CN105524893B - 一种dbat突变酶d166h及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种DBAT突变酶D166H及其应用。所述的突变酶D166H是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了11倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本发明寻找了7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用乙酸乙烯酯、乙酸戊酯和乙酸异丙烯酯，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了74倍，能作为替代昂贵的乙酰辅酶A底物用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。

Description

一种DBAT突变酶D166H及其应用

技术领域

本发明属于生物分子催化领域，特别涉及一种DBAT酶(10-去乙酰基巴卡亭III-10β乙酰基转移酶)突变酶D166H及其应用。

背景技术

定制酶一直是生物化学家奋斗的目标。随着分子生物学技术的逐渐成熟，对蛋白序列进行任意修改，可以解读酶的催化机理并继续理性设计酶。这种理性设计可以是增加已有酶的性质，甚至是重新设计一个蛋白质。

高催化活性酶是在生物产业中发挥重要潜能的关键所在，也是现代蛋白质工程研究的主攻方向。新型催化剂的理性设计往往会拓展我们对蛋白生化特性的认识，尤其是那些错误少、时间使用合理的蛋白质理性改造过程。目前已利用理性设计突变位点技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性以及改进酶的别构效应等进行了成功的改造(Kries et al.,2013)。然而，理性设计方法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。

目前理性设计的思路仍然主要是由Hellinga和Richards于1991年提出的给蛋白增加新的结合位点的观点。实际操作中，第一步在蛋白分子内引入新的功能域，第二步再进行优化(Feldmeier et al.,2013；Koga et al.,2012)。

酶活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进高效的催化作用。因此对酶活性位点改造相较整体蛋白质的改造能更为直接，更为显著的提升酶的催化活性(Kiss et al.,2013)。但是，酶的活性中心需要十分精确的构象调节，它既需要一定的柔性去识别底物，完成催化反应，又需要一定的刚性维持合理的构象，来保持良好的生物学活性；酶的活性中心保持着柔性与刚性间的微妙平衡，随意对活性中心的突变，会导致酶的迅速失稳或者失活(Hilvert,2013)。

随着学者们对酶结构与功能关系认知的逐步完善，计算生物学的迅猛发展，利用计算机辅助设计进化酶学性质的方法也日趋成熟。利用计算机模拟的方法，可以快速鉴定与催化直接相关的不可突变的氨基酸和有可能提升酶活性的靶标位点，为蛋白质工程改造提供快速的指导。

本发明通过合成生物学的手段，研究10-去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰基转移酶的底物拓展和理性设计新酶，建立合成巴卡亭Ⅲ的新方法。本发明能通过高效制备巴卡亭Ⅲ从而极大的改善紫杉醇供不应求的现状。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的首要在于提供一种DBAT突变酶D166H。该DBAT突变酶D166H比野生型DBAT酶具有更高的催化效率。

本发明的另一目的在于提供上述DBAT突变酶D166H的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种DBAT突变酶D166H，是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由天冬氨酸(Asp)改变为组氨酸(His)。

上述DBAT突变酶D166H的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：5。

本发明另一方面涉及携带具有编码序列为SEQ ID NO：5的DBAT突变酶D166H基因的重组质粒，所述的重组质粒为pET-D166H。

本发明还涉及一种工程菌株，其携带上述重组质粒。

所述的工程菌株为重组表达菌株TBL21-D166H，即重组质粒转化进宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21所得。

所述的DBAT突变酶D166H在催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的应用。以乙酰辅酶A为酰基供体时，该DBAT突变酶D166H比DBAT酶的催化效率提高了11倍。

以酰基供体1、酰基供体5或酰基供体7为酰基供体时，所述的DBAT突变酶D166H比DBAT酶具有更高的催化效率。

所述的酰基供体1为乙酸乙烯酯；所述的酰基供体2为乙酸丁酯；所述的酰基供体3为乙酸异丁酯；所述的酰基供体4为乙酸仲丁酯；所述的酰基供体5为乙酸戊酯；所述的酰基供体6为乙酸异戊酯；所述的酰基供体7为乙酸异丙烯酯。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明运用同源建模，分子对接的计算机辅助技术，对DBAT酶进行理性设计，成功构建出突变酶D166H。该突变酶在利用乙酰辅酶A的催化效率上比野生型酶提高了11倍，大大提高了乙酰辅酶A的使用率和产物巴卡亭Ⅲ的产量。同时，为降低生产成本，本发明寻找了7种新型酰基供体，突变酶均能高效利用酰基供体1、酰基供体5和酰基供体7，其中对乙酸乙烯酯的利用率提高了74倍，能作为替代乙酰辅酶A成为合成底物用于制备巴卡亭Ⅲ。迄今为止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未发现有以非植物辅酶类为酰基供体并体现高利用率的研究。

附图说明

图1是各突变酶的SDS-PAGE结果。

图2是各突变酶纯化后的SDS-PAGE结果。

图3是突变酶D166H催化不同浓度酰基供体1、5、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。

图4是突变酶R363H催化不同浓度酰基供体1、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。

图5是突变酶D166HR363H(简称DHRH)催化不同浓度酰基供体1、6、7产生巴卡亭Ⅲ的结果。

图6是DHRH、R363H和D166H分别相对野生型DBAT在利用酰基供体1、2、3、4、5、6上的效率对比图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1野生型DBAT的获得

在NCBI上公布的DBAT酶的基因序列SEQ ID NO：1(GenBank：JQ029678.1)，在其起始密码子ATG前增加GGAATTC(EcoRⅠ酶切位点)，在其终止密码子TGA后增加GCGGCCGCTTTA(NotⅠ酶切位点)，获得带有酶切位点的DBAT酶的基因序列。

用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ(Invitrogen公司)对DBAT酶的基因进行双酶切；同时，用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对pET-32a(+)载体(Invitrogen公司)进行双酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Invitrogen公司)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞(Invitrogen公司)中，质粒小量提取，酶切鉴定，PCR(引物是dbat-F和dbat-R)鉴定后送测序确定表达载体构建成功，命名为pET-DBAT。重组质粒转化E.coli BL21(Invitrogen公司)，获得重组表达菌株TBL21-DBAT。所述DBAT的氨基酸序列为SEQ ID NO：2(GenBank：AFD32413.1)。

dbat-F：5′-GGAATTCATGGCAGGCTCAACAGAAT-3′；(下划线为EcoRⅠ酶切位点)

dbat-R：5′-ATTTGCGGCCGCTCAAGGTTTAGTTA-3′；(下划线为NotⅠ酶切位点)

实施例2DBAT突变酶的获得

(一)利用全质粒PCR方法构建突变酶载体

1、重组质粒pET-DBAT的质粒小量提取；

2、以质粒pET-DBAT为模板，结合两端突变引物，利用重叠延伸PCR技术，扩增出含有突变位点的dbat质粒，PCR体系如下：

所述的Primer-F和Primer-R需要根据不同的突变酶进行相应的变化，具体如表1所示。

引物对D166AF和D166AR用于获得DBAT突变酶D166A，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

引物对D166HF和D166HR用于获得DBAT突变酶D166H或D166HR363H；DBAT突变酶D166H的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：5；DBAT突变酶D166HR363H的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：7。

引物对H162AF和H162AR用于获得DBAT突变酶H162A或H162AR363H；DBAT突变酶H162A的氨基酸序列为SEQ ID NO：10，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：9；DBAT突变酶H162AR363H的氨基酸序列为SEQ ID NO：12，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：11。

引物对R363HF和R363HR用于获得DBAT突变酶R363H或D166HR363H；DBAT突变酶R363H的氨基酸序列为SEQ ID NO：14，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：13；DBAT突变酶D166HR363H的氨基酸序列为SEQ ID NO：8，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：7。

PCR扩增程序：预变性98℃3min；循环设定：变性98℃15s，退火56℃15s，延伸72℃8min，20个循环；最后延伸：72℃10min；反应完成后，利用E.Z.N.ACycle Pure Kit纯化，测定回收浓度后备用。

分别在阴性对照和PCR回收产物中，加入DpnⅠ限制性内切酶(10U/μL，可不加buffer)，在37℃金属浴中消化1h。利用DNA凝胶电泳检测酶切情况。

(二)测序验证突变酶载体构建成功

将消化后的PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂板培养过夜，挑取拟阳性克隆子进行测序验证，确定成功获得突变酶表达载体。

(三)获得突变菌株

酶切鉴定和测序鉴定后，重组质粒转化E.coli BL21菌株，获得DBAT突变酶的重组表达菌株。

表1 获得DBAT突变酶所用到的引物

结果分析：

(一)活性中心正四面体

活性中心是酶催化的核心部位，其特定的构象不仅有助于底物结合，还能促进酶的高效催化。然而，酶活性中心细微的变化也可能会带来酶的性质很大的变化(甚至影响酶正常的生物学功能)，因此，一般尽可能避免改造活性位点(Schmid,2011)。

20世纪初，在对大量不同类型酶在变性过程中的活力、构象变化进行研究，学者们发现酶的失活往往发生在可检测的蛋白质整体构象变化之前，即酶是先失活，后变性。这表明，酶活性中心的构象脆弱性可能是导致酶失去活性的根本原因(Benkovic et al.,2003；C.-L.Tsou,1998；C.Tsou,1993)。因此，我们认为在不破坏活性中心的构象的前提下，对酶的适当理性设计，不但可能不会破坏酶的活性，还可能改变酶的活性。

其中，我们发现，当D166和R363突变成Ala后，酶活均下降；分子对接结果表明，D166和R363均与乙酰辅酶A形成疏水作用。进一步的定点突变实验表明，这两个位点的突变仍然能保留一部分活力，因此，这种疏水作用并不完全决定整个酶促反应过程能否进行。

另外，我们发现，在野生型DBAT中，H162、D166和R363与乙酰辅酶A硫酯键的距离相当，而且这三个氨基酸残基的距离也相近，构成正四面体结构。我们推测，这两个位点可以被改造。尤其是DBAT催化乙酰辅酶A的酰基转移是由单个His发起，这些为引入新的催化位点提供了理论基础。

(二)D166位点

(1)D166A

我们首先利用同源建模，获得D166A突变体的三维结构。再和乙酰辅酶A为底物进行分子对接。突变后Ala166和乙酰辅酶A形成作用力，这和Ala属于疏水性氨基酸有关。和野生型相比，D166A中口袋内的氨基酸，略有变化。推测这和活性下降有关。

从距离上看，His162和乙酰辅酶A的S原子的距离为。这比野生型更近，理论上讲，这更利于His162发动亲核攻击。而Ala166的距离同样变近，增大了空间位阻效应，推测这些均和活性下降有关。

(2)D166H

根据野生型DBAT和D166A的对接结果，D166(或A166)位点距离乙酰辅酶A较近，于是，我们设想，把D166突变成His后，可能会形成两个活性位点，理论上同样有可能参与反应。

首先利用同源建模，获得D166H的三维结构。D166H和WT(野生型DBAT酶)的骨架的RMSD值为，表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再和乙酰辅酶A进行分子对接。突变后His166和乙酰辅酶A形成疏水作用力，这和His属于疏水性氨基酸有关，推测这极有可能改变原有酶学性质。和野生型相比，D166H中，形成口袋的氨基酸残基数目和种类并没有较大的改变。

从空间距离来看，在D166H中，导致His162和乙酰辅酶A的距离是。这和野生型DBAT相比，更近的距离更利于发动攻击。另外，新引入的氨基酸残基His166同样距离乙酰辅酶A较近，也即是说，乙酰辅酶A的羰基有可能同时受到两个组氨酸的亲核攻击，这可能会导致酶活的提高。另外，天冬氨酸和组氨酸分别带负电和正点，这意味着酶的最适pH可能会发生变化。

(三)R363位点

(1)R363H

在野生型DBAT中，R363处于溶剂通道内，和乙酰辅酶A形成疏水作用力。而将其突变成Ala后，导致酶活下降，表明R363并不决定反应能否进行。我们设想，将其突变成His后，可能会改变酶学性质。首先进行同源建模，R363H和WT的骨架的RMSD值为，表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化，再和乙酰辅酶A对接，His363同样和乙酰辅酶A形成疏水作用力。和野生型DBAT相比，口袋内的氨基酸略有变化。另外精氨酸的pKa＝12.5，而组氨酸的pKa＝6.1，推测突变可能会引起酶的最适pH的变化。

进一步考察了His162和His363到乙酰辅酶A的距离，分别为和。这表明，乙酰辅酶A可同时受到两个His(新引入的His363和原有His162)的攻击，可能会导致酶学性质的改变。

(2)H162AR363H

His162是DBAT的关键残基，将其突变后酶活完全丢失。而His上的咪唑基是发动攻击的直接参与者。我们猜想，将原有His162突变导致酶活丢失，再将口袋内和乙酰辅酶A的较近的R363残基突变成His，可能会导致酶活的恢复。

同样，首先利用同源建模，构建H162AR363H的三维结构，H162AR363H和WT的骨架的RMSD值为，表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再和乙酰辅酶A进行对接。新引入的His363和乙酰辅酶A之间形成作用力，表明这一新活性位点可能会发挥催化作用。而Asp162位点虽然被突变成Ala，但新引入的Ala162同样参与和底物的结合过程。

His363距离乙酰辅酶A的距离为，这一距离使得His的咪唑基团能有效接触到乙酰辅酶A的羰基碳，进一步表明这一位点可能会参与酰基转移过程。

(3)D166HR363H

从乙酰辅酶A和上述各个突变酶的对接结果来看，单个突变并不会对整个蛋白的三维结构有大的影响，反而这些位点可能是理性改造酶的最佳候选位置。我们设想，在DBAT的溶剂通道内，同时引入3个His，而且这3个His均距底物的距离足够小，就增加乙酰辅酶A被任意一个His残基亲核攻击的可能，从而提升酶活。

因此，我们利用同源建模构建了D166HR363H双突变酶，D166HR363H和WT的骨架的RMSD值为，表明突变并没有引起蛋白结构的剧烈变化。再将其和乙酰辅酶A进行对接，His162、His166和His363三个氨基酸残基均和乙酰辅酶A形成作用力。

His162、His166和His363和乙酰辅酶A的距离分别为和，这均足以让乙酰辅酶A受到这三个氨基酸残基的亲核攻击。因此，我们认为，理论上来说，D166HR363H双突变酶的活性同样会增加。

实施例3突变酶工程菌株TB21-D166H发酵验证及酶活分析

(一)工程菌株的发酵、蛋白诱导及纯化

1、蛋白诱导表达

用重组质粒转化表达宿主E.coli BL21，获得的重组表达菌株TBL21-D166H。按照1％接种量将阳性克隆菌液接种到100mL LB液体培养基中(加入100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃，220rpm培养至OD600＝0.6～0.8左右，加入终浓度为1mM诱导剂IPTG，28℃诱导3h。

在4℃，8000rpm离心10min收集菌体，每100mL原始发酵液加入20mL磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)进行重悬。利用超声细胞破碎仪对重悬菌体进行破碎，总超声时间12min，工作6s，间隔6s，功率400W，超声过程中菌液始终保持冰浴。破碎后按4℃，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。分别对上清和沉淀进行分离胶浓度为8％的SDS-PAGE蛋白质电泳，检测DBAT突变酶在表达系统E.coliBL21中的表达情况。

2、蛋白纯化

经过SDS-PAGE检测后，按上一步操作重新诱导蛋白。细胞裂解液替换成(50mMNaH2PO4，300mM氯化钠，10mM咪唑，1mM PMSF，pH8.0)。破碎细胞，离心收集上清液。

先装好层析柱(1cm×10cm)，柱材料用量为5～10mg/l mL，用细胞裂解液平衡柱子。将离心得到的上清酶液上样挂柱，用5倍柱体积的缓冲液A冲洗镍柱以清除非特异结合的杂蛋白，接适量蛋白流出液并做好标记，分光光度计测定蛋白浓度，同时进行SDS-PAGE检测杂蛋白的洗脱情况。洗脱完之后用5～10倍柱体积缓冲液B彻底洗脱镇柱，洗脱完之后的镇柱用5～10倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。

将经过SDS-PAGE蛋白电泳验证的收集管中的蛋白洗脱液合并于超滤管(10KDa)中进行4℃超滤浓缩。当洗脱液浓缩至约1mL左右时加入9mL浓缩缓冲液(20mM酸钠，200mM氯化钠和10％甘油)继续浓缩，重复两次。最后将酶液浓缩至1mL左右加入甘油至终浓度为20％，分装于菌种保存管中，置于-80℃保存。

(二)突变酶的酶活分析

1、蛋白浓度测定

采用Bradford法进行蛋白含量的测定。主要原理是当考马斯亮蓝蛋白质在酸性条件下结合时，染色液的最大吸光值波长由465nm转移至595nm，同时其颜色由褐色转为蓝色。通过测定样品的吸光值并对照标准蛋白的吸光值，推算出蛋白浓度。

(1)考马斯亮蓝溶液的配制

称取50mg考马斯亮兰G250完全溶于50mL乙醇(95％)至完全溶解，加入100mLH₃P0₄(85％)，加入蒸馏水至1L，4℃搅拌过夜，滤纸过滤后棕色瓶避光保存于4℃备用。

(2)牛血清白蛋白(BSA)标准曲线

以BSA作为标准蛋白绘制标准曲线。配制10mg/mL BSA溶液，分别吸取0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2mL并加水补足至10mL，得到浓度为0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2mg/mL的BSA溶液，各吸取500μL后分别加入2.5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀后室温下静置5min，在595nm处测定吸光度值，读数在3～5min内保持稳定。得到的BSA标准曲线。

由实验数据进行线性拟合，得到曲线方程：Y＝0.1514X-0.0158，R2＝0.9946。测定时待测蛋白液浓度需在0.1～2mg/mL范围内。

2、酶活测定(以野生型为准)

(1)重组酶催化体系设置

DBAT酶活力单位定义：在30℃条件下，每分钟转化1μM 10-DBA生成巴卡亭Ⅲ的所需的酶量定义为1U。

根据不同目的改变体系内的变量，一般体系设置为：

Mg²⁺1mM，10-DAB 400μM，乙酰辅酶A400μM，纯化后重组酶10μL，Buffer定容至400μL。

(2)测定巴卡亭Ⅲ生成量

加样后，轻轻震荡混匀。30℃下反应1h。反应结束后，立即加入400μL乙腈终止反应。0.22μm微孔滤膜过滤样品，进行HPLC-UV检测。

3、HPLC-UC测定巴卡亭Ⅲ(以野生酶为准)

(1)HPLC条件：采用HPLC-UV对巴卡亭Ⅲ和10-DAB进行定性、定量，主要参数如下：柱温：室温；检测波长：227nm；流动相：MeCN：H₂O(50:50)；流速：1.0mL/min；进样量：20μL。

(2)标准品溶液的制备：分别准确称量巴卡亭Ⅲ和10-DBA标准品适量，甲醇溶解，均配置成1mg/mL母液。

(3)样品溶液的制备：催化反应完成后，加入等体积乙腈，摇匀，终止反应。再用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即可。

(4)标准曲线：精密吸取巴卡亭Ⅲ标准品母液2.5μL、5μL、10μL、15μL、20μL，用色谱级甲醇定容至10mL。过滤后，分别按上述色谱条件测定，重复测定3次，取平均值。以标准品巴卡亭Ⅲ的进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并对所测得的数据进行线性回归分析。

同理绘制10-DAB标准曲线。

(5)精密度的考察：取巴卡亭Ⅲ标准品溶液，精密吸取20μL连续进样5次，分别按上述色谱条件进行检测，考察方法的精密度。

(6)加样回收率：精密称量己知含量的样品，适量加入巴卡亭Ⅲ对照品，制备供试品溶液，分别按上述色谱条件及测定方法进行测定，按下列公式计算回收率：

结果与分析：

由图1可知，野生型DBAT在发生氨基酸替换后对其可溶性表达及表达量有影响。在相同的浓度IPTG诱导后，所有突变体仍能够正常表达。其中，D166A和H162AR363H(简写为HARH)的可溶表达量均减少。相反的是，D166H、R363H和D166HR363H(简写为DHRH)可溶表达量都增加。结果表明R363位点替换成His或者Ala都能增加DBAT的可溶表达，D166位点替换成Ala可溶表达量减少，替换成His时则增加。

分别将这些突变体诱导、表达和纯化(图2)，进行酶学性质测定。

实施例4DBAT酶的酶学性质分析

(一)动力学参数的测定

以10-DAB和乙酰辅酶A为底物，在pH 7.4，0.5mol/L磷酸钠缓冲液中，于30℃反应1h条件下，按照上述酶活力测定方法，测定突变酶在2～10mmol/L底物浓度下产物巴卡亭III的生成量，重复测定3次。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算酶的Km、Vmax和kcat。

(二)突变酶最适反应温度的测定

取适量纯化后的突变酶加入到磷酸钠缓冲液(0.5mol/L，pH 7.4)中，并在不同的温度(10℃～60℃，间隔10℃)条件下，分别设置6个反应体系，测定其最适反应温度，10-DAB和乙酰辅酶A的浓度均为400μmol/L 10-DAB，参照上述测定其酶活力，重复测定3次。以突变酶在不同温度条件下所测得的最高酶活力为100％，其它值与之比较得到的相对值作图。

(三)突变酶的最适反应pH的测定

为了测定突变酶的最适pH值，我们在标准状态下，以1.2M的蔗糖为底物30℃水浴反应60min后，对蔗糖磷酸化酶水解反应的最适pH进行了摸索。将纯化后的突变酶在不同的pH(4.0～9.0)条件下进行酶促反应测定其最适pH值，所使用的缓冲液为0.5mol/L醋酸盐缓冲液，pH(4.0～5.0)；0.5mol/L磷酸钠缓冲液，pH(6.0～8.0)；0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，pH(8.0～9.0)。并参照上述测定其酶活力，重复测定3次。酶活最高的一组反应缓冲液pH值为该酶的最适pH值设定酶活为100％，以此为标准制作不同pH值与酶相对活性关系曲线。

结果与分析：

(一)突变酶的酶学性质测定

利用上述纯化的突变酶，分别以乙酰辅酶A和10-DAB为底物，进行酶学性质测定，以研究这些理性设计位点是否能如预期效果。

(1)D166A

突变体D166A对pH的影响。看出，该酶最佳反应pH是7，这和野生型DBAT一致。但是，在酸性范围内，其活力下降较明显，这和野生型又有比较大的差别。如在pH＝6时，野生型DBAT的相对酶活约为70％，而D166A不到50％；在pH＝8时，野生型DBAT的相对酶活和D166A相当。从酶对环境pH的适应角度来看，Asp属于酸性氨基酸，Ala属于脂肪族氨基酸，Asp166位点突变成Ala，不利于保持酶活性，降低了适应性。我们推测His162发生亲核攻击，需要夺取10-DAB上醇羟基的氢，而在酸性环境下，这一机制极有可能受到干扰，从而使酶活降低。

另外，我们考察了D166A的最适温度。表明D166位点突变成Ala，并未对温度适应性有明显的影响。

(2)D166H

为进一步验证D166位点是否为活性残基H162提供反应的微环境，我们设想，把酸性氨基酸Asp替换成碱性氨基酸(如His)同样会影响酶对环境pH的适应性。我们继续测定了D166H的最适pH。D166H的最适pH为7，这和野生型DBAT和突变体D166A一致。所不同的是，在pH＝6时，D166H的相对酶活还保留在80％以上，这明显高于野生型DBAT和D166A；而在pH＝8时，D166H的相对酶活力却下降到了50％左右，这低于野生型DBAT和D166A。因此，我们认为，D166位点不仅维持了蛋白的高级构象，而且在His162发生亲核攻击的时候，为其提供了一定的微环境。

另外，我们测试了D166H的最适反应温度。可以看出，其最适温度是30℃，这和野生型DBAT和D166A一致。但在较低温度下，还能保持较高的酶活，我们猜测，D166突变成His后，更利于维持其构象。

(3)R363H

pH对突变体R363H酶活的影响。看出，R363H表现出的性质和野生型完全不同，该酶最佳反应pH是3，这和野生型DBAT相差很远。在酸性范围内，R363H的活力较高，而在碱性环境中，活性完全消失，这和野生型完全不同。

His的pKa是6.04，属于弱碱性氨基酸。Arg的pKa是12.48，属于碱性氨基酸。在碱性环境下，Arg363位点突变成His后，不利于His的质子化，从而使得酶活性大大降低。这也说明除了环境pH对酶活性有影响之外，在酶活性中心附近的氨基酸残基(D166和R363)同样为His提供了可供其质子化的微环境，这也在一定程度上决定了酶对环境pH的适应性。

另外，我们研究了温度对R363H酶活性的影响。可知，R363H的最适温度是30℃，这和野生型的一致。但在较高温度(如30～50℃)下，R363H还能保持70％以上的酶活性，而野生型均下降到50％以下。这表明R363H拥有更高的温度适应性。

(4)H162AR363H

根据His催化的酰基转移原理，我们构建了双突变位点突变体H162AR363H，其中，替换了原有的活性残基H162A，同时在R363的位置引入新的拟活性残基His。酶学性质测定，表明H162AR363H具有活性，即新引入的活性残基可以正常发挥作用。我们进一步研究了pH对其酶活的影响。可知，H162AR363H的最适pH为6，而且在酸性环境下(如pH＝4～6时)，仍然具有较高的活力。和His162相比，Ala162改善了活性残基附近的微环境，增加了在较高环境pH下的适应性。

温度对H162AR363H的影响。可知，其最适温度为30℃，这和野生型DBAT及R363H并没有差别。

(5)D166HR363H

His残基首先质子化，再夺取乙酰辅酶A上羰基碳的电子。利用定点突变技术，在DBAT中同时引入2个His位点，这和原有的His162一起，极有可能提升酶活性。

我们仅以研究了pH对其活性的影响。可知，突变体D166HR363H的最佳pH是6，这和H162AR363H一致，和R363H(pH＝3)和野生型DBAT(pH＝7)相差较大。推测这和His166残基同样改善了反应微环境，说明His162、His166和His363彼此形成微环境，His在酸性环境下更易质子化，从而发动亲核攻击。

温度对D166HR363H酶活性的影响。可知，其最适温度为30℃。这和上述所有的突变体一样，表明这些位点的突变不能改变酶分子对温度的适应性。

(6)理性改造酶的酶学动力学常数

根据DBAT的酰基转移机理，通过对非天然酰基供体的利用分析，我们认为酰基供体上的羰基氧距离活性残基的距离和酶的活性呈现线性相关。在野生型DBAT中，H162、D166和R363距离乙酰辅酶A的距离相当，自然这就成了酶理性设计的起点，于是就构建了H162AR363H、D166A、D166H、R363H和D166HR363H等5个理性设计的酶。

在经过大量表达，纯化后，我们对上述突变体的米氏常数、催化效率等性质进行了表征(表2)。结果表明，在H162AR363H中，单一催化位点H363同样可完成催化，表现出和WT相当的催化效率。将酶的活性残基增加到两个后，即单点突变D166H与R363H，酶的效率常数比野生型增加了11倍和12倍，催化效率相似。继续增加到三个后，酶的效率常数提高了39倍，表明将两个活力提高的突变具有加和作用或者协同作用，简单的累加可以进一步提升其催化活性。

表2 突变体的催化效率表征

(二)非天然底物拓展

(1)H162AR363H

虽然乙酰辅酶A可作为H162AR363H的酰基供体，且其转化效率和WT相当。但测试的酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6和酰基供体7均不能被突变体利用。推测这些化合物产生醛类导致活性残基被破坏。

(2)D166H

突变体D166H对酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4和酰基供体6的转化效率极低，几乎不能被利用。但对酰基供体1、酰基供体5和酰基供体7有较高的催化效率(图3)。从图中可看出，随着添加量的递增，转化效率也相应增加。

(3)R363H

突变体R363H均能利用酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6和酰基供体7。其中，对酰基供体1和酰基供体7有较高的催化效率(图4)。

我们进一步分析了突变体R363H对不同酰基供体的偏好性。可知，R363H对酰基供体1和酰基供体5具有较高的催化活性，其次是酰基供体7。这个与野生型的DBAT相似，我们认为酰基供体的侧链结构越复杂，转化成产物的效率越高。

(4)D166HR363H

我们同样测试了双突变体D166HR363H对酰基供体利用情况。结果表明，该突变体均能较为高效的利用酰基供体1、酰基供体2、酰基供体3、酰基供体4、酰基供体5、酰基供体6和酰基供体7。其中，当酰基供体6的添加量超过1％时和酰基供体7添加量超过2.5％时，产量均逐渐下降(图5)。表明该突变体对不同的酰基供体具有不同的耐受性。

同理，我们进一步分析了突变体D166HR363H对不同酰基供体的偏好性。可知，D166HR363H对酰基供体1、酰基供体5和酰基供体7具有较高的催化活性。这个与野生型的DBAT、R363H相似。

(三)进化路线

Kcat/Km是酶的催化效率常数(specificity constant)。对于同一底物而言，Kcat/Km值越大，表示酶的活性越大。以乙酰辅酶A为酰基供体，突变体H162AR363H和WT相当，表明R363位点可以作为新的催化位点。而D166H和R363H分别比WT提高了大约11倍和12倍，这表明这两个位点均可以设计为新的活性残基。D166和R363结合起来，比WT提高了约39倍，这不仅表明对酶的设计和改造是合理的，而且进一步确认了在DBAT催化的中，His是发动亲核攻击的关键残基，在合理的范围内，增加His的数目，可以增加酰基供体的羰基氧受到His的咪唑基团的攻击的机会，从而增加酶的活性。

另外，我们那把这些设计酶进行非天然酰基供体的测试。结果表明，H162AR363H对多数均不能催化，推测这是因为这些烯醇酯产生了醛类，破坏了新引入的H363残基，从而导致活性下降。而对于D166H、R363H和D166HR363H来说，均在不同程度上提高了对这些非天然底物的利用率(图6)。其中，野生型的对酰基供体7没有活性，而这三个突变体均能较高效的利用。酰基供体1的利用率分别提高了74、100和143倍，推测在较多数目的活性His下，羰基氧更容易受到亲核攻击。

(四)结论

通过理性设计快速有效的提升酶的催化活力一直是蛋白质工程领域的研究热点。它不仅能够为加深理解酶分子的结构与功能关系提供可具体案例，同时也能为工业生产提供优秀的新酶源。在本章中，我们利用分子对接的方法，快速准确的在酶活性中心找到靶标位点，即D166和R363。通过定点突变技术，获得了突变体，并对突变体进行性质表征。其中，以乙酰辅酶A为酰基供体，H162AR363H的催化效率和野生型相当，而D166H、R363H和D166HR363H的催化效率均比野生型提高了11倍、12倍和39倍。对于非天然底物，这些突变体表现出不同的性质，多数能同样增加效率。对于这再一次证明了针对活性中心的改造是一种迅速、高效的进化酶活性的方法。

另外，DBAT催化的酰化作用是有其关键残基His162主导的。在不改变酶分子的溶剂通道的前提下，通过在有效的范围内，仅仅简单的增加His数目就可以叠加酶的效率，因此，本例也成为一个极具代表性的案例。在理解酶结构-功能关系的基础上，通过对酶活性中心的改造，将为未来蛋白质工程提供有效的指导。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DBAT突变酶D166H，其特征在于：所述的DBAT突变酶D166H是氨基酸序列为SEQID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。

2.编码权利要求1所述的DBAT突变酶D166H的基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQID NO：5。

3.一种用于在宿主细胞内表达权利要求1所述的DBAT突变酶D166H的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。

5.一种工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株携带有权利要求4所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的工程菌株，其特征在于：所述的工程菌株为TBL21-D166H，其宿主菌株是大肠杆菌BL21。

7.权利要求1所述的DBAT突变酶D166H在催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的酰基供体为乙酰辅酶A，所述的DBAT突变酶D166H的催化效率比DBAT酶提高了11倍。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的酰基供体为乙酸乙烯酯，所述的乙酸乙烯酯的利用率提高了74倍。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的催化10-DAB合成巴卡亭Ⅲ中的酰基供体为乙酸戊酯或乙酸异丙烯酯。