CN105838782A - 一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）收集冬孢子；2）冬孢子悬液；3）冬孢子培养；4）单孢分离培养；5）显微观察；6）性亲和菌株筛选；7）PCR鉴定。通过以上方法可快速稳定地筛选得到菰黑粉菌单倍体菌株，同时通过融合实验初筛及PCR验证交配型基因可准确地获得配对的性亲和单倍体菌株。

Description

一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法。

背景技术

菰黑粉菌属于担子菌亚门黑粉菌属，是一种典型的二型态真菌，与玉米瘤黑粉菌近源。目前为止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株与该专一性地寄生在体内的菰黑粉菌共同作用的结果。至今，茭白的种植及保种育种还是采用茭墩分离筛选的方式，人力物力投入较大，而且菰黑粉菌存在多个生理小种，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品种性状不稳定，退化明显。因此采用人工接种方式是茭白育种的发展方向。

研究表明菰黑粉菌的两个性亲和单倍体混合接种可以使野茭植株孕茭，即植株茎基部发生膨大，而非性亲和单倍体菌株混合、单一单倍体菌株、双核菌丝或冬孢子接种均无法使野茭植株孕茭（及由近源的玉米瘤黑粉菌研究进展可知黑粉菌的侵染需要两个性亲和单倍体一起混合接种），因此，菰黑粉菌性亲和单倍体的获得是保障茭白人工育种的前提。而由于自然界中菰黑粉菌以冬孢子或者双核菌丝存在，没有单倍体菌株。目前普遍采用的分离方法得到的菰黑粉菌一般是双核菌丝，而采用体外梯度稀释培养方式获得的菌株大部分为杂合的单倍体菌株或者双核菌丝，该方法不能标准化，无法保证产物的稳定性。

因此我们通过对菰黑粉菌生活史及其生理特性研究，建立了一种快速稳定分离菰黑粉菌单倍体菌株的方法，并进行了成对的性亲和单倍体菌株的简易筛选鉴定。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法的技术方案。

所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；

2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为10³个孢子/mL；

3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；

4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成10³个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；

5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；

6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD₆₀₀为1.5-2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；

7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1-F、引物pra1-R、引物pra2-F、引物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pra1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物pra3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物pra3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤2）中采用4层灭菌纱布过滤。

所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤3）中担孢子分离培养基含有以下组分：K₂HPO₄ 0.85-1.15 g/l，MgSO₄·7H₂O 0.45-0.55g/l，FeSO₄·7H₂O 0.008-0.012g/l，KCl 0.45-0.55g/l，葡萄糖16-20 g/l，(NH₄)₂SO₄ 5.0-5.5 g/l，琼脂10-15 g/l。

所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤6）中融合反应实验具体过程为：

a、选取一个单倍体菌株菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数；

b、将分离得到其它单倍体菌株的菌液各取1 µL分别覆盖于步骤a中的菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。

所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤7）中PCR条件为：PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL；PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止。

通过以上方法可快速稳定地筛选得到菰黑粉菌单倍体菌株，同时通过融合实验初筛及PCR验证交配型基因可准确地获得配对的性亲和单倍体菌株。

附图说明

图1为菰黑粉菌单倍体菌株的分离及配对性亲和单倍体菌株筛选流程图；

图2 为冬孢子在不同培养基上培养后的菌经PI染色后荧光显微观察图；

图3为两个性亲和单倍体菌株在不同碳氮源培养基上融合生长表型图；

图4 为灰茭和正常茭白中菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的分离及鉴定；

图5为菌种及交配型基因的PCR鉴定结果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：菰黑粉菌交配型位点的克隆分析

根据在不同菰黑粉菌单倍体菌株中获得的部分a位点基因序列，结合实验室前期的菰黑粉菌基因组测序及部分菌株重测序结果，分析发现在菰黑粉菌中存在三个交配型a位点，分别为Ue a1，Ue a2和Ue a3，Ue a1的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，Ue a2的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，Ue a3的左端基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，Ue a3的右端基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。其中Ue a1包含了部分lba（1-197 bp）、panC（7322-8000 bp），完整的pra1（4122-5437 bp）、mfa1.2（1131-1250 bp）、mfa1.3（2786-2911 bp）、rba（6652-7083 bp），片段总长8000 bp；Ue a2包含了部分lba（1-277 bp）、panC（8836-9594 bp），完整的pra2（2204-3421 bp）、mfa2.1（7330-7452 bp）、mfa2.3（1212-1331 bp）、rba（8307-8597 bp）；而Ue a3的位点基因比较特殊，a位点的基因被中间至少间距100kb的碱基隔断，将其分为两个片段，左端包含了完整的lba（1-1650 bp）、mfa3.2（2590-2709 bp）、pra3（4015-5493 bp），片段总长5493 bp；右端包含完整的panC（771-2066 bp）、rba（2305-2595bp）、mfa3.1（3445-3567 bp），片段总长4144 bp。

由其它物种的研究表明，lba、rba以及panC在不同物种间具有较高的同源性，同时我们对获得的菰黑粉菌中Ue a1、Ue a2和Ue a3三个位点中的lba、rba以及panC三个基因进行序列比对分析后发现三者之间的相似度在99%以上，序列基本一致，而mfa的基因序列长度在100-150 bp左右，产物片段太短检测比较费力，因此pra基因是区分菰黑粉菌中的Ue a1、Ue a2和Ue a3三个位点的比较好的选择对象。pra1的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

实施例2：快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法

1）收集冬孢子：龙茭2号灰茭（图1B）直接挑取冬孢子。

2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经4层灭菌纱布过滤，获得较纯的冬孢子悬液，最后再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为10³个孢子/mL。冬孢子形态如图1C所示。

3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养约60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落（图1D）为标准。担孢子分离培养基（1 L）配方为：K₂HPO₄ 0.85-1.15 g，MgSO₄·7H₂O 0.45-0.55g，FeSO₄·7H₂O 0.008-0.012g，KCl 0.45-0.55g，葡萄糖16-20 g，(NH₄)₂SO₄ 5.0-5.5 g，琼脂10-15 g。

4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成10³个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子（图1E），将分离出的担孢子在YEPS（2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%琼脂粉）固体培养基上，28℃培养4 d。一个单菌落分离5个担孢子，取3个以上单菌落。担孢子培养后的菌落形态如图1F所示。

5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑（图1G）则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝（图1H），则舍弃。

6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号（图1F），并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD₆₀₀为1.5-2.0的菌液。通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定。融合反应实验如图1I，具体过程为：将1号菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数。之后将剩余的各菌液各取1 µL分别覆盖于1号菌株菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。培养后对菌落形态进行肉眼观察，若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株。如图1I中所示，1号菌株与2、3、4、8或11号菌株可能为性亲和单倍体菌株。

7. PCR鉴定：众所周知，一个单倍体菌株中只可能存在一个pra基因，而两个性亲和的单倍体菌株中pra基因不一样。因此设计特异性引物用于进一步对筛选得到的单倍体进行PCR验证并进一步确认彼此间的性亲和性。

以上述筛选到的12个单倍体菌株为例，提取各菌株的DNA，先通过引物ITS1和ITS4扩增ITS序列并测序进行菌种鉴定，PCR结果如图5D所示，测序结果经NCBI比对后表明均属于Ustilago esculenta。

接下来对各个菌株基因组DNA中的pra1，pra2和pra3进行PCR扩增，结果如图5A，B，C所示，表明2、4号菌株的信息素受体基因为pra3,3、8、11号菌株的信息素受体基因为pra2，其余菌株的信息素受体基因为pra1，即我们筛选得到的菌株1信息素受体基因为pra1，与2、3、4、8或11号菌株的基因型不一样，因此1号菌株与2、3、4、8或11号菌株为性亲和单倍体菌株。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止，扩增片段长度均在600 bp上下，引物序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’（ 核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示），

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示），

pra1-F：5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示），

pra1-R：5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示），

pra2-F：5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示），

pra2-R：5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），

pra3-F：5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示），

pra3-R：5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’ （ 核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）。

8.确定单倍体菌株：当采用引物pra1-F和pra1-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株命名为单倍体菌株UET1，当采用引物pra2-F和pra2-R扩增后得到长度在600 bp上下扩增片段的菌株命名为单倍体菌株UET2。单倍体菌株UET1和UET2，菌落形态如图4A和图4B所示，在YEPS培养基上进行融合反应，结果如图4C所示，UET1和UET2可以融合形成白色气生菌丝，对菌丝基因组进行PCR鉴定后表明菌丝中同时含有pra1和pra2基因。

菰黑粉菌（Ustilago esculenta）UET1菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11843，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。菰黑粉菌（Ustilago esculenta）UET2菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11844，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。

同样的，从龙茭2号正常茭白中也分离得到了两个单倍体菌株，分别命名为UEMT2和UEMT3，菌落形态如图4D和图4E所示，经PCR验证后表明UEMT2只含有pra2基因，UEMT3只含有pra3基因，证明它们是性亲和的单倍体菌株。在YEPS培养基上进行融合反应，结果如图4F所示，UEMT2和UEMT3可以融合形成白色气生菌丝，对菌丝基因组进行PCR鉴定后表明菌丝中同时含有pra2和pra3基因。菰黑粉菌（Ustilago esculenta）UEMT2菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11841。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。菰黑粉菌（Ustilago esculenta）UEMT3菌株于2015年12 月07日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏号为CGMCC No.11842。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号。

对菌落形态对比后我们发现不同基因型的单倍体菌株形态没有明显区别，但是分离自灰茭的两个单倍体菌株体外融合能力远高于分离自正常茭白的两个单倍体菌株。

实施例3： 担孢子分离培养基选择

本发明中担孢子分离培养基是关键，筛选结果表明葡萄糖和(NH₄)₂SO₄的组合可以有效抑制性亲和单倍体孢子融合形成菌丝，使冬孢子萌发形成的担孢子一直保持芽殖生长阶段，避免了分离培养过程中提前形成双核菌丝等干扰形态，使整个过程可以达到快速稳定的效果。由于自然环境中无纯的单倍体担孢子，我们分离的样品为双核菌丝或者二倍体冬孢子，若使用常规的PDA或YEPS或基础培养基（即更换担孢子分离培养基中的碳源葡萄糖和氮源(NH₄)₂SO₄，选择其它碳源如蔗糖、半乳糖等或其它氮源如KNO₃，尿素等），在第3步冬孢子培养24 h后均会出现双核菌丝，50 h后几乎全部形成菌丝，无法分离得到单倍体，而其中部分形态如单倍体的多核的菌丝更会对实验者造成干扰，造成人力物力的浪费。图2A为冬孢子在常规PDA培养基中培养24 h后的菌形态，其形态如担孢子，但经PI染色后可见多个核，表明其为多核菌丝（白色箭头所示）。而图2B为冬孢子在担孢子分离培养基上培养60 h后的菌形态，经PI染色后发现培养中的菌均为单核。

最佳的担孢子分离培养基筛选过程如下：在基础培养基（K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，KCl 0.5 g，琼脂10 g，1 L）中添加不同的碳氮源，检测其对性亲和菌株融合能力的影响，已期筛选得到能够抑制性亲和单倍体菌株体外融合的培养基，使单倍体菌株始终保持芽殖生长状态。在碳氮源筛选过程中，我们分别选用了半乳糖，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露醇，蔗糖，乳糖，麦芽糖作为碳源；硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，谷氨酸钠，甲硫氨酸，精氨酸，尿素，蛋白胨作为氮源；其中碳源以C₆为单位，浓度为20 mm/L，氮源以N₁为单位，浓度为100 mm/L。以硝酸钾为氮源，我们首先将分离得到的菰黑粉菌性亲和单倍体在不同碳源培养基上进行融合实验。发现在葡萄糖培养基上性亲和菌株融合能力最弱，表现为融合时间最迟及融合菌丝长度最短，图3A。因此我们以葡萄糖为碳源，在不同的氮源培养基上进行融合实验，结果如图3B所示，当硫酸铵作为氮源时两个性亲和菌株不能进行融合反应，表现为菌落边缘光滑，无融合菌丝形成。

SEQUENCE LISTING

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工合成

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

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Claims (5)

1.一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；

2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为10³个孢子/mL；

3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；

4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成10³个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；

5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；

6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD₆₀₀为1.5-2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；

7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1-F、引物pra1-R、引物pra2-F、引物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pra1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物pra3-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物pra3-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤2）中采用4层灭菌纱布过滤。

3.如权利要求1所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤3）中担孢子分离培养基含有以下组分：K₂HPO₄ 0.85-1.15 g/l，MgSO₄·7H₂O 0.45-0.55g/l，FeSO₄·7H₂O 0.008-0.012g/l，KCl 0.45-0.55g/l，葡萄糖16-20 g/l，(NH₄)₂SO₄ 5.0-5.5 g/l，琼脂10-15 g/l。

4.如权利要求1所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤6）中融合反应实验具体过程为：

a、选取一个单倍体菌株菌液先在YEPS固体培养基上进行点样，每个点1 µL，总点样数为分离得到的单倍体菌株数；

b、将分离得到其它单倍体菌株的菌液各取1 µL分别覆盖于步骤a中的菌点上方，标记菌株号，于28℃培养箱中培养4 d。

5.如权利要求1所述的一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于所述的步骤7）中PCR条件为：PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至50 μL；PCR扩增程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃ 终止。