CN105734090A - 一种茶黄素的制备方法 - Google Patents

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贾士儒
吴霄玥
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余坚勇
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Abstract

本发明公开了一种茶黄素的制备方法。该方法包括如下步骤：(1)将木犀科连翘属落叶灌木金钟叶片打碎后加入缓冲溶液进行浸提，得浸提液；(2)过滤步骤(1)得到的浸提液，取滤液离心后收集上清液，得多酚氧化酶液；(3)将步骤(2)得到的多酚氧化酶液和茶多酚的缓冲溶液混合，在通入空气或氧气的条件下，经反应后即得所述茶黄素。本发明方法采用匀浆浸提法从金钟叶子提取得到多酚氧化酶液，并将该多酚氧化酶液作为酶促氧化制备茶黄素的催化剂，金钟叶来源广泛，有效解决了茶黄素合成工艺中高效廉价催化剂的来源问题。

Description

一种茶黄素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种茶黄素的制备方法，属于农产品加工领域。
背景技术
茶黄素是指红茶中溶于乙酸乙酯成橙黄色的物质，由茶多酚类及其衍生物氧化缩合成的一类具有苯骈卓酚酮结构的多组分混合物，其主要结构为以下四种：茶黄素(TF)、茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)、茶黄素-3′-没食子酸酯(TF-3′-G)和茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(TFDG)，其结构式如式Ⅰ所示：
式Ⅰ中，茶黄素(TF)R1＝R2＝OH
茶黄素-3-没食子酸酯(TF-3-G)R1＝OH,R2＝gallate(没食子酰基)
茶黄素-3′-没食子酸酯(TF-3′-G)R1＝gallate,R2＝OH
茶黄素-3,3′-双没食子酸酯(TFDG)R1＝R2＝gallate
茶黄素是红茶的重要品质成分之一，具有抗氧化、降血脂、抗心脑血管疾病、防癌抗癌、抗菌、抗病毒和抗辐射护肝等生理药理活性，在功能食品和医药保健品等领域应用广泛。
茶黄素最早是从红茶中直接提取的，但其中茶黄素含量较低，导致提取收率不高。目前制备茶黄素的方法主要是茶多酚酶促氧化法，采用茶叶自身的多酚氧化酶为催化剂。但由于茶叶中酶含量较低，催化剂多酚氧化酶的成本一直是制约茶黄素工业化生产的关键因素。
发明专利“制备茶黄素的新工艺”(申请号：200810023581，公开号：CN101285081)利用茶叶自身的酶，使用纯乙酸乙酯相发酵，将茶叶中的茶多酚通过生物转化而制备茶黄素。
发明专利“一种茶黄素的制备方法”(申请号：200810052355，公开号：CN101235025)采用茶叶中自身的多酚氧化酶，添加山楂、柿子叶子汁为生物催化剂，在一定程度上降低了生产成本。
发明专利“一种从新鲜绿茶制备茶黄素、茶红素的方法”(申请号：200710130799.6，授权号：101096693)采用新鲜绿茶叶，经凉青后，加入果汁或蔬菜汁为催化剂，梨汁、蓝莓汁、苹果汁、葡萄汁、李子汁或茄子汁发酵，再经分离纯化得到茶黄素和不同分子量的茶红素。
发明专利“固定化多酚氧化酶催化高纯度茶多酚生产高纯度茶黄素的方法”(申请号：02136982，授权号CN1155717)将多酚氧化酶用包埋材料进行固定化，并以其为催化剂使高纯度的茶多酚氧化聚合生成高纯度的茶黄素。
目前，制备茶黄素主要采用的催化剂为新鲜茶叶自身的多酚氧化酶或者添加果汁、蔬菜汁，多酚氧化酶活性较低，导致茶黄素收率不高。因此，寻求廉价高效的多酚氧化酶来源，降低催化剂使用成本，是本发明要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种茶黄素的制备方法，该方法利用金钟叶子为来源提取多酚氧化酶作为制备茶黄素的催化剂，解决了当前茶黄素生产过程中催化剂成本过高的问题。
本发明提供的一种茶黄素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将木犀科连翘属落叶灌木金钟(拉丁学名为Forsythiaviridissima)叶片打碎后加入缓冲溶液进行浸提，得浸提液；
(2)过滤步骤(1)得到的浸提液，取滤液离心后收集上清液，得多酚氧化酶液；
(3)将步骤(2)得到的多酚氧化酶液和茶多酚的缓冲溶液混合，在通入空气或氧气的条件下，经反应后即得所述茶黄素。
上述的制备方法，步骤(1)中，每1g所述金钟叶片中可加入0.1～10mL所述缓冲溶液，具体可为每1g所述金钟叶片中加入1～4mL、1mL或4mL所述缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值可为4～6，具体可为5～5.5、5或5.5；所述缓冲溶液可为磷酸盐缓冲溶液。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述浸提的温度可为20～30℃，具体可为25℃；所述浸提的时间可为10～30min，具体可为15～30min、15min或30min。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述离心的转速可为5000～10000rpm，具体可为8000rpm；所述离心的时间可为10～30min，具体可为10min。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述多酚氧化酶液的酶活可为3500～6000IU/mL，具体可为3782～5831IU/mL、3782～4300IU/mL、4300～5831IU/mL、3782IU/mL、4300IU/mL或5831IU/mL。
上述的制备方法，步骤(3)中，所述多酚氧化酶液和所述茶多酚的缓冲溶液的体积比为(1～5)：1，具体可为1：1；所述茶多酚的缓冲溶液中，茶多酚的质量体积浓度可为1～10mg/mL，具体可为5～10mg/mL、5mg/mL或10mg/mL，溶剂可为pH值为4～6的磷酸盐缓冲液，具体可为pH值为5.5～6、5.5或6的磷酸盐缓冲溶液；所述茶多酚的纯度大于50％，具体可为50％～98％、50％～80％、80％～98％、50％、80％或98％。
上述的制备方法，步骤(3)中，所述空气的通入速率可为100～400mL/min，具体可为100～240mL/min、100mL/min或240mL/min；所述反应的温度可为30～60℃，具体可为30～40℃、30℃或40℃；时间可为30～60min，具体可为50min～60min、50min或60min；所述反应过程中混合液的pH控制在4～6。
上述的制备方法，所述方法在步骤(3)中所述反应之后还包括如下步骤：采用乙酸乙酯萃取所述反应之后的反应液，分层后，减压回收乙酸乙酯相(如旋蒸)，将得到的浓缩液干燥后得茶黄素粉末。
本发明具有如下有益效果：
本发明方法采用匀浆浸提法从金钟叶子提取得到多酚氧化酶液，并将该多酚氧化酶液作为酶促氧化制备茶黄素的催化剂，金钟叶来源广泛，有效解决了茶黄素合成工艺中高效廉价催化剂的来源问题。
附图说明
图1为本发明茶黄素生物合成技术路线图。
图2为实施例1中制备得到的茶黄素中茶多酚与茶黄素色谱分离谱图(茶多酚保留时间：6.16min，15.03min，18.30min，21.16min，21.51min，28.99min，茶黄素保留时间：42.49min，44.56min，45.92min)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
金钟种植于郑州大学新校区校园，叶片取自9月份的金钟叶片。
pH5.5的磷酸盐缓冲液的配方为：分别配置0.25mol/L磷酸二氢钠、0.25mol/L磷酸氢二钠溶液，用pH计调节配制pH5.5的0.25mol/L磷酸盐缓冲液。
pH6.0的磷酸盐缓冲液的配方为：分别配置0.25mol/L磷酸二氢钠、0.25mol/L磷酸氢二钠溶液，用pH计调节配制pH6的0.25mol/L磷酸盐缓冲液。
多酚氧化酶液酶活的测定方法采用比色法，步骤如下：在0.1mL酶液，2.9mLpH为5.5的磷酸缓冲液和1mL0.01mol/L邻苯二酚的反应体系中测定其在410nm处的吸光度值，以1mL酶液在一分钟内使体系的吸光度值增加0.001为1IU/mL。
采用高效液相色谱法对下述实施例中制备得到的茶黄素进行定性和定量分析，色谱条件如下：ODSC18色谱柱，流速：1mL/min，柱温：35℃，波长：280nm，进样量：20μL；流动相：A相(超纯水：乙腈(过滤)：冰乙酸(过滤)＝96.5：3：0.5)；B相(超纯水：乙腈(过滤)：冰乙酸(过滤)＝69.5：30：0.5)；梯度洗脱：0min-45min-48min，B相百分比为0-100％-100％。
实施例1、制备茶黄素
如图1所示，按照如下步骤制备茶黄素：
(1)称取新鲜金钟叶100g，去除杂质，洗干净，晾干后，用组织捣碎机打碎，加入400mLpH5.5的磷酸盐缓冲液，室温(25℃)浸提15min，得浸提液。
(2)将步骤(1)得到的浸提液过滤，固液分离，取滤液，8000rpm下离心10min，得多酚氧化酶液。本实施例制得的多酚氧化酶液的酶活为4300IU/mL。
(3)将含量为50wt％的茶多酚，用pH5.5的磷酸盐缓冲液，配置成浓度为5mg/mL的反应液400mL。将上述多酚氧化酶液和茶多酚反应液混匀(400mL：400mL)，控制温度40℃，控制通入空气速率240mL/min，反应60min。
(4)反应结束后，加入400mL乙酸乙酯萃取，分层后，乙酸乙酯相减压回收，浓缩液50℃真空干燥，得粉末状茶黄素产品，其中茶黄素含量为15％。高效液相色谱图如图2所示，其中，茶多酚保留时间：6.16min，15.03min，18.30min，21.16min，21.51min，28.99min，茶黄素保留时间：42.49min，44.56min，45.92min。
实施例2、制备茶黄素
如图1所示，按照如下步骤制备茶黄素：
(1)称取新鲜金钟叶100g，去除杂质，洗干净，晾干后，用组织捣碎机打碎，加入100mLpH5的磷酸盐缓冲液，室温(25℃)浸提30min，得浸提液。
(2)将步骤(1)得到的浸提液过滤，固液分离，取滤液，8000rpm下离心10min，得多酚氧化酶液。本实施例制得的多酚氧化酶液的酶活为3782IU/mL。
(3)将含量为98wt％的茶多酚，用pH6的磷酸盐缓冲液，配置成浓度为10mg/mL的反应液100mL。将上述多酚氧化酶液和茶多酚反应液混匀(100mL：100mL)，控制温度30℃，控制通入空气速率100mL/min，反应50min。
(4)反应结束后，加入200mL乙酸乙酯萃取，分层后萃余液再加入200mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，乙酸乙酯减压回收，浓缩液50℃真空干燥，得粉末状茶黄素产品，其中茶黄素含量为52％。
实施例3、制备茶黄素
如图1所示，按照如下步骤制备茶黄素：
(1)称取新鲜金钟叶100g，去除杂质，洗干净，晾干后，用组织捣碎机打碎，加入100mLpH5的磷酸盐缓冲液，室温(25℃)浸提30min，得浸提液。
(2)将步骤(1)得到的浸提液过滤，固液分离，取滤液，8000rpm下离心10min，得多酚氧化酶液。本实施例制得的多酚氧化酶液的酶活为5831IU/mL。
(3)将含量为80wt％的茶多酚，用pH6的磷酸盐缓冲液，配置成浓度为10mg/mL的反应液100mL。将上述多酚氧化酶液和茶多酚反应液混匀(100mL：100mL)，控制温度30℃，控制通入空气速率100mL/min，反应50min。
(4)反应结束后，加入200mL乙酸乙酯萃取，分层后萃余液再加入200mL乙酸乙酯萃取，合并有机相，乙酸乙酯减压回收，浓缩液50℃真空干燥，得粉末状茶黄素产品，其中茶黄素含量为38％。

Claims (8)

1.一种茶黄素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将木犀科连翘属落叶灌木金钟叶片打碎后加入缓冲溶液进行浸提，得浸提液；
(2)过滤步骤(1)得到的浸提液，取滤液离心后收集上清液，得多酚氧化酶液；
(3)将步骤(2)得到的多酚氧化酶液和茶多酚的缓冲溶液混合，在通入空气或氧气的条件下，经反应后即得所述茶黄素。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，每1g所述植物叶片中加入0.1～10mL所述缓冲溶液；所述缓冲溶液的pH值为4～6，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述浸提的温度为20～30℃，时间为10～30min。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心的转速为5000～10000rpm，时间为10～30min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述多酚氧化酶液的酶活为3500～6000IU/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述多酚氧化酶液和所述茶多酚的缓冲溶液的体积比为(1～5)：1；所述茶多酚的缓冲溶液中，茶多酚的质量体积浓度为1～10mg/mL，溶剂为pH4～6的磷酸盐缓冲液；所述茶多酚的纯度大于50％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述空气的通入速率为100～400mL/min；所述反应的温度为30～60℃，时间为30～60min。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述方法在步骤(3)中所述反应之后还包括如下步骤：采用乙酸乙酯萃取所述反应之后的反应液，分层后，减压回收乙酸乙酯相，将得到的浓缩液干燥后得茶黄素粉末。
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