分离膜，并在氮气、发酵液温度为20℃的环境中，分离出透过液和截流液，通过氮气保护酶不会失活，当过滤至截流液固含物达到8%时，用适量的pH值为3.5的缓冲液清洗截流液2次，减少茶黄素在截流液中的残留，提高茶黄素得率，得多酚氧化酶液；

34）将步骤33）的透过液经常规纯化、浓缩、干燥，得茶黄素；

35）将步骤33）的多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中参与发酵，完成多酚氧化酶液的第一次回用；

继续进行上述31）—— 35）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中完成第二次回用；

继续进行上述31）—— 35）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中完成第三次回用；

如此循环，依次得到第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次回收多酚氧化酶液及相应茶黄素产品（见表1）。

本实施例1所述磷酸盐缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L纯净水中加入10g磷酸氢二钠，再加入11g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

实施例1实验数据

连续回收十次多酚氧化酶，酶活依然保持原有水平的86.73%。在回收使用八次以后，酶失活钝化加快，建议十次以上适当补充新的多酚氧化酶液。

将所得茶黄素按0.2g/袋的量直接装袋即可。或者将所得茶黄素按常规制成片剂、胶囊或丸剂。

实施例2

一种循环使用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

一、多酚氧化酶液的制备：

11）将质量比为1∶1的苹果和香蕉粉碎成泥，加入其质量的5倍量的pH值为6.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按苹果和香蕉泥∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.2的质量比，在步骤1）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化20 min，过滤，得多酚氧化酶液；

二、茶液的制备：

茶叶粉碎至过50目筛，按1∶20的料液质量比加入纯净水，于95℃温度下，提取30min，提取液降温至45℃，用分子量为30万Da的澄清膜对提取液进行澄清后，再进行常规的反渗透浓缩,得茶液；

三、茶黄素的制备：

31）在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的苹果和香蕉泥质量浓度为40%，再加入茶液至发酵液中的茶多酚质量浓度为3.0%，用磷酸盐缓冲液调整发酵液pH值至6.5；

32）按2个单位/分钟的量，向步骤1的发酵液中通入氧气，于40℃温度、150r/min转速下，发酵40min，得发酵液；

33）将发酵液送入拦截分子量为20万Da的分离膜，并在氮气、发酵液温度为35℃的环境中，分离出透过液和截流液，当过滤至截流液固含物达到12%时，用适量的pH值为6.5的缓冲液清洗截流液3次，得多酚氧化酶液；

34）将步骤33）的透过液以0.5～2.0BV/h的流速送入层析柱，以1～3BV/h的洗脱流速，依次用纯净水、体积分数为15～35%的乙醇洗脱3～5个柱体积（BV），再用体积分数为60～80%的乙醇、以1～2BV/h的洗脱流速洗脱2～4个柱体积（BV），收集体积分数为60～80%的乙醇洗脱液，得纯化液；

35）按30～50mg/Kg的量，在步骤 34）的纯化液中加入食品级抗氧化剂后,经截流分子量为100～500Da的分离膜浓缩，或者经常规减压浓缩后，得浓缩液；

36）将步骤 35）的浓缩液经常规的真空冷冻干燥或真空干燥或喷雾干燥，得高纯度茶黄素；

37）将步骤33）的多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中参与发酵，完成多酚氧化酶液的第一次回用；

继续进行上述31）—— 37）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中完成第二次回用；

继续进行上述31）—— 37）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤31）的发酵液中完成第三次回用；

如此循环，依次得到第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次回收多酚氧化酶液及相应茶黄素产品（见表2）。

本实施例2所述磷酸盐缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L纯净水中加入40g磷酸氢二钠，再加入33g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

实施例2实验数据

连续回收十次多酚氧化酶，酶活依然保持原有水平的85.65%。在回收使用八次以后，酶失活钝化加快，建议十次以上适当补充新的多酚氧化酶液。

取茶黄素加入到纯净水中，至其含量为0.8g/L，再加入常规量的蔗糖，并按常规灭菌后罐装，100g/瓶，得茶黄素饮料。

也可在常规果汁饮料或牛奶中，按0.6g/L的量加入茶黄素，并按常规罐装后得茶黄素果汁饮料或茶黄素牛奶。

实施例3

一种循环使用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

一、多酚氧化酶液的制备：

11）将质量比为1∶2∶1的茄子和莲藕及胡萝卜粉碎成泥，加入其质量的4倍量的pH值为5.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按茄子、莲藕和胡萝卜泥∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.1的质量比，在步骤1）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化10 min，过滤，得多酚氧化酶液；

三、茶黄素的制备：

21）在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的茄子、莲藕和胡萝卜泥质量浓度为30%，再加入市购的茶多酚至发酵液中的茶多酚质量浓度为1.0%，调整发酵液pH值至5.5；

22）按1个单位/分钟的量，向步骤1的发酵液中通入氧气，于30℃温度、100r/min转速下，发酵100min，得发酵液；

23）将发酵液送入拦截分子量为10万Da的分离膜，并在氮气、发酵液温度为25℃的环境中，分离出透过液和截流液，当过滤至截流液固含物达到10%时，用适量的pH值为5.5的缓冲液清洗截流液2次，得多酚氧化酶液；

24）将步骤33）的透过液以1.0BV/h的流速送入层析柱，层析柱填料为大孔树脂树脂D101，以2BV/h的洗脱流速，依次用纯净水、体积分数为25%的乙醇洗脱4个柱体积（BV），再用体积分数为70%的乙醇、以2BV/h的洗脱流速洗脱3个柱体积（BV），收集体积分数为70%的乙醇洗脱液，得纯化液；

25）按40mg/Kg的量，在步骤34）的纯化液中加入食品级抗坏血酸后,经截流分子量为300Da的分离膜浓缩，或者经常规减压浓缩后，得浓缩液；

26）将步骤25）的浓缩液经常规的真空冷冻干燥或真空干燥或喷雾干燥，得高纯度茶黄素；

27）将步骤23）的多酚氧化酶液返回步骤21）的发酵液中参与发酵，完成多酚氧化酶液的第一次回用；

继续进行上述21）—— 27）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤21）的发酵液中完成第二次回用；

继续进行上述21）—— 27）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤21）的发酵液中完成第三次回用；

如此循环，依次得到第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次回收多酚氧化酶液及相应茶黄素产品（见表3）。

本实施例3所述磷酸盐缓冲液为含有30%体积分数乙醇的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L体积分数为30%的乙醇水溶液中，加入30g磷酸氢二钠，再加入23g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

实施例3实验数据

连续回收十次多酚氧化酶，酶活依然保持原有水平的86.28%。在回收使用八次以后，酶失活钝化加快，建议十次以上适当补充新的多酚氧化酶液。

取茶黄素124克、麦芽糊精75g，亚硫酸氢钠1g，混合均匀，充氮包装，0.2g/袋。也可按常规制成片剂、胶囊、丸剂。

实施例4

一种循环使用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

一、多酚氧化酶液的制备：

11）将质量比为1∶1∶1的大豆、马铃薯和荞麦粉碎成泥，加入其质量的4倍量的pH值为4.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按大豆、马铃薯和荞麦粉泥∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.08的质量比，在步骤1）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化15 min，过滤，得多酚氧化酶液；

二、茶液的制备：

茶叶粉碎至过40目筛，按1∶15的料液质量比加入纯净水，于85℃温度下，提取70min，提取液降温至35℃，用分子量为30万Da的澄清膜对提取液进行澄清后，再进行常规的反渗透浓缩,得茶液；

三、茶黄素的制备：

31）在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的茶鲜叶或含外源酶的植物质量浓度为30%，再加入茶液至发酵液中的茶多酚质量浓度为2.0%，调整发酵液pH值至4.5；

32）按1.5个单位/分钟的量，向步骤1的发酵液中通入氧气，于25℃温度、90r/min转速下，发酵80min，得发酵液；

33）将发酵液送入拦截分子量为15万Da的分离膜，并在氮气、发酵液温度为30℃的环境中，分离出透过液和截流液，当过滤至截流液固含物达到11%时，用适量的pH值为4.5的缓冲液清洗截流液3次，得多酚氧化酶液；

34）将步骤33）的透过液以1.0BV/h的流速送入层析柱，层析柱填料为MCI树脂，以2BV/h的洗脱流速，依次用纯净水、体积分数为25%的乙醇洗脱5个柱体积（BV），再用体积分数为70%的乙醇、以1BV/h的洗脱流速洗脱3个柱体积（BV），收集体积分数为75%的乙醇洗脱液，得纯化液；

35）按45mg/Kg的量，在步骤34）的纯化液中加入食品级抗坏血酸后,经截流分子量为400Da的分离膜浓缩，或者经常规减压浓缩后，得浓缩液；

36）将步骤35）的浓缩液经常规的真空冷冻干燥或真空干燥或喷雾干燥，得高纯度茶黄素；

37）将步骤33）的多酚氧化酶液返回步骤1的发酵液中参与发酵，完成多酚氧化酶液的第一次回用；

继续进行上述31）—— 37）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤1的发酵液中完成第二次回用；

继续进行上述31）—— 37）的各步骤，将多酚氧化酶液返回步骤1的发酵液中完成第三次回用；

如此循环，依次得到第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次回收多酚氧化酶液及相应茶黄素产品（见表4）。

本实施例4所述磷酸盐缓冲液为含有30%体积分数乙醇的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L体积分数为30%的乙醇水溶液中，加入30g磷酸氢二钠，再加入22g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

实施例4实验数据

连续回收十次多酚氧化酶，酶活依然保持原有水平的85.02%。在回收使用八次以后，酶失活钝化加快，十次以上需适当补充新的多酚氧化酶液。

在常规果汁饮料或牛奶中，按0.6g/L的量加入茶黄素，并按常规罐装后得茶黄素果汁饮料或茶黄素牛奶。

Claims (9)

1.一种循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于包括下列各步骤：

1）、在发酵液中加入多酚氧化酶液至其中的茶鲜叶或含外源酶的植物质量浓度为10-40%，再加入茶液至发酵液中的茶多酚质量浓度为0.5～3.0%，调整发酵液pH值至3.5～6.5；

2）、按0.5～2个单位/分钟的量，向步骤1）的发酵液中通入氧气，于20～40℃温度、60～150r/min转速下，发酵40～150min，得发酵液；

3）、将步骤3）的发酵液送入拦截分子量为5～20万Da的分离膜，并在惰性气体、发酵液温度为20～35℃的环境中，过滤得透过液和截流液，当过滤至截流液固含物达到8-12%时，用适量的pH值为3.5～6.5的缓冲液清洗截流液2～3次，得多酚氧化酶液；

4）、将步骤3）的透过液经常规纯化、浓缩、干燥，得茶黄素；

5）、将步骤3）的多酚氧化酶液返回步骤1）的发酵液中参与发酵，以回收、循环利用多酚氧化酶液。

2.如权利要求1所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤3）的缓冲液为磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤2）的透过液经下列方法进行纯化、浓缩、干燥：

31）将透过液以0.5～2.0BV/h的流速送入层析柱，以1～3BV/h的洗脱流速，依次用纯净水、体积分数为15～35%的乙醇洗脱3～5个柱体积（BV），再用体积分数为60～80%的乙醇、以1～2BV/h的洗脱流速洗脱2～4个柱体积（BV），收集体积分数为60～80%的乙醇洗脱液，得纯化液；

32）按30～50mg/Kg的量，在步骤 31）的纯化液中加入食品级抗氧化剂后,经截流分子量为100～500Da的分离膜浓缩，或者经常规减压浓缩后，得浓缩液；

33）将步骤 32）的浓缩液经常规的真空冷冻干燥或真空干燥或喷雾干燥，得高纯度茶黄素。

4.如权利要求3所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤31）的层析柱填料为MCI树脂，或者为大孔树脂D130、AB-8、D101、NKA-9、HPD300、HPD10中的一种或几种；所述步骤22）的抗氧化剂为抗坏血酸。

5.如权利要求1所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤1）的多酚氧化酶液通过下列方法制备：

11）将茶鲜叶或含外源酶的植物粉碎成泥，加入其质量的3-5倍量的pH值为3.5～6.5的磷酸盐缓冲液，混合均匀，得混合物；

12）按茶鲜叶或含外源酶的植物∶交联聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）= 1000 ∶ 0.02-0.2的质量比，在步骤11）的混合物中加入交联聚乙烯吡咯烷酮，混合乳化5-20 min，过滤，得多酚氧化酶液。

6.如权利要求5所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述磷酸盐缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L纯净水中加入10-40g磷酸氢二钠，再加入11-33g一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

7.如权利要求5所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤11）的磷酸盐缓冲液为含有20～40%体积分数乙醇的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，通过下列方法配制：在100L体积分数为20-40%的乙醇水溶液中，加入10-40g的磷酸氢二钠，再加入11-33g的一水合柠檬酸，搅拌至固体物完全溶解。

8.如权利要求5所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述步骤11）的含外源酶的植物为：苹果、梨、葡萄、香蕉、蓝莓、枇杷、菠萝、西瓜、橘子、橙子、桃、西瓜、芒果、猕猴桃、柿子中的一种或几种水果，且几种的配比是任意的；或者是茄子、西红柿、莲藕、马铃薯、红薯、菠菜、南瓜、山药、胡萝卜、芋头中的一种或几种蔬菜，且几种的配比是任意的；或者是四季豆、大豆中的一种豆类；或者是小米、玉米、小麦、大麦、荞麦中的一种或几种谷物；或者是木犀科连翘属落叶灌木金钟叶片。

9.如权利要求1所述的循环利用多酚氧化酶制备茶黄素的方法，其特征在于所述茶液为绿茶提取液或者市购的茶多酚溶液，其中绿茶提取液经过下列方法制备：

茶叶粉碎至过20～50目筛，按1∶10～20的料液质量比加入纯净水，于70～95℃温度下，提取30～90min，提取液降温至25～45℃，用分子量为30万Da的澄清膜进行澄清后，再经反渗透浓缩,得绿茶提取液。

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