CN108913796A - 用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业技术领域，具体涉及检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法。本发明合成绿色荧光蛋白基因的特异性引物，培养绿色荧光蛋白标记的绿僵菌，再通过将绿僵菌与植物共培养，验证绿浆菌在植物根中的共生性，验证方法具有灵敏度高、专属性强的特点。

Description

用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特 异性引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法。

背景技术

昆虫病原真菌能够侵染寄生昆虫，使昆虫罹病死亡，其杀虫功能已被用于植物害虫的防控治理中。近年研究发现，昆虫病原真菌除了能够侵染害虫减少植物虫害以外，还能够进入植物宿存、促进植物的发育生长。目前证明至少有8属种杀虫真菌可在植物体内定植，包括绿僵菌(Metarhizium anisopliae,M.robertsii)、白僵菌(Beauveria bassiana)、拟青霉(Paecilomyces sp.)、蜡蚧轮枝孢(Lecanicilliumlecanii)、虫草棒束孢(Isariafarinosa)、支顶孢(Acremoniumsp.)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)、食线虫真菌(Plectosphaerella cucumerina)，还有抑制植物土传病害的粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究发现内生的杀虫真菌与植物形成一定的互惠共生关系，例如绿僵菌提高番茄的株高、根长和生物量，促进柳枝稷和扁豆根生长发育，提高大豆的抗盐特性；白僵菌在小麦植株中定植，促进了小麦植株的生长。这些防真菌自身种群的大量繁殖并不在植物内，而是在相应的寄主虫体中。它们在植物中宿存的生物学意义深受关注，已成为近年研究热点。

不同于植物病害菌侵入植物后会大量繁殖的是，杀虫真菌在植物中通常只有少量存在，发现和检测植物内生的杀虫真菌具有较大难度。现有的检测植物内生菌的主要方法为分离培养法，即用选择性培养基分离到植物内生菌群，再进行单菌落培养，通过鉴别菌落形态和产孢结构的显微形态来鉴定类别。这种方法需要有选择性好的培养基，仅适用于可在培养基上正常生长的、在植物中存活数量较大的类群，其检测的灵敏度较低，分离过程中极易遗漏掉存活量较少的如绿僵菌的杀虫真菌。

为了确证杀虫真菌的内生性，现有技术将供试杀虫菌株加上易于检测的同位素，然后通过人工接种植物共培养，检测植物中是否存在杀虫真菌的人工标记。此法证明了在虫体与植物不接触的情况下，绿僵菌感染的病虫体上的¹⁵N被转运到植株根内，证明了绿僵菌是氮元素在昆虫与植株之间传递的桥梁。然而，同位素标记方法需要特殊的检测仪器和防护环境，过程较为繁琐，并且该实验没有给出绿僵菌菌体进入植物或存在于植物内的直接证据，因此不能排除¹⁵N通过菌体的次级代谢分泌到土壤中再被植物摄取的可能。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不能快速、简便、准确检测植物体内的绿僵菌的问题，本发明提供一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性的引物，其具有特异性强、灵敏度高的特点。

本发明提供一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性的引物。

本发明的再一目的是提供含有上述引物的试剂盒。

本发明的再一目的是提供利用上述引物检测绿僵菌在植物体内内生性的方法。

本发明的再一目的是提供上述引物对在检测绿僵菌在植物的内生性方面的应用。

本发明构建了绿色荧光蛋白基因egfp标记的绿僵菌菌株IPPMaG-58，该菌株的特征是：菌株基因组中插入了含增强型绿色荧光蛋白基因egfp的核苷酸片段，长度1024bp，其中的egfp基因能够随菌体生长过程在菌丝体和孢子中表达eGFP蛋白，该蛋白可以通过一定波长的光照激发显现荧光，即能够被观察和拍摄记录。

绿僵菌菌株IPPMaG-58中插入的绿色荧光蛋白标记基因egfp的序列(1204bp)，如SEQ NO ID 1所示：

以上序列中下划线部分为基因egfp序列，非下划线部分为启动子序列。

根据本发明的具体实施方式，本发明的检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp的特异性引物，其包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列为Pg-F 5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT；所述下游引物的核苷酸序列为Pg-R 5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT。

根据本发明的具体实施方式，检测绿僵菌的植物内生性的试剂盒包括上述的引物和绿色荧光蛋白标记基因egfp。

根据本发明的具体实施方式，本发明的检测绿僵菌在植物中内生性的方法包括以下步骤：

(1)将标记有绿色荧光蛋白基因egfp的绿僵菌孢子与植物共培养；

(2)采集植物样本，提取植物DNA；

(3)用权利要求1所述的用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物扩增步骤(2)提取的植物DNA，判断是否得到特异性扩增结果。

本发明中，将上述菌株孢子混拌到植物栽培基质中，播种供试植物(玉米、花生等)进行共培养，以及将该菌株孢子悬浮液浇淋到田间生长的供试植物羊草和苜蓿根部土壤中使二者相互作用。处理后于不同时间采集根样本，分别进行针对基因egfp的特异性PCR和在激光共聚焦显微镜下观察切片。

根据本发明的具体实施方式，本发明的扩增试剂盒包含5μL 10×Ex Taq缓冲液、4μL 2.5mmol/L dNTP、各2μL 10μmol/L引物、0.25μL 5U/μL Ex Taq和1μL DNA模板。扩增程序为95℃3min→95℃30sec,55℃40sec,72℃1min循环40次→72℃10min→4℃保存。

根据本发明的具体实施方式，小量绿僵菌DNA与大量植物DNA不同比例1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:2500,1:3000和1:3500的混合模板后，测定本发明检测方法的灵敏度大于1:3000。

本发明的有益效果：

本发明将IPPMaG-58菌株孢子混拌到植物栽培基质中，播种玉米种子，进行共培养，分别于处理后4d,7d,11d,14d,17d,21d和24d取样。将样本初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，再用无菌水漂洗2次，每株根样分成2份，分别用PCR检测和制片观察绿色荧光。提取各个时间段的玉米根样本DNA，分别以上述引物PgF/PgR进行PCR扩增，重复样本3次，结果显示每次取样的根在进行的9次PCR重复中，都至少有2次能够扩增得到预期的DNA片段，其中14d的根PCR获得最高几率的阳性扩增，证明了绿僵菌与玉米共培养4d后进入了根内宿存，而且在14d时达到容易监测的量级。

按照本发明的切片制作方法，对14d、21d的根样本切片用激光共聚焦显微镜在488nm波长下进行了仔细观察，发现了少数视野中有明显的绿色荧光菌丝，并可判断菌丝在根细胞之间的空隙延伸或形成小菌丝团，因而可确定绿僵菌由植物体外进入了体内，并且菌丝在胞间有小量的发育生长。

附图说明

图1为激光共聚焦显微镜下绿僵菌IPPMaG-58菌株分生孢子和菌丝，其中，A.同一视野下egfp标记菌株(左)和原始菌株(右)的分生孢子；B.激发光(左)和可见光(右)视野下的egfp标记菌株分生孢子；C.原始菌株的菌丝(左上)和标记菌株36h、48h、60h的菌丝；

图2为玉米根中绿僵菌的内生性的电泳图谱，其中，泳道顺序：Marker，DL2000；1，空白模板对照；2，绿僵菌IPPMaG-58阳性对照；3和4，不接种和接种4d的根；5和6，不接种和接种7d的根；7和8，不接种和接,11d的根；9和10，不接种和接种14d的根；11和12，不接种和接种17d的根；13和14，不接种和接种21d的根；15和16，不接种和接种24d的根；

图3为激光共聚焦显微镜下玉米根内的绿色荧光菌丝直接观测图，其中，A、B、C不接种的根对照，其中C为侧根生长处。其他为接种处理的根，箭头所指为绿色荧光菌丝，D、E中清晰可见荧光菌丝在根内细胞间延伸；F和H显示侧根分支附近有较多的荧光菌丝；G显示根表皮有附着的荧光菌丝；I显示一个在细胞间隙的小菌丝团；

图4为玉米根中小量绿僵菌灵敏性的电泳图谱，其中，泳道顺序:Marker，DL2000；1，空白模板对照；2，绿僵菌IPPMaG-58阳性对照；3，未接种根；4-10，绿僵菌与玉米的混合DNA模板，比例1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:2500,1:3000and 1:3500；

图5为羊草根中绿僵菌的内生性的电泳图谱，其中，泳道顺序：1，绿僵菌IPPMaG-58阳性对照；2，DL2000Marker,；3，绿僵菌与羊草1:2500混合DNA；4，空白模板对照；5，不接种7d的根；6、7、8，接种7d的根；9不接种15d的根；10、11、12，接种15d的根；13，不接种30d的根；14、15、16，接种30d的根；

图6为羊草根中小量绿僵菌灵敏性的电泳图谱，其中，泳道顺序:1,DL2000Marker；2,空白模板对照；3,未接种根；4-10，绿僵菌与羊草的混合DNA模板，比例1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:2500,1:3000and 1:3500；

图7显示花生根中绿僵菌的内生性，其中，泳道顺序:1,DL2000Marker；2,空白模板对照；3,绿僵菌IPPMaG-58阳性对照；4-7，接种45d、30d、15d、7d的花生根；8，不接种的花生根。

具体实施方式

实施例1检测玉米根中绿僵菌的内生性

在PDA培养基上，接种绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株IPPMaG-58，25℃培养14d，获得的分生孢子粉(如图1所示)。配制孢子悬浮液，用血球计数板显微镜计数后，调整浓度为1×10⁸孢子/ml。

取4.3升孢子悬浮液加入到2公斤的已灭菌的蛭石中，作为栽培基质装入花盆中。将已经表面消毒和催芽24小时的玉米种子播种中到花盆中进行共培养。处理后分别于4d,7d,11d,14d,17d,21d和24d取样，每次取3株重复。

将样本初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，再用无菌水漂洗2次，每株根样分成2份，分别用PCR检测和制片观察绿色荧光。提取各个时间段的花生根样本DNA，以引物Pg-F5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT和Pg-R 5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT进行PCR扩增，每个根样本重复3次。

扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离。结果显示，每次时间取样的根在进行的9次PCR重复中，都至少有2次能够扩增得到预期的DNA片段，其中，如图2所示，14d的根PCR获得最多次数阳性扩增，证明了绿僵菌与玉米互作4d后进入了根内宿存，而且在14d时达到容易监测的量级。

选取14d的新鲜根样本，初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，用无菌纯水漂洗2次，用刮胡刀在根表小心地斜切一个小口并小心地沿纵向撕剥下表皮，然后将刀片轻轻多次划过根表面，获得薄切片，浸于无菌纯水中漂洗，用小毛笔转贴到载波片上。如图3所示，通过激光共聚焦显微镜在波长488nm下观察，发现了一些绿色荧光菌丝在根组织细胞间延伸生长并有极少的形成小菌丝团。这是绿僵菌在玉米根中生存的直接观测证据。

实施例2检测玉米根中小量绿僵菌的灵敏性

接种绿僵菌菌株IPPMaG-58到含蔗糖2％、胰蛋白胨0.5％和0.05％磷酸氢二钾的液体培养基中，于25℃180rpm的摇床上培养54小时，收集菌丝体，提取DNA。另外，花盆中装入已灭菌的蛭石，将已经表面消毒和催芽24小时的玉米种子播种到花盆中，培养7d，取根并提取DNA。

用分光光度计分别测定绿僵菌DNA和玉米DNA浓度，然后按比例1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:2500,1:3000和1:3500配制绿僵菌比玉米的混合DNA模板。以egfp的特异性引物Pg-F 5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT和Pg-R 5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT进行PCR扩增。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离。

结果如图4所示，能够检测出绿僵菌egfp标记的混合DNA最低比例可达到1:3000，即检测的灵敏度在1:3000以上。说明此检测方法具有很高灵敏度。

实施例3检测羊草根中绿僵菌的内生性

在PDA培养基上，接种绿僵菌菌株IPPMaG-58，25℃培养14d，获得的分生孢子粉。配制孢子悬浮液，用血球计数板显微镜计数后，调整浓度为1×10⁷孢子/ml。

在羊草为优势种的草地中，将孢子悬浮液逐株浇淋到羊草根部，每株100mL。之后7d、15d、30d取样，每次取3株重复。

将样本初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，再用无菌水漂洗2次。然后他去根样本DNA，以引物Pg-F 5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT和Pg-R 5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT进行PCR扩增，每个根样本重复3次。

结果显示，如图5所示，7d、15d取样的根能够扩增得到预期的DNA片段，但30d的根样没有扩增片段，表明绿僵菌了羊草根内宿存，至少在7d-15d达到可检测量级。

实施例4检测羊草根中小量绿僵菌的灵敏性

设置小量绿僵菌DNA与大量羊草DNA混合模板的PCR检测试验。接种绿僵菌菌株IPPMaG-58到含蔗糖2％、胰蛋白胨0.5％和0.05％磷酸氢二钾的液体培养基中，于25℃180rpm的摇床上培养54小时，收集菌丝体，提取DNA。另外，从天然草地采集羊草，剪去茎上部分，根样经初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，再用无菌水漂洗2次，然后提取DNA。

用分光光度计分别测定绿僵菌DNA和羊草DNA浓度，然后按比例1:500,1:1000,1:1500,1:2000,1:2500,1:3000和1:3500配制绿僵菌比羊草的混合DNA模板。以egfp的特异性引物Pg-F 5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT和Pg-R 5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT进行PCR扩增。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离。

结果如图6所示，能够检测出绿僵菌egfp标记的混合DNA最低比例可达到1:3000，即检测的灵敏度在1:3000以上。说明此检测方法对检测绿僵菌在羊草中的内生性具有很高灵敏度。

实施例5检测花生根中绿僵菌的内生性

在PDA培养基上，接种绿僵菌菌株IPPMaG-58，25℃培养14d，获得的分生孢子粉。配制孢子悬浮液，用血球计数板显微镜计数后，调整浓度为1×10⁸孢子/ml。

取5升孢子悬浮液加入到2.4公斤的已灭菌的蛭石中，作为栽培基质装入花盆中。将已经表面消毒和催芽24小时的花生种子播种中到花盆中，每盆2粒，进行共培养。处理后分别于7d、25d、30d、45d取样，每次取3株重复。

将样本初步漂洗后用超声波清洗5-10分钟，再用无菌水漂洗2次。提取各个时间段的花生根样本DNA，以引物Pg-F 5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT和Pg-R5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT进行PCR扩增，每个根样本重复3次。

结果显示，如图7所示，在30d和45d的根中能够扩增得到预期的DNA片段，证明了绿僵菌与花生共培养30d后进入了根内宿存。

实施例6不同引物序列的灵敏度对比试验

选用3个其他引物序列与本发明的序列进行检测灵敏度的对比，灵敏度检测方法如上，检测结果见表1：

表1不同引物序列的灵敏度检测结果

结果表明，本发明在玉米根和羊草根中的灵敏度均为1：3000，具有较高灵敏度；对比例1中，双向引物中仅改变了个别碱基，变化微小，绿浆菌在玉米跟和羊草根中的检测灵敏度，分别下降至1:1000和1:500，下降幅度巨大；而对比例2、3中，双向引物的起始位点改变后，几乎检测不到绿色荧光蛋白的特异性条带。因此，本发明的引物序列特异性强、灵敏度高。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaatgtag gtattacctg tacattttat ttattcgaga aaaacaaaca aaccaaaacg 60

atgcagcgat cactaccggc gtcatccgga attgaaacgg cgcgcgttga ggggggcctt 120

cttgttcgga cacacacggg gccgccaaag tggggcccat acggctgccc atcccttgct 180

ctccaatacc ctggtcatgt gactcgaaat tggagactca caaagatgct ttgaaacccc 240

gccgggaact ttttctcaca gacacaatca gtcgacctta tcatcgcaaa atcgacaaac 300

ctcaaaaaga actcgaagag tcagtctccc ttgcggttaa actgattgat atctcgtgtt 360

ctctaaacct tcaataagtg agttactgcg cacaaagccg actatactga gcaccaacgc 420

gaattgctca cgttgtcgcc taacagatct tggctttcgt aggaacccaa tcttcaaaaa 480

gcttatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 540

ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 600

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 660

caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 720

gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 780

cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 840

cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 900

gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 960

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 1020

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 1080

ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 1140

ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 1200

gtaa 1204

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtcagtctc ccttgcggtt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggtgctca ggtagtggtt 20

Claims (7)

1.用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为5'-AGTCAGTCTCCCTTGCGGTT；所述下游引物的核苷酸序列为5'-TGGGTGCTCAGGTAGTGGTT。

2.根据权利要求1所述的绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物，其特征在于，所述植物为玉米或羊草。

3.检测绿僵菌在植物中内生性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物，以及绿色荧光蛋白标记基因egfp。

4.检测绿僵菌植物内生性的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物扩增绿僵菌的绿色荧光蛋白标记基因egfp的步骤。

5.根据权利要求4所述的检测绿僵菌植物内生性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将标记有绿色荧光蛋白基因egfp的绿僵菌孢子与植物共培养；

(2)采集植物样本，提取植物DNA；

(3)用权利要求1所述的用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物扩增步骤(2)提取的植物DNA，判断是否得到特异性扩增结果。

6.根据权利要求5所述的检测绿僵菌植物内生性的方法，其特征在于，步骤(2)中，采集植物样本，并制作样本切片，在488nm下，检视样品切片中是否含有绿色荧光菌丝。

7.根据权利要求4所述的检测绿僵菌植物内生性的方法，其特征在于，所述植物为玉米或羊草。