CN110016440A - 紫红曲霉及其筛选方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种紫红曲霉，所述紫红曲霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5771。本发明首次从酒曲中发现一株产洛伐他汀的紫红曲霉，该菌株不产桔霉素且产洛伐他汀活性可达到75 mg/Kg，为洛伐他汀的生产提供了宝贵的菌株资源。

Description

紫红曲霉及其筛选方法与用途
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种紫红曲霉及其筛选方法与用途。
背景技术
紫红曲霉(Monascus purpureus)是一种腐生真菌，因其能产大量的天然红色素而受到广泛关注，一般存在于树木、土壤和堆积物等环境中。从分类学上来讲，紫红曲霉属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌纲(Ascomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，红曲霉科(Monascaceae)，红曲霉属(Monascus)。目前，现有技术中存在的紫红曲霉的主要产物是红曲色素、洛伐他汀和桔霉素，而桔霉素一种毒枝菌素，具有毒性并对农产品、食物、食料等有污染作用，因为桔霉素的存在限制的紫红曲霉的应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种不产桔霉素的紫红曲霉，该紫红曲霉产洛伐他汀可以达到75mg/Kg且不产桔霉素，是一株高产洛伐他汀的新菌株。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种紫红曲霉，其特征在于，其保藏在在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5771。
进一步的，所述紫红曲霉的18S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。
上述紫红曲霉的筛选方法为：
(1)菌株的初筛：无菌条件下取待挑选的略带红色的酒曲放入无菌水中，置揺床上室温振荡30分钟，取菌液按10倍的梯度稀释到10-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入培养箱培养5～7天，培养温度为28～30℃，培养条件为好氧培养，按菌落是否变红进行初筛，挑选菌落变红的单菌落保存，所述培养基为麦芽汁培养基；
(2)菌株的复筛：将初筛的菌株接种到蒸熟的粳米培养基，28～30℃培养10～15天后，50℃烘干备用，烘干的红曲米经前处理，利用高效液相色谱检测洛伐他汀及桔霉素含量，选出不产桔霉素且产洛伐他汀高的菌株。
所述麦芽汁培养基的制备方法为，麦芽汁经乳酸调pH至4.0±0.1，添加2％琼脂粉制得，培养基在115℃下灭菌20分钟。
麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至6～7°Bé。
所述紫红曲霉在生产洛伐他汀中的用途。
所述紫红曲霉在酿酒中的用途。
本发明的紫红曲霉Monascus purpureus，该菌株已于2012年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.5771，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。
本发明的菌株是从四川剑南春(集团)有限责任公司的酒曲中分离获得。该菌株为紫红曲霉，特征如下：
(1)菌落特征：菌落在ME培养基上辐射生长，有辐射形沟纹，28℃培养7天直径约22-30mm；颜色呈紫红色，周围有白色的晕圈；(2)分生孢子及子囊孢子特征：菌丝体分支上有紫红色单个或成串分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，闭囊壳紫红色，近球形，含多数子囊，子囊内含多个孢子，子囊孢子卵形或近球形；(3)培养条件：培养基：粳米、1％葡萄糖、1％蛋白胨；温度：28～30℃；固态发酵：10～15天。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明首次从酒曲中发现一株产洛伐他汀的紫红曲霉，该紫红曲霉产洛伐他汀可以达到75mg/Kg且不产桔霉素，是一株高产洛伐他汀的新菌株。本发明为洛伐他汀生产提供了一种新选择，为洛伐他汀的生产提供了宝贵的菌株资源。本发明的紫红曲霉是从酒曲中分离出来的，所产的洛伐他汀可用于提高白酒中健康成分的含量，提高白酒的品质。同时，本发明紫红曲霉也为生产健康物质洛伐他汀提供了新的选择，具有极大的应用和推广价值。
附图说明
图1为菌落超微结构图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例
1、筛选所述紫红曲霉：
(1)菌株的初筛
材料：四川剑南春(集团)有限责任公司生产的酒曲
培养基：麦芽汁固体培养基。麦芽汁经乳酸调pH至4.0±0.1，添加2％琼脂粉制得。培养基在115℃下灭菌20分钟；培养温度：28～30℃，培养条件：好氧培养。
麦芽汁制备：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55～60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3～4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至6～7°Bé，备用。
实验方法：无菌条件下取10克挑选的略带红色的酒曲于装有90mL无菌水并放有玻珠的25mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30分钟。取菌液按10倍的梯度稀释到10-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入28℃培养箱培养5～7天，按菌落是否变红进行初筛，结果见表1。因为是有针对性的筛选红曲霉菌，所用出现以颜色及菌落形态初选。挑选菌落变红的单菌落保存。初筛得到的菌株经形态观察发现主要为红曲霉菌和紫红曲霉菌。
表1初筛得到菌株的变红时间及颜色深浅
菌株编号 变红时间(天) 颜色
JNC-L1 5 橘红
JNC-L2 5 红
JNC-L3 5 紫红
JNC-L4 5 红
JNC-L5 5 紫红
JNC-L6 5 橘红
JNC-L7 6 橘红
JNC-L8 6 红
JNC-L9 6 红
JNC-L10 6 橘红
JNC-L11 6 紫红
(2)菌株的复筛
将上述初筛的所得的11种菌株接种到蒸熟的粳米培养基，28～30℃培养10～15天后，50℃烘干备用，烘干的红曲米经前处理，利用高效液相色谱检测洛伐他汀及桔霉素含量，结果如表2所示。最终选出一株不产桔霉素且产洛伐他汀高达75mg/Kg的菌株JNC-L5，根据形态初步鉴定为紫红色的霉菌。
表2复筛得到菌株产洛伐他汀及桔霉素
2、JNC-L5菌株的鉴定
2.1、18S rDNA序列分析
(1)DNA提取
收集菌体，溶于5mL提取缓冲液(100mMTris·Cl，100mM EDTA-Na2，200mM NaCl，2％CTAB，pH8.0)中，37℃振荡45min。加入0.75mL 20％SDS，65℃水浴1h。12000rpm，离心10min，收集上清。上清用等体积的酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1)抽提2次，加入终浓度0.3M的NaAC(pH5.2)及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1h。4℃，12000rpm，离心20min，收集沉淀，用70％乙醇漂洗2次，晾干后溶于50μL TE(10mmTris-HCl，1mmNa2EDTA)中，即得总DNA。
(2)扩增18S rDNA
以总DNA为模板，真菌通用引物18SF(SEQ ID No.2：CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA)和18SR(SEQ ID No.3：CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT)分别为正向引物和反向引物扩增18SrDNA。扩增反应体系为50μL：10×Buffer 5μL，dNTP 1μL，Taq酶0.5μL(2U)，正反向引物各1μL，模板DNA 1μL，ddH2O 40.5μL。扩增反应条件：94℃4min预变性；94℃0.5min，55℃1min，72℃0.5min，30个循环；72℃延伸7min。
(3)18S rDNA序列分析
将扩增的18S rDNA片段送上海生工测序，通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序进行比较获得同源性分析结果(见表3)。
扩增片段测序结果SEQ ID No.1所示，如下：
TGGTCCGTGTTTCAAGACGGGTCGCTTACGACCATTACGCCAGCGTCCGAGCCGAAGCGCGTTCCTCGGTCCAGGTAGGCCGCATGGCACCCCGGGCTATAAGACGCCCCGGAGGGCGACACATTCCCGGGGCCTTTGACCGGCCACCCGAACCGACGCTGGCCCGCCCACGGGGAAGTACACCGGCACGAATGCCGGCTGAACCCCGCAGGCGAGTCTGATCGCAAGCGCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTGCTGTTTAACTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCTTTCGATCACTCTACTTGTGCGCTATCGGTCTCCGGCCAGTATTTAGCTTTAGATGAAATTTACCACCCATTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCGTCGAAGGAGCTTCACATGGACCCAGGCACCCCGTCCCAGACGGGATTCTCACCCTCTCCGACGGCCCGTTCCAGGGCACTTAGACGGGGGCTGAGCCCGAAGCATCCTCTGCAAATTACAACGCGGACCCCGGAGGGGCCAGCTTTCAAATTTGAGCTCTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTGAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGCA
表3扩增片段的同源性比对分析
相似菌株 同源性
Monascus purpureus Went(红曲霉属) 98％
Monascus purpureus(紫红曲霉属) 98％
2.2、Biolog微生物鉴定仪鉴定
经18S rDNA序列分析，发现复筛得到的菌株与红曲霉属和紫红曲霉属的同源性都为98％，暂时无法确定其具体属。为了进一步的确定该曲霉的属，本发明人决定采用美国Biolog全自动微生物鉴定仪(BIOLOG MicrostationTM)鉴定(见表4)。
将待鉴定菌株接种至Biolog推荐的培养基2％ME培养基上，26℃培养，培养时间为7天。
校正浊度仪，利用FF接种液调整100％，然后用FF的标准比浊管显示浊度，应为75％T左右。进行读数校正时最好不要随意转动接种液的玻璃管，因管壁的透光度不均匀，转动会发生变化，空白校正时在什么位置，接种时尽量也放在同样的位置。制备孢子悬液时，首先将灭菌的棉棒在接种液浸一下，然后在平板表面滚动粘取孢子，上下反复涂抹接种液上部干燥的管壁上，使孢子分散，然后利用接种液冲下做成均一孢子悬液；将孢子悬液浓度控制在标准浓度为75％T左右。
将菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中。按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中。盖好微孔板的盖子，弹出枪头。将微孔板直接放入26℃培养箱中培养1-4天。每天读板，选取相应的时间。经鉴定(表4)，筛选得到产洛伐他汀菌株为紫红曲霉。因此，结合分子和Biolog微生物鉴定仪鉴定结果，确定菌株JNC-L5为紫红曲霉(Monascus purpureus)。
表4 Biolog微生物鉴定仪鉴定结果
英文名 参考中文名 可能性 相似性 位距
Monascus 紫红曲霉 100％ 0.876 1.85
本发明曲霉株的形态特征及碳源利用特性鉴定
1、菌落形态及菌体显微观察
将4℃保存的菌株用ME斜面培养基活化3天，然后用接种针挑取斜面的菌落接种到ME平板培养基上，于28℃培养7天，取少许菌落，用扫描电镜QuantaTM450FEG观察菌体的超微结构(见图1)。
该曲霉菌落在ME培养基上呈辐射生长，有辐射形沟纹，28℃培养7天直径约22～30mm；颜色呈紫红色，周围有白色的晕圈；菌落反面呈淡红色或暗红色。菌丝体分支上有紫红色单个或成串分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，闭囊壳紫红色，近球形，含多数子囊，子囊内含多个孢子，子囊孢子卵形或近球形。通过查阅文献和比较发现，这些特征与紫红曲霉形态特征基本一致。
2、碳源利用情况
碳源利用情况采用Biolog微生物鉴定仪进行测定。采用上述Biolog微生物鉴定仪鉴定时的接种方法，将紫红曲霉的孢子悬液接种到微生物碳源鉴定板中；该鉴定板中含有各种碳源，以鉴定板的第一个小孔作为空白对照。在28℃条件下，培养48小时，然后用Biolog微生物鉴定仪，750nm处测吸光值，得出碳源利用情况见表5。
表5本发明紫红曲霉菌株的碳源利用情况
注：“+”为阳性，“－”为阴性(阳性即为可以利用该碳源)。
以上揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作地等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种紫红曲霉，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5771。
2.根据权利要求1所述的一种紫红曲霉，其特征在于，所述紫红曲霉的18S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的紫红曲霉的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌株的初筛：无菌条件下取待挑选的略带红色的酒曲放入无菌水中，置揺床上室温振荡30分钟，取菌液按10倍的梯度稀释到10-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入培养箱培养5~7天，培养温度为28～30℃，培养条件为好氧培养，按菌落是否变红进行初筛，挑选菌落变红的单菌落保存，所述培养基为麦芽汁培养基；（2）菌株的复筛：将初筛的菌株接种到蒸熟的粳米培养基，28~30℃培养 10~15天后，50℃烘干备用，烘干的红曲米经前处理，利用高效液相色谱检测洛伐他汀及桔霉素含量，选出不产桔霉素且产洛伐他汀高的菌株。
4.根据权利要求3所述的紫红曲霉的筛选方法，其特征在于，所述麦芽汁培养基的制备方法为，麦芽汁经乳酸调pH至 4.0±0.1，添加2%琼脂粉制得，培养基在115℃下灭菌20分钟。
5.根据权利要求4所述的紫红曲霉的筛选方法，其特征在于，所述麦芽汁的制备方法为：取大麦芽一定量，粉碎，加4倍于麦芽量的水，在55~60℃水浴中保温糖化，不断搅拌，经3~4h后，至糖化液与碘液反应不显蓝色为止。煮沸后过滤，将滤液稀释至6～7°Bé。
6.根据权利要求1或2所述的紫红曲霉在生产洛伐他汀中的用途。
7.根据权利要求1或2所述的紫红曲霉在酿酒中的用途。
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