CN101418341A - 一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方法以紫杉醇合成的关键酶基因作为分子标记，基于PCR扩增技术快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，它根据已经报道的红豆杉的10－去乙酰巴卡亭III－10－O－乙酰基转移酶和C－13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶基因的保守区设计引物，对从红豆杉树皮中分离得到的真菌依次进行扩增筛选，然后对可以扩增出这两个基因的真菌进行发酵培养并提取紫杉醇，用HPLC和MS对真菌紫杉醇进行分析，并最终确定产紫杉醇的内生真菌。本发明为实现由微生物发酵法取代从红豆杉植物组织中提取紫杉醇的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法及一批有效的出发菌株。

Description

一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法

技术领域

本发明属于微生物生物技术、生物制药领域，具体涉及一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法。

背景技术

紫杉醇是目前国际上公认的重要抗肿瘤药物。由于红豆杉资源的不足导致紫杉醇价格的昂贵，影响其在临床上的广泛应用。利用微生物发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的有效途径之一。

自1993年Stierle等首次报道了从太平洋红豆杉树中分离到一株可产紫杉醇的内生真菌以来，国内外只有几十种产紫杉醇内生真菌的报道，原因之一就是产紫杉醇内生真菌的筛选不易。直至目前，对于产紫杉醇内生真菌的筛选方法依然和1993年Stierle等所用方法相似，即通过对分离的内生真菌用大瓶发酵培养后，从发酵液或菌丝体中提取紫杉醇，用薄层层析、高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等手段对抽提物进行分析，通过确定抽提物是否含有紫杉醇进而确定内生真菌是否产紫杉醇。然而，薄层层析法虽简单廉价，但检测的准确度不够；高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等方法虽检测灵敏、准确度高，但其使用成本也很高。如果对几十株、上百株真菌都进行大量培养、紫杉醇提取、纯化，并利用高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等这些灵敏、准确的检测方法进行检测、筛选，将是一个十分耗时耗材的工作。

所以，建立一种快速有效的高通量筛选产紫杉醇内生真菌的方法是提高其开发利用的必需因素之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方法具有速度快、筛选率高等优点，有助于更好地开发利用产紫杉醇内生真菌资源。

本发明提供的快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤：

(1)采用常规的内生真菌的分离法从红豆杉及红豆杉近缘科属植物的树皮组织分离、纯化内生真菌；

(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行dbat基因的扩增：

分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(10-deacetyl baccatin III-10-O-acetyl transferase，DBAT)的扩增检测；其引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μM dbat-F和50～100μM dbat-R，100～200μM dNTPs，5μL 10×PCRreaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌；

(3)对含有dbat基因的内生真菌进行bapt基因的扩增，得到产紫杉醇内生真菌：

对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶(C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase，BAPT)基因的扩增检测。引物为bapt-F(5’-CCTCTGTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTGCGATACTT-3’)；

反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μM bapt-F和50～100μM bapt-R，100～200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，53℃～55℃、50sec～1min，68℃～72℃、1min～1.2min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并收集扩增有bapt基因条带的真菌，即产紫杉醇内生真菌。

本发明是关于以紫杉醇合成的关键酶基因做分子标记(molecularmarkers)，基于PCR扩增技术快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法。它根据已经报道的红豆杉的10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(dbat)和C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(bapt)的保守区设计引物，对从红豆杉以及红豆杉近缘科属植物的树皮中分离得到的真菌依次进行扩增筛选，然后对可以扩增出这两个基因的真菌进行发酵培养并提取紫杉醇，用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)和质谱(massspectroscopy，MS)对真菌紫杉醇进行分析，并最终确定产紫杉醇的内生真菌。

本发明的有益效果包括：(1)利用PCR技术，以紫杉醇合成的关键酶基因dbat和bapt为分子标记，建立了一种快速有效的高通量筛选产紫杉醇内生真菌的方法；(2)和传统筛选方法相比，几十个甚至上百个内生真菌的筛选只需3～5天的时间，经过筛选后，只有少数几个内生真菌需要进一步用昂贵的HPLC-MS等方法进行确定，极大地简化了筛选过程，提高了筛选效率，突破了传统筛选方法耗时费力却不易取得结果的不足。(3)相对于紫杉醇合成的其它关键酶基因，应用dbat和bapt做分子标记筛选产紫杉醇真菌更具有判断性(diagnostic)，因为dbat基因的编码产物，即10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶是专一性催化紫杉醇合成的直接萜类前体巴卡亭III的合成，有dbat基因存在，可以从基因水平上判断有巴卡亭III的合成；而bapt基因的编码产物，即C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶是专一性催化巴卡亭III和官能侧链基团连接形成紫杉醇的第一步反应，有dbat和bapt基因的存在可以从基因水平上判断有紫杉醇的合成。(4)通过该方法从红豆杉树皮和穗花杉树皮中筛选获得了5株可以产紫杉醇的内生真菌。

附图说明

图1为产紫杉醇内生真菌的快速高通量筛选过程示意图。

具体实施方式

本发明的理论依据：目前虽尚无关于产紫杉醇内生真菌的紫杉醇合成酶基因以及紫杉醇合成途径的报道，但“内共生理论”和相关文献报道推测，内生真菌可能是通过和宿主红豆杉之间的基因转移(genetic transfer)或者共进化(co-evolution)关系而获得合成紫杉醇能力的，内生真菌的紫杉醇合成酶基因和红豆杉的紫杉醇合成酶基因可能有着高的相似性(Young et al.，1992，Experientia，48：882-885；Li et al.，1996，Microbiology，142：2223-2226；Lietal.，2006，Biotechnology Bulletin，S1，356-371)。所以，从理论上可根据已报道的红豆杉dbat和bapt基因的保守区设计引物，基于PCR扩增技术筛选产紫杉醇的内生真菌。对利用该方法筛选获得的内生真菌的发酵物进行紫杉醇分析，结果表明这些真菌是可以产紫杉醇的。对这些内生真菌的紫杉醇用核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)分析，结果表明这些真菌的紫杉醇和标准品紫杉醇具有一样的化学结构。这些结果说明了该方法的可行性。

本发明方法的具体步骤包括：1.内生真菌的分离、纯化、保藏

采集红豆杉或者红豆杉近缘科属植物树皮组织，用无菌小刀切成(～0.5×～0.5×～0.5cm)小块，用70％(v/v)酒精进行表面消毒3min，用灭菌的ddH₂O漂洗3次，然后用无菌小刀剥去外表片，剩余的内表皮均匀放置在含有50～100μg/mL的氨苄青霉素的PDA(potato dextrose agarmedium)培养基平板上，在23℃～28℃的培养箱中静置培养，根据内生真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法将形态不同的内生真菌分离到新的PDA培养基平板上。分离后的内生真菌在23℃～28℃培养传代并检测纯度，直至获得单克隆。纯化后的内生真菌接种到PDA斜面进行保藏，并收集其孢子制备孢子悬液，加入终浓度为15％(v/v)的甘油在-70℃进行低温保藏。

2.产紫杉醇内生真菌的筛选

产紫杉醇内生真菌的快速、高通量筛选过程示意如图1。

(1)dbat基因的扩增

将分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法(Kimetal.，1990，Can J Bot，68：1898-1902)提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(dbat)的扩增检测。引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μM dbat-F和50～100μM dbat-R，100～200μM dNTPs，5μL 10×PCRreaction buffer，1～2.5 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌进行bapt基因的扩增筛选。

(2)bapt基因的扩增

对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(bapt)的扩增检测。引物为bapt-F(5’-CCTCTGTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTG CGATACTT-3’)；

PCR反应体系组成包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μMbapt-F和50～100μM bapt-R，100～200μM dNTPs，5μL 10×PCR reactionbuffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，53℃～55℃、50sec～1min，68℃～72℃、1min～1.2min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，收集扩增有bapt基因条带的真菌进行下一步的分析。

3.真菌紫杉醇的分析

接种由步骤2筛选得到的既有dbat基因也有bapt基因条带的真菌到含有300～500mL土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm条件下培养10～15天。然后将培养物用纱布过滤，收集菌体，50℃烘干并研磨成粉，过200目筛子后称取0.5g依据紫杉醇提取方法(Strobel et al.，1996，Microbiology，142：435-440)进行提取、纯化，并对每个真菌的紫杉醇抽提物用HPLC-MS分析。仪器为Agilent 1100LC/MSD Trap；柱型：C18分离柱(5×300mm，Waters)。

注：PDA培养基组分和含量为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g。配制时马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L，高温灭菌待用。土豆葡萄糖液体培养基组分和含量同PDA培养基，只是不含有琼脂。

下面通过借助实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

[实施例1]

从华中科技大学校园苗圃采集曼地亚红豆杉(Taxus media cv.Hicksii)树干部树皮，切成约(～0.3×0.5×0.3cm)小块，采用常规的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组织小块放置在含有50μg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在23℃的培养箱中静置培养，根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得167株内生真菌。

167株内生真菌分别接种到30mL的土豆葡萄糖液体培养基，23℃、120rpm培养3天，提取这些真菌的基因组DNA，50株真菌基因组DNA各0.2μL混合为一个筛选组，有A、B、C三组，另有一个包含67株真菌基因组DNA各0.2μL的D筛选组。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50μM dbat-F和50μM dbat-R，100μM dNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer，1units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：94℃、6min；93℃、50sec，50℃、30sec，68℃、50sec共进行30个循环；之后，68℃再延伸7min。

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，其中A筛选组和D筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

对A筛选组真菌再次进行分组，每10株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A1-A5共5个筛选组；对D筛选组真菌再次进行分组，每10株真菌基因组DNA为一个筛选组，有D1-D66个筛选组和一个包含7株真菌基因组DNA的筛选组D7，依上述dbat扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现：A3和D7两个筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

分别以A3和D7两个筛选组的17株真菌基因组DNA为模板，依上述dbat扩增条件进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，其中有12株内生真菌的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

对这12株内生真菌进行bapt基因的扩增。PCR反应体系组成包括30ng真菌基因组DNA，50μM bapt-F和50μM bapt-R，100μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：94℃、6min；93℃、50sec，53℃、50sec，68℃、1min，共进行30个循环；之后，68℃再延伸7min。

经琼脂糖凝胶电泳分析发现，其中有2株内生真菌可以扩增出bapt基因。将这2株内生真菌接种到300mL土豆葡萄糖液体培养基中，23℃、120rpm条件下培养10天，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这2株真菌可以产紫杉醇。

[实施例2]

从武汉植物园采集云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu)茎部树皮组织，用无菌小刀切成(～0.5×0.5×0.5cm)小块，然后采用常规的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组织小块放置在含有75μg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在26℃的培养箱中静置培养，根据内生真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化内生真菌，并最终获得31株内生真菌。

31株内生真菌分别接种到30mL的土豆葡萄糖液体培养基，26℃、150rpm培养3天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.3μL进行分组筛选，每10株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A、B两组，另有一个包含11株真菌基因组DNA的C筛选组。以混合真菌基因组DNA为模板进行dbat基因扩增。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA、75μM dbat-F、75μM dbat-R、150μM dNTPs、5μL10×PCR reaction buffer、2units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：96℃、3min；93℃、55sec，53℃、40sec，72℃、1min，共进行35个循环；之后，72℃再延伸7min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析表明，其中A筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

依上述dbat扩增条件，对A筛选组的10株真菌基因组DNA分别进行dbat基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有5株内生真菌的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

之后，对这5株内生真菌进行bapt基因的扩增。PCR反应体系组成包括50ng真菌基因组DNA，75μM bapt-F和75μM bapt-R，150μM dNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer，1.5 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：95℃、5min；93℃、55sec，55℃、55sec，72℃、1.2min，共进行35个循环；之后，72℃再延伸7min。

经琼脂糖凝胶电泳分析发现，其中有1株内生真菌可以扩增出bapt基因。将这1株内生真菌接种到400mL土豆葡萄糖液体培养基中，26℃、200rpm条件下培养10天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这1株真菌可以产紫杉醇。

[实施例3]

从华中科技大学校园瑜珈山上，采集东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.)近根部树皮，用无菌小刀切成(～0.1×0.3×0.5cm)小块，然后采用常规的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组织小块放置在含有100μg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在28℃的培养箱中静置培养，根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得45株内生真菌。

45株内生真菌分别接种到50mL的土豆葡萄糖液体培养基，28℃、200rpm培养5天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.5μL进行分组筛选，每5株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A～I共9组，以混合真菌基因组DNA为模板进行dbat基因扩增，

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，100μM dbat-F，100μM dbat-R，200μM dNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer，2.5 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：96℃、3min；93℃、1min，53℃、50sec，68℃、1min，共进行35个循环；之后，68℃再延伸10min。

凝胶电泳检测分析，其中有D、F、G筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

依上述dbat扩增条件，对D、F、G筛选组共15株真菌基因组DNA分别进行dbat基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有8株内生真菌的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

对这8株内生真菌进行bapt基因的扩增。PCR反应体系组成包括100ng真菌基因组DNA，100μM bapt-F，100μM bapt-R，200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，2 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：96℃、6min；93℃、55sec，55℃、1min，72℃、1min，共进行35个循环；之后，72℃再延伸10min。

经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有1株内生真菌可以扩增出bapt基因。将这1株内生真菌接种到500mL土豆葡萄糖液体培养基中，28℃、150rpm条件下培养15天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这1株真菌可以产紫杉醇。

[实施例4]

从武汉植物园采集穗花杉(Amentotaxus argotaenia(Hance)Pilger)近根部树皮组织，用无菌小刀切成(～0.5×0.5×0.3cm)小块，然后采用常规的内生真菌的分离法对组织小块进行处理，并分离内生真菌。树皮内表皮组织小块放置在含有75μg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在28℃的培养箱中静置培养，并根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法分离、纯化获得64株内生真菌。

64株内生真菌分别接种到40mL的土豆葡萄糖液体培养基，28℃、150rpm培养4天，提取这些真菌的基因组DNA，各取0.2μL进行分组筛选，每8株真菌基因组DNA为一个筛选组，有A～H共8组，以混合真菌基因组DNA为模板进行dbat基因扩增。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50μM dbat-F，50μM dbat-R，150μM dNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer，2.5 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：95℃、5min；93℃、1min，51℃、40sec，72℃、55sec，共进行30个循环；之后，72℃再延伸10min。

经凝胶电泳检测分析发现，其中A、G两个筛选组可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

依上述dbat扩增条件，对A、G两个筛选组共16株内生真菌基因组DNA，分别进行dbat基因的扩增，琼脂糖凝胶电泳分析后发现，有8株内生真菌的基因组DNA可以扩增出和预计大小相同的约200bp的dbat基因片段。

对这8株内生真菌的基因组DNA进行bapt基因的扩增。PCR反应体系组成包括80ng真菌基因组DNA，50μM bapt-F和50μM bapt-R，150μMdNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer，2.5 units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL。

PCR扩增条件为：96℃、3min；93℃、1min，54℃、55sec，68℃、1.2min，共进行35个循环；之后，68℃再延伸10min。

经琼脂糖凝胶电泳分析发现，有1株内生真菌可以扩增出bapt基因。将这1株内生真菌接种到500mL土豆葡萄糖液体培养基中，28℃、150rpm条件下培养15天后，提取紫杉醇并进行HPLC-MS分析，结果表明，这1株真菌可以产紫杉醇。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于上述实施例所公开的内容，所以，凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (1)

1、一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤：

(1)从红豆杉树皮组织采用常规的内生真菌的分离法分离、纯化内生真菌；

(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行dbat基因的扩增：

分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(dbat)的扩增检测；其引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)；

反应体系采用标准的PCR反应体系，包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μM dbat-F和50～100μM dbat-R，100～200μMdNTPs，5μL 10×PCR reaction buffer和1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增条件为94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌；

(3)对含有dbat基因的内生真菌进行bapt基因的扩增，得到产紫杉醇内生真菌：

对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(bapt)的扩增检测；引物为bapt-F(5’-CCTCTCTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTGCCATACTT-3’)；

反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μM bapt-F和50～100μM bapt-R，100～200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，53℃～55℃、50sec～1min，68℃～72℃、1min～1.2min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并收集扩增有bapt基因条带的真菌，即产紫杉醇内生真菌。

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