CN107354168A - 一种真菌表达载体及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有超表达真菌转录调控因子Som1的真菌表达载体。所述表达载体为由绿色荧光蛋白基因gfp、超表达真菌转录调控因子Som1基因和pBarEx质粒表达载体构成的组成性表达载体。本发明真菌表达载体的构建方法巧妙、选择剂价格低廉、程序简单，同时对利用本发明真菌表达载体的昆虫病原真菌转基因菌株的筛选程序简单、筛选效率高，而且不影响真菌的代谢平衡，通过提高单个基因的表达量就可以提高真菌的抗逆能力和毒力，在转基因真菌研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景。此外，本发明将为安全、高效的基因工程真菌农药等提供良好的技术平台。

Description

一种真菌表达载体及其构建方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种真菌表达载体及其构建方法。
背景技术
据联合国粮农组织(FAO)统计，世界粮食产量因病虫草鼠害造成的损失每年大约占总产的20-35％，其中虫害14％。化学防治目前仍是害虫防治中的一种重要措施，在保障农业增产方面起着积极作用。然而，化学农药的广谱、高毒和难降解等特性引起了一系列的环境和社会问题。随着人类对生存环境的日益重视，要求减少化学农药使用量的呼声越来越高涨，在这种情况下，以生物防治为主的害虫防治策略正受到广泛重视。由于微生物生物防治具有安全和可持续控制的优点，一直受到人们的广泛关注。杀虫微生物农药是利用昆虫病原微生物研制的一大类生物农药，真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，在自然条件下由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的60％，是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一。与细菌、病毒杀虫途径不同，真菌能够直接从昆虫体壁侵染昆虫，真菌可侵染刺吸式口器害虫、鞘翅目害虫以及昆虫的卵和蛹等。同时，真菌杀虫剂对人和其它脊椎动物没有危险，也不伤害昆虫的天敌，对环境的影响很小。目前，已发现杀虫真菌约有100多属、800多种，除担子菌亚门之外，昆虫病原真菌存在于其它所有真菌亚门中。研究应用的主要种类有白僵菌、绿僵菌、玫烟色拟青霉和蜡蚧轮枝菌在内的十多种真菌。真菌是最先被研制成杀虫剂的微生物，绿僵菌和白僵菌等杀虫真菌农药已用于松毛虫、玉米螟和蝗虫等害虫的防治，其中杀蝗绿僵菌制剂被联合国粮农组织推荐为环保型产品，国内外已登记60多种杀虫真菌农药，目前真菌杀虫剂已作为化学农药的替代产品或补充制剂防治多种有害昆虫。虽然昆虫病原真菌在防治害虫方面具有独特的优势，但目前真菌杀虫剂的市场占有率非常低。造成这种情况的主要原因是由于真菌杀虫剂致病过程较长、杀虫较慢，受环境因素(温度、湿度、光照和风雨等)影响大、防效难以稳定。因此，急需提高菌株的综合性状，如产孢能力、抗逆能力和毒力等。
目前，利用基因工程手段改良菌株主要集中在提高真菌毒力方面，并已取得有良好进展。组成性表达绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因(Pr1)的工程菌株毒力明显提高，致死时间缩短25％，取食量下降40％；组成性表达白僵菌几丁质酶基因的工程菌株对蚜虫的毒力明显增强，对蚜虫的致死剂量比野生菌株降低50％；由于该基因没有几丁质连接域，将家蚕的几丁质连接域与其融合后，组成性表达的工程菌株杀虫活性进一步提高。将昆虫特异性神经毒素AaIT基因置于昆虫血腔特异启动子的控制下转入绿僵菌，工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊的杀虫速度分别提高28％和38％，致死中浓度(LC50)分别下降约22倍和9倍，感染昆虫取食量下降50％；神经毒素只有在真菌穿透昆虫表皮后才能表达，进一步提高了工程菌株的安全性。
然而，作为生物农药进入自然环境中，除了杀虫速度以外，对逆境的耐受能力也直接影响真菌杀虫剂在田间的防效稳定性。目前，国内外还缺乏利用基因工程手段对杀虫真菌工程菌株的综合性状进行改良的报道。因此，迫切需要开展以基因工程手段进行杀虫真菌综合性状改良的研究，为选育具有实用价值的安全、高毒力的杀虫真菌工程菌株奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有超表达真菌转录调控因子Som1的真菌表达载体。Som1位于真菌非常重要的信号传导途径cAMP/PKA的下游直接受到蛋白激酶A的磷酸化调控，当Som1被磷酸化激活后，能形成同源或异源二聚体调控其下游的多个转录因子如Stu1等，Som1与真菌的生长发育、抗逆和毒力等关系密切。本发明将绿僵菌的Som1置于真菌组成型启动子PgpdA的控制之下，转入真菌后进行Som1组成性表达，通过改变其下游抗逆相关基因和毒力相关基因的表达，从而提高真菌的抗逆能力和毒力等综合性状。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种真菌表达载体，所述表达载体为由绿色荧光蛋白基因gfp、超表达真菌转录调控因子Som1基因和pBarEx质粒表达载体构成的组成性表达载体。
所述绿色荧光蛋白基因gfp在Genbank中的登录号为AAB02576，所述超表达真菌转录调控因子Som1基因为绿僵菌MaSom1基因(在Genbank中的登录号为EFY91592)等，但不限于绿僵菌MaSom1基因。
所述表达载体为绿色荧光蛋白基因gfp和超表达真菌转录调控因子Som1基因融合后插入pBarEx质粒表达载体中构成的组成性表达载体。
所述pBarEx表达载体的构建是根据pAN52-1(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建丝状真菌表达载体pBarEx：设计上游扩增引物1为SEQ ID NO.1与下游扩增引物2为SEQID NO.2从构巢曲霉基因组DNA中扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物1，1μl；10μM引物2，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)色氨酸合成酶启动子(pTrpC)序列。设计上游扩增引物3为SEQID NO.3(与引物2反向互补)与下游扩增引物4为SEQ ID NO.4从pCAMBIA 3300(购自CAMBIA公司)中扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，58℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mMdNTP，1μl；10μM引物3，1μl；10μM引物4，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)Bar基因序列；以上游扩增引物1和下游扩增引物4，采用融合PCR扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物1，1μl；10μM引物4，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)pTrpC控制下的Bar Cassette；将pAN52-1与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx。
表1序列表
为了更进一步提高真菌表达载体的筛选、表达效率，本发明pBarEx-Som1:GFP的构建过程是：酶切上述真菌超表达载体pBarEx，37℃水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳，出现6kb左右片段，回收6kb左右的片段；以绿僵菌基因组DNA为模板，利用上游扩增引物5为SEQ ID NO.5和下游扩增引物6为SEQ ID NO.6扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理3min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物5，1μl；10μM引物6，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到MaSom1基因的编码序列；以质粒pEGFP-C1(TaKaRa，China)为模板，利用上游扩增引物7为SEQ ID NO.7和下游扩增引物8为SEQ IDNO.8扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物7，1μl；10μM引物8，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列；以上述两个扩增产物模板，利用上游扩增引物5和下游扩增引物8进行融合PCR扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理4min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物5，1μl；10μM引物8，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到融合基因MaSom1:gfp，回收扩增产物；T4DNA Ligase(TaKaRa，China)16℃连接XbaI/BamHI酶切的pBarEx和融合PCR产物MaSom1:gfp 6小时左右，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB(含100μg/mL氨苄)平板上，37℃恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB(含100μg/mL氨苄)中，37℃250rpm培养12小时，提取质粒DNA，利用XbaI/BamHI酶切提取质粒DNA，切下2.2kb左右的片段，得到pBarEx-Som1:GFP质粒表达载体。
表2序列表
NO. 序列 备注
SEQ ID NO.5 5'-gctctagaatggccatgaacccgaata-3' 下划线为XbaI酶切位点
SEQ ID NO.6 5'-ccttgctcaccatgtcggcaccaatcgggtcgc-3' --
SEQ ID NO.7 5'-gcgacccgattggtgccgacatgg tgagcaagg-3' --
SEQ ID NO.8 5'-cgcggatccttatcattacttgtacagctcgt-3' 下划线为BamHI酶切位点
为了更进一步提高本发明真菌表达载体的筛选、表达效率，酶切真菌超表达载体pBarEx所用酶为XbaI/BamHI(TaKaRa，China)。
为了更进一步提高本发明真菌表达载体的筛选、表达效率，琼脂糖电泳过程中，胶质量分数为0.99％。
本发明的目的之二在于提供所述真菌表达载体的构建方法。
真菌表达载体的构建方法，首先利用融合PCR扩增获得融合基因MaSom1:gfp，并将该融合基因插入上述pBarEx真菌表达载体中，构成组成性表达载体pBarEx-Som1:GFP。
所述超表达真菌转录调控因子Som1基因采用绿僵菌MaSoml基因，其与绿色荧光蛋白基因gfp进行融合PCR扩增得到融合基因MaSoml:gfp，再将融合基因Som1:gfp插入pBarEx质粒表达载体，构成组成性表达载体；其中融合PCR扩增的模板为MaSoml基因的编码序列和gfp基因的编码序列，上游扩增引物如SEQ ID NO.5所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.8所示。
进一步，将融合基因MaSoml:gfp插入pBarEx质粒表达载体是将融合基因MaSom1:gfp克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体pBarEx的XbaI和BamHI位点之间，使MaSom1:gfp基因处于来自构巢曲霉3--磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子与的色氨酸trpC基因的终止子控制之下，得到BarEx-Som1:GFP。
进一步，所述融合PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理4min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min。
本发明的有益效果在于：
本发明的原理独特：含有超表达真菌转录调控因子Som1的真菌表达载体，Som1位于真菌非常重要的信号传导途径cAMP/PKA的下游直接受到蛋白激酶A的磷酸化调控，当Som1被磷酸化激活后，能形成同源或异源二聚体调控其下游的多个转录因子如Stu1等，Som1与真菌的生长发育、抗逆和毒力等关系密切。本发明的原理是将绿僵菌的Som1置于真菌组成型启动子PgpdA的控制之下，转入真菌后进行Som1组成性表达，通过改变其下游抗逆相关基因和毒力相关基因的表达，从而提高真菌的抗逆能力和毒力等综合性状。
本发明真菌表达载体的构建方法巧妙、选择剂价格低廉、程序简单，同时对利用本发明真菌表达载体的昆虫病原真菌转基因菌株的筛选程序简单、筛选效率高，而且不影响真菌的代谢平衡，通过提高单个基因的表达量就可以提高真菌的抗逆能力和毒力，在转基因真菌研究及市场化过程中具有潜在的、广泛的应用前景。此外，本发明将为安全、高效的基因工程真菌农药等提供了良好的技术平台。
附图说明
图1为含有超表达转录调控因子Som1元件的载体示意图；
图2为绿僵菌转基因菌株验证图；其中，WT为野生型菌株；26、34、55为筛选得到的部分绿僵菌转基因菌株；
图3为绿僵菌耐热能力的测定结果；其中，WT为野生型菌株；26、34、55为筛选得到的部分绿僵菌转基因菌株；
图4为绿僵菌耐紫外能力的测定结果；其中，WT为野生型菌株；26、34、55为筛选得到的部分绿僵菌转基因菌株；
图5为绿僵菌毒力的测定结果；5A为蝗虫存活率测定结果图，5B为半致死时间测定结果图；其中，WT为野生型菌株；26、34、55为筛选得到的部分绿僵菌转基因菌株。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1菌株
绿僵菌蝗虫专一化菌株CQMa102(Metarhizium acridum)，已经在申请号为200310110901.8的授权文本中公开，该菌株现可在重庆大学基因工程中心购买；大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司。
实施例2以超表达绿僵菌MaSom1基因作为筛选标记的真菌表达载体pBarEx-Som1:GFP的构建
首先，根据pAN52-1(购自广州拓飞生物科技有限公司)构建丝状真菌表达载体pBarEx：设计上游扩增引物1为SEQ ID NO.1与下游扩增引物2为SEQ ID NO.2从构巢曲霉基因组DNA中扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mMdNTP，1μl；10μM引物1，1μl；10μM引物2，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)色氨酸合成酶启动子(pTrpC)序列；设计上游扩增引物3为SEQ ID NO.3(与引物2反向互补)与下游扩增引物4为SEQ ID NO.4从pCAMBIA 3300(购自CAMBIA公司)中扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，58℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物3，1μl；10μM引物4，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)Bar基因序列；以上游扩增引物1为SEQ ID NO.1和下游扩增引物4为SEQ ID NO.4，采用融合PCR扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min，1个循环；94℃30s，57℃30s，72℃60s，35个循环；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物1，1μl；10μM引物4，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)pTrpC控制下的Bar Cassette；将pAN52-1与Bar Cassette分别采用AatII与BamHI双酶切后，用T4连接酶连接构建成丝状真菌表达载体pBarEx。
表1序列表
利用XbaI/BamHI(TaKaRa，China)酶切上述真菌超表达载体pBarEx，37℃水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳(胶质量分数为0.99％)，出现6kb左片段，回收6kb左右的片段；以绿僵菌基因组DNA为模板，利用上游扩增引物5为SEQ ID NO.5和下游扩增引物6为SEQID NO.6扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理3min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mMdNTP，1μl；10μM引物5，1μl；10μM引物6，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到MaSom1基因的编码序列；以质粒pEGFP-C1(TaKaRa，China)为模板，利用上游扩增引物7为SEQ ID NO.7和下游扩增引物8为SEQ ID NO.8扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理60s为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物7，1μl；10μM引物8，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到绿色荧光蛋白基因gfp的编码序列；以上述两个扩增产物模板，利用上游扩增引物5和下游扩增引物8进行融合PCR扩增(扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理4min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min；扩增体系为：10×buffer(含Mg2+)，2μl；2.5mM dNTP，1μl；10μM引物5，1μl；10μM引物8，1μl；模板，1μl(10-100ng)；Taq，0.5μl；ddH2O，13.5μl)得到融合基因MaSom1:gfp，回收扩增产物；并将融合基因MaSom1:gfp克隆到无其它筛选标记的真菌超表达载体pBarEx的XbaI和BamHI位点之间，使MaSom1:gfp基因处于来自构巢曲霉3--磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)基因的启动子与的色氨酸(trpC)基因的终止子控制之下，得到pBarEx-Som1:GFP(如图1所示)。将得到的融合基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，经测序证明，得到的基因序列一致。pBarEx-Som1:GFP载体用CaCl2法转入大肠杆菌中并进行扩增，载体大量提取的产物经HindIII线性化后去磷酸，再经酚-氯仿(购自Sigma公司，型号为P3803-100ML)抽提得到浓度为500-1000μg/ml的线性化载体，OD260/280在1.80-1.85之间，证明所得到的线性化载体纯度较高，可以用来进行真菌的遗传转化。
表2序列表
NO. 序列 备注
SEQ ID NO.5 5'-gctctagaatggccatgaacccgaata-3' 下划线为XbaI酶切位点
SEQ ID NO.6 5'-ccttgctcaccatgtcggcaccaatcgggtcgc-3' --
SEQ ID NO.7 5'-gcgacccgattggtgccgacatggtgagcaagg-3' --
SEQ ID NO.8 5'-cgcggatccttatcattacttgtacagctcgt-3' 下划线为BamHI酶切位点
>融合基因MaSom1:gfp序列的测序结果(注：直体部分为MaSom1的编码序列去掉了终止密码子，斜体部分为gfp的编码序列)。
ATGGCCATGAACCCGAATATGGGCATGGCCAACATGAACCCGATGGGCGGTGCTATGGGCGGTGCGCCAATGCCCATGATGAACAATGGTGTTGCCATGAATCCTCAGCAGGCTGCTGCCGCCGCCGCCGCCGCGAGACAGTCACAGCTTGACAGCCAGCGCGGCGTTCTCAACACCTATATTTACGAGTACTTCCTCCGCTATGAAATGTTCGACTGTGCTCGCTCGCTGTTGTCGAGCAATCAGCAGGTAAACGTCCACAAGGACGGAAAGAGTGGCAACACGGCCAACGGCGAAGATCCCATGGACACAGACTCCAAGGATGATTTGGATAAGCTGCCCGATGGCCTACCGCCTCCCAAGCTCCCCATGCCCGCGTCCGACTCTTCGTTTCTGTACGAGTGGTTTTGTCTCTTTTGGGATATTTACAATGCTCAGCGTGTCAAAGGTGGTAATGGCACTGTTAACCAATATGTCGCTCACACTCAGGTACGTTTGGATTTTAGCTGCTGTTTTTCACGTCTTGCCACGCCTGTACTACCTTGAAATCAATGTGTCTTGTCCCGCATCGGCTAATAGCAAGTTCCTCTACAGCAACAGTCTCGATTGAAACAAAACCAGCAACAAGAGCTTCTGCGTCAGATGCGCCCCAGTGACCTTGCGCAACAACAATATCAAGCCCAGATGATGAGAATGCAGAATGGCAACATGAATATGGGCATGAAGCAGGGCAACCTTGCCCGTGCTGCCATGGCTAATAACCAGAATAAGTACGCTCTCATGTAAACCATAACTGTGTAAAATGACACATCGTTGCTAATTGCCGTGTCTCGTTCTAGTCCTCAGATGATGATGCAACCAACCAAGCAAAATCAGATGCAGCGTGATCCGTCTGGCATGGATCAAAACCGCGATCGCCCGTCGTCACCCGCGTCCGGAGAGAATGCGCCATCACCTTCCAAGCGACAACGCATCGATGGAGGAGCACCCTTTAACCCTAACCAGCCAGGAATGGTGGCAAATGGCCGACCCGCTCAAGGCATGCCCGGACAGCAGATGCCGAACAACCCAAATGTCGCCGCTGCTCACCAGATGTTGACTGCCAATGGTATCAACCCAAGTAGTTTAAATCCGCAACAGTTCCAGAACTTTGTCAACGCCCCGCCAGCCGCCCAACAGAAATCGATTGCGACGTACTCTCAGAACCTGCAACAGCACCACGGCTCCCAGATGGGCAACAAGCAACAGATGCCAAACGCTGGGGGGCCTCAGAACCAGGGCTCGCCCATGATGGGACCAGGACCAGATGGAACTGCCCTCAATGCCTTTTACAATCCTACCGGTGAAATGGGGGGCCCAGGGGGGATTCGGCCGGGCCCTGGCGGTGCCCAAGCCGCTGCTGGGAGCAATCACGCACTGCAGGACTATCAGATGCAGTTGATGTTACTGGAGCAGCAAAACAAGAAGCGTCTAATGATGGCCCGGCAGGAACAGGATACCATTACTGGTATGCCCGCAAGAGACGGAGCTCCTCCCGGTGCTCCAGGCCAGCCAGGTCAGGGACCCAACGGCCAATCTTTCCCCGAGGCTTCTCCGCAAGCGATGCGATCTGGAGCGTCACCAAACCCTGCCGACCAGATGAAGCGTGGCACCCCCCAGATGAACAATTCGGGCATACCATCACCGGTTCCTGAAGGTGGCCAATCGCGCGACTCTCCTAACCCTGCCATGAACTTCATGGGTAACCAAGTTGACCCCAACATGGCACCTCACTTCTTCAAACCCGGCACCGACATGACCCAGGCCCAGATGAACGGTATGAGGCCGCCAAGCTCACACCCGGGACAGCCATTCAATGGCCAGATGAATCCGCAGCAGATGATGGCCGCCCGCCAAATGCAACAGGCACAAGGGCAACAGGGACAGCAAGCTGGCCAGGGCGCACCGGGACAATGGCAACAGGGTCCTAATGGCCAAACACCGCAGATGCAACAGAACCAGCAGGTGCAAGGAACGCCGCAATCAAGATCGATGGGCCCGCCTTCAGCTCCTGCCGCCACTGCGAATGCAAATAGCCGAACGACTGCATCACCCCAGCAAGCTGCGGCCGCCCCTCCGACGCCAAGTCAAGGAAACAAGCCTGCGCCCAAGAAGAAGGAGACGAAGGCTGCTAAGGAAAAGGTAATAATATACCTCGTCCCTCACTCAATAGATTTCTCATTGTGTTTGTTTGCTCCGGAACTAACATAAATACAGCGTGCCGCTGCCGCAAAGAAGGCCAGTCAAAACGCCAACGCTGCGGGTGCTGCTACAGCAGGTGAGAACTCGGGCGAGACAGAGGCTACACCAGCGACGCCTATCACTTCGACCAACCCGGGATTCAACAAGAATGCGCCGAACGGAGCTGCTGGCGCCAATGGGCAGGCCACCACGGCCGCCACTGCTTCCACTGCTCCAGCTGCTGCACCGGCTCCTCAAGCAGCACCTGTTCCGCCTCAGACCCATGGCGATCCAAGTCAAAACGGAATGATGGACAATTTCGGCAGTATTGTAAGTTTACCAAGGAGTATTGCCTACATCTGGCGTCCCACTAATTGCCTCCTTAGATGGAGTTTGGATCTATGGAGCTTGCCAACCCCCTGCAATCCGGCGATGTCCTGAACGACTTCGACTTCGACTCGTTCCTTCATGAAGACAACACTGAGCCATTTGACTTCAACGGCTTTTCCAGCATGGAAGGAGGCGACCCGATTGGTGCCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAATGATAA
>绿僵菌中MaSom1基因的编码序列
ATGGCCATGAACCCGAATATGGGCATGGCCAACATGAACCCGATGGGCGGTGCTATGGGCGGTGCGCCAATGCCCATGATGAACAATGGTGTTGCCATGAATCCTCAGCAGGCTGCTGCCGCCGCCGCCGCCGCGAGACAGTCACAGCTTGACAGCCAGCGCGGCGTTCTCAACACCTATATTTACGAGTACTTCCTCCGCTATGAAATGTTCGACTGTGCTCGCTCGCTGTTGTCGAGCAATCAGCAGGTAAACGTCCACAAGGACGGAAAGAGTGGCAACACGGCCAACGGCGAAGATCCCATGGACACAGACTCCAAGGATGATTTGGATAAGCTGCCCGATGGCCTACCGCCTCCCAAGCTCCCCATGCCCGCGTCCGACTCTTCGTTTCTGTACGAGTGGTTTTGTCTCTTTTGGGATATTTACAATGCTCAGCGTGTCAAAGGTGGTAATGGCACTGTTAACCAATATGTCGCTCACACTCAGGTACGTTTGGATTTTAGCTGCTGTTTTTCACGTCTTGCCACGCCTGTACTACCTTGAAATCAATGTGTCTTGTCCCGCATCGGCTAATAGCAAGTTCCTCTACAGCAACAGTCTCGATTGAAACAAAACCAGCAACAAGAGCTTCTGCGTCAGATGCGCCCCAGTGACCTTGCGCAACAACAATATCAAGCCCAGATGATGAGAATGCAGAATGGCAACATGAATATGGGCATGAAGCAGGGCAACCTTGCCCGTGCTGCCATGGCTAATAACCAGAATAAGTACGCTCTCATGTAAACCATAACTGTGTAAAATGACACATCGTTGCTAATTGCCGTGTCTCGTTCTAGTCCTCAGATGATGATGCAACCAACCAAGCAAAATCAGATGCAGCGTGATCCGTCTGGCATGGATCAAAACCGCGATCGCCCGTCGTCACCCGCGTCCGGAGAGAATGCGCCATCACCTTCCAAGCGACAACGCATCGATGGAGGAGCACCCTTTAACCCTAACCAGCCAGGAATGGTGGCAAATGGCCGACCCGCTCAAGGCATGCCCGGACAGCAGATGCCGAACAACCCAAATGTCGCCGCTGCTCACCAGATGTTGACTGCCAATGGTATCAACCCAAGTAGTTTAAATCCGCAACAGTTCCAGAACTTTGTCAACGCCCCGCCAGCCGCCCAACAGAAATCGATTGCGACGTACTCTCAGAACCTGCAACAGCACCACGGCTCCCAGATGGGCAACAAGCAACAGATGCCAAACGCTGGGGGGCCTCAGAACCAGGGCTCGCCCATGATGGGACCAGGACCAGATGGAACTGCCCTCAATGCCTTTTACAATCCTACCGGTGAAATGGGGGGCCCAGGGGGGATTCGGCCGGGCCCTGGCGGTGCCCAAGCCGCTGCTGGGAGCAATCACGCACTGCAGGACTATCAGATGCAGTTGATGTTACTGGAGCAGCAAAACAAGAAGCGTCTAATGATGGCCCGGCAGGAACAGGATACCATTACTGGTATGCCCGCAAGAGACGGAGCTCCTCCCGGTGCTCCAGGCCAGCCAGGTCAGGGACCCAACGGCCAATCTTTCCCCGAGGCTTCTCCGCAAGCGATGCGATCTGGAGCGTCACCAAACCCTGCCGACCAGATGAAGCGTGGCACCCCCCAGATGAACAATTCGGGCATACCATCACCGGTTCCTGAAGGTGGCCAATCGCGCGACTCTCCTAACCCTGCCATGAACTTCATGGGTAACCAAGTTGACCCCAACATGGCACCTCACTTCTTCAAACCCGGCACCGACATGACCCAGGCCCAGATGAACGGTATGAGGCCGCCAAGCTCACACCCGGGACAGCCATTCAATGGCCAGATGAATCCGCAGCAGATGATGGCCGCCCGCCAAATGCAACAGGCACAAGGGCAACAGGGACAGCAAGCTGGCCAGGGCGCACCGGGACAATGGCAACAGGGTCCTAATGGCCAAACACCGCAGATGCAACAGAACCAGCAGGTGCAAGGAACGCCGCAATCAAGATCGATGGGCCCGCCTTCAGCTCCTGCCGCCACTGCGAATGCAAATAGCCGAACGACTGCATCACCCCAGCAAGCTGCGGCCGCCCCTCCGACGCCAAGTCAAGGAAACAAGCCTGCGCCCAAGAAGAAGGAGACGAAGGCTGCTAAGGAAAAGGTAATAATATACCTCGTCCCTCACTCAATAGATTTCTCATTGTGTTTGTTTGCTCCGGAACTAACATAAATACAGCGTGCCGCTGCCGCAAAGAAGGCCAGTCAAAACGCCAACGCTGCGGGTGCTGCTACAGCAGGTGAGAACTCGGGCGAGACAGAGGCTACACCAGCGACGCCTATCACTTCGACCAACCCGGGATTCAACAAGAATGCGCCGAACGGAGCTGCTGGCGCCAATGGGCAGGCCACCACGGCCGCCACTGCTTCCACTGCTCCAGCTGCTGCACCGGCTCCTCAAGCAGCACCTGTTCCGCCTCAGACCCATGGCGATCCAAGTCAAAACGGAATGATGGACAATTTCGGCAGTATTGTAAGTTTACCAAGGAGTATTGCCTACATCTGGCGTCCCACTAATTGCCTCCTTAGATGGAGTTTGGATCTATGGAGCTTGCCAACCCCCTGCAATCCGGCGATGTCCTGAACGACTTCGACTTCGACTCGTTCCTTCATGAAGACAACACTGAGCCATTTGACTTCAACGGCTTTTCCAGCATGGAAGGAGGCGACCCGATTGGTGCCGACTAA
实施例3绿僵菌的遗传转化
绿僵菌液生分生孢子准备：将1ml绿僵菌CQMa102成熟分生孢子无菌水悬浮(浓度为107个/ml)接种于装有100ml 1/4Sabourauds dextross agar(1/4SDA)液体培养基的250ml三角瓶中，于温度为26℃-28℃、转速为250rpm条件下振荡培养2.5天，四层灭菌纱布过滤后于4000×g离心力下离心5min，收集液生分生孢子，用无菌水重悬再洗2次，再用体积分数为20％的无菌甘油溶液重悬使孢子浓度达108个/ml，分装后于-80℃保存。
转化时取50μl分生孢子悬液于灭菌60mm平皿中央，使其直径达1cm，然后放于体积分数为70％的乙醇溶液中灭菌基因枪室内。按照Biolistic PDS-1000/he ParticleDelvery System(Bio-Rad)系统提供的方法进行金粉的处理和线性载体pBarEx-Som1:GFP的包埋，并利用该系统，以1350psi气压，27.5英寸汞(Hg)真空度进行微粒子轰击。轰击后取出样品，在超净台上取出孢子液，用5ml灭菌水稀释，取100μl涂布于含有除草剂PPT的筛选培养基平板上26℃-28℃培养7-10天。挑取生长旺盛的真菌菌落，在1/4SDA培养基上扩大培养(温度为26℃-28℃，培养时间为15天)，用于进一步分析验证。
其中，携带有Som1基因的真菌表达载体可使用根癌农杆菌介导法、电转化法、基因枪法、原生质体法或REMI转化法等将其转入真菌中。
实施例4绿僵菌转基因菌株的分子验证及阳性率测定
接种筛选得到的55个绿僵菌菌落的分生孢子，分别提取各菌落的总RNA，反转录后，利用定量PCR扩增(扩增反应条件为：95℃预变性3min，1个循环；95℃10s，58℃15s，72℃20s，40个循环；55℃1s，95℃恒温；扩增体系为：2×SYBR Green Mix，10μl；10μM引物Som1-VF，1μl；10μM引物Som1-VR，1μl；模板，1μl(10-100ng)；ddH2O，7μl)，上游扩增引物为SEQ IDNO.9和Soml下游扩增引物为SEQ ID NO.10，经real time RT-PCR验证转基因菌株，结果如图2所示。
从图2可以看出，转基因菌株中的MaSom1基因的表达量为绿僵菌野生型菌株的1.5倍以上，显著高于野生型菌株。利用软件graphpad prism 6.01进行不同菌株数据之间的显著性分析，26#菌株P值为0.0047；34#菌株P值为0.000020；55#菌株P值为0.010，三者的P值均小于等于0.01。由此证明，本发明成功获得了表达量显著提高的绿僵菌菌株。
表3序列表
NO. 序列
SEQ ID NO.9 5'-gtgctcgctcgctgttgtcg-3'
SEQ ID NO.10 5'-cagtgccattaccacctttga-3'
实施例5绿僵菌超表达Som1菌株与野生型菌株的耐热能力比较
将绿僵菌超表达Som1菌株与野生型菌株孢子用灭菌水配成浓度为1×107个孢子/ml的孢子悬浮液，45℃水浴处理孢悬液9h，取50μl均匀涂布在直径为9cm的1/4SDAY平板上，28℃培养20h。显微计数孢子萌发率，孢子萌发率＝(孢子萌发数/孢子总数)×100％，每组菌株平行测定三次，结果如图3所示。
从图3可以看出，绿僵菌野生型菌株的孢子萌发率为47％，而各超表达Som1菌株的孢子萌发率都在90％以上，超表达Som1菌株的孢子萌发率显著高于野生型菌株。利用软件graphpad prism 6.01进行不同菌株数据之间的显著性分析，26#菌株P值为0.000000013；34#菌株P值为0.0000000086；55#菌株P值为0.000000023，三者的P值均远小于0.01。由此证明，与野生型菌株相比，绿僵菌超表达Som1菌株的耐热能力显著提高。
实施例6绿僵菌超表达Som1菌株与野生型菌株的耐紫外能力比较
配制野生型菌株和超表达Som1菌株的孢悬液，浓度为1×107个/ml，取50μl孢悬液均匀涂布于1/4SDAY培养平板上，用1350mW m-2的紫外灯，28℃照射3.75h后，放入28℃培养箱中倒置培养20h后，显微计数孢子萌发率，孢子萌发率＝(孢子萌发数/孢子总数)×100％，每组菌株平行测定三次，结果如图4所示。
从图4可以看出，绿僵菌野生型菌株的孢子萌发率为22％，而超表达Som1菌株的孢子萌发率显著高于野生型菌株(利用软件graphpad prism 6.01进行不同菌株数据之间的显著性分析，26#菌株P值为0.0018；34#菌株P值为0.00000022；55#菌株P值为0.000013，三者的P值均远小于0.01)，特别是34#菌株的萌发率为83％。由此证明，与野生型菌株相比，绿僵菌超表达Som1菌株的耐紫外能力显著提高。
实施例7绿僵菌超表达Som1菌株与野生型菌株的毒力比较
配制野生型菌株和超表达Som1菌株的孢悬液，浓度为1×107个/ml，溶剂为液体石蜡配制，用煤油稀释，血球计数板显微计数，吸取5μl孢悬液点滴在东亚飞蝗(五龄虫)背板上，每组点滴30头虫，喂养蝗虫麸皮，水及新鲜的植物叶片，每12h统计一次蝗虫生存结果(注：蝗虫身体变红并僵硬是感染绿僵菌致死)，直至蝗虫全部死亡(或停止死亡)时停止统计，蝗虫存活率＝(蝗虫存活的头数/蝗虫总头数)×100％。空白对照组只点滴5μl液体石蜡。每组菌株平行测定三次，结果如图5A所示。
从图5A可以看出，接种后第六天野生型侵染的处理中仍有超过70％的蝗虫存活，而此时超表达菌中侵染的处理中蝗虫的存活率显著降低，特别是34#菌株侵染的蝗虫约70％已被侵染致死(图5A)。
根据图5A的数据，利用Data Processing System(DPS)软件分别计算出各菌株的半致死时间(LT50)，结果如图5B所示。
从图5B可以看出，WT菌株的半致死时间LT50为7.1天，明显低于Som1的超表达菌株26的半致死时间LT50(5.6天)、菌株34#的半致死时间LT50(5.3天)、菌株55#的半致死时间LT50(5.8天)。利用软件graphpad prism 6.01进行不同菌株数据之间的显著性分析，26#菌株P值为0.000097；34#菌株P值为0.000020；55#菌株P值为0.00016，三者的P值均远小于0.01。由此证明，与野生型菌株相比，绿僵菌超表达Som1菌株的毒力得到了显著提高。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
<110> 重庆大学
<120> 一种真菌表达载体及其构建方法
<160>10
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>Aat II酶切位点
<222>（5）…（10）
<223> 上游扩增引物
<400>1
attagacgtc gcaggtcgac agaagaatga c
<210>2
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游扩增引物
<400>2
gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agatccacta gagcggccgc
<210>3
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>Bar基因起始密码子
<222>（24）…（26）
<223> 上游扩增引物
<400>3
gcggccgctc tagtggatct accatgagcc cagaacgacg cccggccgac
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>BamHI酶切位点
<222>（4）…（9）
<223> 下游扩增引物
<400>4
cgcggatcca gcttttatta gatctcggtg ac
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>XbaI酶切位点
<222>（3）…（8）
<223> 上游扩增引物
<400>5
gctctagaat ggccatgaac ccgaata
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游扩增引物
<400>6
ccttgctcac catgtcggca ccaatcgggt cgc
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游扩增引物
<400>7
gcgacccgat tggtgccgac atggtgagca agg
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>XbaI酶切位点
<222>（4）…（9）
<223>下游扩增引物
<400>8
cgcggatcct tatcattact tgtacagctc gt
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游扩增引物
<400>9
gtgctcgctc gctgttgtcg
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游扩增引物
<400>10
cagtgccatt accacctttg a

Claims (9)

1.一种真菌表达载体，其特征在于，所述表达载体为由绿色荧光蛋白基因gfp、超表达真菌转录调控因子Som1基因和pBarEx质粒表达载体构成的组成性表达载体。
2.根据权利要求1所述的真菌表达载体，其特征在于，所述表达载体为绿色荧光蛋白基因gfp和超表达真菌转录调控因子Som1基因融合后插入pBarEx质粒表达载体中构成的组成性表达载体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的真菌表达载体，其特征在于，酶切真菌超表达载体pBarEx，37℃水浴2小时，将酶切产物进行琼脂糖电泳，出现6kb片段，回收6kb的片段；16℃连接回收产物6小时，转化大肠杆菌感受态，涂布于LB平板上，37℃恒温培养12-16小时，挑取单菌落于液体LB中，温度为37℃、转速为250rpm条件下培养12小时，提取质粒DNA，利用XbaI/BamHI酶切提取质粒DNA，切下2.2kb左右的片段，得到pBarEx-Som1:GFP质粒表达载体。
4.根据权利要求3所述的真菌表达载体，其特征在于，酶切pBarEx所用酶为XbaI/BamHI。
5.根据权利要求3所述的真菌表达载体，其特征在于，琼脂糖电泳过程中，胶质量分数为0.99%。
6.权利要求1-5任一项所述真菌表达载体的构建方法，其特征在于：首先将绿色荧光蛋白基因gfp和超表达真菌转录调控因子Som1基因融合得到融合基因Som1:gfp，再将融合基因Som1:gfp插入pBarEx质粒表达载体，构成组成性表达载体。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述超表达真菌转录调控因子Som1基因采用绿僵菌MaSoml基因，其与绿色荧光蛋白基因gfp进行融合PCR扩增得到融合基因MaSoml:gfp，再将融合基因Som1:gfp插入pBarEx质粒表达载体，构成组成性表达载体；其中融合PCR扩增的模板为MaSoml基因的编码序列和gfp基因的编码序列，上游扩增引物如SEQID NO.5所示，下游扩增引物如SEQ ID NO.8所示。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，将融合基因MaSoml:gfp插入pBarEx质粒表达载体是将融合基因MaSom1:gfp克隆到无筛选标记的真菌超表达载体pBarEx的XbaI和BamHI位点之间，使MaSom1:gfp基因处于来自构巢曲霉3--磷酸甘油醛脱氢酶gpdA基因的启动子与的色氨酸trpC基因的终止子控制之下，得到BarEx-Som1:GFP。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述融合PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；以94℃处理30s，57℃处理30s，72℃处理4min为一个循环，循环35次；72℃延伸5min。
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CN108913796A (zh) * 2018-06-19 2018-11-30 中国农业科学院植物保护研究所 用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法

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